（免疫学专业论文）过氧化氢对血管收缩功能的抑制作用及机理研究.pdf

校的博士、硕士学位定。南开大学拥有在著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。作者暨授权人签字：商茁2 0 1 0 年5 月2 5日南开大学研究生学位论文作者信息论文题目过氧化氢对血管收缩功能的抑制作用及机理研究姓名高戈学号2 1 2 0 0 7 0 8 9 1答辩日期2 0 1 0 年5 月2 1 日论文类别博士口学历硕士团硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口院系所医学院专业免疫学联系电话1 3 8 2 0 6 8 9 7 1 8e m a i ls u p e r a l e r t 1 6 3 c o m通信地址( 邮编) ：天津市南开区卫津路9 4 号南开大学医学院3 0 6 室3 0 0 0 7 1备注：是否批准为非公开论文否注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。南开大学学位论文使用授权书根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库：( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h i m 。本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。作者暨授权人签字：高盔：2 0i o 年s 月玎日南开大学研究生学位论文作者信息论文题目苴氧化氩对血管收缩动耗的押科锥f f j 反机理石姓名高衾i 学号i 乒组p 口7 口8 7 fi 答辩日期i乒o i 。年5 月参f 日论文类别博士口学历硕士函硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口院 系f 所i 臣日哇i 专业i鲁矗丘联系电话e m a i li占“通信地址( 邮编) ：云出吊击卉i 歪卫漳酞号毕酱毒廿六卓医茸降：孑。彳亏3 d 口0 7备注：i 是否批准为非公开论文注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。下进行研究工作所文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：直茁2 0 1 0 年5 月2 5 日非公开学位论文标注说明根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明为空白。论文题目口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0申请密级年)保密期限2 0年月日至2 0年月日审批表编批准日2 0年月口期日丐摘要摘要目的：过氧化氢( h 2 0 2 ) 作为机体内主要的氧化反应的代谢产物可以自由穿过细胞膜，并作为一种信息传递分子在血管内起作用。目前h 2 0 2 对血管作用的体外研究大多数局限于探讨它的瞬时影响，而它的长效作用则报道较少。我们的前期实验表明r o t o r 信号通路抑制剂雷帕霉素( r a p a m y c i n ，r a p a ) 可以保护h 2 0 2 长效处理造成的不可逆收缩功能的丧失，而其机理尚不明确，同时有文献报道h 2 0 2 可以激活r o t o r 信号通路，因此，我们拟对h 2 0 2 对血管收缩功能的影响与r o t o r 通路的关系进行研究，同时探讨h 2 0 2 对血管收缩功能影响的潜在作用机制。方法：通过肌电描记器系统( m y o g r a p h ) 记录各种不同药物对h 2 0 2 长效处理所造成的血管收缩功能丧失作用的影响，同时采用蛋白免疫印记法( w e s t e r nb l o t ) 对各种药物处理后组织中4 0 s 核糖体蛋白s 6 激酶( p 7 0 s 6 k ) 的磷酸化水平和肌球蛋白轻链( m l c 2 0 ) 的磷酸化水平进行检测，并且采用e n z o 公司的钙调神经磷酸酶活性测定试剂盒对钙调神经磷酸酶( c a l c i n e u r i n ，p p 2 b ，c a n ) 的活性进行检测。结果：1 r a p a ( 2 0l x m ) 可以保护h 2 0 2 ( 2 0 0l x m ) 处理3h 造成的不可逆收缩功能的丧失( r a p a + h 2 0 2 ：5 5 5 1 1 7 ( 5 0m mk c i ) ，6 5 3 2 4 1 ( 1l x mp e )v sh 2 0 2 1 3 9 4 8 ( 5 0m mk c l ) ，1 0 4 2 8 ( 1 “mp e ) ，p o 0 5 ，n = 3 ) ：3 h 2 0 2 ( 2 0 0 州) 处理3h 使m l c 的磷酸化水平发生变化，同时r a p a 对这种变化产生了影响( 空白：1 0 0 ；h 2 0 2 ：1 2 4 0 9 ；r a p a + h 2 0 2 ：3 9 7 4 - 8 4 ，0 0 5 ，n = 3 ) ；4 h 2 0 2 ( 2 0 0 t m ) 处理3h 使p p 2 b 的活性发生了变化，同时环孢素a( c i c l o s p o r i n a ，c s a ) 与r a p a 均对这种变化产生了影响( 空白：0 2 5 6 0 0 5 2 ；h 2 0 2 ：0 4 0 2 4 - 0 0 5 9 ；r a p a + h 2 0 2 ：0 2 2 6 4 - 0 0 7 4 ；c s a + h 2 0 2 ：0 1 3 14 - 0 0 2 6 ，p o 0 5 ，n = 3 )1 ) 在h 2 0 2 造成的血管收缩功能丧失过程中，r a p a 能起到一定的保护作用，并且这种保护作用与h 2 0 2 的浓度和处理时间有关，但r a p a 并不能逆转h 2 0 2 造成的血管收缩功能的丧失。2 ) h 2 0 2 并没有激活m t o r - s 6 k 通路，而r a p a 对h 2 0 2 造成血管收缩功能丧失的保护作用也不是通过m t o r - s 6 k 信号通路。3 ) c s a 和f k 5 0 6 均和m p a 一样，对于h 2 0 2 造成的血管收缩功能丧失具有一定的保护作用。4 ) 钙调神经磷酸酶参与了h 2 0 2 引起的血管收缩功能丧失的过程。关键词：过氧化氢雷帕霉素平滑肌收缩钙调神经磷酸酶t h eo x i d a t i o nr e a c t i o ni nv i v ol a y e da l li m p o r t a n tr o l eo nt h eb l o o dv e s s e l sa sa ni n f o r m a t i o nt r a n s f e rm o l e c u l e a tp r e s e n t ，t h es t u d yo fh y d r o g e np e r o x i d eo nt h eb l o o dv e s s e l si nv i t r ow a sm o s t l yi ni t st r a n s i e n ti m p a c t ，b u ti t sl o n gt i m ee f f e c tw a sl e s sr e p o r t e d o u rp r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h em t o rp a t h w a yi n h i b i t o rr a p a m y c i nc o u l dp r o t e c tt h ei r r e v e r s i b l el o s so fc o n t r a c t i l ef u n c t i o nw h i c hw a si n d u c e db yl o n g - t e r mt r e a t m e n to fh y d r o g e np e r o x i d ea n dt h i sm e c h a n i s mw a sn o tc l e a r h o w e v e ri tw a sr e p o r t e dt h a th y d r o g e np e r o x i d ec o u l da c t i v a t e t h er o t o rp a t h w a y t h e r e f o r e ，w ei n t e n d e dt os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em t o rp a t h w a ya n dh y d r o g e np e r o x i d ee f f e c t so nv a s c u l a rc o n t r a c t i l ef u n c t i o n w ea l s od i s c u s s e dt h ep o t e n t i a lm e c h a n i s mo ft h el o s so fv a s c u l a rc o n t r a c t i l ef u n c t i o ni n d u c e db yh y d r o g e np e r o x i d e m 匝t h o d sn l ew i r e dm y o g r a p hw a su s e dt om e a s u r et h er o l eo fd i f f e r e n td r a g sf o rt h ee f f e c to nt h ec o n t r a c t i l i t yo fb l o o dv e s s e lb yh 2 0 2 ，a n dw e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c tt h ep h o s p h o r y l a t i o nc h a n g eo fs 6 ka n dm l c 2 0 t h ep p 2 ba c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e db yc a l c i n e u r i nc e l l u l a ra s s a yk i t r e s u i j s1 r a p a m y c i nc o u l dp r e v e n tt h el o s so fc o n t r a c t i l er e s p o n s e st ok c la n dp e( r a p a m y c i n + h 2 0 2 ：5 5 5 + 11 7 ( 5 0m mk c l ) ，6 5 3 + 2 4 1 ( 1 1 t mp e ) v sh 2 0 2 ：1 3 9 士4 8 ( 5 0m mk c l ) ，1 0 4 + 2 8 ( 1 p mp e ) ，p o 0 5 ，n 叫) 2 h 2 0 2c o u l dn o ti n d u c et h ec h a n g eo fs 6 kp h o s p h o r y l a t i o n ( h 2 0 2 ：9 6 8 + 3 6 2 v sc o n t r o l ：10 0 ，矿0 0 5 ，n = 3 ) 3 h 2 0 2c o u l di n d u c et h ec h a n g eo fm l cp h o s p h o r y l a t i o nw h i c hc a nb ea f f e c t e db yr a p a m y c i n ( c o n t r o l ：1 0 0 ，h 2 0 2 ：1 2 4 + 0 9 ，r a p a m y c i n + h 2 0 2 ：3 9 7 士8 4 ，p o 0 5 ，n 予3 ) 4 h 2 0 2c o u l di n d u c et h ec h a n g eo fp p 2 ba c t i v i t yw h i c hc a l lb ea f f e c t e db yb o t hi i ia b s t r a c tr a p a m y c i na n dc s a ( c o n t r o l ：0 2 5 6 - a ：0 0 5 2 ，h 2 0 2 ：0 4 0 2 - - l 0 4 5 9 ，r a p a m y c i n + h 2 0 2 ：0 2 2 6 - a ：0 0 7 4 ，c s a + h 2 0 2 ：o 131 士0 0 2 6 ，p 0 0 5 ，n 芦3 )c o n c l u s i o n s1 r a p a m y c i nc o u l dp r e v e n tt h el o s so fc o n t r a c t i l er e s p o n s e st ok c la n dp e ，b u tt h i sr o l ew e r ee f f e c t e db yt h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2a n di n c u b a t i o nt i m e 2 i - 1 2 0 2d i dn o ta c t i v a t em t o r - s 6 kp a t h w a y , a n dm o r e o v e r , r a p a m y c i nc o u l dp r e v e n tt h el o s so fc o n t r a c t i l ef u n c t i o nw h i c hi sn o tr e l a t e dt om t o r s 6 kp a t h w a y 3 c s aa n df k 5 0 6c o u l dp r e v e n tt h el o s so fc o n t r a c t i l er e s p o n s e st ok c ia n dp ew h i c hw e r es i m i l a rt or a p a m y c i n 4 c a l c i n e u r i np l a y sar o l ei nt h el o s so fc o n t r a c t i l ef u n c t i o nw h i c hw a si n d u c e db yh 2 0 2 k e yw o r d s ：h y d r o g e np e r o x i d er a p a m y c i ns m o o t hm u s c l ec o n t r a c t i o nc a l c i n e u r i n i v1 i 2h 2 0 2 的血管效应2第二节r a p a m y c i n 与m t o r 通路。21 2 1r a p a m y c i n 21 2 2m t o r 信号通路及其生理学作用。3第三节平滑肌及其收缩机理41 3 1 平滑肌的微细结构和收缩机制41 3 2 平滑肌在功能上的分类51 3 3 平滑肌活动的控制和调节6第四节钙调神经磷酸酶6第二章材料和方法8第一节材料82 1 1 实验动物82 1 2 仪器、试剂8第二节实验方法92 2 1 相关溶液的配制92 2 2m y o g r a p h 132 2 ：；w e s t e r nb l o t 1 52 2 4 钙调神经磷酸酶活性测定1 72 2 4 统计学处理2 0第三章结果21第一节过氧化氢对血管收缩功能的作用2 1第二节基因转录和蛋白合成对过氧化氢所造成血管收缩功能丧失的作用2 2第三节雷帕霉素对过氧化氢所造成血管收缩功能丧失的作用2 2第四节p 1 3 k a k t 对过氧化氢所造成血管收缩功能丧失的作用。2 4v目录第五节p 7 0 s 6 k 磷酸化水平的检测2 5第六节m l c 2 0 磷酸化水平的检测2 6第七节环孢菌素a 和f k5 0 6 对过氧化氢所造成的血管收缩功能丧失的作用2 7第八节钙调神经磷酸酶活性测定2 8第四章讨论2 9第五章结论3 2参考文献3 3致j 谢3 8个人简历3 9v i英文缩略词表英文缩写r a p ac h xa c tds o de a tc s ac a nc a mr o sp 1 3 km 1 o rp ea c hs md o cp m s fn p 4 0几c英文缩略词表英文全称r a p a m y c i nc y c l o h e x i m i d ea c t i n o m y c i nds u p e r o x i d ed i s m u t a s ec a t a l a s ec i c l o s p o r i nac a l c i n e u r i nc a l m o d u l mr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sp h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e sr a p a m y c i na s s o c i a t e dp r o t e i np h e n y l e p h r i n ea c e t y l c h o l i n es m o o t hm u s c l ed e o x y c h o l a t ep h e n y l m e t h y ls u l f o n y i f l u o d d en o n i d e tp 4 0m y o s i nl i g h tc h a i ni中文雷帕霉素放线菌酮放线菌素d超氧化物歧化酶过氧化氢酶环孢素a钙调神经磷酸酶钙调素活性氧家族磷脂酰肌醇3 激酶哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白去氧肾上腺素乙酰胆碱平滑肌脱氧胆酸盐苯甲基磺酰氟化物乙基苯基聚乙二醇肌球蛋白轻链第一章前言第一章前言第一节r o s 家族与h 2 0 2活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 通常包括羟自由基( o h ) 、超氧阴离子( 0 2 ) 、和过氧化氢( h 2 0 2 ) 等具有很强氧化活性的物质，这些物质对多种具有重要生理功能的分子( 如蛋白、脂质和d n a 等) 有毒性作用。1 1 1r o s 与疾病r o s 介导的细胞损伤被认为和许多疾病的发病机制相关，包括心血管疾病中的心肌缺血再灌注损伤、炎症、心肌肥大、动脉粥样硬化和糖尿病的内皮功能失调等。其中，h 2 0 2 被认为是引起血管损伤的首要成份【1 1 ：在生理情况下，由于h 2 0 2 可被过氧化氢酶和过氧化物酶分解为水，所以h 2 0 2 不致浓度过高。但在一些病理情况下，这些酶被大量消耗后，h 2 0 2 的浓度可升高到毫摩尔水平。在对h 2 0 2 进行的大量研究中，人们发现h 2 0 2 浓度远低于此水平的几十至几百微摩尔就可引起血管平滑肌的损伤【2 圳。许多研究发现，包括h 2 0 2 在内的r o s 增多与动脉粥样硬化的形成之间有密切关系【5 棚，研究证明h 2 0 2 可致l d l 氧化生成具很强毒性的o x l d l ，后者被同样由r o s 激活的单核细胞所吞噬；同时激活的单核细胞与内皮细胞黏附并进入内皮下，通过其细胞上的清道夫受体介导，大量摄入脂质变成泡沫细胞，从而引起粥样硬化的形成。在动脉粥样硬化形成的过程中，h 2 0 2 对血管平滑肌细胞的生长具有双重效应：即一方面刺激血管平滑肌细胞的增殖，另一方面又可引起细胞的凋亡。由葡萄糖氧化酶葡萄糖或二乙基马来酸处理后，会引起处理的细胞死亡，而h 2 0 2 是引起细胞死亡的主要r o s ，且证实h 2 0 2 的致细胞死亡作用可能通过其进一步生成羟自由基而介导的【_ 丌。研究发现h 2 0 2 还可增加血管平滑肌细胞中d n a 复合物的含量及细胞的数量( 浓度为2 0 0 t m o l l 时作用最强) ：同时还发现2 0 0l x m o l l 的h 2 0 2 显著增加了细胞中c m y c 和c f o sr n r n a 的含量，这些结果均提示h 2 0 2 在血管损伤后的增殖初期起了重要的作用【8 j 。另外，许多氧化的低密度脂蛋白可引起血管平滑肌细胞的有丝分裂，而此作用可能是由h 2 0 2 所介导的 9 1 。第一章前言1 1 2h 。0 ：的血管效应研究发现经h 2 0 2 预处理后，血管对高钾和q 受体激动剂的收缩反应明显减弱，同时血管对乙酰胆碱的反应性也明显下降【l 们。h 2 0 2 不仅可影响血管对其它舒缩物质的反应性其本身还具有直接的收缩或舒张血管的效应。r u z e n a 曾报道2 0 2 0 0p m o l l 的h 2 0 2 可引起大鼠离体主动脉环产生浓度依赖的收缩【1 1 1 。此外，有文献报道h 2 0 2 可舒张a 受体激动剂预收缩的血管【1 2 j 。但h 2 0 2 对高钾预收缩血管的作用则有不同的报道，w o h n 等【l3 】发现h 2 0 2 可使高钾预收缩的牛肺动脉产生舒张，而i e s a k i 等【1 4 j 贝0 认为h 2 0 2 对高钾引起的血管收缩无舒张作用，且在去内皮的兔主动脉上，h 2 0 2 可使高钾引起的收缩加强。第二节r a p a m y c i n 与m t o r 通路1 2 1r a p a m y c i n雷帕霉素( r a p a m y c i n ) 是一种抗真菌、抗肿瘤的大环内酯药物( 图1 1 ) ，不仅具有较强的免疫抑制作用，还能预防血管形成术( a n g i o p l a s t y ) 后的冠状动脉再狭窄。r a p a 与r o t o r ( m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i n ) 特异性结合后，可抑制某些翻译启动因子，降低蛋白质合成速率，阻止细胞周期的转化。m t o r 的基因突变、m t o r 氨基酸的种类和排列顺序、r o t o r 的蛋白构象以及m t o r 与r a p a 、f k b p l 2 所形成复合物的结构都可影响m t o r 激酶活性。r a p a m y c i n图1 1 ：r a p a m y c i n 的分子结构图2第一章前言1 2 2m t o r 信号通路及其生理学作用哺乳类动物r a p a 靶蛋白m t o r 又称r a p a 相关蛋白( r a p a m y c i na s s o c i a t e dp r o t e i n ，f r a p ) 或r a p a 与f k 5 0 6 结合蛋白1 2 靶蛋白( r a p a m y c i na n df k b p l 2t a r g e t ，r a f t l ) ，是一类脯氨酸调控的丝氨酸苏氨酸( s e r t h r ) 蛋白激酶，属于磷酸肌醇相关激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o lk i n a s e r e l a t e dk i n a s e s ，p i k k s ) 家族成员。作为一种重要的信号传导分子( 图1 2 ) 。m t o r 参与调节多种生化代谢、协调蛋白质的生物合成和降解，如翻译的起始和延长、核糖体的生物合成、氨基酸和a t p 的摄取与利用、以及参与大脑的形成和发育、神经突触的发生、学习和记忆的形成等【”0 7 1 ，在细胞的生存、生长与增殖中起着重要的控制作用。血管内皮生长因子( v e g f ) 、碱性成纤维生长因子( b f g f ) 、血小板源性生长因子( p d g f ) 等许多细胞因子激活磷脂酰肌醇3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3k i n a s ep 1 3 k ) a k t ，活化的a k t 直接磷酸化r o t o r 的s e r 2 4 4 8 和t h r 2 4 4 6 博9 1 。引起真核细胞启动因子4 e 结合蛋1 刍( 4 e b p l ) 、4 0 s 核糖体蛋白s 6 激酶( p 7 0 s 6 k ) 和周期素依赖蛋自激酶抑制物( c l o s ) 家族成员之一的p 2 7 k i p l 等【2 0 。2 6 】的激活及促细胞周期运转因子的过度表达，诱发增殖【2 7 。2 8 】。另外，m t o r 信号通路调控异常与肿瘤发生密切相关，是肿瘤治疗的一个重要靶点。是较在脊椎动物中也构成了除心肌外的大部分内脏肌。虽有如斧足类的闭壳肌和足系牵引肌等是由平行走向长纤维状细胞( 平滑肌纤维) 所构成，但多数的平滑肌则是由长纺锤形( 脊椎动物的内脏肌长不到1m m ) 的单核细胞构成。平滑肌不构成独立的器官，而只是成为体壁和内脏壁的组成部分( 肌层) 。其细胞实质仅由相当于横纹肌的向异性物质组成，整体表现同样的双折射。作为收缩物质的肌动球蛋白与横纹肌大致相同，但含量少，肌动蛋白细丝和肌球蛋白细丝间的相互排列缺乏规律性。平滑肌收缩和舒张的速度较慢，横纹肌每次收缩大约是0 1s ，而平滑肌需要数秒，甚至数十秒。时值( 电刺激时约o 1s ) 和潜伏期( 0 2 1 0s ) 也长，容易产生刺激的总和，认为这是由于缺少肌管系统的缘故。与作为应相性肌和运动肌的横纹肌不同，平滑肌作为紧张性肌和保持肌，其被动的伸展性和主动的缩短度都明显大于横纹肌的，并且经常显示自动的兴奋性。在平滑肌内兴奋的传导有各种形式，有的是通过神经的( 瞬膜) ，有的则是通过肌细胞间传递乃至合体细胞的连接( 子宫) ，但速度常常很低( 2 3c m s ) 。在后一种情况下可以看到有类似于横纹肌峰电位的动作电位产生。受体液支配也是平滑肌的特征之一，在子宫壁和血管壁特别显著( 催产素、肾上腺素等) 2 9 - 3 3 】。1 3 1 平滑肌的微细结构和收缩机制目前认为，平滑肌纤维和横纹肌一样，是以“肌丝滑动 原理进行收缩的。由于每个收缩单位是由粗肌丝( 肌球蛋白) 和细肌丝( 肌动蛋白) 组成，它们的一端借细肌丝附着于肌膜的内面，这些附着点呈螺旋形。肌丝单位大致与平滑肌长轴平行，但有一定的倾斜度。粗肌丝没m 线，表面的横桥有半数沿着相反方向摆动，所以当肌纤维收缩时，不但细肌丝沿着粗肌丝的全长滑动，而且相邻的细肌丝的滑动方向是相对的。因此平滑肌纤维收缩时，粗、细肌丝的重叠范围大，纤维呈螺旋形扭曲而变短和增粗。平滑肌虽然也具有同骨骼肌类似的肌丝结构，但不同于骨骼肌那样平行而有序的排列( 平滑肌的肌丝有它自己的“有序的 排列) 。平滑肌细胞内部的特点是细胞内部存在_ 个细胞骨架，包含一些卵圆形的称为致密体的结构，它们也间隔地出现于细胞膜的内侧，称为致密区，并且后者与相邻细胞的类似结构4第一章前言相对，而且两层细胞膜也在此处连接甚紧，因而共同组成了一种机械性耦联，藉以完成细胞间张力的传递；细胞间也存在别的连接形式，如缝隙连接，它们可以实现细胞间的电耦联和化学耦联。在致密体和致密区中发现有同骨骼肌z带中类似的蛋白成分，故认为这两种结构可能是与细肌丝连接的部位。另外，在致密体和致密区之间还有一种直径介于粗、细肌丝之间的丝状物存在，它们是一种称为结蛋白( d e s m i n ) 的聚合体。这样由丝状物联结起来的致密体和膜内侧的致密区就形成了完整的细胞内构架【3 4 - 3 9 。平滑肌细胞中的细肌丝有同骨骼肌类似的分子结构，但不含肌钙蛋白；同一体积的平滑肌所含肌纤蛋白的量是骨骼肌的2 倍，推测平滑肌肌浆中有大量细肌丝存在，它们的排列大致与细胞长轴平行。与此相反，胞浆中肌凝蛋白的量却只有骨骼肌的1 4 。估计连接在致密体上的3 - 5 根细肌丝会被较少数目粗肌丝包绕，形成相互交错式的排列，这可能就是类似于骨骼肌中肌小节的功能单位。一般平滑肌细胞呈梭形，直径2 - - 5p m ；其长度可变性很大，大约长度为4 0 0 肛m 时是产生张力的最适长度。它们没有骨骼肌那样发达的肌管系统。肌细胞膜只有一些纵向排列的袋状凹入，但其功能尚不清楚，不过这使得细胞膜表面积和细胞体积之比更为加大，因此和肌丝靠近的不是横管或肌浆网系统，而是肌膜。细胞被激活时，细胞外c a 2 + 进入膜内，但平滑肌细胞中靠近膜的肌浆网也构成了细胞内c a 2 + 贮存库。一些兴奋性递质、激素或药物同肌膜受体结合时，通过g 蛋白在胞浆中产生第二信使，引起c a 2 + 库中的c a 2 + 释出。因平滑肌的细肌丝中不存在肌钙蛋白，因而c a 2 + 引起平滑肌细胞中粗、细肌丝相互滑行的横桥循环的机制与骨骼肌不同。目前认为，横桥的激活开始于它的磷酸化，而这又依赖一称为肌凝蛋白激酶的活化；其过程是c a 2 + 先与胞浆中一种称为钙调蛋白( c a l m o d u l i n ) 的特殊蛋白质结合，后者结合4 个c a 2 + 之后才使肌凝蛋白激酶活化，使a t p 分解，由此产生的磷酸基结合于横桥并使横桥处于高自由状态。比起骨骼肌来，平滑肌横桥激活的机制需要较长的时间，这和平滑肌收缩的缓慢相一致【4 删。1 3 2 平滑肌在功能上的分类尽管体内各器官所含平滑肌在功能特性上判别很大，但一般可分为两大类：一类称为多单位( m u l t i u n i t ) 平滑肌，其中所含各平滑肌细胞在活动时各自独l-，第一章前言立，类似骨骼肌细胞，如竖毛肌、虹膜肌、瞬膜肌( 猫) 、以及大血管平滑肌等，它们各细胞的活动受外来神经支配或受扩散到各细胞的激素的影响；另一类称为单位( s i n g l e u n i t ) 平滑肌，类似心肌组织，其中各细胞通过细胞间的电耦联而可以进行同步性活动，这类平滑肌大都具有自律性，在没有外来神经支配时也可进行近于正常的收缩活动( 由于起搏细胞的自律性和内在神经丛的作用) ，以胃肠、子宫、输尿管平滑肌为代表。还有一些平滑肌兼有两方面的特点，很难归入哪一类，如小动脉和小静脉平滑肌一般认为属于多单位平滑肌，但又有自律性；膀胱平滑肌没有自律性，但在遇到牵拉时可作为一个整体起反应，故也列入单位平滑肌。1 3 3 平滑肌活动的控制和调节和平滑肌本身的特性具有多样性一样，它们活动所受的调控也是多种多样的，不象骨骼肌那样单纯。大多数平滑肌接受神经支配，包括来自自主神经系统的外来神经支配，其中除小动脉一般只接受交感系统一种外来神经支配外，其他器官的平滑肌通常接受交感和副交感两种神经支配。平滑肌组织，特别是消化管平滑肌肌层中还有内在神经丛存在，后者接受外来神经的影响，但其中还发现有局部传入性神经元，可以引起各种反射。平滑肌的神经肌接头有些类似骨骼肌，但不具有后者那样特殊结构形式。支配平滑肌的外来神经纤维在进。入靶组织时多次分支，分支上每隔一定距离出现一个膨大，呈念珠状，称为曲张体，其中含有分泌囊泡，它们在神经冲动到达时可以释放其中递质或其他神经活性物质；每个曲张体和靶细胞的距离亦不固定，平均约为8 0 , - - - , 1 0 0n l n ，这说明由神经末梢释放出来的递质分子要扩散较远距离才能达到靶细胞，而靶细胞和神经末梢的关系也不可能是固定的；凡是递质分子可以到达而又具有该递质受体的平滑肌细胞，都可能接受外来神经的影响。平滑肌细胞约保持一5 5 一6 0m v 的静息电位，产生机制和骨骼肌类似。单位平滑肌细胞有产生动作电位的能力，而且通过细胞间通道可使相邻细胞也产生动作电位。第四节钙调神经磷酸酶钙调神经磷酸酶( c a l c i n e u r i n ，c a n ) 又称蛋白磷酸酶p p 2 b ，是一种主要的钙调素( c a l m o d u l i n ，c a m ) 结合蛋白，也是唯一受c a 2 + c a m 调节的丝氨酸6第一章前言苏氨酸蛋白磷酸酶。c a n 在多系统中发挥重要作用，参与多种生物学效应，如在t 细胞活化的信号传导中、在神经递质的释放、突触可塑性方面及在学习记忆、老年性痴呆的发病中均有重要的调节作用。同时c a n 介导的信号通路在心血管的形态发生中起重要作用，并参与心肌肥大及心肌凋亡、血管平滑肌细胞增殖和内皮细胞功能的调节1 4 孓”】。心肌细胞在心肌肥厚因素如a n gi i 刺激下，可通过去磷酸化n f a t 3 再与锌指转录因子( g a t a 4 ) 相互作用，活化多种心肌肥厚的相关基因，最终导致心肌重构【5 2 。5 3 】。研究发现c a n 可能参与醛固酮诱导的心、肺和脑的病变，特别值得注意的是，醛固酮可能作为重要的致病因子通过活化肥大信号分子而参与心、肺、脑组织细胞和血管重构【5 4 5 6 1 。c s a ( c a l c i n e u r i na ，c s a ) 和f k5 0 6 是两种免疫抑制剂，同时它们均为钙调神经磷酸酶的抑制剂。c s a 与f k5 0 6 在机体内分别结合它们各自的细胞内受体c y c l o p h i l i n 与f k b p ，形成结合于c a l c i n e u r i n 的抑制性复合物并阻断磷酸酯酶活性。而f k 5 0 6 的受体f k b p 同时能与r a p a 结合，形成复合物后发挥作用。7第二章材料和方法第二章材料和方法第一节材料2 1 1 实验动物雄性c 5 7 b l 小鼠，体重2 3 + 3 9 ，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。饲养于南开大学医学院动物房，饲养中小鼠自由取用食物和水。实验过程遵循中国国家药品监督管理局生物制品规程( 2 0 0 0 版) 中实验动物和动物实验管理规程( 0 6 0 1 1 5 ) 的规定进行，并参考密西根大学医学院实验动物医学部啮齿类动物的术后医学护理操作规程( m e d i c a lc a r ef o rr o d e n t sf o l l o w i n ga n e s t h e s i aa n d o rs u r g e r y , u n i tf o rl a b o r a t o r ya n i m a lm e d i c i n e ，t h eu n i v e r s i t yo fm i c h i g a nm e d i c a ls c h 0 0 1 ) 。选用实验动物小鼠大鼠配合饲料( l a b o r a t o r ya n i m a l s m i c ea n dr a t sf o r m u l af e e d s ) ，符合中华人民共和国国家标准g b1 4 9 2 4 3 2 0 0 1 。其中常规营养成分、氨基酸、维生素、矿物质和微量元素以及卫生标准皆符合相应国家标准，购自：北京市实验动物研究中心。2 1 2 仪器、试剂2 1 2 1 仪器：仪器名称生产公司w i r em y o g r a p h6 1 0 mc h e m i d o cx r ss y s t e mp o w e r l a b 信号采集分析系统高速冷冻离心机酶标仪手术器械电泳仪及转膜仪液氮容器7 0 。c 冰箱丹麦d m t 公司美国b i o r a d 公司澳大利亚a d i n s t r u r n e n t s 公司德国h e t t i c h 公司美国t h e r m o 公司上海医疗器械有限公司美国b i o r a d 公司山东东亚机电工贸有限公司美国t h e r m o 公司第二章材料和方法一2 0 ，4 冰箱电热恒温水槽电子分析天平中国海尔公司上海精宏实验设备有限公司赛多利斯科学仪器2 1 - 2 2 试剂：1 p 7 0 s 6k i n a s e a 、p - p 7 0 s 6k i n a s e - a 抗体购于美国s a n t ac r u z 公司。2 m l c 2 0 、p - m l c 2 0 抗体c e l ls i g n a l i n g 公司。3 1 3 - a c t i n 抗体购于美国s i g m a 公司。4 雷帕霉素( r a p a m y c i n , r a p a ) 、环孢素a ( c i c l o s p o r i na ，c s a ) 、f k 5 0 6购于美国s i g m a 公司。5 去氧肾上腺素( p h e n y l e p h r i n e ，p e ) 、乙酰胆碱( a c e t y l c h o l i n e ，a c h ) 购于美国s i g m a 公司。6 蛋白合成抑制剂( c y c l o h e x i m i d e ，c h x ) 、基因转录抑制剂( a c t i n o m y c i nd ，a c td ) 购于美国s i g m a 公司。8 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 购于美国s i g m a 公司。9 i - 1 2 0 2 ( 3 0 ) 购于上海凌峰化学试剂有限公司l o 钙调神经磷酸酶( c a l c i n e u f i n , c a n ) 活性测定试剂盒购于瑞士e n z o 公司。2 2 1 相关溶液的配制第二节实验方法2 2 1 1m y o g r a p h 相关缓冲液的配制l xp s s ( 1 0 0 0 m l ) ：溶液1 c h e m i c a lm w ( g m 0 1 )c o n c ( m m o l l )n a c l5 8 4 41 18 9 9k c l7 4 5 64 6 9m g s 0 4 - 7 h 2 02 4 6 4 81 1 79c o n c ( g l )6 9 5 40 3 5 00 2 8 9第二章材料和方法k h 2 p 0 41 3 6 0 91 1 80 1 6 1溶液2 c h e m i c a lm w ( g m o l lc a c l 2 - 2 h 2 01 4 7 0 2溶液3 c h e m i c a ln a h c 0 3e d t ag l u c o s em w ( g m 0 1 )8 4 0 13 7 2 2 41 9 8 7 7c o n c ( m m o l l )2 5 0c o n c ( m m o v l )2 5 0 00 0 35 5 0c o n c ( g l )0 3 6 8c o n e ( g l )2 1 0 00 。0 1 01 0 9 11 按照以上配方分别配制三种溶液，每种溶于约1 0 0m l 双蒸水中，一般情况下需要加热溶液3 以溶解e d t a ；2 将溶液1 倒入带有刻度的试剂瓶中，加入双蒸水至5 0 0 m l ；3 再将溶液3 倒入，再加入双蒸水至溶液总体积约8 5 0 m l ；4 给混合溶液通入9 5 氧气和5 - - 氧化碳的混合气约2 0m i n ；5 然后加入溶液2 ，用双蒸水定容至1 0 0 0m l ，继续通入混合气直至p s s缓冲液的p h 值达到7 4 。2 2 1 2w e s t e r n b l o t 相关溶液的配制10 5mt n s h c l ，p h 6 8 ：1 5 1 4 9t r i s 溶于2 0 0 m l h 2 0 ，浓h c l 调p h 至6 8 ，定容至2 5 0 m l 。21 5m i r i s h c l ，p h 8 8 14 5 4 3 9t r i s 溶于2 0 0 m li - 1 2 0 ，浓h c i 调p h 至8 8 ，定容至2 5 0m l 。31mt r i s - h c l ，p h 7 5 ：3 0 2 9 9t f i s 溶于2 0 0 m lh 2 0 ，浓h c l 调p h 至7 5 ，定容至2 5 0m l 。1 0第二章材料和方法4 蛋白裂解液1 0 m l