（发酵工程专业论文）野木瓜总皂苷的分离纯化及抗氧化活性研究.pdf

2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 中文摘要 野木瓜( s t a e n t o n i a c h i n e n s i s ) 属蔷薇科( r o s a c e a e ) 木瓜属( c h a e n o m e l e s ) 植物，是贵州省正安县的特色资源。野木瓜含多种有机酸、氨基酸、蛋白质、 维生素和矿物质等元素，并富含三萜皂苷、多糖、黄酮、s o d 等活性物质， 是一种药食两用的天然植物，在临床治疗及保健功能上均具有广泛的应用价 值。目前对野木瓜的研究主要集中在普通保健食品的开发上，有效成分提取 纯化和活性方面的系统研究尚未见报道本论文通过对野木瓜三萜皂苷进行 分离纯化的工艺研究及体外抗氧化活性的试验，建立了野木瓜总皂苷的含量 测定方法，提出了适宜于野木瓜总皂苷提取及纯化的最佳工艺条件，并对其 体外抗氧化活性作了初步的探索。主要研究内容和结果如下； 1 野木瓜总皂苷的含量测定 选用齐墩果酸为标准品，采用分光光度法，以5 冰乙酸香草醛溶液和 高氯酸为显色剂，在5 4 5n l n 处测定吸光度。以齐墩果酸标准溶液浓度为横坐 标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，经计算得回归方程y = 0 0 4 6 6 7x + o 0 8 0 2 5 ( r = 0 。9 9 9 4 ) ，方程在4 2 8u e m l 范围内线性关系良好，以此计算野木瓜 中总皂苷的含量。经方法学实验结果显示，在1h 内吸收值稳定，r s d 为0 7 8 ；精密度和重现性良好，r s d 分别0 6 6 和1 4 1 ；平均回收率为1 0 2 2 1 ( n = 5 ) ，r s d 为2 2 3 。表明本法简便灵敏，重现性良好，方法可靠，可作 为野木瓜总皂苷的定量方法。 2 野木瓜总皂苷浸提条件的优化 以乙醇为提取溶剂，采用浸提法来考察影响野木瓜总皂苷提取率的因素。 在单因素实验的基础上，用正交实验确定了最佳的提取条件。结果表明，以 7 5 乙醇为提取溶剂，料液比1 ：1 5 ，提取温度为7 0 ，时间为6 0r a i n ，p h 值为7 时总皂苷的提取率最高 3 野木瓜总皂苷纯化工艺的优化 采用d l o l 大孔树脂柱( r 1 5x i - 1 2 0 0 姗，干树脂质量4 0 0 0g ) 分离纯化 野木瓜总皂苷，最佳的吸附参数是：上样液浓度8 8 6m e n a t , ，流速lm l m i n ， p h 5 左右，最大进样体积不超过1 8r i d , 最佳的洗脱条件是：先用1 0 0m l 蒸 馏水洗去杂质，再用1 0 0m l5 0 乙醇洗脱野木瓜总皂苷，洗脱流速l ，5 m l m i n ，收集5 0 乙醇洗脱部分研究结果表明，未纯化前总固物中总皂苷 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 的含量为3 3 5 ，纯化后总固物中的野木瓜总皂苷含量为6 0 3 ，精制度达 1 7 9 2 ，且洗脱率达8 0 以上。从精制度、纯化率等方面考虑，该工艺适宜 于野木瓜总皂苷的分离及纯化。 4 野木瓜总皂苷抗氧化活性的初步研究 体外抗氧化活性实验表明，野木瓜总皂苷具有清除羟自由基和超氧阴离 子自由基的能力。且清除能力与样液浓度呈量效关系，其中对羟基自由基的 能力较强，而对超氧阴离子的清除能力不及同浓度的v c 能力强。 关键词：野木瓜；总皂苷：提取；纯化；抗氧化能力 v 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文野术瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 a b s t r a c t y e m u g u a , as p e c i a l i z e dr e s o u r e o fz h e n g a nc o u n t yi ng u i z h o up r o v i n c e , b e l o n g st o r e s a c e a cc h a a n o m e i s e sp l a n t i ti m p l i e sv a r i o u so r g a n i ca c i d s ，a m i n oa c i d s ，m i n e r a l s , v i t a m i n s , t r a c e e l e m e u t s , a n dc o n t a i n ss o m ea c t i v es u b s t a n c e ss u c ha st r i e r p e n o i ds a p o n i n s , f l a v o x a t e ，p o l y s a n c h a r i d e s ，s o d ，a n ds oo n b e i n ga n a t u r a lp l a n tu s e da sb o t hm e d i c i n e sa n d f o o d s ，i th a sb e e na p p l i e dw i d e l yo nc l i n i c a lt r e a ta n dh e a l t hp r o t e c t i o n a tw e s e n t , t h e r e s e a r c ha i m e dt oy e m u g n ai sc o n c e n t r a t e dm a i n l yo ne x p l o i t a t i o no fc o m m o nf o o d ，a n d s y s t e m a t i cr e s e a r c ho ne x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o nf o ri t sa c t i v es u b s t a n c er e m a i n su t u e p o n e d t h ea r t i c l es t u d i e dm a j o r l yt e c h n o l o g yc o n d i t i o n so fe x t r a c t i n ga n dp u r i f y i n gt o t a ls e p o n i n s , e s t a b l i s h e dc o n t e n td e t e r m i n a t i o nm e t h o do ft o t a ls a p o n i n sf o ry e m u g u a , p o s e dt h eb e s t t e c h n o l o g yp a r a m e t e r ss u i t a b l et oe x t r a c ta n dp u r i f yf o rt o t a ls a p o n i n s i na d d i t i o n , s t u d i e d i n i t i a l l ya n d 丽酣o i li t s a n t i o x i d a n tc a p a b i l i t yo u t s i d e b o d y t h er e s e a r c hw o r ka n d e x p e f i m c n tr e s u l t sa i ea sf o l l o w s ： 1 c o n t e n td e t e r m i n a t i o nm e t h o do f t o t a ls a p o n i mf o ry e m u g u a b ys e l e c t i n go l e a n o l i ca c i d 笛c o n t r o la r t i c l e c o l o m t i n gw i t h5 v a n i l l i n - c h 3 c o o h a n dh c l 0 4 ，d e t e r m i n e da b s o r b a b i l i t yi nt h ep o 缸o f 5 4 5 n mw 弛u l t r a v i o l e t - v i s i b l ea b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p ya n dc a l c u l a t e dt o t a ls a p o n i nc o n t e n to fy e m u g u a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e m e t h o d i s l i n e a r i n t h er a n g e o f 2 0 。1 4 0 u g ( r - 0 9 9 9 4 ) ，a b s o r b a b i l i t ys t a b i l i t y w i t h i n l l l , r s d 0 7 8 ，m o r e o v e x , t h ea v e r a g er e c o v e r y1 0 2 2 1 ，r s d2 2 3 睁5 ) t h ec o n c l u s i o ni st h a t t h em e t h o di ss e n s i t i v ea n dr e l i a b l e , w h i c hm a yb eu s e df o r t h eq u a l i t yc o n t r o lo f y e m u g u a 2 t h eo p t i m i z a t i o no f e x 缸a c t i o nc o n d i t i o mf o r t o t a ls a p o n i mo f y e m n g u a i n f l u e n c ef a c t o r sa b o u te x t r a c t i o nr a t i oo ft o t a ls a p o n i n sh a db 嘲s t u d i e db ys e l e c t i n g a l c o h o l 嚣s o l v e n t a n d t a k i n g m e t h o d o f i m m e r s i o n t o w i t h d r a w o b t h e b a s i s o f s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t , u s e do r t h o g o n a ld e s i g nt oc o n f i r mt h eb e s t e x t r a c t i o np a r a m c t e m a sar e s u l t , w h e na l c o h o ll e v e l7 5 ，s o l i d - l i q u i dp r o p o r t i o n l ：1 5 ，t e m p e r a t u r ea n dt i m er e s p e c t i v e l y7 0 a n d6 0 m i n , t h ee x t r a c t i o nr a t i o 啪r e a c ht ot h eh i g h e s tl e v e l 3 t h eo p t i m i z a t i o n o f p u r i f i c a t i o n p r o c e s s f o r t o t a ls a p o n i a s o f y e m u g u a t ou s ed t mm a c r o p o r o u sr e s i n ( c o l u m ns p e c i f i c a t i o n ：r 1 5x1 - 1 2 0 0m m 。r e s i n w e i g h t ：4 0 0 0g ) f o rp u r i f y i n gt o t a ls a p o n i n so f y e m u g n a , t h eo p t i m a la d s o r p t i o nc o n d i t i o m w e r ec o n c e n t r a t i o no ff e e d8 8 6 m g m l , f e e d i n gr a t e1m l m i n , p hv a l u e5 。t h el i m i t e df e e d v l ! 塑! 旦堡圭堡壅竺兰些笙茎 墅查墨璺皇堇塑坌堡丝垡墨适丝堡塞 v o l u m e1 8 m l t h eo p t i m a ld e a d s o r p t i o np a r a m e t e r s 、v e f ea l c o h o lc o n c e n t r a t i o n5 0 e l u t i o nv o l u m eb o t ho fw a t e ra n da l c o h o lw e r e1 0 0m l ，e l u t i o nr a t e1 5m l m i n ，t h e nt h e p a r te l m e db y5 0 a l c o h o lw e r eg a t h e r e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt o t a l s a p o n i n so fy e m u g u ai nt h es o l i de x t r a c tc o u l dr e a c h6 0 3 w e l la b o v eu n p u d f i e do f3 3 5 ，t h er e f i n er a t i oa n de l a t i o nr a t i or e a c h e dr e s p e c t i v e l y1 7 9 - 2 a n da b o v e8 0 ，o nt h e w h o l c t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sa 他s u i t a b l ef o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f t u t a is a p o n i n si n y e m u g u a 4 i n i t i a lt r i a lo na n t i o x i d a n tc a p a b i l i t y o u t s i d eb o d y t h ee x p e r i m e n ts t u d i e di n i t i a u yt h ec a p a b i l i t yo ft o t a ls a p o n i n si ny m u g u at oc l e a r h y d r o x y lf r e er a d i c a l ( o 田p r o d u c e db yf e n t o nr e a c t i o na n dt oc l e a rs u p e r o x i d ea n i o n ( d j ) t h er e s u l t sm a n i f e s t e dt h a tt h ec a p a b i l i t yt oc l e a rh y d r o x y lf r e er a d i c a l ( o 哟w 秘 s t r o n g e r t h a n t o c l e a rs u p e r o x i d ea n i o n ( d ：) 1 畸w o r d s ：y e m u g u a ；t o t a ls a p o n 雌；e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n ：a n t i o x i d a n tc a p a b i l i t y i 附：学位论文原创性声明和关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是泰人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文储弛取娟 日觏t 2 哨年6 羚 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；苓人授权贵州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 签名靴臌：裂帆 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 1 三萜皂苷化合物研究现状 前言 我国幅员辽阔、资源丰富，有很多具有巨大经济价值和应用价值的药用植物 资源。几个世纪以来，天然产物尤其是高等植物的代谢产物一直是人类获得药物 的来源。在发展中国家，植物是药品的主要来源，世界上有3 0 的人口主要依 赖于植物和植物提取成分来维护生命和健康，即使在美国，也有1 2 0 种以上重要 的处方药来源于植物，大约占美国药物总用量的2 5 纠翻。天然药物在保障人类健 康方面所发挥的作用越来越得到科学家的重视。在中国，天然药物又称为中草药， 它与中医一起构成中华民族文化的瑰宝，也是全人类的宝贵遗产以中草药或其 他动植物、微生物和海洋生物为主要研究目标的天然产物化学工作，已经成为我 国寻找新药的重要研究途径。 天然药物之所以能够防病治病，其物质基础在于所含的有效活性成分。因此， 寻找活性成分一直是资源植物化学及天然产物化学研究的主流，其研究内容主要 是对天然产物进行化学成分的提取分离、结构鉴定。并且结合药理学研究以筛选 具有活性的次生代谢产物 彻纰叫m e t a b o l i s ms u b s t a r t c e ) ，如生物碱、蒽醌、黄 酮、皂苷、挥发油、有机酸、鞣质等等 2 1 这些次生代谢产物是重要的药物来源。 对这些活性成分进行化学结构、理化性质与生物活性方面的研究，可逐步阐明其 防病治病的原理，并为寻找新药物、新药源或开发利用对国民经济有价值的资源 打下良好的基础，同时可探索中草药加工工艺，改进药物剂型，控制中药及其制 剂的质量，提高临床疗效等等网 皂苷是存在于植物界的一类比较复杂的化合物，广泛分布于蔷薇科、石竹科、 无患子科、薯预科、远志科、天南星科、百合科、玄参科。豆科、五加科等植物 中嘲。因其水溶液振摇时能产生大量持久的蜂窝状泡沫，与肥皂相似，故名皂苷。 近年来，随着分离纯化技术及结构测定方法的进步，皂苷的化学研究取得了重大 突破，其生理和生化功能也得以不断揭示，在临床医学和营养保健方面得到了越 来越广泛的应用 1 1 皂苷的分类和理化性质 1 1 1 分类 ( 1 ) 按照皂苷元的化学结构不同，可分为甾体皂苷和三萜皂苷甾体皂苷是 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 由甾体皂苷元和糖组成，其基本碳架为螺旋甾烷及其异构体异螺旋甾烷。三萜皂 苷由三萜皂苷元和糖组成，基本碳架是6 个异戊二烯单位，由3 0 个碳原子构成。 ( 2 ) 按照皂苷分子中糖链数目的不同，可分为单糖链皂苷( 只含1 条糖链) 、 双糖链皂苷( 含有2 条糖链的皂苷) 和三糖链皂苷( 含有3 条糖链的皂苷) 等。 ( 3 ) 按照皂苷分子中是否含有酸性基团( 如羧基) ，可将皂苷分成中性皂苷 和酸性皂苷。 1 1 2 理化性质 ( 1 ) 性状：皂苷的分子量较大，不易结晶，大多为白色或乳白色无定形粉末， 仅少数为晶体皂营多无明显的熔点，一般测得的是分解点。多具有苦、辛辣味， 其粉末对人体各部位的粘膜有较强的刺激性。大多数甾体皂苷属于中性皂苷，而 多数三萜皂苷属于酸性皂苷 ( 2 ) 溶解性：大多数皂苷极性较大，易溶于水和醇类，难溶于丙酮、乙醚等 非极性溶剂。皂苷水解成次皂苷后，在水中的溶解度随之降低，易溶于中等极性 的醇、丙酮、乙醚。皂苷完全水解后生成的皂苷元则不溶于水，而溶于石油醚、 苯、乙醚、氯仿等低极性溶剂。皂苷有一定的助溶性能，可促进其它成分在水中 的溶解。 ( 3 ) 表面活性：皂苷有降低水溶液表面张力的作用，多数皂苷的水溶液经强 烈振摇能产生持久性的泡沫，并不因加热而消失。而含蛋白质和粘液质的水溶液 虽也能产生泡沫，但不能持久，加热后很快消失 ( 4 ) 溶血性：皂苷的水溶液大多能破坏红细胞，产生溶血现象皂苷溶血作 用的有无与皂苷元有关，溶血作用的强弱则与结合的糖有关。单糖链皂苷溶血作 用一般较显著：双糖链皂苷，尤其是中性三萜类双糖链皂苷溶血作用较弱或没有 溶血作用；酸性皂苷的溶血作用介于二者之间。 ( 5 ) 水解性：皂苷苷键的裂解，可采用酸催化水解、氧化开裂、酶解等水 解条件剧烈时，一些皂苷元往往会发生脱水、环合、双键移位、取代基位移、构 型转化等，生成次生产物。着想得到皂苷元，需选用温和的水解方法。 1 2 三萜皂苷的结构及生理功能 1 2 1 结构 三萜皂苷的皂苷元为三萜类衍生物，其基本骨架由6 个异戊二烯单位、3 0 个 2 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 碳原子的皂苷元和各种糖和糖醛酸构成。组成皂苷的糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖、 半乳糖、鼠李糖、木糖及其它戊糖类。糖醛酸主要有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。 其中，葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖醛酸是最常见的直接与皂苷元相连的单 糖。皂苷中的糖链为链状或分枝状，共包含一至十余个单糖单元，每个糖支链通 常由2 5 个单糖残基组成。单皂瞢( m o n o d e s m o s i d i cs c q n i n s ) 只有一条糖链， 且该糖鞋通常连于皂苷元的3 一羟基氧上；双皂苷( b 函d e s m o s i d i es a p o n i r 西) 具有 两条糖链，分别以醚键连接予皂苷元的c 一3 位及以酯键连于c 一2 8 或c - - 2 6 上； 三皂苷( t r i d e s m o d d i cs a p o n i n s ) 具有三条糖链，极少见。植物体内有与皂苷共存 的酶，可将单皂苷的糖链缩短，或使双皂营水解成单皂苷，这些经酶解产生的苷 叫次级苷。 根据皂苷元的结构，三萜皂苷又可分为四环三萜皂苷和五环三萜皂苷两大类。 ( 1 ) 四环三萜皂苷类的常见结构类型有羊毛脂甾烷( 1 a n o s t a n e ) 型、大戟烷 ( e u p 觑t n e ) 型、葫芦素烷( c u c u r b i t a n e ) 型等。结构如下图所示 羊毛脂烷 大载烷葫芦烷 ( 2 ) 五环三萜皂苷类的常见结构类型有齐墩果烷型( 又称1 3 一番树脂烷型， 皂萤元以齐墩果酸为多见) 、乌索烷型( 又称。一香树脂烷型或熊果烷型，皂苷元 以熊果酸( 乌索酸) 为多见) 、羽扇豆烷型( 常见皂萤元有自桦脂醇和自桦脂酸) 等五环三萜皂苷中作药用的又以齐墩果烷型分布最广，研究最多洲 ， 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 齐墩果烷( o l e o n a n e ) 型，又称d 一香树脂烷( f l - a m y r a n e ) 型。此类化合物在植 物界分布极为广泛，主要分布在豆科、五加科。其基本碳架是多氢蒎的五环母核， 环的构型为a b 环、b c 环、c d 环均为反式，而d e 环为顺式。母核上有8 个甲 基，其中c 。艮c 。上的甲基均为p 一型，而c “上的甲基为旷型，c 位和岛位各 有二个甲基。分子中还可能有其他取代基存在，例如羟基、羧基、羰基和双键等 一般在g 位有羟基，而且多为旷型，也有旷型，如旷乳香酸( t r - b o s w e l l i c a d 口。 若有双键，则多在c 。位或c 。位；若有羰基，则多在c - 位；若有羧基，则多在、 c ，o 或位上结构如下图所示 齐墩果烷 h 齐墩果酸 h 乌苏烷( 砒姗功型又称* 香树脂烷( 删彻嘲型或熊果烷型。其分子结构与齐 墩果烷型不同之处是e 环上两个甲基位置不同，即在c 1 9 位和c 2 0 位上分别各有一 个甲基。乌苏酸( u r s o l i ca c i d ) 又称熊果酸，是乌苏烷型的代表性化合物。 羽扇豆烷型( 1 u p a n e ) 与齐墩果烷型不同点是c 2 i 与c 1 9 连成五元环e 环，且d e 环的构型为反式。同时，在e 环的1 9 位有构型的异丙基取代，并有2 0 ( 2 9 ) 双键。 。 1 2 2 皂苷的生理功能 皂苷的生理活性与其结构有着密切的关系研究表明，已有的研究显示，苷 元结构对皂苷的生物活性起决定性作用刘美正等t m 分析y 近千种中草药和药用 植物有效化学成分与药效之间的关系。发现含萜类皂曹的中草药主要用于清热解 毒，消肿散结。具有升阳作用，如人参、刺五加、升麻、黄芪等：而含甾类皂苷 的中草药则主要用于平喘止咳。滋阴润燥，具有强心和养阴作用。如麦冬、洋地 黄、党参等。糖链在皂苷生物活性方面也起着重要作用通过改变糖链结构可以 克服强心苷应用的局限性如将氨基糖取代洋地黄毒苷的糖链，皂苷的活性增大 了3 倍，而中毒指数降低了4 倍将地高辛 g 甜柳的1 6 位甲基化，得到的甲基 4 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 地高辛毒性较小，安全性增大，起效快，口服吸收率高。已有的研究表明，皂苷 中苷元改变其药理活性和生物活性也随之改变，而具有细胞识别能力的糖链则只 能调控皂苷的生物活性大d , t 3 7 鲍5 0 j 3 1 。 越来越多的研究表明，皂苷具有广泛的药理作用和生物活性如免疫作用、抗 肿瘤、抗炎抗病毒、抗氧化、抗诱变、调节血糖血脂等，而且还可以作为食品天 然甜昧剂、保护剂发泡剂、增味剂、抗氧化剂等。 1 2 2 1 抗癌活性 s a s h i d a 和m i n a k i 从百合科植物o r a i t h o g a l u ms a s u n d e r s m c 中分离出一种皂苷 o s w - - 1 ，这个化合物对人的正常细胞几乎没有毒性，而对恶性肿瘤细胞具有强 烈毒性体外生理活性实验表明，它的抗癌活性比目前应用的抗癌药物如顺铂、 紫杉醇等高1 0 0 倍，有望成为一类新的抗癌药物从生长在中国的三七( p t m a x n o t o g y n s e n g ) 根部提取的皂苷混合物中，人参皂苷r g l 含量比其它三七品种高1 0 倍，而生理活性测试证明，人参皂苷r g l 对小鼠皮肤癌具有非常强的抑制作用鲫。 对人参提取物抗癌活性的实验证明，人参提取物可以预防治疗食道癌、胃癌、肺 癌、肝癌等多种癌症。特别是人参皂苷r h 2 有较强的抑制肿瘤细胞生长作用。进 一步研究表明，人参皂苷的抗肿瘤作用机制可概括为3 个方面，( 1 ) 提高机体免疫 系统抑制癌细胞生长，( 2 ) 使癌细胞再分化逆转成非癌细胞，( 3 ) 直接杀灭癌细胞 瞪i 蛔。 1 2 2 2 抗氧化活性 近年研究表明，皂苷大多具有明显的抗氧化作用，已知氧化损伤与许多病理 生理现象如衰老、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等有关。皂苷类的抗氧化作用 则可能是其延缓衰老，抗动脉粥样硬化，抗缺血再灌注损伤等药理作用的共同作 用机制。喻正坤等彻从黄芪中分离出的皂苷具有淬灭氧自由基的作用，据此解释 了黄芪为什么对老年性心血管疾病具有良好的疗效王先远等 6 1 对苦瓜皂苷的实 验表明，苦瓜皂苷具有良好的抗氧化功能，可显著增强超氧化物歧化酶( s o d ) 和谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - - p x ) 的活力傅耀文等阁对人参总皂苷的研究表 明，人参总皂苷能清除肾缺血再灌注损伤产生的氧自由基( o f r ) ，保护内源性s o d 活性，减轻肾脂质过氧化损伤。王银萍等 9 1 实验表明。大豆皂苷能减轻自由基对 细胞的损伤，增加s o d 的含量，降低脂质过氧化物浓度，消除自由基等又如酸 枣仁总皂苷可提高s o d 活性，具有抗脂质过氧化作用，t t , 0 肌缺血，可抑制动脉 粥样硬化的形成和发展，对缺血性脑损伤有保护作用等【1 1 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 1 2 2 3 增加机体免疫力 b c r c k 等人i 删发现，人参皂苷r c 和r d 能促进t 细胞增殖，提高天然杀伤细 胞( nk ) 的活性，从而提高机体免疫力。对人参皂苷r 9 3 的免疫功能进行实验， 结果表明r 9 3 能明显提高小鼠碳粒廓清速率、免疫器官重量、血清溶血素含量、 脾淋巴细胞转化和自然杀伤细胞活性，其结果均具有显著性差异。又如黄芪皂苷 和人参皂苷均能增强网状内皮系统的吞噬功能，促进抗体生成，加快原抗体反应 和淋巴细胞转化。党参皂苷及其水溶性成分均能提高巨噬细胞功能，使细胞内的 脱氧核糖核酸、糖类酸性磷酸酮、琥珀脱氢酶的活性增强等。 1 2 2 4 抗菌消炎、抗病毒作用 据应用药理学记载，甘草皂苷具有广谱抗菌作用，对溶血性金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌、肺炎双球菌、痢疾杆菌等常见致病性病菌均有较强的抑制作用 甘草皂苷能抑制艾滋病病毒、水痘病毒、带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒的增殖 柴胡皂苷对许多炎症过程包括渗出、毛细管通透性、炎症介质释放、白细胞游走 和结缔组织增生等都有影响。剑麻总皂苷具有较明显的抗炎、抗菌、止血、抗衰 老和降血糖的活性，经过初步活性筛选，发现其还具有较好的调血脂活性等嗍 1 2 2 5 调节机体的物质代谢 皂苷能促进核酸及蛋白质的合成，对血糖有调节作用，可使高胆固醇症动物 体内胆固醇降低，但对正常动物则能促进脂质合成。文献报道，苦瓜皂苷可抑制 葡萄糖一6 一磷酸酶和果糖一l 6 一二磷酸酶活力，从而抑制糖异生，苦瓜皂苷还 可调节细胞色素氧化酶p 4 5 0 活性，增强红细胞、肝脏中葡萄糖- - 6 - - 磷酸脱氢酶 活力，加速葡萄糖氧化。柴胡皂苷能诱导脂皮质素合成，抑制磷酸酶a 2 活性， 具有促进糖原、肝细胞核糖核酸合成及脂质代谢作用 1 3 皂苷的提取分离及含量测定方法 1 3 1 三萜皂苷的提取方法 植物有效成分的提取过程实质是溶质从植物体内部细胞向溶剂中转移的传质 过程其过程包括溶剂从溶剂主体传递到植物体的表面；溶剂扩散渗入植物体内 部和内部微孔隙内；溶质溶解进入溶剂；通过植物体微孔隙通道中的溶液扩散至 植物体表面并进一步进入溶剂主体具有生理活性的有效成分绝大部分存在于细 胞内，如果植物体内的细胞壁没有受到破裂，浸取作用将难以进行。这是由于溶 质分子不能通过细胞壁，只有溶剂通过细胞半透膜渗透入细胞内，当把细胞胀破 6 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 时，溶质才被带到浸取液中，致使浸取的速率缓慢。因此，为了提高提取效率， 通常需要对生物体内的细胞进行预处理。一般而言，从植物中提取活性成分时， 需首先将物料进行干燥，然后通过粉碎、研磨等方法尽量使细胞壁破裂，以便其 中的活性成分能够很快地扩散到提取溶剂中。 提取皂苷的溶剂主要有水和亲水性有机溶剂。水提法是植物有效成分提取最 早也是最常用的方法之一。中国药典1 9 9 0 年版一部和卫生部药品标准中药成 分制剂l 9 册，共收载中成药1 9 4 5 种，其中采用热水提工艺的多达8 2 6 种，占 总数的4 2 50 6 1 3 s l 。有机溶剂提取法的基本原理与水提法相同，不同之处是用亲水 性有机溶剂如甲醇或乙醇等作溶剂浸出中药有效成分，该法可以有效减少药材中 水溶性杂质如淀粉、蛋白质和粘液质的浸出 1 3 1 1 传统提取方法 皂苷的传统提取方式又可分为冷浸法( 渗漏法) 和热提法( 包括回流法和索 氏法) 两种。冷浸法一般用于提取热敏性成分，因避免了加热，从而使其中的有 效成分有了一定的安全性，但有机溶剂用量较多，生产周期较长，操作较麻烦。 回流法和索氏法较之冷浸法提取率要高，但由于均需长时间加热，因此很容易使 其中的有效成分发生改变。具体选择何种溶剂及提取方式，要根据提取物的特性 来决定。可通过对提取工艺条件进行摸索和优化，建立切实可行的提取方法，达 到提高效率、降低成本的目的，以实现生产的科学化、标准化和规范化。 1 3 1 2 高新提取技术 近年来，一些新型提取技术正逐渐引入植物有效成分的提取中，如超声强化 技术、微波辅助技术、超临界流体萃取技术等。大量的研究结果表明，这些新型 技术与传统技术相比，具有速度快、效率高、能耗少等优点，因而有着广阔的应 用前景。简述如下： ( 1 ) 超声强化提取技术 超声波 4 7 1 是一种频率为1 5 - 6 0k h z 的高频声波，声波主要通过瞬间空化实现 5 0 0 0 的高温和5 0 ，的局部高压，强化提取过程，具有提取速度快、收率高 等特点，同时，超声波破碎过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反应，勿需 加热，因此被浸提的生物活性物质在短时间内保持不变 ( 2 ) 微波辅助提取技术 微波提取技术是利用频率为3 0 0 3 0 0 ，0 0 0m h z 的电磁波辐射提取物，使提 取物内的极性分子产生高速摆动而发生相互磨擦，产生热量，提供能量的快速传 7 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 递和充分利用。微波辅助提取技术能有效提高提取效率、节省时间，同时它还具 有成本低、投资少的优点，在工业化提取植物有效成份方面具有广阔的应用前景 【船】。 ( 3 ) 超临界提取技术( s f e ) 超临界提取技术是近年来发展起来的新型提取技术，它与常规溶剂萃取的区 别在于不应用有机溶剂，而是选用一种称为超临界流体( 简称s f ) 的物质代替有 机溶剂。c 0 2 是最理想的s f s f e 的主要优点是；可以在低温下提取，防止热敏 性成分氧化和逸散；完全没有溶剂的残留；萃取和蒸馏合为一体，不需回收溶剂， 可大大提高生产效率和节约能源【3 1 超临界流体萃取技术不适于极性物质的提取 分离，对生产设备的工艺要求较高，运行成本也比较高，离大规模工业应用还有 一定距离，但是，该项技术的高选择性、高收率及低毒害是其他方法所不能比拟 的。 1 3 2 三萜皂苷的纯化及精制方法 有效成分的分离纯化就是把需要的成分和不需要的成分分开，即去粗取精的 过程在皂苷类成分的提取物中，往往伴随着诸如糖类、鞣质等亲水性较强的植 物成分，给皂苷类成分的分离纯化增加了难度。纯化总皂苷的方法主要有溶剂萃 取法、沉淀法、吸附法、水蒸汽蒸馏法、大孔树脂吸附法等。而要把结构相近的 皂苷分离，得到单体成分，进行结构分析，则需要作进一步分离，目前常用的分 离精制手段主要是色谱分离法 1 3 2 - 1 纯化总皂苷的方法 ( 1 ) 正丁醇萃取法：将提取液减压浓缩至浸膏状，复溶于水，抽滤除去杂质。 改用亲水性强的正丁醇为溶剂继续在水溶液中作两相萃取，由于皂苷在正丁醇中 的溶解度很大，且能与水成两相，因此皂苷转溶于正丁醇，一些亲水性强的的杂 质如糖、蛋白质、鞣质等仍留在水中，从而与皂苷分离。收集正丁醇溶液，减压 蒸干，即得粗总皂苷。 ( 2 ) 有机溶剂沉淀法：利用皂苷不溶于乙醚和丙酮等有机溶剂的特性，将提 取液真空浓缩后，加入等体积的乙醚，摇匀，大量白色沉淀析出，倾出上清液， 再加入乙醚，又有白色沉淀产生，如此重复，直到加入乙醚无沉淀产生为止把 沉淀物干燥，即得粗总皂苷，此法流程简单，能耗少。易于操作，但溶剂消耗量 大 矗 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 ( 3 ) 氧化镁吸附法：提取液中含有的糖类、鞣质、蛋白质、色素等杂质可以 被氧化镁所吸收，利用此性质，可进行皂苷分离纯化。将提取液浓缩后加入新鲜 锻制的氧化镁粉末，拌匀，水浴上蒸干，磨碎，放入连续回流提取器中，用甲醇 或乙醇提取，被吸附在氧化镁上的皂苷能被热醇提取出来，而杂质仍留在氧化镁 中，浓缩提取液并冷却，皂苷即可析出此法所得皂苷纯度不高，而且操作比较 麻烦，因此用得较少。 ( 4 ) 大孔树脂吸附法：大孔吸附树脂是一类新型非离子型具有大孔结构的高 分子化合物，它用于总皂苷的纯化，能除去水溶性色素、多糖和无机盐等水溶性 杂质。利用弱极性的大孔树脂吸附性质很容易用水将糖等亲水性成分洗脱下来， 然后再用不同浓度的乙醇洗脱被大孔树脂吸附的皂苷类，从而达到纯化的目的。 大孔吸附树脂具有吸附容量大，选择性好，易于解吸附，机械强度强，再生处理 简便，吸附和解吸速度快等优点。因而在天然产物有效成分的分离纯化中得到了 越来越广泛的应用 6 3 1 1 3 2 2 分离精制皂苷的方法 ( 1 ) 分配色谱法：分配色谱法与液一液连续萃取法相似，它是利用混合物各 组分在两种互不相溶的液相间分配系数不同而进行分离，常以硅胶、硅藻土、和 纤维素作为载体，以吸附大量的液体作为流动相。皂苷极性大，采用分配色谱法 分离效果较好。如从远志根中，用硅胶柱色谱，以3 草酸水溶液为固定相，氯 仿：甲醇：水( 2 6 ：1 4 ：3 7 ) 为流动相，分离得4 种单一的皂苷，即远志皂苷b ，c ，d 。 ( 2 ) 吸附色谱法：吸附色谱也称固一液吸附色谱，常用硅胶和氧化铝为吸附 剂，洗脱剂一般采用混合溶剂，从柱顶部加入作为流动相。例如分离混合甾体皂 苷元的方法是将样品溶于含2 氯仿的苯中，上硅胶柱后，先用此溶剂系统冲出 单羟皂苷元。再用含2 0 氯仿的苯冲洗出单羟酮基的皂苷元，再用含1 0 甲醇的 苯冲洗出双羟基皂苷元 ( 3 ) 高效液相色谱法( s p l c ) ：h p i c 使用硅胶、反相硅胶或其它碳水化合物 作色谱柱填料，快速分离粗皂苷，只需几十微克纯品就可以对某些简单的皂苷进 行结构鉴定。高效液相色谱用于皂苷元单体的分离具有分离效率高，应用范围广， 分析速度快，样品用量少而且灵敏度高等特点，因而正得到广泛应用 ( 4 ) 液滴逆流色谱法：液滴逆流色谱法是利用物质在互不混溶的两相液滴中 的分配系数不同而达到分离目的。其主要的优点是没有固体吸附剂，不存在着被 分离物质的不可逆吸附问题。液滴逆流色谱法分离效能高，有时可能将结构极其 9 2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 近似的成分分开。例如采用下行法，溶剂系统c h c i 。：m e o h ：n p r o h ：e 炉- 9 - 1 2 ： l ：8 可从鼠李科植物酸枣( z i z y p h u ss p i n a c h r i s t 2 ) 的叶子中分离出酸枣苷类化 合物( j u j u b o g e n i ng l y c o s i d e s ) i j 。 ( 5 ) 聚酰胺柱层析法：聚酰胺分子中含有多数酰胺基，在水溶液中能与羟基 通过氢键结合而被吸附，从而与不含羟基的化合物分离，化合物分子中羟基数越 多或其活性越大则吸附越强。将粗皂苷类化合物进行聚酰胺柱层析，分别用水、 不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，在某一合适浓度即可锝到所需的皂苷类组分嘲 ( 6 ) 高速逆流色谱分离技术：高速逆流色谱分离技术简称h s c c c ，是一种 不用任何固态载体或支撑体的液液分配色谱技术h s c c c 技术分离效率高、产品 纯度高、不存在载体对样品的吸附和粘染，具有制备量大和溶剂消耗少等优点 上世纪8 0 年代后期，各国学者迅速认识到该项技术的应用和开发价值，并广泛用 于天然植物的分离制备和分析中。目前，已成功开发出分析型和生产型两大类高 速逆流色谱仪，可分别用于中药不效成分的制备和定量分析。进样量可从毫克级 到克级，进样体积可从几毫升到几百毫升，不仅适用于非极性化合物的分离，也 适用于极性化合物的分离。既可用于中药粗提取物各组分的分离，也可用于各组 分的进一步精制。 1 3 3 三萜皂苷的含量测定方法 在三萜皂苷的定性定量研究中，目前国内外主要有比色法，分光光度法，薄 层色谱法，高效液相色谱法和毛细管电泳法等。 ( 1 ) 比色法：比色法d q 是皂苷类成分分析测定中历史较长、应用较普遍的方 法其原理是皂苷类成分和一些显色试剂反应后显色，在最大吸收波长处测定其 吸光度，从而得出植物中所含的皂苷浓度。常用的显色试剂有浓硫酸、香草醛一 浓硫酸、香草醛一冰醋酸、香草醛一高氯酸等比色法的显色反应虽然较灵敏， 但显色试剂的专属性较差，因此比色法通常用于总皂苷的测定。但由于颜色反应 简便、灵敏，因而在皂苷类成分的分析测定中仍占有重要地位 ( 2 ) 分光光度法：分光光度法实际上是比色法的延伸，它不仅能测定有色物 质，还能精确测定含共轭结构和杂原子的有紫外吸收的无色物质，也是一种成熟 经典的分析方法因简便灵敏、适用范围广泛，故常用于三萜皂苷的分析测定 ( 3 ) 高效液相色谱法( 咿u ) ：具有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点， 正好适应中药成分的多样复杂性，因而在中药化学成分分析方面得到了迅速的发 展和应用 ：2 0 0 7 届硕士研究生毕业论文 野木瓜总皂苷的分离纯化及活性研究 ( 4 ) 薄层色谱法( t l c ) ：薄层色谱法可以使某一成分与其他成分或杂质分离， 排除干扰，从而进行定性或定量分析，由于其简便易行，并可以同时作多个样品 点的平行分析，因此得到广泛的应用。近年来，单纯的t l c 法仅用来定性分析， 通过同板或异板r f 值来鉴定成分，古老的目视比较法等薄层定量方法已被高效薄 层( h p t l c ) 法、薄层扫描法( t l c s ) 取代。 ( 5 ) 高效毛细管电泳法( m c e ) r n ：是最近几年来发展最快的分析方法之一 c e 是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。具有三高二少的特点，即高灵 敏度、高分辨率、高速度、样品少、成本低。在实际工作中，结合传统电泳的工