（环境工程专业论文）巴氏梭菌高产13丙二醇的研究.pdf

巴氏梭荫高产i ，3 丙二：醇的m 究 摘要 l ，3 丙二醇( 1 ，3 p d ) 是一个具有多种用途的中间化合物，是生产新型p t t 纤维 的主要单体，具有许多优良特性和很好的应用前景。微生物发酵法生产1 ，3 丙二 醇与化学合成法相比具有显著的优点，因而越来越受到重视，成为当前的研究热 点。 本实验为提高巴氏梭菌转化甘油生产1 ，3 丙二醇的能力，采用以离子束与紫 外线复合诱变和产物耐受相结合的平板筛选方法，同时测定了诱变前后甘油代谢 途径中的甘油脱水酶( g d h t ) 和l ，3 丙二醇氧化还原酶( p d o r ) 的酶活变化，获得可 耐受高浓度1 ，3 丙二醇的优良突变菌株2 株，与出发菌株相比，两株高产突变菌株 的l ，3 - 丙二醇产量分别提高了4 3 和4 0 ，达到6 6 8 4 9 l 和6 5 6 2 9 l 。 并且对巴氏梭菌发酵甘油产生1 ，3 丙二醇的发酵条件做了研究，通过对p h 、 发酵时间、接种量、m g 、f e 和微量元素对巴氏梭菌发酵甘油产生1 ，3 丙二醇影响 进行分析。结果说明，p h 和菌体生长，l ，3 丙二醇合成存在如下规律：p h 高时， 菌体生长较快，但l ，3 一丙二醇终浓度不高。p h 较低时，刚好相反。发酵时间和接 种量必须控制在2 4 h 和6 ，这样才能保证巴氏梭菌发酵产生1 ，3 丙二醇的产量。 m g 、f e 和微量元素也要适量添加，量不能过高，高浓度时1 ，3 丙二醇在发酵液中 不是主要成分，影响l ，3 丙二醇的产量，当浓度过低时会影响菌体的生长。最终 确定的最佳发酵培养基是：甘油4 0 0g l ，k h 2 p 0 40 5 g l ，k 2 h p 0 41 0g l ， ( n h 4 ) 2 s 0 43 0g l ，c a c 0 32 0g l ，f e s 0 4 0 0 1g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2g l ，酵母 膏1 0g l ，c a c l 2 2 h 2 00 0 2g l ，微量元素2 m l l ，p h 6 5 。 关键词：巴氏梭菌甘油1 ，3 一丙二醇诱变培养基优化 a b s t r a c t 1 ，3 - p r o p a n e d i o l ( 1 ，3 一p d ) i sam u l t i - p u r p o s ei n t e r m e d i a t ea n d h a saw i d er a n g eo f p o t e n t i a lu s e ，p a r t i c u l a r l ya sam o n o m e rf o r t h ep r o d u c t i o n o fb i o d e g r a d a b l e p o l y m e r s p t tf i b e r c o m p a r e dw i t hc h e m i c a ls y n t h e s i s ，m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n p r o c e s s e st o1 ，3 - p dh a v em a n yo b v i o u sa d v a n t a g e s ，t h ee n v i r o n m e n t a lf r i e n d s h i pa n d p r i c ea d v a n t a g em a k ei tm o r ep r o m i s i n g ，a n db e c o m et h ef o c u s e so f r e a c h b a s e do ni o nr a ya n du l t r a v i o l e tl i g h tm u t a t i o nm e t h o d s ，t h ep r o d u c tt o l e r a n c e c a p a b i l i t y ，t h ef l a t p a n e ls c r e e n i n gt e c h n i q u ew a se s t a b l i s h e d ，i no r d e r t oi n c r e a s et h e c o n v e r s i o na b i l i t yo fg l y c e r o li n t o1 ，3 - p r o p a n e d i o lb yc l o s t r i d i ap a s t e u i a n u t h e a c t i v i t i e so fg l y c e r o ld e h y d r a t a s e ( g d h t ) a n d1 , 3 一p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s e ( p d o r ) a r ea l s os t u d i e d u s i n gt h i sa p p r o a c h ，t w oe x c e l l e n tm u t a n t st o l e r a t i n g1 ，3 - p r o p a n e d i o l w i t hh i g hc o n c e n t r a t i o na r ea c h i e v e d c o m p a r e dt oo r i g i n a ls t r a i n ，t h e 1 , 3 p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o nc a p a b i l i t yo f t h e s et w om u t a n t sw a si n c r e a s e db y4 3 a n d 4 0 ，i n c r e a s e dt o6 6 8 4 9 la n d6 5 6 2 9 l a n dm e a n w h i l ef e r m e n tc o n d i t i o n s u n d e rw h i c hc l o s t r i d i ap a s t e u i a n u l f e r m e n t i n gg l y c e r o ly i e l d1 , 3 一p r o p a n e d i o l w e r ea l s or e s e a r c h e db ya n a l y s i n gt h e i n f l u e n c es u c ha sp h ，f e r m e n t a t i o nt i m e ，i n o c u l a t i o nv o l u m e ，m g ，f e ，a n d t r a c e e l e m e n t se x e r to nt h ep r o d u c t i o np r o c e s s t h er e s u l ti l l u s t r a t e dt h a tt h eg r o w t hs p e e d o fc l o s t r i d i ap a s t e u i a n u lw a sp o s t i v er e l a t e dt ot h ep hw h e r e a st h ef i n a lc o n c e n t r a t i o n o f1 , 3 p r o p a n e d i o lw a sn e g a t i v er e l a t e dw i t ht h ep h t oo b t a i nah i g hp r o d u c t i o no f 1 , 3 p r o p a n e d i o l ，t h ef e r m e n t a t i o nt i m em u s tp e r s i s t 2 4h o u r sa n dt h ei n o c u l a t i o n v o l u m em u s tb ek e p ta t6 m g f ea n dt r a c ee l e m e n t sc o u l db ea d d e di nt h em e d i a ， w h o s ev o l u m es h o u l dn o tb et o oh i g ht ok e e p1 , 3 一p r o p a n e d i o la st h em a i ni n g r e d i a n t ， a n dw h o s ev o l u m es h o u l dn o tb et o ol o wt oa v o i dp r e v e n t i n gt h eg r o w t ho fc l o s t r i d i a p a s t e u i a n u l f i n a l l y ，a f t e ras e r i e sr e s e a r c h e s ，t h eo p t i m i z i n g m e d i as e l e c t e df o r f e r m e n t a t i o ni st h a tg l y c e r o l4 0 0g l ，k h 2 p 0 40 5g l ，k 2 h p 0 41 0g l ，( n h 4 ) 2 8 0 4 3 0g l ，c a c 0 32 0g l ，f e s 0 4 0 0 1g l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 2g l ，y e a s te x t r a c t1 0g l ， c a c l 2 2 h 2 0o 0 2g l ，t r a c ee l e m e n t s2 m l l ，p h 6 5 k e yw o r d ：c l o s t r i d i ap a s t e u i a n u l ；g l y c e r o l ；1 , 3 一p r o p a n e d i o l ；m u t a g e n e s i s ；m e d i a o p t i m i z a t i o n i i i 巴氏梭菌，岛产1 3 丙一二醇的研究 插图索引 图1 1微生物厌氧代谢甘油途径1 1 图1 2l ，3 丙二醇生产简图17 图2 1本课题研究技术路线图一18 图3 1 1 ，3 丙二醇标样g c 图谱2 8 图3 2 l ，3 丙二醇标准曲线一2 9 图3 3离子束处理剂量与致死率关系曲线2 9 图3 4诱变前后g d h t 酶活的变化2 9 图3 5诱变前后p d o r 酶活的变化2 9 图4 1 p h 对发酵的影响3 7 图4 2菌体在种子培养基中的生长曲线3 8 图4 3接种量对发酵的影响3 8 图4 4 m 9 2 + 对发酵的影响3 9 图4 5f e 2 + 对发酵的影响4 0 图4 6微量元素对发酵的影响4 0 v i 硕f 学位论文 附表索引 表3 1主要实验仪器17 表3 2 诱变时间与致死率关系2 l 表3 3突变株与出发菌株发酵对比考察2 2 v i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者硌r 虱延出 吼力7 年乡月钼 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 作者签名： 导师签名： l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) ，日建点 日期： 。9 年 日期： 夕7 年 f 6 月厂。日 ， 6 月，9 日 第一章综述 近几年受石油价格不断攀升，作为可再生的石油替代品，生物柴油的产量近两 年增长迅猛，这必然导致甘油市场过剩，因此以甘油为原料生产高附加值产品将 成为生物柴油行业的必然趋势。其中用生物法将甘油转化为l ，3 一丙二醇是最受人们 关注的方法之一。 1 ，3 丙二醇( 1 ，3 p d ) 是一种重要的有机化工原料，主要应用于油墨、涂料、化 妆品、制药、防冻剂等行业，它最重要的用途是作为聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单 体。由它合成的聚酯，如聚对苯二甲酸丙二醇酯( p t t ) 】，有独特的性质和优异的 性能，而且可以使聚酯塑料具有易于自然循环的可生物降解特性。目前1 ，3 - 丙二 醇的生产主要是以石油裂解的乙烯和丙烯为原料，在高温和重金属催化剂的作用 下化学合成的。这种合成方法使用有毒的化合物，相近的副产物较多，导致分离 纯化困难，生产成本相应较高。与化学合成法相比，生物制备法具有一下优点： 可利用成本较低的再生资源，生产条件温和，节约能源，无需贵重金属催化剂， 转化率高，选择性好，副产物少，易于分离纯化，环境友好等。生物制备法依据 原料不同可分为淀粉转化法和甘油转化法，前者主要应用d u p o n t 公司与g e n e r c o r 公司合作开发的一种产生1 ，3 丙二醇的生物技术【2 ，3 】。他们利用微生物将葡萄糖( 来 自谷物淀粉，如玉米淀粉) 转化为1 ，3 丙二醇，目前已申请了多项专利，2 0 0 0 年建 成了1 8 k t a 中试装置，现已进行试生产。后者是德国国家生物技术中心( g b f ) 于2 0 世纪8 0 年代开发的技术，以德国h e n k e l 公司为代表，利用肠道细菌在厌氧条件下 直接将甘油歧化为1 ，3 丙二醇【4 1 。国内开展p t t 的研究相对起步较晚，近几年国内 在这方面的研发也异常活跃，有十余家科研单位从事甘油生物转化的研究与开发 工作，目前大多处于小试阶段，因而与工业化生产尚有很大距离。虽然目前能够 生产1 ，3 丙二醇，但产量比较低。 1 1 1 , 3 丙二醇( 1 ，3 p d ) 的概况 1 1 1l ，3 丙二醇的理化性质 1 ) 主要物理性质： l ，3 丙二醇是无色、无臭，具咸味、吸湿性的粘稠液体( 纯品) 。具有吸湿性，可与 水、醇和醚等互溶；难溶于苯、四氯化碳、石油醚；是一种呵燃、低毒性的物质。 其具体的物理性质如下： 分子式：c 3 h 8 0 2 相对分子量：7 6 0 9 结构式：h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 沸点( 1 0 1 3 k p a ) - 2 1 4 c 介电常数( 2 0 c ) ：3 5 1 0 。4 表面张力( 0 ) ：4 7 4 1 0 - 3 n m 相对密度( 2 0 2 0 ) ： 1 0 5 5 4 蒸发热( b p ) - 1 8 4 6 8k j m o l 折射率( 2 0 ) ：1 4 3 8 9 体积膨胀系数( 2 0 。c 4 0 。c ) ：0 6 1 1 0 。3 熔点：3 2 2 ) 主要化学性质：与l ，2 丙二醇类似，高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸 性氯化物生成聚氨酯。与1 ，2 丙二醇不同的是1 ，3 丙二醇只有两个端羟基有反应 活性，且反应活性相同。l ，3 一丙二醇在酸性催化剂作用下，与醛或酮反应生成二 氧杂环乙烷。这是一种广泛应用的有机无机溶剂。在氧化铝催化下，l ，3 丙二醇 可生成乙醇、丙二酸等。1 ，3 丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚 氨酯。 1 1 21 , 3 丙二醇的用途 1 ，3 丙二醇是一种重要的化工原料，作为有机溶剂可用于化妆品、耐高压润 滑剂、染料、油墨、防冻剂、抗冻剂涂料等行业，显示出优良的性能，如1 ，3 丙 二醇用于油墨可提供墨水的吸附性、稳定性等。l ，3 丙二醇既有单醇的性质，又 具有二醇的化学性质，1 ，3 丙二醇可用来合成杂环以及药物中间体【5 】。但其最看好 也是最主要的应用领域还是用做新型聚酯原料，在高温下与羧酸缩合成酯，与异 氢酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯，在酸性催化剂条件下与二元酸反应生成聚酯1 6 】， 分而述之主要在如下几个方面： ( 1 ) 聚酯纤维领域 1 3 丙二醇和对苯二甲酸或对苯二甲酸二甲醋反应生成对苯二甲酸丙二醇 酯，再经缩聚生成聚对苯二甲酸丙二醇酯( p t t ) ，最后经熔融纺丝而成聚酯纤维。 p t t 纤维具有优异的弹性复性和低温染色性能，目前p t t 产生技术掌握在壳牌和 杜邦两家公司手中，商品名称分别为c o r o e r a 与s o r o n a 。 ( 2 ) 可降解性材料领域 1 ，3 丙二醇可与己二酸、癸二酸缩聚，制成相应的聚酯薄膜。这种聚酯薄膜 具有生物降解性，埋在土壤中可在自然界的微生物作用下逐步分解。 ( 3 ) 涂装领域 2 硕士学位论文 以l ，3 一丙二醇为原料合成的油漆，具有很好的弹性和硬度，用途广泛，比如 可以用作蛇管外层涂料、罐头油漆和粉末喷涂等。其品质优良，目前只有价格昂 贵的二醇类( 主要是1 , 6 己二醇) 才能与之相媲比。 ( 4 ) 合成药物中间体领域 在药物合成领域，1 ，3 丙二醇已用于维生素h 的合成。近年1 ，3 丙二醇作为 有机合成原料已越来越受重视，比如1 ，3 丙二醇经空气氧化可生成3 羟基丙酸和 丙二酸，与尿素反应可合成环状碳酸酯。 1 1 31 ，3 丙二醇的合成工艺 1 ，3 一丙二醇合成路线较多，下面根据其原料进行综述【7 ，8 】： ( 1 ) 乙烯法 这是以日本t e i j i n 公司为主体探讨乙烯反应合成l ，3 丙二醇的技术路线。所 用原料乙烯价廉易得，且l ，3 丙二醇的收率较高，只是此反应的化学过程较为复 杂。 ( 2 ) 丙烯醛合成法 德国d e g u s s a 公司发明了以丙烯醛为原料产生1 ，3 丙二醇的工业化技术，在 其产生路线中，产品的收率取决于丙烯醛的水合反应、而最终产品的质量则由3 羟基丙醛的加氢效果来决定。 ( 3 ) 环氧乙烷合成法( e o 法) s h e l l 公司采用环氧乙烷路线大规模产生l ，3 一丙二醇，其工艺的特点是技术难 度大，设备投资高，但产品的质量和成本有竞争力。该方法工程化方面存在的困 难是：( a ) 选择和改进高效催化剂；( b ) 反应压力较高，氢甲酰化反应压力在1 5 m p a 左右，反应器结构相当复杂。 ( 4 ) 1 ，3 二氯丙烯加氢法 l ，3 二氯丙烯加氢法合成路线简单，但选择性不高，而且伴随有氢解反应， 专一性不强。为了最大降低氢解的影响，可以先用保护基团取代比较活泼的烯丙 基氯( 如先制备醋酸氯丙烯酷) ，然后再加氢，最后除去保护基团一j 。 ( 5 ) 甲醛乙醛缩合法 最近印度申请了以甲醛为原料制备1 ，3 丙二醇的专利。该方法是用k o h 作催 化剂将甲醛和乙醛缩合成3 羟基丙醛，再用离子交换树脂脱除k o h 后，用异丙 醇铝将3 一羟基丙醛还原成1 ，3 丙二醇。 该方法具有原料易得、价格低廉的优点，从分子角度来说该方法也是一种非 常经济的技术路线。但此反应的选择性较差，特别是如何将均相碱性催化剂从反 应体系中分离而不影响3 羟基丙醛( 3 h p a ) 的收率还有待进一步解决。 ( 6 ) 甘油法：分甘油微生物发酵法和甘油化学法。 巴氏梭菌高产1 , 3 丙二醇的研究 甘油微生物发酵法 甘油微生物发酵法是一种以补料分批发酵的方式，将工业甘油在微生物作用 下转化为1 ，3 丙二醇的方法。后面将对此做详细的综述。 甘油化学法 即以甘油为原料通过化学反应制备1 ，3 一丙二醇。c e l a n e s e 公司采用r h w 催 化剂，在2 0 0 由甘油和合成气反应制备1 ，3 一丙二醇，其副产物是l ，2 1 ，3 丙二醇 和丙醇。d e g u s s a 公司采用以三氧化二铝为载体的磷酸催化剂，3 0 0 。c 将甘油转化 成丙烯醛( 7 0 5 ) 和羟基丙酮( 10 ) 。然后丙烯醛再进行水合制取3 h p a ，最后 3 h p a 通过加氢制得l ，3 1 ，3 丙二醇( 6 0 ) 和1 ，2 1 ，3 丙二醇( 1 0 ) 。这种方法以甘 油为原料，因此并不是化学产生l ，3 1 ，3 丙二醇的好方法。 ( 7 ) 淀粉法 也是一种利用生物技术产生l ，3 丙二醇的方法，是杜邦公司与g e n e r c o r 公司 合作开发的一种产生l ，3 丙二醇的生物技术。他们利用微生物将葡萄搪( 来自谷物 淀粉，如玉米淀粉) 转化为l ，3 丙二醇，目前已申请了多项专利，2 0 0 1 年建成了 1 8k t a 中试装置。化学系统公司认为，实现生物法产生1 ，3 丙二醇将是生物技术 发展中的一个里程碑。 在上述的各种产生方法中，以生物技术制取1 ，3 丙二醇，不但产生成本低廉， 而且还具有化学合成技术不可比拟的优点，即环境污染小、资源可再生利用，专 一性好，产品易分离纯化。因此，采用生物技术制取1 ，3 丙二醇的开发与研究旮 国际上越来越受到关注。 目前，我国已有一些单位进行了1 ，3 丙二醇合成的小试研究。但是其产生成 本较高，产量小，产品主要供于药物中间体而无法应用于p t t 领域 因此，虽然我们在1 ，3 丙二醇的产生开发上做了一些工作，但是整体研究尚 处于起步阶段，特别是在化工合成方面和国外相比差距明显。要在较短的时问内 赶上或超过国外水平，抓住p t t 行业所带来的契机，我们必须着眼于1 ，3 一丙二醇 产生的新技术一生物技术。生物技术产生l ，3 丙二醇，利用可再生资源，环境污 染小代表着传统化工工业转变的方向( 即转向“绿色化工”) 。而且我国微生物资 源丰富，研究手段和国外较为接近。只有在这方面加大开发力度，才能形成具有 自主知识产权的产生技术，参与国际竞争，改变现在l ，3 丙二醇供应状况。 1 2 微生物发酵法产生l ，3 一丙二醇的研究进展 1 2 1 产生1 , 3 一丙二醇的微生物 自1 8 8 1 年f r e u n d 发现巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ) 能发酵甘油产生 1 ，3 丙二醇以来，至今所发现的l ，3 丙二醉生产者均为细菌，主要有肠道细菌中的 4 硕士学位论文 肺炎克雷伯氏菌( k l e b s i e l l ap n e u m o n i a ) 、弗氏柠檬酸杆菌( c i t n o b a c t e rf r e u n d i i ) 及成 团肠杆菌( e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ) ，乳杆菌属的短乳杆菌( l a c t o b a c i l l ib r e v i s ) 和 布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l ib u c h n e r i ) ，梭菌属的丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 和巴 斯德梭菌( c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ) 等t l o d 。7 1 ，它们只能利用甘油而不能由糖类等廉 价碳源直接产生1 ，3 丙二醇。肺炎克氏杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和丁酸梭菌具有较 高的底物转化率和生产强度，因而得到了较多关注。 1 2 2 微生物产生1 ，3 丙二醇的代谢途径 1 ，3 丙二醇是一种典型的甘油发酵产物，在以其他有机物为底物进行的发酵 产物中没有发现。通过分析表明，甘油发酵的一部分产物和糖发酵的产物相同。 这些产物提供菌体生长的能量。在以底物水平磷酸化生成这些产物的同时产生了 许多还原力。还原力能将甘油还原为1 ，3 丙二醇，本身被氧化。但是乳杆菌产生 1 ，3 丙二醇的途径比较特殊，只有一个还原途径，需要另外添加发酵底物以提供 能量和还原力【l 引。 从甘油到丙酮酸的途径在产生l ，3 丙二醇的生物体内都是相同的。微生物厌 氧代谢甘油途径如下图。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶b 1 2 的甘 油脱水酶催化甘油脱水生成3 羟基丙醛：第二步，由1 ，3 丙二醇氧化还原酶催化 3 羟基丙醛还原生成1 ；3 丙二醇【1 9 。2 2 1 。氧化途径中生成丙酮酸的反应在各菌中是 相同的，丙酮酸的去向则因微生物种类而异。在肠道细菌中，丙酮酸被丙酮酸甲 酸裂解酶催化分解为乙酰c o a 和甲酸，甲酸往往又会分解为c 0 2 和h 2 。乙酰c o a 在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的a t p ，而在经乙醛形成乙醇的两步反 应中要消耗2 摩尔还原力。在不控制p h 值的条件下，丙酮酸也可能经q 一乙酰乳 酸产生3 羟基丁醇并最终转化为2 ，3 丁二醇。此外，肠道细菌发酵甘油的产物中 还有乳酸和琥珀酸【2 3 。26 1 。在丁酸梭菌中，有两个典型的氧化途径产物：乙酸和丁 酸。丁酸由两分子乙酰c o a 氧化2 个n a d h 2 后的一连串反应生成，伴随着a t p 的产生【2 7 艺9 1 。在巴斯德梭菌中丁醇成为氧化途径的主要产物，也有少量的乙醇产 生p 。另外，如果假设平均细胞生物量组成为c 4 h 7 0 2 n ，甘油比生物量更为还原， 故细胞生长也可为1 ，3 丙二醇生成提供还原力【2 。 巴氏梭菌高产1 , 3 丙二醇的研究 l 。3 - 嚣：醇 猁魏 戴船 p 芝 卜卜 黼揩 2 ，3 - 了：醪 忑丁簿丁羧 琵1 1 微生物甘油茨氟发酵代诱嬲 营池脱水酶l ，3 一阳氧化还朦酶 嚣油脱氨簿 固铁蛋白氧化还缀璐 丙酾酸税氢酶两酸醴一擎黢裂台鹅 图卜1 微生物厌氧代谢甘油途径 1 2 3 合成1 ，3 丙二醇的关键酶 合成l ，3 丙二醇的关键酶有两个，分别是甘油脱水酶( g d h t ) 和1 ，3 - 丙二醇脱 氢酶( 也称作1 ，3 一丙二醇氧化还原酶，p d o r ) 。另外，甘油氧化途径中的甘油脱氢 6 獯 一 硕士学位论文 酶( g d h ) 与l ，3 丙二醇形成也有很大关系，它影响着甘油转化为1 ，3 丙二醇的转 化率。 甘油脱水酶( g d h t ) ，1 ，3 丙二醇脱氢酶( p d o r ) 和甘油脱氢酶( g d h ) 活性在产 生1 ，3 丙二醇的不同生物体内差别很大1 3 卜3 3 j 。l ，3 丙二醇形成的酶及其基因已经 得到了广泛的研究。对肺炎克氏杆菌代谢甘油的调节机制研究得比较清楚，涉及 到厌氧甘油代谢的系统由d h a 调节子负责，它主要包括甘油脱水酶、甘油脱氢酶、 甘油激酶和l ，3 丙二醇氧化还原酶。编码甘油代谢的酶的基因属于同一个调节子， f o r a g e 和l i n 称其d h a 调节子。其中甘油脱水酶由d h a b c e 编码。1 ，3 丙二醇氧化 还原酶由d h a t 编码。它们属于还原途径，催化l ，3 丙二醇的生成：甘油脱氢酶由 d h a d 编码，甘油激酶由d h a k 编码，它们属于氧化途径；此外还可能存在一个调 控基因d h a r 3 4 4 叭。肺炎克氏杆菌和弗氏柠檬酸杆菌d h a 调节子中的基因己被克隆 和测序，多数基因的功能也已知道。巴斯德梭菌的甘油脱水酶和1 ，3 一丙二醇氧化 还原酶基因也已克隆和测序。d h a t 基因是单个的开放阅读框【4 ，而d h a b c e 由四 个开放阅读框组成，其中三个为结构基因，在肺炎克氏杆菌中称作g l d a 、g l d b 、 g l d c ，在弗氏柠檬酸杆菌和巴斯德梭菌中称作d h a b 、d h a c 、d h a e 4 2 4 4 1 ，它们分别 编码组成甘油脱水酶的“qby ”三种亚基【37 。甘油脱水酶是1 ，3 一丙二醇产生途径 的关键限速酶 4 5 , 4 6 】，在催化过程中很快即被底物甘油失活，而d h a b c e 基因中的 另一个开放阅读框g d r a ( k p n e u m o n i a e 中) 或d h a f ( c f r e u d i i 和c p a s t e u r i a n u m 中) ， 和g d r b ( k p n e u m o n i a e 中) 或d h a g ( c f r e u d i i 和c p a s t e u r i a m 中) 共同编码一个双组 分的甘油脱水酶的激活酶，此酶可以激活被甘油失活的甘油脱水酶【4 7 。4 9 1 。k a j i u r a 等人对此激活酶进行了比较深入的研究并提出了其激活机制【50 1 。 s a i n t a m a n s 等人曾发现丁酸梭菌v p i3 2 6 6 的甘油脱水酶不依赖于辅酶b 1 2 且对氧非常敏感。最近，r a y n a u d 等人对丁酸梭菌v p i1 7 1 8 的1 ，3 一丙二醇调节子 的分子特性进行了研究。令人感兴趣的是，尽管其d h a t 基因与肺炎克氏杆菌、 弗氏柠檬酸杆菌和巴斯德梭菌的d h a t 基因同源性相当高( i d e n t i t y7 6 8 5 ) ，蛋 白同源性( s i m i l a r i t y ) 与巴斯德梭菌更是达到9 2 ，其甘油脱水酶与此前发现的依 赖于辅酶b 1 2 的甘油脱水酶却显然不同，它是不依赖于辅酶b 1 2 的，而且对氧极 其敏感，而此前有人发现肺炎克氏杆菌在微好氧条件下也可将甘油转化为l ，3 丙 二醇【4 5 1 1 。 1 2 4 发酵生产l ，3 丙二醇 ( 1 ) 菌种筛选 在l ，3 丙二醇发酵过程中，细胞的生长受到底物和多种产物的抑制。为了提 高1 ，3 丙二醇产量和底物转化率，必须克服底物甘油、产物1 ，3 丙二醇和其它副 产物对细胞生长的抑制作用。a b b a d a n d a l o u s s i 等人通过亚硝基胍诱变后经过耐 巴氏梭菌高产1 , 3 丙二醇的研究 高渗透压和质子自杀手断筛选的丁酸梭菌突变株可耐受高浓度甘油和高1 ，3 - 丙二 醇，且此突变株的产乙酸途径发生突变。与野生型菌株相比，在补料批式培养 ( f e d b a t c h ) 中甘油消耗提高4 4 以上，最终1 ，3 丙二醇浓度为6 5 9 l ，产量提高 5 0 以上，但发酵时间需8 0 8 5 h 5 2 1 。r e i m a n n 等人利用以上突变株，采用底物甘 油、氯化铵的补加与碱相关联的流加策略，可使f b ( b 料批式培养) 中1 ，3 丙二醇 终浓度达到7 0 9 l ，生产强度达1 4 9 l 1 h ，且发酵时间大大缩短。在连续培 养中，突变株的1 ，3 丙二醇和丁酸产量较野生型菌株有所上升，乙酸产量则有所 下降。但是后来运用了多种方法，试图在上述突变株中得到不产或少产丁酸的菌 株却没有成功。a b b a d a n d a l o u s s i 等人用烯丙基乙醇筛选丁酸梭菌e 5 菌株得到了 丁酸产量下降的突变株，但这些突变株并没有增加1 ，3 一丙二醇产量，氢气产量反 而接近生理最大值【45 1 。m a l a o u i 还发现丁酸梭菌e 5 菌株的烯丙基乙醇抗性突变株 m d 可耐受较高浓度的3 羟基丙醛1 2 。 除了梭菌以外，有关其他菌种诱变筛选的报道很少，但就可达到的1 ，3 丙二 醇浓度而言，克氏肺炎杆菌和梭菌相差不大。由于克氏肺炎杆菌会产生一些诸如 乙醇和乳酸的副产物，且产生的副产物只提供很少或根本不提供还原力，故k p n e u m o n i a 的转化率要低于梭菌。 ( 2 ) 发酵工艺 肠杆菌和梭菌均适合产生1 ，3 丙二醇。用分批、补料分批发酵获得的l ，3 丙二 醇浓度在以上两种类型的生物中几乎相同，产物含量5 5 7 3 ，和乙醇发酵相比 低了很多( 乙醇接近1 5 ) ，却高于丙酮丁醇发酵( 2 5 ) 。两种生物的发酵周期基本 相同，在k l e b s i e l l a 属内，菌株a t c c l 5 3 8 0 有很高的发酵产率【53 。，c l o s t r i d i a 属内， 菌株c b u t y r i c u md s m 5 4 3 1 生长速度最快。延长其他一些梭菌的发酵时间，也可 获得高浓度的1 ，3 丙二醇【5 引。 g u n z e l 在不同规模2 t 和1 2 t 的搅拌和气升式发酵罐中研究了c b u r y r i c u m 的 1 3 丙二醇发酵，结果表明通入的气体种类( 氮气带动二氧化碳，氢气) ，搅拌速 度，发酵规模和类型对l ，3 丙二醇的产生没有明显的影响。从g u z e l 所得的结果 看，工业化大规模产生1 ，3 丙二醇不存在大的问题。气升式发酵罐的成本低，其 应用前景较为看好。 补料分批发酵中，对添加营养物质的方法做了一些改良。s a i n t 用二氧化碳作 为控制参数，r e i m a n n 把k o h 调整p h 和添加营养物质相结合。通过计算控制参 数与营养物质之间比率，以维持稍微过量的甘油浓度，来降低丁酸的含量。而控 制什么样的甘油浓度还有待做进一步的研究1 5 5 5 6 j 。 连续培养技术有助于了解1 ，3 丙二醇形成时产物的组成。从产生角度考虑， 连续培养的生产强度较高，但产物浓度过低，给下游提取增加了困难。m e n z e l 以 0 1 h 一的稀释率连续培养k p n e u m o u i a ，l ，3 丙二醇的浓度可达4 8 9 l ，摩尔转化率 硕士学位论文 为6 3 ，生产强度为4 8 9 l 。1 h 一。但此时要求甘油剩余5 0 9 l 。当甘油过量很 少时，l ，3 丙二醇浓度只有3 3 9 l ，转化率为4 6 ，生产强度为3 3 9 l 以h 。1 【2 引。 b o e n i g k 采用两步连续培养c f r e u n d i i ，第二步稀释率为0 0 5 h 。这种条件下1 ，3 丙二醇的浓度为4 2 9 l ，转化率为6 2 ，甘油剩余1 7 9 l ，但是他的生产强度为 2 1 9 l 。1 h 1 【2 3 1 。低稀释率，补加高浓度甘油的梭菌发酵数据未见报道，但如果 从r e i m a n n 的估算来看，在稀释率为0 2 7 时，l ，3 丙二醇浓度可达2 3 9 l ，转化 率为6 8 ，生产强度6 2 9 l 1 h 。 采用细胞滞留技术可提高甘油发酵的生产强度。p f l u g m a c h e n 和g o t t s c h a l k 用固定化反应器培养c i t r o b a c t e r ，相比1 9 9 3 年b o e n i g k 所采用的搅拌培养，生产 强度翻了一番，但所得的l ，3 丙二醇浓度最大只有1 9 9 l t 5 7 】。r e i m a n n 用错流过 滤技术培养c b u t y r i c u m 也得到了同样的结果。其生产强度是原来连续培养的四 倍，而最大产物浓度只有2 6 9 l ，并未因为回收细胞得以提高【5 5 1 。 在研究发酵的过程中，有三个方面对整个工艺的影响巨大。 第一，3 一羟基丙醛对发酵过程的影响。 b a r b i r a t o 等人( 1 9 9 6 ) 发现，3 羟基丙醛一l ，3 丙二醇产生途径中的中间代谢产 物对细胞生长和1 ，3 丙二醇产生均有抑制。培养成团肠杆菌时，3 羟基丙醛的瞬 间积累即可使细胞生长和1 ，3 丙二醇产生停止。而对肺炎克氏杆菌和弗氏柠檬酸 杆菌，3 羟基丙醛可在发酵终了时完全消耗。3 。轻基丙醛的毒害作用提示我们发 酵时必须不断检测3 羟基丙醛量，以便了解菌体的代谢状态【1 2 , 5 8 】。 第二，蔗糖为辅助碳源的双底物发酵。 甘油作为唯一碳源，厌氧代谢时有两条支路：条是还原支路，利用n a d h 2 产生1 ，3 丙二醇；另一条是氧化支路，产生a t p 和n a d h 2 ，n a d h 2 除了供给菌 体生长之外还供给还原支路合成l ，3 丙二醇。整个过程中消耗在氧化支路上的甘 油降低了摩尔转化率。如果添加葡萄糖或蔗糖来提供氧化支路上的能量、还原力 消耗，那么可能会提高1 ，3 一丙二醇产生时的摩尔转化率。19 9 5 年，h i e b la n dm a r t e n 做了这方面的工作。他们在k p n e o m o n i a 补料批式培养过程中以甘油为底物，流 加葡萄糖作为辅助底物，甘油转化率提高了5 3 4 ，生产强度提高了1 3 9 9 。 a b b a d a n d a l o u s s i 等人【59 】研究了连续培养条件下，丁酸梭菌d s m 5 4 3 l 以葡萄搪 为辅助底物发酵生产l ，3 丙二醇，发现甘油转化率由单独使用甘油时的5 7 提高 到9 2 9 3 。m a l a o u i 和m a n c z a k 用野生型丁酸梭菌e 5 菌株和其烯丙基乙醇抗性 突变株m d 以葡萄搪为辅助底物发酵甘油，l ，3 一丙二醇摩尔转化率分别为8 9 和 8 4 ，和仅用甘油为发酵底物时相比，均有提高【6 0 1 。试验结果也发现葡萄糖或蔗 糖代谢产生的还原力没有完全被产生1 ，3 丙二醇所利用，部分甘油也转化为生物 量和其他副产物，因此l ，3 丙二醇摩尔转化率并没有达到理论最大值1 0 0 。 第三，对k p n e u m o n i a 进行微供氧发酵。 9 巴氏梭菌高产l ，3 丙二醇的研究 k p n e u m o n i a 在厌氧条件下以甘油为底物生长才能形成1 ，3 丙二醇。而在好 氧条件下，甘油激酶可将甘油转化为3 磷酸甘油，再在3 一磷酸甘油脱氢酶作用下 形成磷酸二羟基丙酮直接进入e m p 的途径，参与下一步代谢。因此在好氧条件 下进行甘油发酵时，不能获得l ，3 丙二醇。但是在发酵过程中，菌体的需氧量很 大，如果出现供氧不足则厌氧代谢通路就可以打开，产生1 ，3 丙二醇。修志龙等 首先报道了k p n e u m o n i a 在供氧条件下产生1 ，3 丙二醇的情况，批式发酵时获得 了比厌氧发酵更高的生产强度2 9 4 9 l 。1 h ，补料发酵时最终产量5 9 5 9 l 。但 是供氧会使菌体内n a d h 2 通过呼吸链消耗，降低了还原3 羟基丙醛( 3 h p a ) 的 n a d h 2 供应，对提高1 ，3 丙二醇得率不利，必须控制适当的供氧量【6 1 1 。 ( 3 ) 发酵过程的动力学研究 在1 ，3 丙二醇发酵过程中，细胞的生长受到底物和多种产物的抑制。b i e b l 发现 1 ，3 丙二醇、乙酸、丁酸和甘油对丁酸梭菌细胞生长都有抑制。z e n g 等人通过对 克氏肺炎杆菌和丁酸梭菌的底物和产物抑制现象的研究建立了一个能同时适用于 克氏肺炎杆菌和丁酸梭菌的生长模型，方程如下 2 9 , 6 2 】： = 而东筹麓河川一杀一杀一爰一一每 上式中“。，为最大比生长速率：c + 代表底物或产物的临界浓度，超过此值细胞将停止生长。 、在1 ，3 丙二醇发酵过程中，甘油既是细胞生长的底物，又是潜在的抑制剂。 在甘油过剩的情况下，其比消耗速率随甘油的残余浓度呈s 形饱和曲线变化。产 物1 ，3 一丙二醇、乙酸和a t p 的比生长速率也有类似情况。z e n g 、f o n d 、m e n z e l 等人对用克氏肺炎杆菌和丁酸梭菌进行1 ，3 丙二醇连续发酵的动力学和动态行为 进行研究并针对上述现象提出了过量动力学模型 2 1 , 3 3 】，如下式： 吼吧+ 专+ 埘芒若玄 c s c s + “) 吼矿驴+ 专+ a q a t p m 蔫 c s c s * q q 尸= 聊p + 匕m + a q p r ；二导 c s c s ( 3 ) o s 一。s t n p 这罩c 。，1 1 分别是底物在培养基中的浓度，底物在反应器中的比生长速率。 q 。和q a t p ，q 。分别是底物比消耗速率、能量比消耗速率和产物比生成速率。m 。和 y 。m 分别是底物维持需求量和底物限制条件下最大生长产率。方程( 2 ) 右边最后一 项表示由于底物过量而导致的底物消耗增加量。q 。m 是底物消耗速率的最大增加 值，它取决于营养限制的性质，与生长速率无关。k 。表示底物过量条件下的饱和 常数。m a t p 、m p 、m 。、y a t p m 、y p m 和k p 都是常数，它们的物理意义与方程( 2 ) 中对应的参数