（果树学专业论文）珠眉海棠与山定子耐盐机理的对比研究.pdf

摘要 以耐盐的珠眉海棠( m a l u sz u m im a t s ) 和盐敏感的山定子( m a l u sb a c c a t a ( l ) b o r k h ) 为 试材，研究了苹果属植物不同基因型耐盐机理和盐伤害机理，结果表明： l 拒盐和泌盐机理的研究 盐胁迫对生物量、n a + 含量、拒盐能力、泌盐能力有明显的影响。盐胁迫下，苹果属 植物生物量降低，盐敏感的山定子降低幅度大于耐盐的珠眉海棠。盐处理8 天，珠眉海棠 n a + 含量为根 叶 茎；山定子在低盐胁迫下根 叶 茎，在高盐胁迫下叶 根 茎。盐处理1 5 天，二者均为叶 根 茎，但珠眉海棠有更多的n a 十分配在茎。珠眉海棠与山定子拒盐能力 均为9 6 ，泌盐能力珠眉海棠为0 1 - 0 2 ，山定子为0 0 7 6 0 0 8 。在高盐胁迫下，珠眉 海棠植株体内吸收的n a + 离子6 1 由叶片分泌至体外，而盐敏感的山定子仅为2 5 。由此 推论，山定子与珠眉海棠均为拒盐型植物，拒盐在苹果属植物耐盐机理中起主导作用；泌 盐是耐盐的苹果属植物珠眉海棠的一种耐盐机理，但不起主导作用。 2 细胞中离子区域化的研究 ， 采用灌注离心技术研究了珠眉海棠和山定子质外体、共质体离子浓度的变化。i 结果表 明，随盐胁迫加重，茎顶端第二叶含水量、水势降低，山定子降低幅度大于珠眉海棠。与 此同时，叶片n a + 含量、质外体、共质体n a + 浓度升高，但珠眉海棠低于山定子。珠眉海 棠在低盐胁迫下能保持高的共质体、质外体n a + 浓度梯度一比值为1 1 0 l ，在高盐胁迫下降 低，山定子n a + 浓度梯度低于对照。说明珠眉海棠在盐胁迫下能保持高的离子区域化能力。 叶片c a 2 + 含量、质外体、共质体c a 2 + 浓度和n a + c a 2 + 均随盐胁迫加重而升高。叶片k + 含 量呈增加趋势。p ， 3 盐胁迫下膜系统的研究 ， ，对胁迫1 5 天的珠眉海棠和山定子叶片细胞质膜透性、叶绿素含量、i l d a 、膜保护酶系 统。d 、p o d 、c a t 活性及根细胞膜透性的研究结果表明，盐胁迫对根系细胞质膜透性没有 明显的影响，叶片细胞质膜透性增加，山定子高于珠眉海棠。在1 0 0 n t l 的高盐胁迫下，山 定子叶片细胞质膜透性达9 0 ，表明细胞膜受到严重的破坏。随盐胁迫加重，叶绿素a 、b 含量降低，叶绿素a 叶绿素b 增加，类胡萝h 素变化不明显。l i l d a 含量随盐胁迫而升高， 珠眉海棠低于山定子。山定子s o d 、p o d 、c a t 活性随盐胁迫加重而降低，珠眉海棠s o d 活 性在盐胁迫f 保持稳定，p o d 、c a t 增高。e h 此推论珠眉海棠有较强的膜保护酶系统。l 、。 关键讯苹果秒，譬，离子甲膜保占酶，篓岁通 椭禽裳。凸蚂， ll c o m p a r a t i v e s t u d i e so ns a l tt o l e r a n c em e c h a n i s m s o f m a l u sz u m ia n dm a l u sb a c c a t a m a l i q i n g ( i n s t i t u t ef o rh o r t i c u l t u r a lp l a n t s ，c o l l e g eo f h o r t i c u l t u r a ls c i e n c e ，c h i n aa g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y , b e i j i n g1 0 0 0 9 4 ) a b s t r a c t t h es a l tt o l e r a n c es p e i c e sm a l u sz u m im a t sa n dt h er e l a t i v e l ys a l ts e n s i t i v es p e i c e sm a l u s b a c c a t a ( l ) b o r k hw e r ee m p l o y e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l st os t u d yo nm e c h a n i s m so fs a l t t o l e r a n c ea n ds a l ti n j u r y t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 1 h em e c h a n i s mo fs a l te x c l u s i o na n ds e c r e t i o ni nm a l u s t h ei n f u l e n c eo f s a l ts t r e s so nb i o m a s ，r a t i oo f d r yw e i g ht of l e s hw e i g h ，i o nc o n t e n ta n dt h e a b i l i t y o fs a l ts e c r e t i o na n de x c l u s i o nw e r er e m a r k a b l e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eb i o m a s d e c r e a s e du n d e rs a l i n i t yb u ti td i d n ts h o ws i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e st h er a t i oo ff w d wf o r mz u m im a t s k e p tc o n s t a n ta n dd e c r e a s e di nmb a c c a t a ( l ) b o r k h a f t e r 8d a y ss a l ts t r e s s ，t h e n a c o n t e n t si nr o o tw e r et h eh i g h e s t ，t h es e c o n dw e r el e a f , t h es t e mw a st h el o w e s ti tw a st h e s a m ef o ri v b a c e a t a ( l ) b o r k hu n d e r5 0m mn a c is t r e s s ，b u tt h en a _ c o n t e n t si nl e a f w e r et h e h i g h e s tf o rmb a c c a t a ( l ) b o r k hu n d e r1 0 0m m n a c is t r c s s ，w h i c hw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h e s a l ts t r e s sf o r1 5d a y t h en a 十e x c l u s i o nw a sa c c o u n t e df o r9 6 o f t h et h e o r e t i c a lm a x i m u mi o n u p t a k eb o t hmb a c c a t a ( l ) b o r k ha n dm z u m im a t s o ft h e o s ew e r et a k e nu p6 1 w e r e s e c r e t e df r o mt h es h o o t si nmz u m im a t sa n do n l y2 5 i nmb a c c a t a r l ) b o r k h w ec a ni n f e r f r o mt h e s ea n a l y s i s e st h a tmz u m im a t si sm o r es a l tt o l e r a n tt h a nmb a c c a t a ( l ) b o r k h t h e y a l la t t r i b u t et os a l te x c l u s i o nt y p e s s a l te x c l u s i o ni sam a i nm e c h a n i s mo fs a l tt o l e r a n c ef o rm z u m i s e c r e t i o ns a l ti sam e c h a n s i o no fs a l tt o l e r a n c ef o rmz u m im a t s b u tn o tam a i n m e c h a n s i o n 2 t h em e c h a n s i o no fi o nd i s t r i b u t i o ni nc e l l i o nr e l a t i o n so f a p o p l a s t i ca n d s y m p l a s t i cs p a c e i nl e a v e sf r o ms a l ts e n s i t i v emb a c c a t af l l b o r k ha n ds a l tt o l e r a n c emz u m im a t sw e r es t u d i e db yt e c h n i q u eo fv a c c u mi n f i l t r a t i o na n d c e n t r i f i c a t i o n t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tw a t e rc o n t e n ta n dw a t e r p o t e n t i a l i nl e a v e s d e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gs a l ts t r e s s ，m e a n t i m ef h en a 十c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e di nl e a v e s ， a p o p l a s ta n ds y m p l a s to fb o t hs p e c i e s b u ts a l tt o l e r a n c e 膨z u m im a t sh a dam o r eh i g h e r 3 c a p a c i t yt om a i n t a i n n a + c o n c e n t r a t i o ng r a d i e n t sb e t w e e ns y m p l a s ta n da p o p l a s te s p e c i a l l yu n d e r 5 0m mn a c is t r e s sa n dt h en a + g r a d i e n to fs y m p l a s t a p o p l a s tw a s1 10 1 c a ”c o n c e n t r a t i o na n d n a * c a 2i n c r e a s e du n d e rt h e i n c r e a s i n g s a l ts t r e s si n t e a f , a p o p l a s t a n d s y m p l a s t k + c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e du n d e rt h ei n c r e a s i n gs a l ts t r e s si nl e a f ，a p o p l a s ta n ds y m p l a s t ，b u tt h e k 1 n d e c r e a s e d t h o s ea n a l y s i s e ss u g g e s t e dt h a ts a l tt o l e r a n tmz u m im a t sh a dm o r ea b i l i t yt o m a i n t a i ni o nd i s t r i b u t i o ni nc e l lt h a nm b a c c a t a ( l ) b o r k h 3 t h em e c h a n i s mo fa n t i o x i d a t i v es y s t e mt os a l tt o l e r a n c e u n d e rs a l t s t r e s s ，t h e m d ac o n t e n ta n dm e m b r a n c ep e r m e a b i l i t yi nl e a fi n c r e a s e d ， e s p e c i a u t l yu n d e r1 0 0m m n a c is t r e s st h em e m b r a n c e p e r m e a b i l i t yf o rmb a c c a t a ( l ) b o r k h i n c r e a s e de n o r m o u s l yw h i c he x p r e s s e dt h em e m b r a n c eh a db e e nd e s t r o y e di n t e n s i v e l y t h e c h l o r o p h y l la ( c h l a ) ，c h l o r o p h y l l b ( c h l b ) c o n t e n td e c r e a s e d ，t h e c h l a c h l b i n c r e a s e d ，b u tt h e c a r o t e n o i dc o n t e n tk e p tc o n s t a n t t h er o o tm e m b r a n c ep e r m e a b i l i t yd i d n ts h o wo b v i o u s l y c h a n g e s t h em e m b r a n ep r o t e c t i v ee n z y m e s ，s o d ，p o da n dc a t d e c r e a s e df o rm b a c c a t a ( l ) b o r k h ，w h e r e a st h es o d k e p tc o n s t a n ta n dp o d a n dc a ti n c r e a s e df o rmz u m im a t st h e r e s u l ts u g g e s t e dt h a ts a l tt o l e r a n tmz u m im a t sw e r eb e t t e r p r o t e c t e da g a i n s ta c t i v eo x y g e n s p e c i e su n d e rs a l t s t r e s st h a nt h er e l a t i v e l ys a l t s e n s i t i v e 腻b a c c a t a ( l ) b o r k ha n dh a d s t r o n g e rm e m b r a n c ep r o t e c t i v ee n z y m es y s t e m k e yw o r d s ：m a l u s s a l te x c l u s i o ns a l ts e c r e t i o ni o nd i s t r i b u t i o nm e m b r a n c e p r o t e c t i v ee n z y m e s - 4 缩略语 英文缩写及符号中文名称英文名称 o ， b s a c a t d t t f 6 p g 6 p d h h o h 2 0 2 h e p e s h p i m d a n a d p n b t p o d s o d t r i s m e t t c a t b a v b ， 单线氧 牛血清蛋白 过氧化氢酶 二硫苏糖醇 果糖6 一磷酸 葡萄糖6 磷酸 羟自由基 过氧化氢 三羟甲基甘氩酸 磷酸己糖异构酶 丙二醛 烟酰胺腺嘌呤辅酶i i 硝基蓝四唑 过氧化物酶 超氧化物歧化酶 三羟甲基氨基甲烷 蛋氨酸 三氯乙酸 硫代巴比妥酸 核黄素 s i g l e to x y g e n b o v i n e s e r u ma l b u m i n c a t a l a s e d i t h i o t h r e i t o l f r u c t o s e - - 6 - - p h o s p h a t e r o b i s o n e s t e r h y d r o x y lr a d i c a l h y d r o x y lp e r o x i d e b o e h r i n g e r h e x o s ep h o s p h a t ei s o m e r a s e m a l o n a l d e h y d e h i c o t i n a m i d ea d e i v i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e n i t r ob l u et e t r a z o l i u m p e r o x i d a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t r i s - h y d r o x y m e r h y l a m i n om e t h a n e m e t h i o n i n e t r i c h l o r a c e t i ea c i d s u l f o b a r b i t i ca c i d h e p a t o f l a v i n 文献述评 植物的耐盐机理是植物对环境长期适应中进化形成的。许多盐生植物具有特殊的耐盐 机理，吸盐型植物将进入体内的盐分通过细胞的离子区隔化作用分配积累于液泡或通过组 织的肉质化冲淡盐离子对植物的毒害；泌盐植物通过特殊的盐腺或盐囊泡把体内过多的盐 分排出体外。淡土植物多为拒盐型植物，通过对盐离子的选择性吸收和适度控制盐分在不 同器官、组织或细胞不均一分配的协调作用，以及地上部盐分通过韧皮部向下运输等来维 持地上部光合细胞中相对低的盐离子浓度，通常每种植物都具有不同程度的上述两种机制 ( 刘友良，1 9 9 3 ) 。 l 拒盐机理 通过拒盐降低地上部盐分浓度是植物耐盐的重要机理之一，拒盐植物一般具以下特征： 第一，植物拒绝或减少n a 十进入根细胞内，即使进入，细胞n a + h + 泵可将其排出；第二， 植物把吸收的n a + 贮于根、茎基部、节和叶鞘等薄壁细胞发达的器官或组织中，并将n a + 封闭在这些细胞的中央液泡中，从而阻止n a + 向叶片运输；第三，植物吸收的n a + 在木质 部向上运输过程中被木质部或韧皮部传递细胞吸收并释放到韧皮部，再运回根中，最后， 分泌到环境中；第四，盐胁迫下，植物吸收的n a + 向上运输特别是向叶片运输选择性降低， 而k + 选择性增加( 王宝山，1 9 9 7 ) 。 1 1 盐胁迫下植物对离子的选择性吸收和运输 根系凯氏带是n a + 、c i - 等离子进入植物体的主要屏障，阻止了离子由质外体向共质体 的运输，因此大多数n a + 跨膜经共质体而达到木质部。只有在根尖、内皮层未完全木质化 的幼根或正在发育的侧根，离子才能经过内皮层的质外体被动运输( y e oe ta l ，1 9 8 6 ) 。由 于根系对离子的选择性吸收，共质体k + 浓度可比质外体或土壤溶液高5 0 2 0 0 倍( 胡坞敬 等，1 9 9 3 ) 。质膜h + - a t p a s e 活性、阳离子通道对不同离子的通透性、k + ，h + 共运输以及n a + h + 逆向运输等过程决定植物根系对离子的选择性。植物在轻度盐胁迫下，k + 的吸收量大于 n a 十，并对n a 十的吸收有抑制作用，同时n a t 通过n a * h + 逆向运输被大量排出细胞外。而在 高盐胁迫下h * - a t p a s e 活性降低( 王宝山，1 9 9 1 ) ，对离子的选择性下降，大量的n a + 流入 ( b i n z e la n dr e u v e n i ，1 9 9 4 ) 。k + n a + 是调节质膜a t p a s e 活性的重要因素。耐盐的植物 无论根系还是茎中k + n a + 和i - f - a t p a s e 活性一直高于盐敏感的植物( j a t t i m ie ta l ，1 9 9 2 ； l a t t i n i ，1 9 9 5 ：n e q r i n i ，1 9 9 5 ) 。此外，耐盐的植物吸收k + 、c a “向上运输选择性增加， 而n a + 向上运输选择性降低，这主要表现在盐胁迫下根系k + n a + 与地上部k + n a + 值明显增 加，而盐敏感植物相反。耐盐植物在盐渍环境中叶片n a + 含量较低，而k + 、c a ”较高，根 中n a + 含量高，盐敏感型植物相反。c a 2 + n a + 高，可提高质膜对离子的选择性，原因是c a 2 + 、 m 2 2 + 共同调节a t p a s e 活性( r i n a l d e l l ia n dm a n c u s o ，1 9 9 6 ) ，且c a 2 + 对膜的稳定性起保护 作用( c r a m e r ，1 9 8 5 ) 。 1 2 木质部液流中n a + 再吸收 植物地上部n a + 含量取决于木质部蒸腾流中n a + 浓度，木质部蒸腾流n a + 浓度取决于两 个方面，一方面是根、茎基部的拒n a + 作用，另一方面是木质部薄壁细胞对木质部汁液离子 的选择性吸收和释放。通过不同根段渗出液的浓度分析，发现红花菜豆根近基区域含n a + 量大大超过根尖和叶片，此区域木质部汁液中n a + l ( + 只有0 8 ，而木质部薄壁细胞中却高 达3 2 ，显然木质部汁液中n a + 被薄壁细胞重新吸收并大量积累( 刘友良，1 9 9 2 ；y e o ，1 9 7 7 ) 。 n a + 被木质部薄壁细胞重新吸收通过质膜上n a + i ( + 交换进行，增加木质部汁液中k + 的浓度 和向上运输，从而改善了地上部分k * n a + ，减少n 矿在叶片中的积累和毒害作用( l a c a n e ta l ，1 9 9 5 ；刘友良，1 9 9 8 ) 。 一些淡土植物菜豆、玉米等地上部也具有拒盐能力，根系吸收n a + 、c i 经木质部传递 细胞运输到叶片，再通过韧皮部传递细胞进入韧皮部筛管再将离子运回茎基部和根部，形 成n a + 在植株体内的循环过程，并进而调节根系对n a + 的吸收速率( d r e we t a l ， 1 9 8 7 ) 。 中等盐胁迫条件下，白羽扇豆和蓖麻的茎、叶柄韧皮部汁液中n a + 显著高于木质部而 茎基部韧皮部n a * 最高。芦苇地上部所含”n a + 的6 6 向根部下运，且茎基部木质部液流中 n a + 可横向运输到韧皮部，并与地上部下运的n a + 一同向下运至根部，最后分泌到环境中( 余 叔文等，1 9 9 9 ) 。即植物通过脉内再循环( i n t r a v e i n a lr e c y c l i n g ) 把n a + 再运到体外( 赵可 夫，1 9 9 9 ) 。 2 叶片排盐机理 泌盐植物是依赖于叶片或茎上盐腺的分泌作用将植物体内过剩的盐分分泌到体外或 贮存到盐囊泡中( l i p h s c h i t za n dw a i s e l ，1 9 7 4 ；m a r c u m ，1 9 9 8 ) ，以调节组织含盐量，使组 织免受盐害。泌盐是主动生理过程，与外界的盐浓度、温度、光照、以及光周期有关。除 盐腺外，植物还通过淋溶和吐水方式排盐。淋溶去盐是热带红树林植物和其他海岸盐生植 物的主要脱盐方式，如可通过蒸腾流将叶细胞内和积累在叶表面的盐分排掉，干旱地区通 过大雾也可将植物组织中的盐分淋溶掉；一些植物通过排水孔把地上部盐分排掉( 赵可夫， 1 9 9 9 ) 。还有些植物通过落叶的办法降低植物体内盐分( w a i s e l ，1 9 7 4 ) ，如盐生植物灯心草， 叶片衰老后盐分达到饱和即脱落f v e oa n df l o w e r s ，1 9 8 4 ) 。许多盐生植物都具有这种现象， 即幼叶含盐量少，成熟叶片含盐量高，衰老叶片含盐量最高，n a + 在成熟和衰老叶片中积累， 避免或减轻了盐离子对幼叶的伤害，这一机制普遍存在于各种植物中。 3 离子区域化作用 2 无论是盐生植物还是非盐生植物，盐离子在植物体内区域化都是重要的耐盐机制。对 玉米( j o h a n s e na n d c h e e s e m a n ，1 9 8 3 ) 、蓖麻、大麦( j a s c h h e l ，1 9 8 4 ) 、石榴( 汪良驹，1 9 9 5 ) 、 柑橘( w a l k e r ，1 9 8 6 ) 等植物的研究表明，耐盐类型植物地下部n a + 分布高于地上部，盐 敏感的相反。由于相对于茎和根，分生组织和叶片对n a + 更敏感，n a + 在根、茎中木质部积 累，减少了n a * 离子对于分生组织和叶片的伤害作用。而不同器官离子的区域化基于各器 官细胞的耐盐性和细胞对离子的区域化作用。 液泡是植物成熟细胞中最大的细胞器，能贮存营养和代谢产物，避免有毒溶质对细胞 的伤害。盐生植物和较耐盐的淡土植物组织所吸收的n a + 、c l _ 主要分布在液泡内作为渗压 剂，盐离子在液泡的分布是植物抗盐性的重要特征( f l o w e r sa n dr e o ，1 9 7 7 ) 。苜蓿悬浮细 胞液泡中n a 十、c r 分别占原生质体n a + 、c i - 分布总量的7 3 8 9 1 2 和7 4 8 9 4 ( 贺志 理等，1 9 9 2 ) 。盐分积累于液泡是维持细胞质中高k + ，n a + 的最有效的机理之一。m u n n s ( 1 9 9 3 ) 认为植物根系吸收盐离子的开始阶段，首先被区域化在液泡中，当盐离子饱和后， 即达到液泡最大负荷，继续增加的盐离子在质外体和细胞质中积累，达到一定浓度后产生 伤害。叶片中n a + 累积与根中相同( c h e e s e ，1 9 8 8 ) 。 早期的研究认为盐离子经木质部汁液到达叶片，经叶肉细胞质外体到达液泡。当叶肉 细胞液泡n a + 饱和时，通过质膜吸收的n a + 变得饱和，以后吸收的n a + 在细胞壁积累( c h e e s e ， 1 9 8 8 ) 。荧光染料的研究结果表明，叶肉质外体的蒸腾流是不连续的( c a r m y1 9 9 0 ) 。在这 种情况下，当液泡离子饱和时盐离子在质外体而不是在胞质累积，因为过剩的盐离子可能 外流，试验证据表明质外体可能积累了大量的n a + 盐。f l o w e r s 和r e o ( 1 9 9 1 ) 发现，当胞质 n a + 达2 4 0 3 2 0 m 0 1 m 4 时，水稻细胞质外体n a + 、k + 总浓度高于细胞质，当然这与基因型 有关。盐无论在质外体积累还是在细胞质积累对植物来说都是灾难，质外体n a + 增加，将 造成叶片失水萎缩。随盐胁迫加重，将造成细胞收缩，质壁分离，最后细胞脱水。由于胞 质体积仅为液泡体积的1 1 0 ，当液泡盐离子吸收达到饱和后，盐在细胞质中积累速率大大 加快( r a n s o ne ta l ，1 9 8 8 ) ，胞质中盐积累到一定程度必将对胞质中许多与代谢有关的酶产 生毒害作用( m u n n se ta l ，1 9 8 3 ) 。因而细胞是否脱水或死亡依赖于胞质或质外体是否聚积 过多的盐离子。 4 膜系统的耐盐机理 生物膜是细胞生命活动的关键部位，也是植物忍耐环境胁迫的重要环节。近些年来， 在植物逆境生理研究中得到广泛的重视。盐胁迫可导致质膜稳定性受到破坏( v e i lc e n g i z a n dz a l pa u s e y i n ，2 0 0 0 ) ，使质膜透性增加，电解质、可溶性物大量外渗，电导率升高使细 胞内离子失去平衡，产生代谢紊乱，生理过程受到干扰( 王洪春，1 9 8 7 ；吕芝香，1 9 9 0 ； 裴真明，1 9 9 6 ；廖祥儒，1 9 9 6 ) 。膜透性的变化与膜质结构、钙调蛋白、离子通道等有关 ( b i n g j i u y ue ta l ，1 9 9 8 ；m a n s o u r ，1 9 9 5 ) 。在许多植物上膜相对透性和稳定性已成为鉴定 3 植物耐盐性的指标。 4 1 生物膜结构和膜脂组分与植物耐盐性 膜系统是植物盐害的主要反应部位( l e o p o d ，1 9 8 4 ) ，膜结构和功能的完整性是控制 离子运输和分配的主导因素，但在盐逆境生理研究领域对膜结构研究主集中于盐生植物， 对淡土植物研究较少。对叶绿体、线粒体膜的研究比较系统，对质膜和液泡膜研究的比较 粗糙，只是以破裂为着眼点。盐胁迫下，叶片膜系统最先发生变化的是叶绿体类囊体膜， 以后整个叶绿体片层均膨胀以至内外膜瓦解，质膜发生波状折叠并逐渐脱离细胞壁，部分 断裂或消失( 龚明，1 9 8 9 ；吕芝香，1 9 9 0 ) 。对根结构的观察表明，最先发生膨胀的部位是 线粒体，这可能与线粒体、叶绿体是氧自由基的产生部位有关。 生物膜膜脂双层结构及膜渗透特性是决定细胞内离子组成和有机渗透物质的重要因 素，二者主要依赖于脂类组成( k u i p e r ，1 9 8 4 ) ，膜磷脂、固醇和甘油脂的水平常与盐胁迫 下植物体内盐离子的变化有关( k u i p e r1 9 6 8 ) 。膜质含量种类( c h e t a l ，1 9 8 0 ；d o n g l a sa n d w a l k e r ，1 9 8 3 ：e r d e i ，1 9 8 0 ；f e r g u s o n ，1 9 6 6 ；k u i p e r ，1 9 6 8 1 9 8 4 ；m a n s o u r ，1 9 9 4 ；s t u i v e r ， 1 9 7 8 ，1 9 8 2 ) 、膜质脂肪酸组分均与植物抗盐性有关( k u i p e r ，1 9 6 8 ；m a r s c h n e r e ta l ，1 9 8 1 ； 吕芝香，1 9 9 3 ) 。但是，人们对脂类与植物耐盐性的关系尚未取得共识。 4 2 盐逆境下活性氧与膜伤害 自m c c o r d 和f r i d o v i c h ( 1 9 6 9 ) 提出自由基伤害学说以来，现已广泛应用于研究需氧 生物细胞的毒害机理。植物体内可通过许多途径产生自由基，但主要产生于叶绿体的光合 作用和线粒体的呼吸作用中的电子传递。盐逆境下自由基大量产生，若不能及时被超氧化 物歧化酶( s o d ) 分解，将进一步形成破坏性更强的羟自由基( a l l e n ，1 9 9 5 ) ，导致膜质 过氧化或脱脂化作用，使膜选择性丧失。植物遭受干旱、盐胁迫、s 0 2 伤害等几种逆境均 使植物产生膜质过氧化作用( 王以柔等，1 9 8 6 ；余叔文，1 9 8 0 ：吕芝香，1 9 9 3 ) ，丙二醛( m d a ) 含量增加，膜透性增加( 陈少裕，1 9 8 9 ) 。生物膜伤害的直接原因是磷脂性质的改变，间接 原因是膜蛋白受到了伤害( s i m e n ，1 9 7 4 ；陈少裕，1 9 9 1 ) 。超氧化物歧化酶( s o d ) 、过 氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 以及a s a ( 抗坏血酸) 、谷胱甘肽酶( g s h ) 等都 是膜保护酶系统，在逆境中能清除植物体内的h 2 0 2 、h o 、1 0 ：等自由基，维持体内的活 性氧代谢平衡，保护膜结构，减轻有毒物质对生活细胞的伤害，使组织保持生活力，从而 使植物在定程度上忍耐或抵抗逆境胁迫( a l b e r t ee ta l ，1 9 9 3 ；k a l i re ta l ，1 9 8 1 ；j o h n ， 1 9 9 3 ：廖祥儒1 9 9 7 ) 。尽管m d a 已成为许多植物的膜脂过氧化指标，膜保护酶在许多植 物的逆境胁迫中起重要的作用。但是，苹果属植物膜保护酶系统在盐胁迫中的作用未见报 道。 5 苹果属植物耐盐机理研究进展 4 同一年生作物相比，果树耐盐生理的研究相对薄弱，仅在柑桔、无花果、石榴、葡萄 等树种有一定的研究，研究的内容涉及耐盐生理指标的鉴定( 姜卫兵等，1 9 8 9 ；汪良驹， 1 9 9 1 ：江良驹，1 9 9 5 ；王连量，1 9 9 5 ；廖祥儒，1 9 9 6 ) 、耐盐机理的研究( 汪良驹等，1 9 8 9 ； 汪良驹，1 9 9 1 ；千业遴。1 9 9 0 ) 、基因工程的研究( h o l l a n de ta l ， 1 9 9 4 ) 。 苹果是世界栽培面积最大的树种之一。由于资源或资金的原因，苹果耐盐机理的研究 相对落后。l - l a s s a n 等( 1 9 9 0 ) 认为苹果属在果树中耐盐性属中等，耐盐性强于杏、桃、酸 橙，但弱于梨和葡萄。马如池( 1 9 9 2 ) 、查霞娟( 1 9 8 6 ) 等对苹果砧木耐盐性的研究表明， 八棱海棠最耐盐，能耐全盐量0 2 3 0 3 。李晓林( 1 9 9 6 ) 等对四川阿坝州地区的苹果砧木 资源的耐盐性研究调查发现花叶海棠、变叶海棠1 2 0 、大果楸子1 3 0 、小金海棠耐盐性强。 顾遁良( 1 9 9 6 ) 和马继龙( 1 9 9 6 ) 均认为在苹果属植物中珠眉海棠是最耐盐的树种之一， 可以在滨海盐碱地及干旱盐碱地中正常生长。近几年，中国农大园艺学院园艺研究所搜集 苹果种质资源，在前人筛选基础上、从中选出了耐盐的珠眉海棠和盐敏感的山定子，并以 珠眉海棠和山定子为试材进行了耐盐生理指标的鉴定及盐胁迫f 矿质元素的代谢、细胞信 号传导、耐盐机理的初步研究( 许雪峰，2 0 0 0 ) 。尽管已取得一定的成就，但由于实验方法 的限制( 江宝珍1 9 9 5 ；余叔文，1 9 9 5 ) ，在离子区域化的研究中未取得肯定性的结果( 查 f ：明，1 9 9 9 ) ，耐盐机理其它方面还需要进一步的研究。 总之，目前对耐盐机理的研究大多集中在盐生植物及一年生草本植物，对多年生木本 植物研究的比较少。苹果属植物耐盐机理的研究仅处于起步阶段，还有许多工作有待进一 步研究。 本试验目的是通过对比研究耐盐的珠眉海棠和盐敏感的山定子，探讨苹果属植物耐盐 机理及膜保护酶系统在苹果属植物耐盐机理中的作用，为果树盐逆境生理及分子生物学的 进一步研究奠定基础。 材料与方法 l 试验材料及盐处理 以耐盐的珠眉海棠( m a l u sz u m im a t s ) 组培苗和盐敏感的山定子( m a l u sb a c c a t a ( l ) b o r k h ) 实生苗为试材。组培苗继代，生根所用的培养基及其苗培养参照平吉成( 1 9 9 4 ) 和 王瑛( 1 9 9 7 ) 的方法，组培苗生根后移入营养液中水培；实生苗的种子先清洗后浸种4h ， 4 低温层积，待种子露白后，播于蛭石中，长至一叶一心后移入营养液中水培。 水培苗长至1 0 c m 后进行盐胁迫处理，采用逐渐增加盐浓度的方法对营养液进行以下 处理对照0 m m n a c i 5 0 m m n a c i 1 0 0 m m n a c i 。每天增加5 0 r a m 直到所需的盐浓 度。每处理1 5 株苗，三次重复。每四天换一次营养液。在拒盐、泌盐实验中，不换营养液， 每四天加一次去离子水至初始体积，每次加去离子水后，取部分营养液待测离子含量。 2 苹果属植物拒盐、泌盐机理的研究 2 1 生物量的测定 盐处理1 5 天，幼苗分成根、茎、叶三部分，用去离子水冲洗干净，擦干，称重，1 0 0 杀青1 5 m i n ，在7 0 。c 的烘箱烘至恒重，而后称重。 2 2 泌盐的测定 盐处理1 5 天，每5 株苗的叶片用4 0 m l 去离子水封固，振荡5 s ，溶解掉外面的盐晶体， 而后取出叶片，擦干称重，7 0 c 烘干称重。洗液重新封固冷冻，待测离子含量( k e n n e t h ， 1 9 9 8 ) a 2 3 离子含量的测定 盐处理8 天、1 5 天，将烘干的叶片、茎和根分别研磨后称取o 2 9 ，浓硝酸硝化，去离 子水定容至2 5 m l 容量瓶中。用火焰光度计( 型号为2 6 5 0 0 ) 测硝化液、洗液及储存的营养 液n a + 、k + 含量。 2 4 计算 植物的拒盐泌盐能力参照p a u l ( 1 9 9 1 ) 的方法。 植物吸收离子的最大值= ( 植物由于呼吸和生长对水分的消耗溶液离子含量) 植物泌盐能力= 堕差荡蕞瓮篙鲁筹- 。 6 - 植物体内盐分的增加= 蔫黧蒹盅翥器县鬻t 。 植物的拒盐能力= ( 1 一泌盐能力一盐分的增加) x1 0 0 3 苹果属植物叶片离子区域化实验体系的确立及离子区域化的研究 3 1 质外体、共质体离子浓度测定实验体系的确立 3 1 1 叶片质外体汁液的提取 参照d a r m e l ( 1 9 9 5 ) 1 1 陶洪斌( 2 0 0 0 ) 厨 凹卜 固1 质外体汁i 夜提取装置 f i 1d e v i c eu s e df o rt h eiz o l a t lo n a p o p l a x tf l u id 的方法，取茎顶端成熟的第二位叶片进行实验， 将叶片自叶柄处剪下用去离子水洗净、擦干称 取约o 7 0 0 8 0 9 ，在1 个大气压的真空下向叶片 灌注浓度为0 2 8 m m 的山梨醇( s o r b i t 0 1 ) 溶液： 灌注后将叶片用去离子水洗净、擦干、称重： 然后立即将叶片朝一个方向平铺在塑料布上， 卷起后将叶片叶柄向下放入5 m l 一次性注射器 中注射器针头处接一5 0 0 p - i 的离心管，接口密 封，防止汁液流出。将注射器放入5 0 m l 离心管 中，在g l 一2 0 g i i 型高速冷冻离心机( 上海安 亭科学仪器厂、中离心( 见图1 ) 。离心过程中温 度4 ，以防止质外体成分蒸发。结合预备性实验的结果，本实验选用了不同的离心力 1 0 0 0 9 、2 0 0 0g 、2 5 0 0 9 、3 0 0 0 9 、4 0 0 0 9 、5 0 0 0 9 、6 0 0 0 9 、7 0 0 0 9 、8 0 0 0 9 、1 0 0 0 0 9 和1 2 0 0 0 9 对苹果叶片进行离心，离心时间1 0 分钟，重复4 次。 3 1 2 叶片匀浆的制备 将叶片自叶柄处处剪下后立即称取约o5 9 左右，液氮快速冷冻，然后将叶片在研钵中 快速研磨、匀浆，用3 m l 缓冲液提取磷酸已糖异构酶( h p i ) 。缓冲液成份为：1 0 0 m m 三 羟甲基甘氨酸( h e p e s ) ，3 0 r a m 山梨醇( s o r b i t a l ) ，2 r a m 二硫苏糖醇( d t t ) ， l m m c a c l 2 ，1 聚乙烯吡咯烷酮( p o l a r ) 和i 牛血清蛋白( b s a ) 。匀浆的样品和提取液的 混和物经过高度冷冻离心后，取上清液待测。试验操作中温度4 ，以防止酶失活。 3 1 3 磷酸已糖异构酶( h p i ) 活力的测定 酶反应介质中各成分的浓度为，5 0 r a mt r i s ，5 m mm g c l 2 ，l m mn a c i ，0 3 9 m mn a d r o4 6 u m l g 6 p - d h 和i 4 m m f - 6 p ( d a n n e le ta l ，1 9 9 5 ) 。通过检测3 4 0 n m 下，5 r a i n 内n a d p h 量的变化即可测定h p i 的活力，测定所用仪器为岛津u v 2 2 0 1 紫外分光光度计。 3 2 苹果属植物植物叶片离子区域化的研究 3 2 1 质外体体积的确定 气体体积的确定按n i e l s e n ( 1 9 9 8 ) 、s p e e r 和h u s t e d ( 1 9 9 5 ) 的方法，将叶片自叶柄处 剪下，_ j 去离子水洗净、擦干后称重，用高粘度的硅酮油( 粘度为5 c s ：密度为o 9 1 2 ：g c m ) 真空灌注，擦干叶表面、再称重。灌注前后重量差作为质外体空气体积( v a i r ，e m a i r c m 3 l e a f ) 。 液体体积的测定按h u s t e d ( 1 9 9 5 ) 的方法，将叶片自叶柄处剪下，洗净、擦干。用溶解 在5 0 m m 磷酸缓冲液( p h6 2 ) 中的5 0 p - m 靛卡红( i n d i g o 一5 5 - d i s u l f o n i ca c i d ) 或6 1 t m 的 溴甲酚蓝( 3 3 s 一5