（有机化学专业论文）酶催化henry反应的研究及α氟代βγ不饱和膦酸酯的dielsalder反应的初探.pdf

摘要 d 应i e 的l s 要a 究l de 及r 发蒸翁霸揲不饱 反应的初探 有机化学硕士研究生汤荣昌 指导老师何延红教授 摘要 本论文共分为两部分：第一部分是关于酶催化h e n r y 反应的研究。酶催化反 应是当今催化研究领域的热点，由于酶有着高效，经济，环保等优点而备受亲睐。 同时，h e n r y 反应是形成c c 键的一种重要的反应。其产物1 3 一硝基醇是有机合成 中的一种非常有价值的有机中间体，在化学合成中也得到了广泛应用。本文选用 谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶a 作为催化剂催化h e n r y 反应的进行。所得硝基醇产物 的产率最高达9 6 。另还对影响酶催化反应的条件进行了一些探讨，对酶催化h e n r y 反应有了更深入的理解。 第二部分主要研究了a 氟代一p ，y 不饱和膦酸酯的合成及其d i e l s a l d e r 反应。 由于产物的空间位阻较大，所以没能得到所期望的d i e l s a l d e r 产物。我们对氟化 膦酸酯的合成研究还在进行中。 关键词：h e n r y 反应；谷氨酰胺转氨酶；脂肪酶a ；硝基烷烃；氟代- d ，丫- 不饱 和膦酸酯，d i e l s a l d e r 反应 a b s t r a c t s t u d i e so nt h e r e a c t i o na n d d i e l s a l d e r y u n s a t u r a t e dp h o s p h o n a t e s m s c a n d i d a t em a j o r i n gi no r g a n i cc h e m i s t r y ： r o n g - c h a n gt a n g a d v i s o r ：p r o f y a n - h o n gh e a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ft w op a r t s ：p a r tii s m a i n l ya b o u tt h es t u d i e so nt h e e n z y m e c a t a l y z e dh e n r yr e a c t i o n b e c a u s et h ee n z y m e - c a t a l y z e dr e a c t i o ni se f f i c i e n t ， e c o n o m i c a la n de n v i r o n m e n t a lf r i e n d l y , i ta r o u s e dg e n e r a li n t e r e s ti nt h er e s e a r c ho f c a t a l y s i st o d a y o nt h eo t h e rh a n d ，h e n r yr e a c t i o ni so n eo fm o s tp o w e r f u lc cb o n d f o r m i n gr e a c t i o n s t h er e s u l t i n g1 3 - n i t r oa l c o h o l sa r ev a l u a b l es y n t h e t i ci n t e r m e d i a t e si n t h es y n t h e s i s ，w h i c hu s u a l l yw e r ea p p l i e di n t ot h es y n t h e s i so fb i o l o g i c a l l yi m p o r t a n t c o m p o u n d s i nt h i st h e s i sw eu s e dt r a n s g l u t a m i n a s ea n dl i p a s eaa st h ec a t a l y s t st o p r o m o t et h eh e n r yr e a c t i o n t h ec o r r e s p o n d i n gn i t r oa l c o h o l sw e r eo b t a i n e di ny i e l du p t o9 6 i na d d i t i o n ，w ea l s oe x p l o r e dt h ei n f l u e n c eo fr e a c t i o nc o n d i t i o n st ot h e e n z y m e - c a t a l y z e d ，a n dw i t hab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h ee n z y m e - c a t a l y z e dh e n r y r e a c t i o n p a r ti im a i n l ys t u d i e st h es y n t h e s i so f 仪- f l u o r o 一1 3 ，1 ，一u n s a t u r a t e dp h o s p h o n a t e sa n d t h e i rd i e l s - a l d e rr e a c t i o n s b e c a u s eo ft h es t e r i ch i n d r a n c ew ed i d n t g e tt h e d i e l s a l d e rp r o d u c t sa se x p e c t a t i o n t h er e s e a r c ho nt h es y n t h e s i so ff l u o r i n a t e d p h o s p h o n a t ei so n g o i n g k e yw o r d s ：h e n r yr e a c t i o n ；t r a n s g l u t a m i n a s e ；l i p a s ea ；n i t r o - a l k a n e s ； 伍- f l u o r o - i ，7 - u n s a t u r a t e dp h o s p h o n a t e s ；d i e l s a l d e rr e a c t i o n i l l y r n 独创性声明 学位论文题目：醛i 崔化h 星堕盟厦廑的硒究拯垡：氩岱：昼，y 二丕丝塑 塍酸酯的旦i 鱼! 苎：! 鱼丛厦座数翅拯 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：汤彖易签字日期：乃伊年 月弓f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。， ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：坼保密， 口保密期限至年月止)。 学位论交作者签名：国耘 签字魄翻。年箩月咖 导师签名： 曩砭讧 j 签字日期：f 。年厂月71 日 第一部分酶催化h e n r y 反应的研究 第一部分酶催化h e n r y 反应的研究 第一章绪论 1 1h e n r y 反应及酶催化反应的介绍 c c 键形成的反应是有机化学中最重要的化学反应之一。h e n r y 反应则是一类 经济高效的c c 键形成的反应。 i - 3 1 特别是当羰基化合物与含有0 t 氢的硝基烷烃化 合物发生反应时，形成的双官能团化合物b 一硝基醇是众多产物合成中的一种非常 有价值的有机中间体。川例如2 一氨基醇，2 一氨基酮和硝基烯，如图l 所示。1 5 - 7 】这 些化合物又可以用来合成具有生物活性的一系列重要化合物。 8 - 9 1 r ， r 矿父凡一 艮 r 3 r 4 o x - - - - r 3 r 4 2 h o o h 图1p 一硝基醇常作为合成其它化合物的中间体 s c h e m e1j 3 - n i t r oa l c o h o l sa r eo f t e nu s e da sv a l u a b l es y n t h e t i ci n t e r m e d i a t e si nt h es y n t h e s i so f o t h e rp r o d u c t s 因此，催化h e n r y 反应发生的新型手性催化剂的一直深受关注。 1 0 - 1 7 1 如 s c h e m e2 所示，二价双唑啉醋酸铜配合物作为手性催化剂催化h e n r y 反应时其产率 和e e 值分别达到9 5 和9 4 。1 1 3 】 1 h = 艮 限 f oh 暇南人学硕士学位论文 图2 手性铜配体化合物 s c h e m e2c h i r a lc o p p e r - l i g a n dc o m p l e xc o m p o u n d s 另一方面，酶作为催化剂时所具有的处理过程简便，高选择性和反应条件温 和，及其能够大幅度降低化学反应活化能的特点使酶更多的被应用于合成反应中。 酶的生物多样性主要体现在其具有广泛的应用性上：在生物体内，酶作为生 物体内化学反应的催化剂，不断地自我更新，使生物体内及其复杂的代谢活动不 断地，有条不紊的进行；酶由于与某些疾病有着极重要的联系，所以酶在疾病诊 断和临床医疗上有着重要的应用；酶作为催化剂被广泛应用于工业生产中，如酶 工程，一些氨基酸，抗生素的药物的合成都应用了酶催化技术。关于酶作为催化 剂的研究开发正如火如茶的进行着。 1 8 - 1 9 1 o n e p o t 图3 脂肪酶直接催化m a n n i c h 一锅化反应 s c h e m e3l i p a s e c a t a b ，s e dd i r e c tm a n n i c hr e a c t i o ni nao n e p o ts t r a t e g y 近期，四川大学的一篇关r 脂肪酶催化反应的文章发表在g r e e nc h e m i s t r y 上。 其主要是利用脂肪酶的生物催化作用来直接催化m a n n i c h 反应。如s c h e m e3 所示 的实验条件下，该脂肪酶催化m a n n i c h 反应的产率达到8 9 。 2 0 1 上述反应是酶作为催化剂催化化学反应较为典型的r = 例。 2 r 第二章谷氨酰胺转氨酶催化h e n r y 反应的研究探讨 引言 谷氨酰胺转氨酶是一种催化蛋白质，多肽分子内和分子外发生交联作用的酶， 并广泛存在于生物组织中。此外，谷氨酰胺转氨酶还有着丰富的生物多样性，从 而使其在蛋白质变性，食品加工、医药、化妆品、纺织等领域具有重要的潜在应 用价值。但长期以来谷氨酰胺转氨酶作为生物催化剂的应用并没有得到足够的重 目前，澳大利亚的h e r f r i e dg r i e n g l d 、组发现羟基氰基裂解酶对催化h e n r y 反应 有着较好的立体选择性。【2 1 】 q h r c h 。+ 嗡忑b u f f e r t b m e ，r f o 慨 k h y d r o x y n i t r i kl y a s e ，i r t ，4 8 h 、 围4 羟基氰基裂解酶催化醛和硝基甲烷为底物时的h e n r y 反应 s c h e m e4h b h n l - c a t a l y z e dh e n r yr e a c t i o no fa l d e h y d e sw i t hn i t r o m e t h a n e 如s c h e m e4 所示的实验条件下，用羟基氰基裂解酶催化一系列醛的h e n r y 反 应时的产率和e e 值分别达到5 7 和9 9 。此例说明酶催化h e n r y 反应可以得到较高 的产率及较好的立体选择性。 目前，酶作为催化剂来催化h e n r y 反应的研究报道仍较少， 而谷氨酰胺转氨 酶作为催化剂催化h e n r y 反应还没有相关的报道。 谷氨酰胺转氨酶( t r a n s g l u t a m i n a s e ，简称t g a s e 或t g ) ，是以灰轮丝链轮丝菌 ( s t r e p t o r e r t i c i l l i u mg r i s e o v e r t i c i l l a t u m ) 作为生产菌株通过发酵过程所得到。 谷氨酰胺转氨酶是由4 0 6 个氨基酸组成的蛋白质。【2 2 1 其氨基酸序列为： 1m r y t p e a l v fa t m s a v y a p pd s c r r p a r p pp t m a r g k r r sp t p k p t a s r rm t s r h q r a q r 61s a p a a s s a g ps f r a p d s d d rv t p p a e p l d rm p d p y r p s y gr a e t v v n n y ir k w q q v y s h r 121d g r k q q m t e eq r e w l s y g c vg v t w v n s g q yp t n r l a f a s fd e d r f k n e l kn g r p r s g e t r 181a e f e g r v a k es f d e e k g f q ra r e v a s v m n ra l e n a h d e s ay l d n l k k e l an g n d a l r n e d 2 41 a r s p f y s a l rn t p s f k e m gg n h d p s r m k av i y s k h f w s gq d r s s s a d k rk y g d p d a f r p 3 01a p g t g l v d m sr d m i p r s p ts p g e g f v n f dy g w f g a q t e a d a d k t v w t h gn h y h a p n g s l 3 6 1g a m h v y e s k f r n w s e g y s d f d r g a y v i t f ip k s w n m p d kv k q g w p 3 如s c h e m e5 所示，此图为谷氩酰胺转氨酶的m 晶结构图。1 2 3 1 田5 谷氨酰胺转氨酶的单晶结构 s c h e m e 5 c r y s t a ls l r u c t ：u r e o f t r a n s g l u t a m l n a s e 同时，我们对酶催化反应有若浓厚的兴趣，且酶催化反应研究所需的条件相 埘温和所以我们选用了谷氨酰胺转氟酶及其它一螋酶来作为催化h e n r y 反应进行 的催化荆。 2 i 实验仪器和药品 溶剂与试剂均为分析纯所使用的无水溶剂都是按照标准方法处理获得的。 t l c 和柱层析都是使用青岛海洋化工厂生产的g f 2 5 4 型，柱层析硅胶为1 0 0 2 0 0 日和2 0 0 - 3 0 0 目；熔点为x 4 型数字显微熔点仪所测定：。h ，”c - n m r 谱用b r u c k e r a v - 3 0 0 型超导核磁共振波谱仪；d l s b 一低温冷却液循环泵9 8 1 b 型电子调温电热 套d f - 1 0 l s 集热式恒温加热磁力搅拌器s h b - i v 双a 循环水式多用真空泵 r e - 2 0 0 0 旋转燕发仪z x z 8 c 型旋片式真空泵8 5 z 型恒温磁力搅拌器z f i 型三 用紫外分折仪s f g 一0 24 0 0 电热恒温鼓风干燥器f a 2 0 0 4 a 电子天平。 2 2h e n r y 反应的产物2 a s ，3 a - d ，4 a d 的一般合成方法 2 2 i 化台物2 a s 的合成 第一部分酶催化h e n r y 反应的研究 在2 5m l 的圆底烧瓶中加入2 0 0m g 的酶，3m l 的去离子水，和5m l 的二氯甲 烷。再依次加入2 0 0m g 的醛和2g 的硝基甲烷( 3 2m m 0 1 ) 。最后在2 0 3 0 的条 件下搅拌反应。 反应进行了一定时间后，用滤纸将反应体系中的酶滤去以使反应终止。用二 氯甲烷洗涤滤纸多遍，确保滤纸上的产物都洗进了滤液中。再用2 0m l 的二氯甲烷 萃取滤液3 次，合并有机层后，用无水n a 2 s 0 4 干燥，减压蒸馏出去溶剂，得到的粗 产物用石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液快速柱层析得到纯净的产物。 2 2 2 化合物3 a d 及4 a d 的合成 在2 5m l 的圆底烧瓶中加入2 0 0m g 的酶，3m l 的去离子水，和5m l 的二氯甲 烷。再依次加入1m m o l 的醛和2 5m m o l 的硝基烷烃。最后在3 0 的条件下搅拌反 应。 反应进行了一定时间后，用滤纸将反应体系中的酶滤去以使反应终止。用二 氯甲烷洗涤滤纸多遍，确保滤纸上的产物都洗进了滤液中。再用2 0m l 的二氯甲烷 萃取滤液3 次，合并有机层后，用无水n a 2 s 0 4 干燥，减压蒸馏出去溶剂，得到的粗 产物用石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液快速柱层析得到纯净的产物。 2 3 谷氨酰胺转氨酶催化h e n r y 反应实验条件的选择 2 3 1 建立模板反应 选取对硝基苯甲醛和硝基甲烷作为模板反应的底物来探讨酶催化h e n r y 反应 的最佳条件。体积比为1 0 ：l 的环己烷和去离子水作为模板反应体系的溶剂，且反应 选择在2 0 3 0 的室温条件下进行( s c h e m e6 ) 。 c h o 众 i l、l + c h 3 n 0 2 v n 0 2 0 2 n e n z y m e c y c l o h e x a n e w a t e r ，r t n 0 2 h 图6 对硝基苯甲醛和硝基甲烷为底物时的酶催化h e n r y 反应 s c h e m e6e n z y m ec a t a l y z e dh e n r yr e a c t i o no f4 n i t r o b e n z a l d e h y d ea n dn i t r o m e t h a n e 2 3 2 酶的选择 为了得到反应效果最佳的酶，我们用上述模板反应的体系对酶进行了筛选。 如表格所示，谷氨酰胺转氨酶作为催化剂反应3 2 d x 时后，得到的h e n r y 反应的产物 产率达到9 3 ( 表1 ，e n t r y1 ) 。脂肪酶a 和胰酶也有着较好的催化活性( 表1 ，e n t r i e s2 a n d3 ) 。但是，蛋白酶a ，蛋白酶b ，蛋白酶c ，蛋白酶d ，和蛋白酶e 的催化活性就 5 西南入学硕士学位论文 较低( 表1 ，e n t r i e s4 8 ) 。此外，蛋白酶f ，蛋白酶g ，蛋白酶h ，蛋白酶i 和蛋白酶j 作为催化剂时，通过t l c 观察只能得到痕量的产物( 表1 ，e n t r i e s9 - 1 3 ) 。 表1 硝基甲烷和对硝基苯甲醛作为底物时的酶催化h e n r y 反应的产率 t a b l e1t h ec a t a l y t i ca c t i v i t i e so t d i f f e r e n te n z y m e si nh e n r yr e a c t i o nb e t w e e n 4 - n i t r o b e n z a l d e h y d ea n dn i t r o m e t h a n e 表1 的实验条件为：对硝基苯甲醛( 2 0 0m g ，1 3m m 0 1 ) ，硝基甲烷( 2 9 ，3 2m m 0 1 ) ， 去离子水( o 5m e ) ，环己烷( 5m e ) ，酶( 2 0 0m g ) ，实验温度为2 0 3 0 c 。所得初产品 均用柱层析纯化。e d t a 失活处理酶是在1 0 0 的条件下加热回流2 4 小时，n b s 预处理酶是在2 5 条件下搅拌2 4 小时。 同时，我们做了些对照反应来验证谷氨酰胺转氮酶的催化活性。正如所预料 到的，以对硝基苯甲醛和硝基甲烷为底物的h e n r y 反应在不添加酶的条件下，即使 反应进行了5 天后，产率也仅有1 0 ( 表1 ，e n t r y1 4 ) 。而且，非酶作用的牛血清蛋白 作为催化剂时也仅得到1 6 的产率( 表l ，e n t r y1 5 ) ，这样就可以排除蛋白质催化 h e n r y 反应的可能性。当反应用经过e d t a 预处理后的谷氨酰胺转氨酶来催化h e n r y 反应时，即使反应进行了5 天却并没有得至l j h e n r y 反应的产物( 表1 ，e n t r y1 6 ) 。这说 6 第一部分酶催化h e n r y 反应的研究 明谷氨酰胺转氨酶属于金属依赖的酶，且谷氨酰胺转氨酶的三级结构被破坏，从 而产生失活的效应。另外，当使用n b s 对谷氨酰胺转氨酶进行预处理后，谷氨酰 胺转氨酶的活性被强烈的抑制，所催化的h e n r y 反应在反应4 8 d 时以后，产物仅有 1 2 ( 表1 ，e n t r y1 7 ) 。 上述这些对照实验说明了谷氨酰胺转氨酶在催化h e n r y 反应时酶自身的一个特 定的催化部位在起作用，从而催化h e n r y 反应的进行。因此，我们选择了谷氨酰胺 转氨酶作为催化剂来研究h e n r y 反应。 2 3 3 有机溶剂的选择 由于有机溶剂对于酶的活性和反应底物的溶解性都有影响，所以选择合适的 有机溶剂对于酶催化反应同样很重要。所以我们对一系列的溶剂进行了筛选( 表2 ) 。 表2 不同有机溶剂条件下谷氨酰胺转氨酶催化h e n r y 反应的结果 t a b l e2h e n r yr e a c t i o no f 4 - n i t r o b e n z a l d e h y d ea n dn i t r o m e t h a n ec a t a l y z e db yt g a s ei nd i f f e r e n t s o l v e n t s 表2 的实验条件为：对硝基苯甲醛( 2 0 0m g ，1 3m m 0 1 ) ，硝基甲烷( 2 9 ，3 2m m 0 1 ) ， 去离子水( 0 5m e ) ，有机溶剂( 5m e ) ，谷氨酰胺转氨酶( 2 0 0m g ) ，实验温度是 2 0 3 0 。所得初产品均用柱层析纯化。 通过表格我们可以看到：在使用甲基叔丁基醚，二氯甲烷，或者环己烷作为 h e n r y 反应的溶剂时，都可以得到极好的产率( 表2 ，e n t r i e s4 ，5a n d6 ) 。当使用d m s o ， d m f ，或者t 耶作为h e n r y 反应的溶剂时，均能得到中等的产率( 表2 ，e n t r i e s1 ，2a n d 3 ) 。极性较小的有机溶剂可能更有利于谷氨酰胺转氨酶催化的h e n r y 反应。另外， 用去离子水作为溶剂时，h e n r y 反应的产率很低( 表2 ，e n t r y7 ) ，这可能是水对反应 底物溶解性不好的原因。有趣的是，即使是在无溶剂的条件下，h e n r y 反应的产率 也很高( 表2 ，e n t r y8 ) 。 7 曲南人学硕十学位论文 通过对溶剂的筛选，并结合对底物有较好溶解性的特点，我们选择二氯甲烷 作为h e n r y 反应最适宜的有机溶剂。 2 3 4 含水量的选择 因为酶需要适量水的存在才能保持其活性，而对于酶催化的h e n r y 反应，确认 体系所需水的含量就显得很重要。因此，我们对体系中水含量不同时的反应产率 进行了研究( s c h e m e7 ) 。 ，、 装 、- ， 旦 竺 一 0 00 10 20 3o 4o 5 0 6 0 70 80 9 w a t e rc o n t e n t ( v 。眦v 扯h j 0 f o 删h 。) 图7 含水量与有机溶剂量的比值对谷氨酰胺转氨酶催化h e n r y 反应产率的影响 s c h e m e7i n f l u e n c eo f w a t e rc o n t e n ti no r g a n i cs o l v e n to nt h ey i e l do f t h et g a s e c a t a l y z e dh e n r y r e a c t i o n 图7 的实验条件为：对硝基苯甲醛( 2 0 0m g ，1 3m m 0 1 ) ，硝基甲烷( 2 9 ，3 2m m 0 1 ) ， 谷氨酰胺转氨酶( 2 0 0m g ) ，实验温度足2 0 3 0 。c 。二氯甲烷( 5m l ) ，反应体系中去 离子水和二氯甲烷的体积比依次为0 - 0 9 ，所得初产品均用柱层析纯化。 观察图7 ，当水与二氯甲烷的体积比小于0 6 时，谷氨酰胺转氨酶催化的h e n r y 反应产率随着水含量的增多而提高。但是，体系中的水与二氯甲烷的体积比一旦 超过0 6 后，h e n r y 反应产率明显下降，这可能是由于体系对底物的溶剂性不够而 导致的。所以，我们选择了水与二氯甲烷的体积比为0 6 时的水量作为h e n r y 反应 的最适宜含水量。 2 3 5 投料比的选择 为了得到最优的实验条件，我们进_ 步的研究了硝基甲烷的量对h e n r y 反应的 影响( 表3 ) 。 表3 硝基甲烷的投料比对h e n r y 反应的影响 8 鲇 鲒 筠 加 第一部分酶催化h e n r y 反应的研究 t a b l e3e f f e c to fm o l a re q u i v a l e n t so fn i t r o m e t h a n eo nt h ey i e l do fh e n r yr e a c t i o n 表3 的实验条件为：对硝基苯甲醛( 15 1m g ，lm m 0 1 ) ，谷氨酰胺转氨酶( 2 0 0r a g ) ， 去离子水( 3m e ) ，二氯甲烷( 5m l ) ，硝基甲烷的量从1m m o l 至3 0m m o l 不等。实 验温度为2 0 3 0 。所得初产品均用柱层析纯化。 从表3 我们可以看出：醛的量为1 摩尔时，硝基甲烷的量在2 5 或3 0 摩尔时， h e n r y 反应的结果最好。所以，我们选择2 5 当量的硝基甲烷作为h e n r y 反应最适 宜的量。 2 3 6 酶量的选择 在一定范围内酶的浓度与反应初速度呈j 下相关。为了寻找到催化效果好，时 间短并且酶量经济的条件，我们对不同酶含量催化反应进行了对比，结果如下： 表4 酶量对h e n r y 反应的影响 t a b l e4e f f e c to ft g a s el o a do nt h ey i e l do fh e n r yr e a c t i o n 9 西南大学硕士学位论文 表4 的实验条件为：对硝基苯甲醛( 1 5 1m g ，1m m 0 1 ) ，硝基甲烷( 1 5 9 ，2 5m m 0 1 ) ， 去离子水( 3m e ) ，有机溶齐t j ( 5m e ) ，谷氨酰胺转氨酶酶量从5 0m g 至5 0 0m g 不等， 实验温度是2 0 3 0 。所得初产品均用柱层析纯化。 如表4 所示，我们对酶量的选择进行了研究。酶的量在5 0m g 到1 0 0m g 之间时， h e n r y 反应的产率明显不同。但一旦酶的量超过1 0 0m g 后，h e n r y 反应的产率保持 在9 0 左右。酶量选择的结果表明1 0 0m g 的谷氨酰胺转氨酶是以对硝基苯甲醛和硝 基甲烷为底物的h e n r y 反应的最佳酶量。但是考虑到一些底物反应速率的影响，我 们最终选择了2 0 0m g 的酶量作为h e n r y 反应的最适宜酶量。 2 3 7 温度的选择 任何酶都有它对应的活性温度范围，温度过低或过高都会影响催化效果甚至 会破坏酶的结构，导致酶失活。为此，我们对温度对于h e n r y 反应的影响做了研 究( 表5 ) 。 表5 温度对h e n r y 反应的影响 t a b l e5e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nt h ey i e l do fh e n r yr e a c t i o n 表5 的实验条件为：对硝基苯甲醛( 1 5 1m g ，1m m 0 1 ) ，硝基甲烷( 1 5 9 ，2 5 m m 0 1 ) ，谷氨酰胺转氨酶( 2 0 0m g ) ，去离子水( 3m l ) ，二氯甲烷( 5m l ) ，实验温 度为3 0 ，3 5 和室温( 2 0 3 0 ) ，所得初产品均用柱层析纯化。 从图5 可以看出，以对硝基苯e t 醛和硝基甲烷为底物的h e n r y 反应，在室温 ( 2 0 - 3 0 ) ，3 0 和3 5 三种刁i 同温度条件下，产率变化较小。 考虑到二氯甲烷的沸点，所以，我们最终选择了3 0 为最佳反应温度。 2 3 8 一系列醛的h e n r y 反应 在得到最优化的反应条件后，我们选择了另外一系列的醛，在以谷氨酰胺转氨 酶为催化剂的条件下对h e n r y 反应进行了更深入的研究与探讨( 表6 ) 。以便证实谷氨 酰胺转氨酶的一般性质及其生物多样性。而从图6 中即可以验证我们的推断。 表6 以硝基甲烷为底物，谷氨酰胺转氨酶为催化剂时，不同醛的反应情况 t a b l e6t g a s ec a t a l y z e dh e n r yr e a c t i o no fa l d e h y d e sw i t hn i t r o m e t h a n e 1 0 第一部分酶催化h e n r y 反应的研究 +ch3n02面器鼯，r人ohrcho n 0 2 + 西面面万丁一 r h u 2 l a s 2 a - s e n 仃y r t i m e ( h ) y i e l do f 2 ( ) 1 p h ( 1 a ) 9 6 5 8 2 2 - m e o c 6 h 4 ( 1 b ) 1 2 0 5 1 3 3 - m e o c 6 h 4 0 c ) 12 05 9 4 4 - m e o c 6 h 4 ( 1 d ) 12 0 5 0 5 4 - c h 3 c 6 h 4 ( 1 e ) 12 06 0 6 2 - n 0 2 c 6 h 4 ( 1 0 12 0 8 6 7 3 - n 0 2 c 6 h 4 ( 1 9 ) 1 2 0 6 2 8 4 - n 0 2 c 6 h 4 ( 1 h ) 4 8 9 6 9 4 - f c 6 h 4 ( 1 i ) 12 06 8 1 0 4 - b r c 6 h 4 ( i j ) 1 2 0 6 8 11 2 - c i c 6 h 4 ( 1 k ) 1 2 0 7 7 1 2 3 - c i c 6 h 4 ( n ) 1 2 0 6 4 13 4 - c i c 6 h 4 ( 1 m ) 12 0 6 4 1 4 4 - c n c 6 h 4 ( 1 n ) 1 2 0 7 9 15 2 - t h i e n y l ( 1 0 ) 1 2 021 1 6 2 - f u r y l ( 1 p ) 1 2 0 1 2 1 7 ethyl(1q)48 6 i l8 n p r o p y l ( 1 r ) 4 8 7 0 1 9i s o b u t y l ( 1 s ) 4 8 71 表6 的实验条件为：e 1 ( 2 0 0m g ) ，硝基甲烷( 2 9 ，3 2m m 0 1 ) ，谷氨酰胺转氨酶 ( 2 0 0m g ) ，去离子水( 3m e ) ，二氯甲烷( 5m e ) ，反应温度为2 0 3 0 。所得初产品均 用柱层析纯化。 一系列的芳香醛，杂环醛和脂肪醛在谷氨酰胺转氨酶的催化作用下，都发生 了相应的反应。一般来说，对于芳香醛而言，带有吸电子基官能团的醛h e n r y 反应 后，所对应生成的p 硝基醇化合物的产率都高于6 2 ( 表6 ，e n t r i e s6 - 1 4 ) 。尤其是， 邻硝基苯甲醛和对硝基苯甲醛h e n r y 反应的产率分别达到t 8 6 年i 9 6 ( 表6 ，e n t r i e s 6a n d8 ) 。相反的是，芳香醛中有推电子基官能团时，h e n r y 反应的产率较低( 表6 ， e n t r i e s2 5 ) 。这是由于吸电子基团增强了羰基的亲电子性，而推电子基的作用刚好 相反。另外，谷氨酰胺转氨酶为催化剂的h e n r y 反应中，脂肪醛的反应速度更快， 且得到了较好的产率( 表6 ，e n t r i e s1 7 1 9 ) 。这可能是由于脂肪醛的烷基对反应进行 】1 西南大学硕士学位论文 的阻力较小的原因。 在杂环醛的酶催化h e n r y 反应中，2 位取代的噻吩甲醛( 1 0 ) 和呋喃甲醛( 1 p ) 的酶 催化h e n r y 反应的进程很明显的受到了杂环原子的影响。2 位取代的噻吩甲醛( 1 0 ) 和呋喃甲醛( 1 p ) 的产率都较低。有趣的是，我们经过对2 位取代的呋喃甲醛( 1 p ) 反 应过程的检测，意外的发现存在着个h e n r y m i c h a e l 的两步反应过程，得到了一 个产率为3 6 的2 硝基取代的化合物3 ，【2 1 】但所期望得到的化合物产率只有1 2 ( s c h e m e8 ) 。 分c h 。+ c h 3 n 0 2 t g a s e c h 2 c 1 2 h 2 0 ，r t c h s n 0 2 qp h 崂弋n 0 2 2 p r o 虮n 0 2 图8 糠醛与硝基甲烷之间发生h e n 拶m i c h a e l 白勺串联反应 s c h e m e8t a n d e mh e n r y mi c h a e lr e a c t i o nb e t w e e n2 - f u r a l d e h y d ea n dn i t r o m e t h a n e 2 3 9 其它硝基烷烃白, j h e n r y 反应 此外，我们还分别对硝基乙烷( 表7 ) 或硝基丙烷( 表8 ) 为底物时的谷氨酰胺转氨 酶催化的h e n r y 反应进行了探讨。 表7 谷氨酰胺转氨酶催化醛和硝基乙烷的反应 t a b l e7t g a s ec a t a l y z e dh e n r yr e a c t i o no fa l d e h y d e sw i t hn i t r o e t h a n e 表7 的实验条件为：醛( 1m m 0 1 ) ，硝基乙烷( 1 5g ，2 5m m 0 1 ) ，谷氨酰胺转氨酶 ( 2 0 0m g ) ，去离子水( 3m e ) ，二氯甲烷( 5m e ) ，反应温度为3 0 。所得初产品均用 柱层析纯化。差相异构产物用高效液相色谱的a d h 柱及1 hn m r 来检测。 1 2 们 3 o 矿 r = 第一部分酶催化h e n r y 反应的研究 表8 谷氨酰胺转氨酶催化醛和硝基丙烷的反应 t a b l e8t g a s ec a t a l y z e dh e n r yr e a c t i o no fa l d e h y d e sw i t hn i t r o p r o p a n e 表8 的实验条件为：醛( 1m m 0 1 ) ，硝基丙烷( 2 2g ，2 5m m 0 1 ) ，谷氨酰胺转氨酶( 2 0 0 m g ) ，去离子水( 3m l ) ，二氯甲烷( 5m e ) ，反应温度为3 0 。所得初产品均用柱层 析纯化。差相异构产物用高效液相色谱的a d h 柱及1 hn m r 来检测。 如表格七和表格八所示，芳香醛发生h e n r y 时，取代基电子效应的影响与以硝 基甲烷为底物时效果一样。如预测的一样，吸电子取代基的对硝基苯甲醛与硝基 乙烷的酶催化反应的产率高达9 0 ( 表7 ，e n t r y3 ) ，与硝基丙烷反应时的产率更达到 了9 4 ( 表8 ，e n t r y3 ) 。而推电子取代基芳香醛和硝基乙烷及硝基丙烷的h e n r y 反应 只得到了中等的产率( 表7 ，e n t r i e s1 - 2a n d 表8 ，e n t r i e s1 2 ) 。同时，脂肪醛与硝基 乙烷及硝基丙烷的h e n r y 反应也得到了较好的产率( 表7 ，e n t r y4a n d 表8 ，e n t r y4 ) 。 另外，芳香醛与硝基乙烷和硝基丙烷的h e n y 反应得到了差相异构的产物，且主要 得到的是顺式产物( 表7 ，e n t r i e s1 3a n d 表8 ，e n t r i e s1 3 ) 。但3 甲基正丁醛o s ) 与硝基 乙烷和硝基丙烷的产物没有差相异构体( 表7 ，e n t r y4a n d 表8 ，e n t r y4 ) 。总结硝基乙 烷及硝基丙烷的h e n r y 反应的结果，发现硝基烷烃碳链的长度对h e n r y 反应也存在 影响。一般情况下，相比硝基甲烷，碳链更长的硝基乙烷及硝基丙烷的h e n r y 反应 需要更长的时间，产率且更低，这可能是因空间位阻的作用所导致的。 2 4 谷氨酰胺转氨酶催化h e n r y 反应的机理 基于我们所探讨的结果，我们提出了谷氨酰胺转氨酶催化h e n r y 反应的一个可 能存在的机理，即s c h e m e9 所描述的。首先，体系中的氨基基团协助硝基烷烃去 质子化形成氮酸酯，然后，氮酸酯亲核进攻醛的羰基碳形成c c 键。同时，酶中的 铵基提供给羰基氧形成产物b 硝基醇。 1 3 西南人学硕士学位论文 _ _ 。一r o 。1 e n z y m e | r ：, n t y m p l ：是n h 2 ，8 + h 2 苍、h 胃誊+ h 星 图9 酶催化h e n r y 反应可能的机理 h h n 0 2 r s c h e m e9p r o p o s e dm e c h a n i s mo fe n z y m a t i ch e n r yr e a c t i o n 2 5 化合物的核磁数据 1 苯基一2 一硝基醇( 2 a ) y e l l o wo i l ；1 h n m r ( 3 0 0m h z ，c d c l 3 ) ：6 = 3 0 5 ( 1 h ，b rs ) ，4 4 8 ( 1 h ，d d ，户1 3 2 5h z ， j - - 3 1 5h z ) ，4 5 8 ( 1 h ，d d ，j - - 1 3 2 4h z ，j = 9 4 7h z ) ，5 4 3 ( 1 h ，d ，户9 3 3h z ) ，7 3 8 ( 5 h ， s ) 【2 l 】 1 一( 2 甲氧苯基) - 2 - 硝基醇( 2 b ) y e l l o wo i l ；1 h n m r ( 3 0 0m h z ，c d c l 3 ) ：6 = 3 2 2 ( 1 h ，d ) ，3 8 8 ( 3 h ，s ) ，4 5 2 - 4 6 6 ( 2 h ， m ) ，5 6 2 ( 1 h ，b rs ) ，6 9 1 ( 1 h ，d ，j = 8 2 5h z ) ，7 0 1 ( 1 h ，t ，卢7 4 3h z ，户7 4 4h z ) ，7 3 3 ( 1 h ，t ，j = 7 7 4h z ，j = 7 7 9h z ) ，7 4 3 ( 1 h ，d ，, - - 7 4 5h z ) 1 1 1 ( 3 甲氧苯基) 2 硝基醇( 2 c ) y e l l o wo i l ；1 h n m r ( 3 0 0m h z ，c d c l 3 ) ：5 = 3 1 8 ( 1 h ，b rs ) ，3 7 9 ( 3 h ，s ) ，4 4 5 - 4 6 0 ( 2 h ， m ) ，5 3 9 ( 1 h ，d ，j - - 9 2 6h z ) ，6 8 7 ( 1 h ，d ，j - - 8 5 6h z ) ，6 9 3 ( 2 h ，d ，户6 5 9h z ) ，7 2 9 ( 1 h ， t ，j - - 8 0 4h z ，j - - 8 1 5h z ) 【1 7 】 1 ( 4 甲氧苯基) 一2 一硝基醇( 2 d ) y e l l o wo i l ；1 h n m r ( 3 0 0m h z ，c d c l 3 ) ：5 =