（材料学专业论文）Ti、NiTi合金表面HACOL复合层的制备.pdf

中文摘要 本文通过在模拟体液中加入胶原，在t i 、n i t i 合金表面生长h a c o l 复合 层，即成分、结构等与骨组织类似的仿生复合层，进一步扩大t i 、n i t i 合金作 为硬组织植入或替换材料在生物医学领域的应用。 通过改变胶原及模拟体液的浓度确定了在t i 、n i t i 合金表面生长h a c o l 复合层的工艺；通过扫描电子显微镜( s e m ) 、x 射线衍射( ) 、红外光谱( m ) 、 x 射线光电子能谱( x p s ) 和透射电子显微镜仃e m ) 对表面复合层进行了表征；并 初步探讨了t i 、n i t i 合金表面h a c o l 复合层的生长机理。 结果表明；在t i 、n i t i 合金表面生长h a c o l 复合层的工艺为：在0 5 9 , l 的c s b f 溶液中生长1 2 2 4 h ；在1 0 9 l 的1 5 c s b f 溶液中生长3 d 。t i 、n i t i 合 金表面的复合层主要由结晶度较低的羟基磷灰石和胶原组成。 根据生物矿化的原理和过程，t i 、n i t i 表面h c o l 复合层的生长过程分 为预成核、晶体成核和晶体生长三个阶段。预成核在试样表面形成了带负电荷的 微结构和磷酸钙盐的初始晶核；在胶原的调控下，无机相在有机无机界面成核： 晶核在胶原以及溶液中离子的运送速率和结合速率的影响下生长，最终在试样表 面形成羟基磷灰石和胶原的复合层。 关键词。t i ；n i t i ；h a c o l 复合层；仿生生长；生物矿化 a b s t r a c t t h i sw o r ki sm a l a ya t t r i b u t e dt of o r mh a c o lc o m p o s i t ec o a t i n g so nt h es u r f a c e o ft ia n dn i t ia l l o yb y 甜m n gc o l l a g e ni n t os b f ( s i m u l a t e db o d yf l u i d ) ，o fw h i c h t h ec o m p o n e n ta n ds 缸 u c t u r ea l es i m i l a rt ot h a to f h u m a i lb o n e a n df u r t h e re n l a r g et h e a p p l i c a t i o no ft ia n dn i t ia l l o yi nt h eb i o m e d i c a lf i e l da sh a r di s s u ei m p l a n t a t i o no r s u b s t i t u t em a t e r i a l s f o r m a t i o np r o c e s s e so fh a c o lc o m p o s i t ec o a t i n g s0 1 1t h es u r f a c eo ft ia n dn i t i a l l o yw e r ec o n f i r m e db ya l t e r i n gt h ec o n c e n t r a t i o n so fc o l l a g e na n dc s b f , a n dt h e c h a r a c t e r i s t i c so fc o m p o s i t ec o a t i n g sw e l ei n v e s t i g a t e du s i n gs e m ，x r d ，i r , x p s a n dt e m a tt h es a n l et i m e t h eg r o w t hm e c h a n i s mo fh a c o lc o m p o s i t ec o a t i n g s o nt h es u r f a c eo f t ia n dn i t ia l l o yw a sp r i m a r i l yd i s c u s s e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tf o r m a t i o np r o c e s s e so fh a ，c o lc o m p o s i t ec o a t i n g so n t h es u r f a c eo ft ia n dn i t ia l l o yw e r er e s p e c t i v e l yd e p o s i t i n gi n0 5 9 lc s b ff o r 1 2 2 4 ha n di n1 o g l1 5 c s b ff o r3 d 1 1 l ec o m p o s i t ec o a t i n g so nt h es a l r f a c eo ft i a n dn i t ia l l o yw e r em a i n l yc o m p o s e do f p o o r l yc r y s t a l l i z e dh y d r o x y a p a f i t eo a n d c o l l a g e n a c c o r d i n gt ot h et h e o r ya n dp r o c e s so fb i o m i m c t i cm i n e r a l i z a t i o n ，t h eg r o w t h p m c 髓so fh a c o lc o m p o s i t ec o a t i n g so nt h es u r f a c eo ft ia n dn i t ia l l o yc a l lb e d i v i d e dt ot h r e es t a g e s ，i e 1 y r e - n u c l e a t i o n ，c r y s t a ln u c l e a t i o na n dc r y s t a lg r o w t h f i r s t l y , e l e c t r o n e g a t i v es t r u c t u r ea n dp r i m a r yc r y s t a ln u c l e u so fc a l c i u mp h o s p h a t e w e r ef o r m e do nt h es u r f a c eo fa l l o y ；t h e ni n o r g a n i cp h a s e sw 唧n u c l e a t e do nt h e o r g a n i c i n o r g a n i ci n t e r f a c eu n d e rt h ec o n t r o la n di n f l u e n c eo fc o l l a g e n ；a n dt h e n c r y s t a l s w e r eg r o w i n gu n d e rt h ei n f l u e n c eo fc o l l a g e na n dt h et r a n s p o r ta n d c o m b i n a t i o nv e l o c i t i e so fi o n si nt h es o l u t i o n ，a n df i n a l l yh a c o lc o m p o s i t e c o a t i n g sw e r ef o r m e do nt h es u r f a c eo f t ia n dn i t ia l l o y k e yw o r d s ：t i ；n i t i ；h a c o lc o m p o s i t e c o a t i n g ；b i o m i m e t i cg r o w t h ； b i o m i m e t i cm i n e r a l i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：拣霭而 签字日期：谚6 年r 月茁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 曝秀丽 签字日期：切z 年f 月g 日 导师签名1 幻。馒乞 签字日期：? 。以年f 月f 占日 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 生物医用材料( b i o m e d i c a lm a t e r i a l s ) ，又称生物材料( b i o m a t e r i a l s ) ，它是对生 物体进行诊断、治疗和置换损坏的组织、器官或增进其功能的材料 1 】。它是材 料科学技术中一个正在发展的新领域，不仅技术含量和经济价值高，而且与患者 的生命和健康密切相关。近1 0 多年以来，生物医用材料及制品的市场一直保持 2 0 左右的增长率。 生物医用材料按材料组成和性质分为医用金属材料、医用高分子材料、生物 陶瓷材料和生物医学复合材料等。金属、陶瓷、高分子及其复合材料是应用最广 的生物医用材料。按应用，生物医用材料又可分为可降解与吸收材料、组织工程 材料与人工器官、控制释放材料、仿生智能材料等。 生物医用材料的研究和发展方向主要为【1 】： ( 1 ) 改进和发展生物医用材料的生物相容性评价 ( 2 ) 研究新的降解材料 ( 3 ) 研究具有全面生理功能的人工器官和组织材料 ( 4 ) 研究新的药物载体材料 ( 5 ) 材料表面改性的研究 近年来，金属和合金的表面改性研究成为生物医用材料领域的研究热点，利 用表面改性技术不仅可以提高金属表面的稳定性和耐磨性，而且能够赋予生物活 性，即可使新骨直接沉积于金属表面，而无纤维结缔组织的中间隔层。 1 2t i 和f l it i 合金 1 2 1t i 和n i t i 合金的基本物理性能 t i 和n i t i 合金的基本物理性能见表1 1 ； 第一章文献综述 表1 - 1t i 和n i t i 合金的基本物理性能【2 ，3 】 t a b l e1 - 1b a s i cp h y s i c a lp r o p e r t i e so f t ia n dn i 能a l l o y s 2 ，3 】 1 2 2t i 和n i t i 合金的机械性能 t i 和n i t i 合金的机械性能见表1 - 2 ： 表l - 2t i 、n i t i 合金的机械性能【3 ，4 】 t a b l e1 - 2m e c h a n i c a lp r o p e r t i e so f t ia n dn i t ia l l o y s 3 , 4 】 1 2 3nit ；合金的特殊性能 3 】 1 2 3 1niti 合金的形状记忆效应 n i 砸形状记忆合金在一定范围内发生塑性变形后，经过加热到某一温度上， 能够恢复变形，其实质是热弹性马氏体相变。n i t i 合金的低温相为马氏体，柔软 且易变形；n i t i 合金的高温相为奥氏体( 母相) ，比较硬。冷却过程中，母相会 转变为孪晶马氏体，该马氏体在外应力下容易变形成某一特定形状；加热时，己 发生形变的马氏体会回到原来的奥氏体状态，这就是宏观的形状记忆效应。 1 2 3 2n i t j 合金的超弹性 产生热弹性马氏体相变的形状记忆合金，在a 吓温度以上诱发产生的马氏体 相只有在应力作用下才能稳定存在，应力一旦解除，立即发生逆相变，回到母相， 在应力作用下发生的宏观变形也随逆相变而完全消失，其应力应变关系呈现明显 第一章文献综述 的非线性。 1 3 羟基磷灰石涂层的制备 羟基磷灰石( c a s ( p 0 4 ) 3 ( o h ) ，h a ) 的组成接近于生物体骨组织的无机成分， 具有非常好的生物相容性，钛基h a 涂层材料在具备金属材料的高强度和高韧性 的同时，也具有h a 良好的生物活性。在钛及其合金表面制备h a 涂层的主要技 术见表1 - 3 。 表1 - 3 在钛及其合金表面制备h a 涂层的技术 5 ，6 】 t a b l e 1 - 3 f o r m a t i o nt e c l m o l o b ”o f h ac o a t i n go nt h es u r f a c eo f t ia n di t sa l l o y s 5 , 6 制各技术 优点缺点 1 4 胶原及其特性 胶原( c o l l a g e n ) 是蛋白质的一种，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌 腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体 的功能。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的2 5 3 0 ，相当于体重的6 7 】。 1 4 1 胶原的结构【7 】 胶原和其它蛋白质一样，具有四级结构。胶原的四级结构，对它的分子大小、 形状、化学反应性、生物功能等起着决定性的作用。 第一章文献综述 1 4 1 1 一级结构 一级结构揭示的是某种蛋白质中有多少种氨基酸，每种氨基酸有多少个，这 些氨基酸是怎样连接成多肽的。一般把蛋白质的一级结构叫做化学结构。胶原分 子中的具有n - 链组成的三股螺旋构象被称作“胶原域”，分子中至少应有一个胶 原域才叫胶原。 胶原的胶原域有“甘氨酸一脯氨酸一羟脯氨酸”、或“甘氨酰一脯氨酰一x ” 和“甘氨酰一x y ”( x 、y 代表除甘氨酰和脯氨酰以外的其他任何氨基酸残基) 这样一些三肽的重复顺序存在。“甘氨酰一脯氨酰一x ”三肽的数量为全部三肽 总和的将近1 3 ，其化学结构如下： 且n c v c n - 吵 n o n ，c f h f f n 甲c a o n ， i | i fii g l yp r oyg l y x h y p 1 a 1 2 二级结构 图1 - 1 胶原的二级结构示意图 f i g 1 - 1s k e t c hm a po f t h es e c o n ds l r u e t u r eo f c o l l a g e n 4 一 illiiiilf ，。，0 ，v川川 卜1ii面=：引划鳓ii上 第一章文献综述 蛋白质的二级结构是指其多肽链主链骨架中的若干肽段所形成的有规则的 空间排布( 如洳螺旋、p 折叠、p 转角) 或无规则的空间排布( 如无规则卷曲) 。 胶原的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，胶原的基本结构单位是原胶原 ( t r o p o e o l l a g e n m o l e c u l e s ) 分子，基本结构单位直径约1 5 1 0 l o m ，长2 8 0 0 1 0 4 0 m ， 相对分子质量约3 0 0 0 0 0 。这些基本结构单位头尾相连，并排成束，形成胶原纤 维。胶原的二级结构示意图见图1 1 。 1 4 1 3 三级结构 三级结构是描述整个肽链，包括主、侧链在内的空间排布。就其实质而言， 三级结构主要揭示蛋白质分子中肷链之间次级键的作用，也就是氨基酸残基侧链 的极性基团产生的离子腱、氢键和范德华力和非极性基团产生的疏水键、范德华 力等作用力，使三级结构得以保持稳定。除了这些次级键，胶原分子内和分子问 还有三种交联： 醇醛缩合交联； 醛胺缩合交联； 醛醇组氨酸交联。 这三种交联把胶原的两条肽链、三条肽链牢固地连接起来，使胶原具有很高 的抗张强力。胶原的三级结构是由三条螺旋拧成的一股绳状的右手复合螺旋，其 中两条螺旋在前，一条在后。 1 a 1 4 四级结构 四级结构是指各个亚基( 具有三级结构的多肽链单位) 的空间排布，亚基间 相互作用与接触部位的布局。 1 4 2 胶原的主要性质和功能 1 4 2 1 胶原的物理性质 胶原是一种聚两性电解质，这是由于胶原每个肽链具有很多酸性或碱性的侧 基，并且每个肽链的两端有弘羧基和弘氨基决定的。在特定的p h 范围内，这些 基团可以解离产生正电荷或负电荷。在溶液中，随着介质的p h 值不同，胶原即 成为带有许多正电荷或负电荷的离子： h o o c p 一嘲+ 亭o h - 一p 一悄+ 宁o h - 一o o c p - n i l 2 ( 1 一1 ) 正离子两性离子负离子 第一章文献综述 胶原在某一p h 值的溶液中表现不出电荷，呈两性离子状态，即它所带的正电荷 与负电荷相等( 零电荷) ，而这一p h 值就是胶原的等电点。 1 4 2 2 胶原的生理化学性能【8 】 ( 1 ) 静电学性能：胶原蛋白大分子约含有2 4 0 个赖氨酸、羟赖氨酸和精氨酸 的6 - 氨基和胍基，同时还含有2 3 0 个天冬氨酸和谷氨酸的羧基，这些基团在生理 条件下都带电荷。在天然纤维中，大部分基团通过分子内或分子间相互作用形成 盐键，只有少量的基团是自由的，给胶原纤维提供很大的稳定性。改变p h 值或 用化学方法修饰静电侧基可改变胶原纤维内的静电性质。 ( 2 ) 离子和大分子结合能：在自然状态和生理条件下，胶原分子约有6 0 个 自由羧基。这些基团有结合阳离子的能力。在易溶盐存在情况下，离子结合程度 提高。 ( 3 ) 成纤性能：在组织中天然的胶原蛋白纤维以特定的顺序组织起来，通过 胶原蛋白的重组可得到多晶型胶原蛋白。重组环境对胶原蛋白多晶型有很大的影 响。改变分子间相互作用的状态可获得各种多晶型分子聚集体。 ( 4 ) 结合多种因子：胶原蛋白能结合多种因子，如：f n 、i l i i 等，并诱导、 调节细胞生长。 ( 5 ) 支架作用：胶原蛋白是器官和组织必不可少的构造骨架，是结缔组织的 主要结构成分，可作为细胞外基质纤维支架，稳定结构并塑形。 1 4 2 3 胶原的生物学性能 8 】 ( 1 ) 止血性能：天然的胶原聚集体是良好的止血剂。其止血机理为：血小板 首先粘附在胶原表面诱导血小板释放，随后血小板开始聚集并产生最终止血栓。 ( 2 ) 细胞相互作用性能：胶原蛋白作为细胞生长的依附和支架，能诱导上皮 细胞等的增殖、分化和移行。 ( 3 ) 免疫性能：胶原蛋白的免疫性很低，而不溶性胶原蛋白的免疫性比可溶 性胶原蛋白更低。因此，含异体胶原蛋白的器械可长期植入人体而只产生很低的 免疫反应。 1 5 有机无机复合物的制备 骨组织的主要组成部分为矿物质、水和胶原，而矿物质中最主要的成分为羟 基磷灰石( 姒) 。事实上，在实际植入的过程中，预处理后的t i 及其合金表面 所形成的羟基磷灰石如何最终与水和胶原蛋白等作用，形成人工骨组织，使生物 第一章文献综述 植入体更接近于人体环境，提高合金材料的生物相容性，同时防止金属离子的析 出，这将是显著提高合金材料功能化，完善植入应用的一个最大的难题。为此， 研究学者对羟基磷灰石与聚合物( 包括各种蛋白质) 相互作用的研究上倾注了大 量的精力，许多崭新的研究方法与研究成果应运而生。 那么，为什么要对h a 与聚合物的相互作用进行研究呢? 实践发现，当出现 骨质缺损的时候，现有的植入生物玻璃和玻璃一陶瓷混合物能自发键合至活性骨 上，但是相对于天然骨质来说，它们的易碎性和缺乏柔韧性限制了其应用的程度。 在此基础上，利用具有生物活性的陶瓷和蛋白质的混合物能很好地解决这个问 题。所以，这种有机一无机复合层的制备相对于单纯的h a 层具有更高的应用前 景，o h t s u l d 等 9 通过加入钙离子和引入特定的功能基团如s i o h ，成功了制备 出一种新的有机一无机杂化层，从而在生物活性功能材料的发展应用上迈出了新 的一步。 通常，胶原与h a 复合的生物模拟方法主要是h a 纳米晶体直接在胶原纤维的 表面形核长大。在这种形核过程中，溶液的p h 值由5 变为碱性条件下的1 0 和1 1 ， 同时悬浮的胶原由小的纤维组装成新的纤维，然后h a 纳米晶体在新的纤维表面 形核，这种化合过程所形成的化合物的形貌与自然骨组织的形貌吻合较好，即呈 现一种纳米尺度的针状( n e e d l e s h a p e d ) ，h a 的六倍对称轴的晶向与胶原纤维的 最长轴平行；一般情况这种h a 胶原的质量比例大约从8 0 ：2 0 至1 j 3 0 ：7 0 ；h a 的 晶体大小约1 2 1 5 n m ，在胶原里生长的h a 的c 轴平行于纤维最长轴的方向f l o 。 这种有机无机复合物的制备最初主要在溶液中进行，主要采取的方式为将 含有两者的溶液直接混合，在一定p h 值和温度下模拟、配比达到一定浓度的离 子平衡。1 9 9 9 年，b r a d t 等 1 1 提出了一种新的改进骨植入材料合成的方法，即将 胶原在体外矿物化，实现在一个过程中完成胶原纤维的组装与磷酸钙晶体的形核 长大。具体地，这种反应首先将胶原溶解于一定浓度的盐酸中，同时制备一定浓 度的含钙的胶原溶液和含磷酸的胶原溶液，最后将中和缓冲液( n e u t r a l i z a t i o n b u f f e r ) 加入上述混合胶原溶液中，形成包括胶原、氯化钙、磷酸、氯化钠和三 羟甲基氨基甲烷等在内的混合物，最终将该混合物在p h 值为6 8 ，3 0 下反应几 分钟。通过扫描电镜观察，发现胶原纤维形成了一种三维网络结构，在这种网络 结构上面发现了磷酸钙晶体的沉积。同时，通过在上述混合溶液中除去磷酸溶液， 防止生成磷酸钙的方式，作者也获得了胶原纤维的原始结构。 接着，d u 等 1 2 通过胶原基质的矿物化过程制各出三种类型的磷酸钙肢原 复合物，即非晶态磷酸钙胶原，弱结晶性含碳酸根的磷灰石胶原，含碳酸根的 磷灰石+ 磷酸四钙胶原复合物。制备过程是将i 型胶原首先浸入含有磷酸根的 溶液中，然后浸入含有钙离子的溶液中以获得矿物质的沉积。他们制备的这些复 第一章文献综述 合物的强度与杨氏模量均达到了所报道的骨组织的最小量程范围。当植入到肌肉 组织里，该复合物也具备了一定的生物降解能力。 如果仅仅是通过胶原与h a 的溶液混合而生长出所需晶体，这个过程不足以 达到包括与天然骨组织完全吻合，结合强度较高在内的性能的提高。如果在此基 础上加入一些具有特定基团功能化的蛋白质，对晶体的形核和长大、矿化等方面 可能具有一定的促进作用，因此各种功能化蛋白质被引入胶原与h a 混合溶液中 以达到改进h a 形核和长大的目的。 2 0 0 1 年，r a h e e 等【1 3 】在生物有机体、胶原、硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ) 及它们的混合物上制备出一种仿生h 彪约米晶的规则阵列，这种制备方法主要是 利用沉积法，将氢氧化钙悬浊液与包含胶原和硫酸软骨素的磷酸溶液混合，合成 h a 胶原，h a 硫酸软骨素，h a g e 原硫酸软骨素三种复合物。其中比较令人关 注的是，在胶原纤维上所合成的h a 的( 0 0 2 ) 面衍射显示约6 0 0 弓形角( a r c h i n g a n g l e ) ，而在硫酸软骨素上的衍射显示为1 0 0 弓形角，作者将此种差别解释为两 种不同纤维的大分子的不同所导致。当然，这种结果显示骨替代材料具有很好的 应用前景，既能仿生模拟h a 晶体中的特殊构型和具体的有机组成部分，又能为 人工合成替代材料提供重要的基础。 b r a d t 等【1 1 在反应混合物中加入了聚天冬氨酸( p o l y a s p a r t a t e ) ，结果显示聚 天冬氨酸增强了胶原纤维与磷酸钙的结合强度，磷酸钙紧密结合在胶原纤维的上 方或者内部；而在没有聚天冬氨酸的情况下，胶原纤维与磷酸钙之间则是一种非 常松散的结合。实验证明，这种在胶原矿化的过程中加入氨基酸的做法取得了很 好的效果，增强了胶原纤维与磷酸钙的结合强度，这为新的骨植入材料的发展提 供一种极具前景的实验方法。 在溶液中以聚合物膜作为晶体生长的模板也是h a 晶体生长的方法之一， b i g l 等 1 4 。1 5 在猪的皮肤上提取出a 型白明胶( g e l a t i n ) ，然后在此基础上通过机 械搅拌该明胶的水溶液制各出海绵胶( g e l a t i ns p o n g e s ) ，制备海绵胶的目的是为 了模拟脊椎动物硬组织的生物矿化过程。随后，他们将化学合成的h a 加入到上 述白明胶溶液中形成羟基磷灰石海绵胶复合层，将这种复合层放入模拟体液中 生长，通过改变复合层中羟基磷灰石与海绵胶的组成成分比例获得了不同的形 貌。他们发现，十字交叉的海绵胶呈现一种多孔结构，孔径大小和孔壁的厚度分 布非常广泛，当海绵胶里存在羟基磷灰石晶体的时候，对海绵胶的形貌有积极的 影响，即混合后的机构更趋于规则性，出现的椭圆形小孔的平均直径约为 2 2 0 - a ：4 0 i t m 和4 8 0 士8 0 岫。但令人不解的是在扫描电镜下没有观察到姒的存在， 对此的解释是h a 尺寸较小，同时在混合物中的比例又太少。为了证实h a 的存在， 利用透射电镜下观察到非常小的类似于薄片状的晶体，经过粉末x 射线分析，结 第一章文献综述 果显示了h a 的衍射峰，即证实了h a 的存在。 其实早在1 9 8 1 年，t e r m i n e 等【1 6 】就报道了存在纤维状胶原的情况下，一种骨 蛋白能促进h a 的形核长大，并且在低浓度的牙质( d e n t i n ) ，牙质骨唾液酸糖蛋 白( d e n t i ns i a l o p r o t e i n ) 的主要磷酸蛋白质的作用下，白明胶中的h a 形成数量越 来越多。在此基础i - b i # 等 1 4 。1 5 1 经过实验分析得出，没有h a 的情况下，在模拟 体液中长期浸泡可以在海绵胶上沉积非常少量的无定形磷酸钙，而海绵胶里的 h a 对类似于骨头的磷灰石晶体的沉积具有极大的促进作用，这种在涂层上的沉 积表现出类似于球形聚集体，并且随着在模拟体液中浸泡时间的不断增长，每个 球形聚集体的直径也不断交大，具体表现为4 天的直径约1 - 2 阿1 到2 1 天的直径约 3 5 1 u n ：同时在这种有机相与无机相的组成中，无机相的比例逐渐增长，最终达 到5 6 ，这说明这种复合材料的成分已经很接近于骨组织的组成成分。经过分析， 这种无机相主要是结晶非常弱的含碳酸根的磷灰石，类似于小梁骨磷灰石 ( t r a b e e u l a r b o n e a p a t i t e ) 。 加入功能化蛋白质的目的一方面为了促进h a 的形核长大，另一方面也促进 胶原的矿化过程，h u n t e r 等【1 7 】利用唾液蛋白一蛋白多糖嵌合蛋白 ( s i a l o p r o t e i n d e c o r i n c h i m e r i c p r o t e i n ) 来促使胶原的矿物化。在实际过程中，将 老鼠的蛋白多糖嵌合蛋白上的假定胶原成键位置与猪的唾液蛋白上两种假定h a 形核位置中的一种相结合，结果显示嵌合蛋白( c h i m e r i cp r o t e i n ) 诱导一种稳态 琼脂糖凝胶体里的h a 晶体的形成，并且这种h a 与i 型胶原具有很高的亲和力， 同时，加入嵌合蛋白到胶原凝胶体里，加入低浓度的钙离子与磷酸根离子，结果 会导致在胶原纤维表面形成非常明显的巨大针状h a 晶体，这些足以说明唾液蛋 白一蛋白多糖嵌合蛋白在体外能诱导胶原的矿化。 h a r t g 嘶1 1 1 ( 等【1 8 】利用缩氨酸( p e p t i d e - a m p h i p h i l e ) 的p h 值诱导自组装制备出 具有纳米结构的纤维状支架，设计这种缩氨酸的目的是为了允许这种纳米纤维能 够可逆地进行交联，而交联的原因是基于氧化形成分子内的双硫键，结果导致以 化学方法形成的粗状纤维，并且这种交联能通过还原双硫至自由巯基而可逆的恢 复，交联的目的主要用于加强或降低它们结构的完整性。事实上，经过交联后， 这种纤维能够直接促使h a 的矿物化，并形成一种新的复合物材料，在这种材料 里，h a 晶体的c 轴与纤维的长轴平行，这种排列与骨头里所观察到的胶原纤维与 h a 晶体之间的排列是一样的。可以说，这种可逆变化的研究大大提高了模拟生 物植入材料应用于人体的研究进程。 大部分人在模拟体液中生长晶体，这种生物模拟的方法能获得预期的效果， 但是也有一些人采用更为简单的溶液进行晶体生长，同样也达到了非常好的效 果。m a r q u e s 等 1 9 】研究了白蛋白在两种磷酸盐矿化过程中的作用，这种反应没 第一章文献综述 有采用模拟体液，而是在一种无缓冲液的模拟无机血浆( b u f f e r l e s ss i m u l a t e d i n o r g a n i cp l a s m a - h b s s ) 里进行。结果发现，白蛋白与钙的结合加速了h b s s 溶 液中叶磷酸三钙( 舡t c p ) 的形成，同时看到了基体上形成了一些刻蚀点，认为 这些刻蚀点主要成为磷酸钙沉积的形核点，可以说这种白蛋白与最初的过饱和溶 液中可溶性钙离子的吸附为h a 提供了形核的中心点，白蛋白的这种作用还因不 同的基体而呈现不同的情况，相关研究也在继续进行。 h e 等【2 0 】报道了牙本质基质蛋白1 ( d e n t i n m a t r i x p r o t e i n1 - d m p l ) 促使h a 形 核长大的研究。这个过程遵循多重步骤，首先d m p l 与钙离子键合，形成最初的 矿物沉积，经过形核后的无定形磷酸钙沉淀物逐渐形成纳米晶体；然后这些晶体 长大并结合成微米大小的晶体，接着在c 轴方向上被拉长。这是一种基于蛋白质 为媒介构筑纳米晶体的新方法。 2 0 0 5 年，o n u m a 等【2 1 】研究了卵黄磷蛋白( p h o s v i t i n ) 对磷酸钙的形核和生 长的一些影响。研究表明，卵黄磷蛋白对h a 的形核具有促进作用，即当卵黄磷 蛋白键合到胶原表面上时，在胶原基体上h a 的形核速度与数量明显增加，并且 这种已形核的晶体均匀地排布于胶原的表面上；相比而言，在没有卵黄磷蛋白的 情况下，h a 晶体形核缓慢，并且只是在特定的小区域形核。在从磷酸钙到h a 的 转变过程中，卵黄磷蛋白的存在抑制了这种变化，在不存在卵黄磷蛋白的情况下， 重构是由磷酸钙直接转变为h a ) 存在卵黄磷蛋白情况下，姒则在磷酸钙表面上 以一种异相成核的生长方式而存在。 实验发现，一方面，特定功能蛋白质的加入对h a 的形核有促进作用，能使 h a 的形核更趋于均匀化、有序化，具有尺寸更小，厚度较大等优点；然而，实 验也证明一些蛋白质的加入对h a 的晶体生长具有抑制效应，在生理p h 值和3 7 c 下，加入丝氨酸，酪氨酸和4 羟( 基) 脯氨酸( 两端无电荷侧基) 至过饱和磷酸钙 溶液里会降低h a 的晶体生长速度 2 2 2 4 1 。k o u t s o p o u l o s 等在此试验基础上观察 到，由于氨基酸侧基的不同，各种氨基酸对h a 的生长抑制也各不相同，同时也 发现这种抑制与加入的浓度相关。这说明h a 结晶动力学通过封锁晶体表面的活 性生长位置而受到显著的影响。在此基础上，他们进一步研究了在赖氨酸，天冬 氨酸，谷氨酸的存在对h a 结晶化的影响情况。同样，赖氨酸也降低了h a 结晶化 的速度，他们将这种速率的降低归因于晶体表面的活性生长位置的吸收与随后进 一步阻滞效应所导致。 紧接着，k o u t s o p o u l o s 等 2 5 在水溶液中研究前胸腺素( p r o t h y m o s i na ) 碎 片对h a 生长的一些影响。前胸腺素旺一般用于药物研究，用途十分广泛，将它置 于磷酸钙的过饱和溶液中，结果发现，前胸腺素a 碎片的存在显著地降低了磷酸 钙的结晶速度，作者将此种抑制效应归结为前胸腺素a 碎片吸收后对活性生长点 第一章文献综述 的封闭，动力学分析这种在h a 表面的吸收遵循l a n g m u i r 型曲线，与基体具有相 对较高的亲和力，h a 晶体生长速率随着前胸腺素a 碎片的增大而逐渐降低，直到 稳定于一个水平线上。可以说，这是阻碍活性生长位置的一种新材料。 c o m b e s 等 2 6 】研究表明，根据加入蛋白质的浓度的不同，蛋白质能够改变形 核速率并导致一种不利的影响，例如在i 型胶原上的磷酸钙结晶过程中血清蛋白 的作用就能说明这种不利影响的存在。 k n e p p e r - n i c o l a i 等 2 7 】在矿化的胶原里加入骨钙蛋白( o s t e o c a l c i n ) ，其主要 目的是控制h a 的结晶过程，同时可以模拟造骨细胞( o s t e o b a l s t ) 和破骨细胞 ( o s t e o c l a s t ) 的相互作用。结果发现，骨钙蛋白的加入能导致钙质的纳米微结构 的形成，这说明骨钙蛋白对h a 结晶具有抑制作用。但是，加入骨钙蛋白又会降 低材料的断裂强度，也就是对应着h a 晶体结构具有更高的缺陷。而对各种骨质 细胞来说，骨钙蛋白的加入可能会提高造骨细胞的最初黏附力，而对细胞的增殖 没什么影响。 在讨论蛋白质对磷酸钙的形核问题上，一般都会认为蛋白质在磷酸钙材料生 物活性和生物矿化过程中扮演重要的角色，但是对矿物化晶体材料的形成是促进 还是抑制或者两者皆有仍然没有定论，但是我们仍然可以得知，蛋白质的加入肯 定存在着一个从促进形核到抑制形核的平衡过程，在转变过程中，生长出的晶体 形貌也会有所不同，只要我们能够通过改变条件获得最佳参数，一定能模拟出与 天然骨组织一样的形貌，同时尽可能地提高材料的生物相容性。于是，一些研究 学者对加入蛋白质后整个体系的各种性能进行了研究，以期望获得更好的结果。 s u k h o d u b 等 2 8 】研究h a 与水分子的相互作用对胶原矿化的影响，h a 存在于胶原 间隙位置处，胶原纤维的矿化会显著减少存在于最初水合外壳里的水分子，这个 过程导致了胶原结构中的一些结构变化，但是不至于使胶原分子变性。 蛋白质能直接控制生物矿化的形核和生长，但是基于蛋白质与生物矿化界面 的分子识别与组装仍然没有弄清楚，为此，l o n g 等人 2 9 】利用n m r 技术研究在 h a 表面上含水的一种生物矿化蛋白质( s t a t h e r i n ) 的结构，进而分析s t a t h e r i n 对 h a 的形核作用。结果发现，这种蛋白质能很好地吸附到h a 表面，在水的存在下， 它的n 端在h a 表面形成一种d 双螺旋的构型。进一步分析显示，富含阴离子的n 端能强烈地吸附并固定于h a 的表面，同时，中间和c 端区域能与矿物质表面形成 比较微弱的相互作用。 人体的骨组织是一种细胞外基质，主要由h a 纳米晶体与胶原纤维所构成。 所以，h a 与胶原之间成键的强度直接影响骨头的各种机械性能，一般这种化合 的方法为生物模拟共沉积。为了获得两者之间的强度，c h a n g 等【3 0 】利用戊二醛 ( g l u t a r a l d e h y d e ) 交联h a 与胶原复合物，结果显示，这种交联导致该复合物结 第一章文献综述 构从纳米尺度到微米尺度的逐渐变化，进一步地，利用f 1 ：取对此反应进行控制， 结果发现，随着这种交联程度的增加，有机物的含量也在逐渐增加，作者认为这 种构型的变化可能影响胶原大分子之间渡桥的形成与h a 胶原纤维的位向排列。 y i n 等【3 1 】研究了在h a 上吸附的蛋白质的表面电性能，他们主要是通过对h a 表面上阴离子与阳离子进行分析，实验分析指出，p 0 4 和c a 2 + 为确定电位离子 ( p o t e n t i a l - d e t c r m i n i n gi o n s ) ，相对于其它离子来说，它们的变化对( 电势的极性 和量级能造成显著变化。同时，他们分析了h a 上的牛血清白蛋白( b s a ) 的吸 收情况。结果显示，h a 与b s a 之间的静电相互作用成为这种吸收过程中的主导 因素，确定电位离子具有这种优先吸附的能力，也就是说确定电位离子能够用于 除去吸收的生物分子，使得b s a 与h a 的吸附过程能成为一种可逆的物理吸附过 程。 2 0 0 3 年，k a w a s a k i 等 3 2 1 比较了在h a 表面吸附唾液蛋白质和一些具有不同电 荷的典型蛋白如溶解酵素( 1 y s o z y m e ) ，人体血清白蛋白( h u m a ns e t l j i 1 1a l b u m i n ) 等，他们分别从不同的吸收量，电泳迁移率，表面覆盖程度和吸收动力学来分析。 从吸收量来说，和其他大多数的蛋白质相比，唾液蛋白质与h a 之问的吸附力非 常低，而在电泳迁移率上，在溶液中蛋白质含量较低的情况下，唾液蛋白质中带 有正电荷蛋白质更倾向于吸附于带负电荷的h a 表面，在吸收过程的最初阶段， 唾液蛋白质中带正电部分的生长方向为沿基板向上，但是这种优先生长方向在某 种程度上因为钙离子的存在而被抑制，而牙齿里的表皮部分里含有一定数量带有 正电荷的蛋白质，带正电荷的蛋白质能将牙齿表面的电势减小到一个很低的数 值，相应地，在和其它部分相互作用时，这种静电作用仅发挥很小的作用。 另外，v e g a 等 3 3 】研究了从稀的柠檬酸水溶液吸收于h a 上的情况，他们对比 在不同温度下的u v 吸收情况。结果显示，实验中的一个柠檬酸离子连接两个磷 酸位置点与理论上保持一致。 最近，采用分子自组装制备h a 晶体也是一种获得较好晶体结构的制备方 法，z h a n g 等 3 4 】利用矿化胶原里纳米纤维的自组装制备出一种层次结构，即胶 原纤维通过胶原三股螺旋的自组装而形成。而在此纤维表面生长的h a 晶体的c 轴沿着纤维的纵轴方向，同时经过矿化的胶原纤维彼此之间相互平行。r o v e d 等 3 5 】让h a 在自组装胶原纤维上直接形核，以此建立一种胶原h a 纳米晶体复 合物，这样就能利用生物系统的性质在分子层次上来储存和加工信息。他们在 体外重新构建了能够模拟骨胶原矿化的i 型胶原分子，事实上，这种i 型胶原 分子在纤维上自组装，重新制造了蛋白质一h a 晶体相互作用以促进h a 纳米晶 体的形核并形成它们的优先生长方向。结果显示，h a 沿着胶原纤维轴的c 轴优 先生长，说明姒与蛋白质之间具有非常接近的相互作用，这种合成的h a 纳米 第一章文献综述 晶体为刀片式结构( b l a d e - s h a d e ) ，h a 晶角，碳酸根含量和位置等与骨里所观 察到的结构非常类似，因此也说明这种仿生方法是切实可行的。可以说，分子 之间的自组装能获得比较有序的结构，对晶体的性能肯定会有极大的提高，所 以这也是今后发展的趋势之一。 在其他方面，m a t s a m l o t o 等 3 6 】将h a 颗粒作为蛋白质的一种可控释放载体 ( e o n t r o l l e d r e l e a s e c a r r i e r ) 。在低温下合成的h a 显示出具有低的结晶性，高的可 溶性等优势，而通过调整h a 合成的温度和蛋白质的浓度能够在h a 颗粒上获得不 同的蛋白质数量。同时，在不同p h 值下从h a 颗粒中释放的蛋白质的数量也有所 不同，在p h = 7 的溶液中释放的蛋白质就比p h = 4 的溶液中少很多。而且，这种 蛋白质的释放也取决于h a 的再吸收过程。 这种在溶液中胶原与h a 化合过程能出色地模拟自然骨组织的组成与形貌， 如果将这种化合移植到植入体基体表面，将会大大提高基体材料的生物相容性。 但是仅仅是胶原与h a 在基体表面上进行化合比较困难。因此，基于此对两者进 行改性研究，比如对合金进行预处理，在胶原与h a 混合溶液中加入一些功能化 的蛋白质可以逐步改进h a 的形核生长过程等等，这些新方法的改进与应用使合 金植入体的研究显示出强大的生命力，不断提高合金材料的生物相容性。 在植入体基体材料的选择上，主要是聚合物、金属及合金，聚合物的优点是 能与h a ，胶原纤维等以化学键结合，结合强度较高，但是它植入人体不能满足 各种机械性能的要求；而金属及合金材料则能很好的满足各种机械性能的要求， 它主要包括t i ，n i t i ，t i 6 a 1 4 v 等，但是其缺点是与h a 等结合强度低，植入后随 着时间的推移很容易产生松动甚至植入失败，而且金属离子容易析出，对人体造 成伤害等等，因此对金属及合金材料进行改性研究，结合两种基体的优点制备合 适的植入材料将是研究的前进方向之一。下面就这对在这两种基体上仿生生长的 发展进行简要的介绍一下。 最早，v e r h e y e n 等制备出聚( l 乳酸) h a 涂层，与此同时，b o n f i e l d 等则制 备出聚乙烯h a 涂层，而s t u p p 和c i e g l e 锖u 备出聚合电解质h a 复合物。在这些复合 物中，相同点是在聚合物的基体上，h a 均是分布于聚合物基质里。而在t a n a h a s h i 等报道的聚合物h a 复合物中，h a 则覆盖在一种聚合物基底的表面上 3 7 】。 0 y a k o 等 3 8 】在一种亚稳态磷酸钙溶液中自发生长处一种昆布氨酸 ( 1 a