（蔬菜学专业论文）转bt基因甘蓝的抗虫性研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰- 5 过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材科，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：付重咻 时间：劢卜年 月夕日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密，商业秘密或申请专年| l 等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：付雪杯 导师签名： 激 签名日期：7 o l 口年6 月罗日签名日期：口2 o 年歹月夕日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 目录 摘要。1 a b s t r a c t ：； 缩略语表5 1文献综述6 1 1 课题的提出6 1 2 抗虫基因的分类及特点6 1 3 抗虫基因工程的进展6 1 4 抗虫基因工程遇到的问题及解决方案8 1 5 叶绿体转化的抗虫基因工程的进展9 1 6 本研究的目的和意义1 0 1 7 本实验的技术路线1 0 2 材料与方法1 2 2 1 甘蓝0 8 j 8 0 再生试验1 2 2 1 1 a g n 0 3 浓度对外植体褐化的影响。1 2 2 1 2 a s 对外植体不定芽分化的影响1 2 2 1 3 6 - b a 浓度对甘蓝再生影响1 2 2 1 4 外植体类型对甘蓝再生影响1 2 2 1 5 苗龄对再生影响1 2 2 2 甘蓝遗传转化1 3 2 3 转基因甘蓝的分子检测1 4 2 4 s o u t h e r nb l o t 检测。1 4 2 5 i u - p c r 检测。1 4 2 6 转基因甘蓝离体叶片的抗虫性试验1 4 3 结果与分析1 5 3 1 不定芽再生1 5 3 1 1 a g n 0 3 浓度对甘蓝外植体褐化抑制效果1 5 3 1 2 a s 对外植体分化不定芽的影响1 5 3 1 3 6 - b a 浓度对外植体再生频率的影响1 6 3 1 4 外植体类型对甘蓝不定芽再生的影响1 7 3 1 5 甘蓝无菌苗苗龄对外植体再生频率的影响1 7 l 致谢。4 1 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 摘要 本实验分别对激素、外植体类型、无菌苗培养时间及硝酸银和乙酰丁香酮浓度等 影响甘蓝0 8 j 8 0 外植体再生的因素进行了研究，建立了甘蓝下胚轴高效再生体系。利 用该再生体系采用农杆菌介导法，将表达不同苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因c r y l a c 、 c r y l c 分别转化甘蓝中甘8 号和0 8 j 8 0 ，获得再生植株。将生根植株置于添加5m g l 卡那霉素的生根培养基上筛选。提取筛选后存活且生长正常的植株的d n a ，以目的基 因为引物，进行p c r 检测，获得扩增出目的基因的植株。以c r y l a c 基因为探针，将 部分转基因植株进行s o u t h e r nb l o t 分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中。提 取转基因植株根、茎、幼叶和成熟叶部位的的r n a ，反转录成c d n a 后，再进行p c r 扩增，通过r t - p c r 实验以检测抗虫基因在转基因植株各组织的表达情况。室内离体 叶片抗虫试验中，观察转基因甘蓝叶片和野生型甘蓝叶片的损害程度，统计幼虫校正 死亡率，平均单虫重，解剖正常死亡和中毒死亡的虫体，观察其肠道的差异。本研究 获得的主要结果如下： 1 建立的甘蓝下胚轴再生体系为：选取6 d 至7 d 苗龄的下胚轴，将其置于m s + 6 - b a2 0 m g l + n a a0 0 5 m g l + a g n 0 35 m g l 的芽分化培养基中，芽分化为丛 生芽，频率高达8 0 。 2 获得的甘蓝再生植株中，转c r y l a c 基因的中甘8 号植株3 6 9 株，转c r y l c 基因 的中甘8 号甘蓝4 1 2 株，转c r y l a c 基因的0 8 j 8 0 7 5 0 株。在不定芽生根过程中， 杂交甘蓝的生根率达到6 0 ，0 8 j 8 0 的生根率约为1 0 ，其中0 8 j 8 0 甘蓝在不 定芽及生根阶段玻璃化很严重。 3 在含有5m g l 卡那霉素的生根培养基中筛选转化植株，获得转c r y l a c 基因的 杂交甘蓝5 株，转c r y l c 基因的中甘8 号甘蓝5 株，转c r y l a c 基因的0 8 j 8 0 甘 蓝3 株。 4 p c r 检测，能够扩增出目的条带的植株中，转c r y l a c 基因的中甘8 号甘蓝4 株，转c r y l c 基因的中甘8 号甘蓝4 株，转c r y l a c 基因的0 8 j 8 0 甘蓝3 株。阳 性检测率超过9 0 。 5 部分转c r y l a c 植株的s o u t h e r nb l o t 结果表明外源基因已经整合到甘蓝的基因组 中。 6 部分转c r y l a c 基因植株的r t p c r 结果显示，c r y l 4 c 基因在转基因植株各组织 呈组成型表达。 7 室内离体叶片抗虫试验结果表明，转基因植株叶片的损害程度较轻，野生型植 株叶片损害严重；啃食转基因植株叶片的小菜蛾在2 4 h 至7 2 h 时期内出现中毒 死亡现象，啃食野生型甘蓝叶片的小菜蛾虫体活泼，7 2 h 后存活的昆虫生活力 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究学位论文 强，且虫体同7 2 h 之前稍大；啃食转基因植株的昆虫校正死亡率超过8 0 ，转 基因植株叶片上昆虫的单虫重同野生型叶片上昆虫的单虫重相比差异显著。解 剖虫体实验结果显示，野生型叶片上死亡的虫体的肠道完整无损，无异常情况， 转基因叶片上死亡的虫体肠道肿胀交粗，呈褐色，有的部位开始腐烂。这些现 象说明研杀虫蛋白能够有效杀死小菜蛾等鳞翅目昆虫。 词：甘蓝；转基因；研；小菜蛾；抗虫性 2 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 a b s t r a c t a ne f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mf o rc a b b a g eh y p o c o t y le x p l a n tw a sd e v e l o p e du s i n g a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c t i o n ss t r a i n se h a 10 5a n dl b a 4 4 0 4r e s p e c t i v e l y v a r i o u sf a c t o r s a f f e c t i n gt h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c ya n ds u b s e q u e n tr e g e n e r a t i o nw e r ei d e n t i f i e d t h ea g e o fs e e d l i n g s ，g r o w t hc o n d i t i o na n ds t a t u so fa g r o b a c t e r i u ms u s p e n s i o n , p r e c u l t u r eo f e x p l a n t s ，6 - b a ，a c e t o s y r i n g o n e a n ds i l v e rn i t r a t eh a das i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo n t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c ya n dp l a n tr e g e n e r a t i o n t h ep r e s e n c eo ft h eb tg e n e si nt h o s e s e l e c t e dp l a n t si nk a n a m y c i nm e d i u mw e r ec o n f i r m e db yp c ra n ds o u t h e r nb l o t t i n g , t h e f r e q u e n c yo fr e g e n e r a t i o nf r o mh y p o c o t y lw a sa n a l y z e d t h er t - p c r w a sd o n et od e t e c t t h eb tg e n ee x p r e s s e di nd i f f e r e n tt i s s u e s l e a fs e c t i o nb i o a s s a y so fi n s e c tr e s i s t a n c es h o w e d t h a tb tt r a n s g e n i cc a b b a g es i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dt h el e v e lo fr e s i s t a n c ea g a i n s tt h el a r v a e o fi n s e c td i a m o n d b a c km o t h t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h es y s t e mf o rr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yo fc a b b a g ew a s 雒f o l l o w s ：t h em e d i u mw a s m s + b a2 0m g l + n a a0 0 5m 鲫l + a gn 0 35m g l ，t h ea g eo fs e e d l i n gw a s6 dt o 7 d ，t h eb e t t e re x p l a n tw a sh y p o c o t y l t h et i m es p e n tb o t ho np r e c u l t u r ea n dc o c u l t u r e p e r i o dw e r e2d a y sr e s p e c t i v e l y a n dt h er e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yw a sm o r et h a n8 0 2 b a s e do nt h eh i 曲f r e q u e n c yt r a n s f o r m a t i o n , m e d i a t e db ya g r o t a c t t e r i u mt u m e f a c i e c i n , 3 6 9p u t a t i v et r a n s g e n i cc r y l a ch y b i r dc a b b a g ep l a n t s ，4 1 2c r y l ch y b i r dc a b b a g e ，7 5 0 c r y l a ci n b r e di n c o m p a t i b l el i n ec a b b a g e sw e r eo b t a i n e d t h er o o t e dr a t i oo fb o t h h y b i r dc a b b a g ea n di n b r e di n c o m p a t i b l el i n ep l a n t sw e r e6 0 a n d10 r e s p e c t i v e l y 3 i ns e l e c t i v er o o t e dm e d i u mc o n t a i n i n g5 m e g lk a n a m y c i n , 5r o o t e dc r y l a ch y b r i d p l a n t s ，5r o o t e dt r a n s g e n i cc r y l ch y b r i dc a b b a g e sa n d3r o o t e dt r a n s g e n i cc r y i a c i n b r e di n c o m p a t i b l el i n ec a b b a g e sw e r eo b t a i n e d 4 t h ep c ra n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a t4c r y l a ca n d4c r y l ch y b r i dp l a n t sa n d3c r y l a c i n b r e di n c o m p a t i b l el i n ec a b b a g e sw e r ec o n f m n e d 9 0 r o o t e ds e l e c t i v ep l a n t sw e r e p o s i t i v e 5 t h es o u t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h et a r g e tc r y l a cg e n ew a si n t e g r a t e di n t o t h ec a b b a g eg e n o m eo fs o m ep u t a t i v et r a n s g e n i cp l a n t s 6 t h er t - p c ra n a l y s i so fs o m ec r y l a ct r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e dt h a tt h ec r y l a cg e n e e x p r e s s e dd i f f e r e n t l yi nr o o t ，s t e m ，y o u n gl e a v e sa n dm a t u r el e a v e st i s s u e s 7 t h eb i o a s s a y so fb tt r a n s g e n i cc a b b a g e sr e s i s t a n tt oi n s e c ti n d i c a t e dt h a ta l lt h e t r a n s g e n i cl e a v e ss h o w e dl i t t l ed a m a g e ( 1o ) ，t h eg r o w t ho fl a r v a ew a ss e v e r e l y i n h i b i t e do nd e t a c h e dt r a n s g e n i cb tc a b b a g el e a v e s ；a n dt h ea v e r a g ew e i g h to fi n s e c t 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究学位论文 o nb tl e a v e si ss i g n i f i c a n t l yl e s st h a nt h eo n e s o nw i l dt y p ec a b b a g e s ；t h ec o r r e c t e d m o r t a l i t yo fl a r v a ei sm o r et h a n8 0 ，s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 a l lt h e t r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e dt h ep a r t i a lt ot o t a lc o n t r o lo fl a r v a e t h ep l a n t sa m o n gt h e t r a n s g e n i cc r y l a ch y b r i dc a b b a g es h o w e dt h es i m i l a rc o n t r o l ，a n dt h ep l a n t sa m o n g t h e t r a n s g e n i cc r y l ch y b r i dc a b b a g e s s h o w e dt h es i m i l a rr e s i s t a n c et ot h e d i a m o n d b a c km o t h , t h ep l a n t sb e t w e e nt h ec r y l a ca n dt h ec r y l ct r a n s g e n i ch y b i r d c a b b a g es h o w e dn od i f f e r e n c ei nr e s i s t a n c et ot h el a r v a e ，y e tt h et r a n s g e n i cc r y l a c p l a n t sb e t w e e nt h eh y b r i dc a b b a g ea n di n b r e di n c o m p a t i b l el i n ec a b b a g es h o w e da l i t t l ed i f f e r e n c ei nl e a v e sd a m a g ea r e a t h ed e a dd i a m o n d b a c km o t h sb o t ho nw i l d t y p ec a b b a g ea n db tc a b b a g ew e r eo b s e r v e du n d e rt h el i g h tm i c r o s c o p y t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h es i z eo fd e a dl a r v a ep l a c e do nw i l dl e a v e sw a sb i g g e rt h a nt h e o n eo nt r a n s g e n i cl e a v e s ；a n dt h em i d g u to fi n s e c t sd i e do nw i l dt y p ec a b b a g e sw a s n o td a m a g e d ，b u tt h eo n e o nt h et r a n s g e n i cl e a v e sw a sa f f e c t e db yt h eb tp r o t e i n yw o r d s ：c a b b a g e ；t r a n s g e n i c ；b t ；d i a m o n d b a c km o t h ；i n s e c tr e s i s t a n c e 4 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 缩略语表 5 抗虫基因中，研基因产生的晶体蛋白对甘蓝等十字花科作物上的鳞翅目害虫有显著的 毒害作用( 喻子牛，1 9 9 0 ；p e r e za n ds h e l t o n , 1 9 9 6 ) ，达到了较好的抗虫效果。故b t 基 因成为十字花科抗虫基因工程育种的首选基因，有着广阔的前景( b o c k 。2 0 0 7 ) 。 1 3 抗虫基因工程的进展 目前，十字花科作物厨基因的转化途径分有核基因组( b h a t t a c h a r y a e ta 1 ，2 0 0 2 ) 和叶绿体基因组两种( b e n d i c h , 1 9 8 7 ) 。前者技术已经成熟，后者处于探索阶段。研 基因的命名有两种分类系统。一种是h o f t e w h i t e l e y 分类系统，另一种是c r i c k m o r e 分 类系统( c r i k m o r ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。已发表的文献中，研基因的命名两种系统均有采用。 1 9 9 0 年代，茄科蔬菜如茄子( c h e ne ta 1 ，1 9 9 5 ) ，烟草( b o u l t e r , 1 9 9 5 ；h u a n ga n d n o r d e n e e n ，1 9 9 7 ) 的抗虫基因工程已经成熟，甘蓝类等十字花科蔬菜的转单价抗虫基因 6 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 已取得一定进展，且抗虫效果明显( d a m g a a r de ta 1 ，1 9 9 7 ；j e p s o ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。如华学 军等( 1 9 9 2 ) 首次成功将研基因导入花椰菜，得到转基因植株，通过s o u t h e r n 检测， 证实历基因整合到花椰菜基因组中，不过当时没有对转化植株进行抗虫检测。毛慧珠 等( 1 9 9 6 ) 通过农杆菌感染法将c r y l 基因转入甘蓝，经s o u t h e r n , n o r t h e r n 和w e s t e r n 杂交分析，c r y l a c 基因已经整合到甘蓝基因组中并且得到表达，生物试验测定对菜粉 蝶幼虫有明显毒杀作用，同时对存活的幼虫生长有抑制作用。c a o 等( 2 0 0 1 ) 将单价抗虫 基因转化结球甘蓝以达到抗虫目的，转基因植株在t o ，t l ，t 2 代对小菜蛾的致死率维 持在9 0 以上，表现出了良好的抗虫性。徐淑平等( 2 0 0 2 ) 将厨基因转化花椰菜，通 过s o u t h e r n , n o r t h e r n 杂交等分子检测，研基因已经整合到花椰菜基因组中，转基因 植株在t o 对小菜蛾有9 0 以上致死率，表现出良好的抗虫性。随着转基因植株代数的 增加，小菜蛾的致死率逐渐下降，体内晶体蛋白的残留量增多，到了t 4 至t 6 代( c a o e t a 1 ，2 0 0 1 ) ，害虫就表现出了明显的抗性。束春娥等( 2 0 0 1 ) 通过用转厨棉花叶子连续 多代饲喂棉铃虫，检测每代存活的棉铃虫体内杀虫蛋白晶体含量，连续检测8 代虫体， 结果显示棉铃虫在连续取食2 代转基因植物后体内的晶体蛋白开始积累，存活的棉铃 虫数目增多，对抗虫转基因植株的抗性增强。由于害虫已在世界范围内对这种杀虫性 晶体蛋白产生抗性( b i r c h - m a c h i n e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，因而有必要采取必要措施来进行抗性管 理( r e s i s t a n c em a n a g e m e n t ，r m ) ( s h e l t o n e ta 1 ，2 0 0 0 ：b w o a d w a ya n dd u f f e y , 19 8 6 ) 来 延缓害虫抗性进化。措施有以下几种。 第一，当害虫对一种晶体蛋白产生抗性时，可以转入除这种晶体蛋白基因之外的 其他基因，以延缓害虫抗性的进化。因为害虫对每种晶体蛋白产生抗性的性状是由害 虫体内的一个或几个隐性基因控制( h e c k e l e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。例如，害虫对c r y ，4 蛋白的 抗性表型是由定位在连锁群7 ( 1 i n k a g eg r o u p7 ) 上的一个隐性基因控制( h e c k e l ，e ta 1 ， 1 9 9 9 ) ，害虫对c r y l c 蛋白的抗性至少由一个隐性基因控制( z h a o e ta 1 ，2 0 0 0 ，2 0 0 2 ) 。而 最近一个图谱研究显示控制昆虫体内对c r y l c 蛋白产生抗性的基因定位于两个分离的 连锁群上( n o s 2 0 和3 0 ) ，该图谱与c r y1 a 图谱不同( b a x t e r , e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。该信息说 明不同类型的研基因的遗传信息不同，产生的晶体蛋白不同，昆虫对不同晶体蛋白之 间也就不会产生交叉抗性，因此转不同基因可以延缓害虫抗性。c a o 等( 1 9 9 9 ) 将改 良过的c r y l c 基因转入青花菜，饲喂对c r y1 a 蛋白和c r y l c 蛋白产生抗性( c r yi 彳r 和c r y i c r ) 的小菜蛾幼虫，发现改良过的c r y l c 青花菜对c r yi a r 型幼虫有1 0 0 致死作用，而对c r y i c r 型幼虫表现出中等抗性。该实验有力证明了昆虫对髓不同类 型基因之间没有交叉抗性，为抗性管理在实际生产中的实施提供了一个依据和方法。 第二，厨基因采用特异性启动子来延缓害虫的抗性，如加强型启动子和诱导型启 动子，诱导型启动子包括伤诱导型( t a b a s h n i k ，1 9 9 7 ，2 0 0 2 ) ，化学试剂诱导性( u k n e s e ta 1 ，1 9 9 3 ) 等。蔡林等( 1 9 9 7 ) 利用加强型c a m v 3 5 s 启动子和c r y ，彳基因的重组 质粒转入甘蓝，获得了抗小菜蛾的转基因甘蓝。s t a c h e l ( 1 9 8 5 ) 采用伤诱导型启动子 7 加，即转基因植株对2 4 代小菜蛾的抗虫性呈下降的趋势。只有第三种组合中小菜蛾的 数量随着繁殖代数的增加而呈现下降的趋势，故第三种组合抗虫效果最佳。这一研究 结果证实应用双价抗虫基因能有效控制害虫抗性的产生。 1 4 抗虫基因工程遇到的问题及解决方案 抗性管理策略的理论认为只要控制害虫对晶体蛋白产生抗性的隐性等位基因的频 率在很低水平，如低于0 o l 时，就能有效延缓害虫的抗性( r o u s e l 9 9 5 ) 。故z h a o 等 ( 2 0 0 3 ) 的第三种模型固然取得较好抗虫效果和有效延缓害虫抗性，但该模型在实际 生产中运作与抗性管理理论相冲突。即为了维持抗性管理策略中敏感等位基因的低频 率，就得要求种植更大规模的非转基因作物，以便让害虫在非转基因作物上完成其生 活史，降低选择压。但在市场销售中，人们对抗虫效果和作物产量及品质的更高要求 需要生产者种植更大面积的抗虫转基因作物。目前两者之间的冲突在实际生产中没有 得到很好解决( s h e l t o nc ta 1 ，1 9 9 1 ，2 0 0 0 ) ，这种抗性管理策略还在试验阶段。 8 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 9 0 年代农药过多的使用导致害虫产生抗性，而2 1 世纪抗虫转基因作物较大面积 的种植也使害虫产生抗性。正如r o u s h 等( 1 9 9 7 ) 所言：研转基因作物无非只是一种 新的杀虫剂或是人们进行抗性管理新的开端。因此r o u s h 等( 1 9 9 4 ，1 9 9 6 ，1 9 9 7 钆b ) 提 出一种抗性管理模型，该模型并非完美无缺，后来一些育种学家针对模型的缺陷不断 完善，并相继提出新的抗性管理模型。 r o u s h 等( 1 9 9 0 1 9 9 7 ) 的模型名为：“高剂量庇护 策略( l l i g h d o s e r e f u g e ) 。 该模型有两个假设作为前提，一个假设是只有对晶体蛋白产生抗性的昆虫纯合子( 即 基因型为r r ) 才能在抗虫转基因作物上生存，另一假设为野生型作物上要有足够数量 的昆虫( 基因型为r r ) ，该昆虫对晶体蛋白敏感，以保证抗性昆虫和敏感性昆虫之间 的交配。由于抗性性状是由隐性基因控制，那么抗虫转基因作物上的昆虫杂合子表现 出对晶体蛋白敏感的症状( 基因型r r ) ，将死亡，从而r 基因随着杂合子昆虫的死亡 逐渐被消除。该模型从本质上消灭了产生抗性的昆虫，从而逐渐消除了产生抗性的隐 性基因。但该模型是在假设的基础上建立，在实际生产试验中，其杀虫效果和模型中 结论会有不符，即当有的昆虫对研毒素表现出的抗性性状是由不完全隐性基因控制 时，该模型就不适用了。 h o k k a n e n 等( 1 9 9 1 ) 提出了陷阱作物策略( t r a pc r o ps t r a t e g i e s ) 。该策略旨在维持 作物品质和产量的基础上，最小程度使用杀虫剂以保存自然天敌。策略内涵是在经济 作物周围种植害虫更偏爱的作物即所谓的陷阱作物，让害虫在其更偏爱的作物上取食 并产卵，完成生活史( b a d e n e p e r e z ，e t a l ，2 0 0 6 ) ，以保证经济作物免遭虫害。十字花 科有两种候选的陷阱作物：羽衣甘蓝( b r a s s i c ao l e r a c e as s p a c e p h a l a ) 和芥菜( i n d i a n m u s t a r d , b ，u n c e a ) 。两者皆能吸引小菜蛾以保护结球甘蓝免遭虫害，从而达到抗虫目 的( s r i n i v a s a na n dm o o r t h y , 1 9 9 7 ；l u t h e re t a 1 。1 9 9 6 ；b e n d e re t a 1 ，1 9 9 9 ；c h a r l e s t o na n d k f i r2 0 0 0 ；m i t c h e l le ta 1 2 0 0 0 ) 。该模型的缺陷是羽衣甘蓝和芥菜对害虫没有毒性，且 羽衣甘蓝宽大叶片有利于害虫产卵，孵化，这样导致田间害虫数量增加。而“死胡同 陷阱作物 模型( d e a d e n dt r a pc r o p s ) 则弥补了“陷阱作物模型”的不足。将抗虫基 因导入陷阱作物，如羽衣甘蓝，这样害虫及虫卵均不能在转基因羽衣甘蓝上存活( t a n g e ta 1 ，1 9 9 9 ；c a oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。如转c r y l a c 基因羽衣甘蓝( e a r l ee ta 1 ，2 0 0 4 ) ，转c r y i a c 及c r y l c 基因芥菜( c a oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 均取得了较好的抗虫效果，且使目标经济作物在 不喷施杀虫剂的前提下免遭虫害。 1 5 叶绿体转化的抗虫基因工程的进展 r o u s h a n d h o k k a n e n 等人的策略理论看似完美，但从环境安全性角度不得不考虑 基因漂移( g e n ef l o w ) 这个问题。羽衣甘蓝是二年生作物，在第一年将其拔掉，避免 越冬春化，不让其开花结籽，这样暂可解决基因漂流这一问题( c a o ，e ta 1 ，2 0 0 8 ) ，由 于拔掉后的羽衣甘蓝没有经济价值，且占用了耕地面积，在大规模商业生产中可行性 9 化不同厨基因于不同甘蓝品种，通过分子检测及室内离体叶片抗虫性试验来鉴定转 基因植株的抗虫性，并比较不同研基因之间抗虫效果的差异，为甘蓝等十字花科蔬菜 鳞翅目昆虫抗虫育种提供理论和实践基础。 1 7 本实验的技术路线 本实验在毛慧珠( 1 9 9 6 ) 、李汉霞( 2 0 0 6 ) 等前人甘蓝转化的实验基础上，通过 设立激素浓度梯度及其它试剂浓度梯度，统计并比较不同浓度配方下外植体分化出芽 频率，从经济成本和实验效率两个方面确定分化培养基最佳配方，以优化甘蓝再生实 验体系。 以该实验建立的高频再生体系为基础，通过农杆菌介导的厨基因的转化获得再 生植株，通过抗生素对转基因植株进行筛选，p c r 等分子检测以确定目的基因是否转 入到甘蓝基因组中。 1 0 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 将转基因植株移栽于田间，观察其田间虫害情况，并通过r t - p c r 检测转基因植 株各器官杀虫蛋白基因的表达情况。 随机选取不同转基因植株的叶片，设三个重复，将叶片剪成约4 c m 的叶盘，每个 培养皿中放3 个叶盘。每叶盘投放1 0 头二龄小菜蛾幼虫，每皿共计3 0 头。分别在2 4 h 、 4 8 h 、7 2 h 等不同时间段观察幼虫对叶盘损害情况，幼虫啃食转基因叶片后的中毒症状， 称量小菜蛾的单虫重，统计昆虫死亡率等。通过这些指标来验证研基因是否具有抗虫 性，并比较不同甘蓝转化材料，不同所基因之间抗虫效果。 外植体预培养基为：m s + 6 - b a2m g l + n a a0 0 5m g l + a g y 0 35m g l + a s 2 0 0i tm o l l ，芽分化培养基为：m s + 6 - b a2m e l + n a a0 0 5m g l + a g n 0 35m g l ， 外植体共培养基为：m s + 6 - b a 2m g l + n a a0 0 5m g l + a g n 0 35m g l 。将不同类型 的外植体：带子叶的叶柄，下胚轴置于上述培养基上，统计不同外植体的不定芽分化 频率。 2 1 5 苗龄对再生影响 芽分化培养基为：m s + 6 - b a2m g l + n a a0 0 5m g l + a g n 0 35m g l ，外植体预 培养基为：m s + 6 - b a 2m g l + n a a0 0 5m g l + a g n 0 35m g l + a s2 0 0i jm o l l ，外 植体共培养基为：m s + 6 - b a 2m g l + n a a0 0 5 m g l + a g n 0 35m g l 。选取不同苗龄 ( d ) ：5 d 、6 d 、7 d 的外植体置于上述培养基上，统计不同苗龄的外植体的芽分化频率。 1 2 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 2 2 甘蓝遗传转化 遗传转化程序如下： 接种：选取饱满的种子用蒸馏水浸泡约半小时，再用7 5 酒精洗涤1 r a i n ，o 1 h g c l 2 震荡洗涤1 5r a i n ，灭菌蒸馏水洗涤3 4 遍，种子接种到1 2m s 培养皿中，2 d 后，将发芽的种子移到1 2m s 接种盒中。1 6 h s h 光照暗，2 5 c 。 预培养：将生长5 7 d 的幼苗取其下胚轴和叶柄切成约0 5 c m 的小段，置于预培养 基上，黑暗条件下预培养2 天。 菌液的培养：用灭菌的牙签挑单茵落于添加过1 0m g lk a m 的l b 液体培养基的 三角瓶中，摇床上过夜培养，约1 6 h ，菌液的o d 值0 3 5 - 0 5 。 浸染：将农杆菌悬浮液倒入灭过茵的培养皿中，将经预培养的外植体切段浸在细 菌悬浮液中，浸染5 m i n ，倒出菌液，取出外植体置于无菌滤纸上将菌液吸干。 共培养：将吸干菌液的下胚轴转移到共培养基上暗培养2 d 。 分化培养：将下胚轴转移到含有5 0 0m g l 头孢霉素c e f ( c e f o t a x i m e ) 培养基上， 以抑制多余农杆菌的生长。每皿放约5 0 个切段，光照培养约1 0 天。直到不定芽出现， 必要时可继代一次。下胚轴一端或两端会出现不定芽，有的是先形成愈伤组织，然后 从愈伤组织上分化出芽，有的直接分化出芽。 生根及筛选培养：将不定芽转到含有1 2m s4 - n a a 0 2m e , l 生根培养基中进行生 根培养，中甘8 号约1 0 d 后生根，0 8 j 8 0 约2 5 d 后生根。切掉生根正常植株的根，将 无根的植株置于含有卡那霉素的生根培养基m s + n a a0 2 m g l + 5m g lk a m 上筛选。 表1 甘蓝遗传转化培养基 t a b l e1 t h ei n g r e d i e n t so fm e d i ai nc a b b a g et r a n s f o r m a t i o n 培养基配方 m e d i a i n g r e d i e n t s 无菌苗培养基 1 2m s + 3 蔗糖+ 琼脂7 4m g l ，p h 5 8 预培养基m s + 3 蔗糖+ 琼脂7 4m g l + 6 一b a2m g l + n a ao 0 5m g l + a g n 0 35 m g l + a s2 0 0um o l l p h 5 8 共培养基 芽分化培养基 生根培养基 筛选生根培养基 l b 液体培养基 m s + 3 蔗糖+ 琼脂7 4m g l + 6 一b a2 m g l + n a a 0 0 5m g l + a g n 0 3 5m g l ，p h 5 8 m s + 3 蔗糖+ 琼脂7 4m g l + 6 - b a2m g r l + n a a 0 0 5m g l + a g n 0 3 5m g ，l + c e f 5 0 0m e c l ，p h 5 8 1 2m s + 3 蔗糖+ 琼脂7 4m e c l + c e f5 0 0m e i + n a a0 2m g l ， p h 5 8 1 2m s + 3 蔗糖+ 琼脂7 4m g l + c e f5 0 0m e t , + n a a0 2m g l + k a m5m g t p h 5 8 蛋白胨1 0g 几+ 酵母提取物5g l4 - 氯化钠1 0g l ，p h7 0 因引 0 | lg 作进 r n a ， 文之 术有 基因 计算 小菜蛾幼虫校正死亡率( ) = ( 处理组死亡率对照组死亡率) ( 1 对照组死亡率) x 1 0 0 1 4 _一i一 转b t 基因甘蓝的抗虫性研究 3 结果与分析 3 1 不定芽再生 3 1 1 a g n 0 3 浓度对甘蓝外植体褐化抑制效果 以甘蓝0 8 j 8 0 无菌苗下胚轴和叶柄为外植体，以m s 为基本培养基，分别添加0 、 2 5 、5 、7 5m g l 四种浓度的a g n 0 3 ，比较不同浓度a g n 0 3 对不定芽的分化频率影响。 结果显示甘蓝外植体在不同a g n 0 3 浓度下的分化频率为1 - 1 0 0 。不添加 a g n 0 3 ，外植体分化频率最低，几乎不出芽，2 5m g l 与5m g l a g n 0 3 浓度下的外植 体分化频率有显著差异，5m g l 和7 5m g l a g n 0 3 浓度下分化频率无明显差异，均高 达1 0 0 。叶柄在不同浓度a g n 0 3 的培养条件下，分化频率有显著差异，变化幅度在 2 7 5 之间，结果见图1 。 图1 硝酸银浓度对甘蓝外植体褐化抑制效果 f i g 1e f f e c t so fs i l v e rn i t r a t ec o n c e n t r a t i o n so nt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y 3 1 2 a s 对外植体分化不定芽的影响 在设置的0 、5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、2 5 0a s ( um o l l ) 六个浓度处理中，观察和 统计甘蓝外植体不定芽分化的数目和频率( 见图2 ) 。结果显示m s 再生培养基中添加