（发酵工程专业论文）ε聚赖氨酸菌种筛选及发酵工艺的研究.pdf

捅要 摘要 一聚赖氨酸( _ p l ) 自身所具有的水溶性强、抑菌谱广、可以食用且对人体无任何毒 副作用等特点，使其成为最理想的生物型防腐剂。除此以外，_ 聚赖氨酸还可以作为生 物材料广泛应用于药物载体、基因芯片等领域。因此，聚赖氨酸在近些年来引起了学 者们的广泛关注。本论文的研究工作主要由以下三部分内容组成： 改进并建立了一种简便可行的聚赖氨酸产生菌的筛选方法，由此筛得了多株 p l 产生菌。在加有复合抑制剂的初筛平板上涂布土壤悬液，于3 0 培养7 d 后整体将 琼脂揭下，平铺到另一加有美兰的琼脂上。挑取形成透明圈的菌落进行摇瓶发酵，发酵 液与d r a g c n d o r f f 试剂和甲基橙反应，挑选阳性菌住。通过薄板层析，确定菌株的产物 中含有赖氨酸聚合物。再通过水杨醛保护氨基的化学法确定了聚赖氨酸是通过酰氨键 聚合而成。通过生理生化特征和分子生物学鉴定，筛得的菌株包括：稠李链霉菌 s t r e p t o m y c e sp a d a n u s 、灰褐链霉菌s t r e p t o m y c e sg r i s e o f u s c u s 、禾粟链霉菌s t r e p t o m y c e s g r a m i n e a r u s 、吸水链霉菌s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ，而且这四种菌株目前为止尚未见 过报道。 对筛选到的一株灰褐链霉菌进行了发酵工艺的初步探索。本论文通过对发酵过程中 p h 参数的考察，验证了p h 值是影响灰褐链霉菌合成聚赖氨酸的关键性因素。研究 发现，灰褐链霉菌在p h 4 0 以上有利于菌体的生长，但几乎不合成产物；而当p h 低于 4 0 时，虽然不利于菌体的生长，但对产物的积累起到了积极的作用，在p h 3 5 时聚 赖氨酸可达到2 4 9 l ，是摇瓶产量的4 倍。在控制p h 3 5 的情况下，采用补料分批培养 方式，使得发酵时间延长至l o o h ，聚赖氨酸产量也有了较大幅度的提高，达到4 5 9 l ， 接近摇瓶产量的8 倍。采用分阶段控制p h 方法使菌体量增加后再控制p h 3 5 ，可使发酵 时间延长至1 9 0 h ，同时聚赖氨酸产量达到7 5g l 。因此控制合适p h 条件下再补料 是提高灰褐链霉菌合成聚赖氨酸能力的有效途径。 探索原生质体育种的方法，为下一阶段的多亲株轮回式融合( g e n o m es h u f f l i n g ) 打基 础。由于灰褐链霉菌的代谢途径尚不清楚，所以现阶段选择传统育种方法是提高其产量 的唯一途径。本论文对灰褐链霉菌与稠李链霉菌两株菌的原生质体制备条件及融合条件 进行了研究，初步建立了原生质体融合的育种方法。利用灰褐链霉菌产黑色素这一生化 特性作为遗传标记与稠李链霉菌进行原生质体融合育种，融合子中最高产量为0 7 5g l ， 较两亲本初始产量分别提高了2 6 、3 6 。 关键词：聚赖氨酸；菌种筛选；发酵；补料分批培养；原生质体 a b s t r a c t t h e6 - p o l y l y s i n e ( s - p l ) i sb e c o m i n gam o s tp o p u l a rp r e s e r v a t i v eo w i n gt oi t hg o o d s o l u b i l i t y ，丽d er a n g eo fi n h i b i t o r ya n de d i b l eq u a l i t y i na d d i t i o n , i ti sa l s oa p p l i e dt od r u g c a r t i e ra n dg e n ec h i pe t c ，a sb i o l o g i c a lm a t e r i a l s t h e r e f o r e , 8 - p lh a sb e e nc o n c e m e db y m a n ys c h o l a r sr e c e n t l y t h e m a i nc o n t e n t so f t h i sp a p e ra r ea sf o l l o w s ： t h es t r a i ns c r e e n i n gm e t h o do fs - p o l y l y s i n ei si m p r o v e db a s e do ne x p e r i e n c ei no u rl a b t h es o i ls u s p e n s i o n sa r ec o a t e do nt h ea g a rm e d i u m sa d d e dc o m p o s i t ei n h i b i t o r s a f t e r7 d a y s g r o w t h ，r e n l o v et h ew h o l ea g a rf r o mt h ep e t r id i s ha n dt h e nc o v e ri to na n o t h e rp e t r i d i s hw h i c hi sa d d e dm e t h y l e n eb l u e s t r a i n sf o r m i n gt r a n s p a r e n tc i r c l e sa l es e l e c t e dt o f e r m e n ti ns h a k ef l a s k s t h ef e r m e n t a t i o nb r o t h e sa l em i x e d 、 ，i t l ld r a g e n d o r f fr e a g e n ta n d m e t h y lo r a n g es o l u t i o nt op i c kp o s i t i v eo n e s b yt h ec h r o m a t o g r a p h yp l a t e , s t r a i n s b o r t h e s c o n t a i n i n gl y s i n ep o l y m e r 羽哈d e t e c t e d t h es t r u c t u r eo fp o l y m e ri sa n a l i e db yc h e m i c a l m e t h o dt oc o n f i r mt h a tt h ep o l y m e ri ss - t y p e s t r a i n sa r ec o n f n r n e da ss t r e p t o m y c e sp a d a n u s 、 s t r e p t o m y c e sg r i s e o f u s c u s 、s t r e p t o m y c e sg r a m i n e a r u s 、s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u sb y p h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr d n as e q u e n c e t h e s ef o rs t r a i n sh a v e n o tb e e nr e p o r t e ds of a r t h e n , t h ep a p e rv e r i f i e dt h a tp hi sac r u c i a lf a c t o ri nf e r m e n t a t i o np r o c e s so f s t r e p t o m y c e sg r i s e o f u s c u sb yd i f f e r e n tp hl e v e l s t h e r e s e a r c hd e m o n s t r a t e dt h a t s t r e p t o m y c e sg r i s e o f u s c u sp r o d u c e sb i o m a s sw h e np hi sa b o v e4 0 ，b u tn os - p o l y l y s i n e w h i l ep hi sb e l o w4 0 ，t h o u g hi ti sn o tc o n d u c i v et ob i o m a s s ，i ti si nf a v o ro f 一p o l y l y s i n e s y n t h e s i s t h ey i e l dc o u l dr e a c h2 4g lw h e np hi s3 5 ，3t i m eh i g h e rt h e nt h eo n ei ns h a k e f l a s k u n d e rt h i sc o n d i t i o n , ay i e l do f4 5g ，lw a so b s e r v e dw h e nw ec a r r i e do u tf e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n , w h i c hp r o l o n g e dt h ef e r m e n t a t i o nc y c l et ol o o h w h e nc o n t r o l l i n gt h ep h a b o v e4 0e a r l yi nt h ef e r m e n t a t i o na n dt h e nc o n t r o l l i n gi t3 5 ，t h eb i o m a s sc o u l d r e a c h18g l w i t has - p o l y l y s i n ey i e l do f7 5g l t h i ss h o w st h a ti ti sa ne f f e c t i v ew a yt oi m p r o v ey i e l do f s - p o l y l y s i n ef o rs t r e p t o m y c e sg r i s e o f u s c u sw h e nc a r r i e so u tf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o nu n d e r s u i t a b l ep h t r a d i t i o n a lb r e e d i n gm e t h o di st h eo n l yw a yt oi m p r o v ei t hy i e l d i nt h i sp a p e r , p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s a n d p r o t o p l a s t f u s i o ne o n d i t i o mo fs t r e p t o m y c e s g r i s e o f u s c u sa n ds t r e p t o m y c e sp a d a n u sa r er e s e a r c h e d w ec a r r i e do u to n ef u s i o no ft h et w o s t r a i n st a k i n ga d v a n t a g eo ft h a ts t r e p t o m y c e sg r i s e o f u s c u sg e n e r a t e sm e l a n i n , w h i c hi sa n a v a i l a b l eg e n e t i cm a r k e r a m o n gt h ef u s i o ns t r a i n s ，t h eh i g h e s ty i e l di so 7 5g l ，w h i c hi s 2 6 h i g h e ra n d3 6 h i g h e rt h e ns t r e p t o m y c e sg r i s e o f u s c u sa n ds t r e p t o m y c e sp a d a n u s ， r e s p e c t i v e l y t h i ss t e pi sa b a s e m e n tf o rn e x to p e r a t i o ng e n o m es h u f f l i n g k e yw o r d s ：s - p o l y l y s i n e ；s t r a i ns c r e e n i n g ；f e r m e n t a t i o n ；f e d - b a t c h ；p r o t o p l a s t i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苓人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的4 - z - 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：日 期： 2 竺三丝么z 兰 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留，使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：垄扭导师签名： 日 期丛翠垃 第一章绪论 第一章绪论 1 1 食品防腐剂背景 食品在物理、生物化学和有害微生物等因素的作用下，可失去固有的色、香、味、 形而腐烂变质，其中有害微生物的作用是导致食物腐烂变质的主要因素。通常将蛋白质 的变性称为腐败，碳水化合物的变质称为发酵，脂类的变质称为酸败。人类为了生存， 一直关注着减少食物腐烂的方法，经过几个世纪的探索，找到了盐腌、糖渍、醋渍及发 酵等方法。到了近代，随着社会发展，人民生活水平的提高，传统的盐腌、糖渍、醋渍、 干制、罐藏等方法已不能满足人们的生活要求，现在人们需要的是常年供应新鲜食品， 可以用物理方法或者化学方法来防止有害微生物的破坏。所谓化学方法就是利用抑菌或 杀菌( 延缓或制止腐烂) 的化学药剂，这些化学药剂称为防腐剂。防腐剂的使用为食品 防腐提供了有效、简便、经济的方法，它在粮食、水果、蔬菜、肉、禽、蛋、水产等原 料及加工品的储藏中，起了非常重要的作用。今后，在食品工业中，抑菌、防霉技术必 将有更大的发展，这是因为从食品的加工、储存、运输、货架直至消费过程中，微生物 生长并分泌有害物质对食品的污染问题逐渐突出，这必将促使人们对食品的防腐、防霉 采取更为安全有效的措施【l j 。 食品污染是由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌共同引起，其主要的病原体包括埃希 氏菌属大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和杆菌。据估计，我国每年约有2 0 3 0 的 食物因各种腐败而损失。食品腐败变质不仅会使食品丧失营养价值，还会造成食物中 毒。食品本身含有的丰富的营养成分最易使微生物滋生且繁殖，并最终导致食品的腐败 变质。目前在食品工业上最为普遍和有效的方法就是添加防腐剂来抑制或杀灭微生物， 以达到防腐的目的。食品防腐剂不影响食品的口感，它可以抑制微生物的生长，杀死食 品中含有的有害微生物，以防止食品加工完成后的发酵、霉变和腐败等。食品防腐剂可 以抑制微生物的生长速率，以此来达到延长食品保存期的目的。有时，食品防腐剂具有 抗菌和抗氧化的双重作用，它既可以抑制霉菌，酵母等细菌的生长而起到防腐作用，另 外，它还可以使食物不产生腐臭，抑制褐变和黑斑的形成。当氧气、光、热等其他一些 可以弓l 起食品变质的反应条件同时存在时，防腐剂可以抑制食品与这些因素之间的相互 作用。在大批量食品的储藏期间，防腐剂也可以最大限度的减少蛋白质和氨基酸的损失， 防止维生素的流失等 2 1 。 食品防腐是- - f l 综合技术，也可以说是一项系统工程。防腐的效果是一个综合效果， 不是哪一种手段能单独达到。从防腐剂的应用角度来说，它的作用的发挥与贮藏条件和 食品本身的性质密切相关。再好的防腐剂，在不适宜的贮藏条件或不合适的食品中使用， 也不会有好的效果。比如，在遍体鳞伤的水果上使用防腐剂不会有效果，山梨酸只适用 于有良好卫生条件和微生物数量较少的食品的防腐。这里所说的贮藏条件和食品的性质 包括温度、贮藏环境的气体成分、食品的组分、p h 值、水分活度、氧化一还原电势、防 腐剂在油一水中的分配系数等。所以说，既不可能，也不需要单独靠防腐剂来进行食品 江南大学硕士学位论文 的防腐保鲜。只有上述这些因素各以不同额度数量组合起来才是最佳选择。即使它们中 的任何一个因素都不能单独抑制微生物的活动，但其总的结果还是能够抑制微生物的生 长【3 l 。 目前各国政府批准使用的食品防腐剂种类很多。根据防腐剂的来源和组成可分为化 学合成防腐剂、天然防腐剂和微生物来源防腐剂，目前所应用的防腐剂大多为化学防腐 剂。化学防腐剂又可以分为有机化学防腐剂和无机化学防腐剂。有机化学防腐剂主要包 括苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类、丙酸及其盐类、对羟基苯甲酸酯类及乳酸等。无 机化学防腐剂包括亚硫酸及其盐类、二氧化碳、硝酸盐和亚硝酸盐类、游离氯及次氯酸 盐等。 天然防腐剂因其安全性一直是近年来研究开发的重点，也是今后防腐剂发展的主要 方向。目前，已开发的天然防腐剂按其来源可以分成植物源天然防腐剂、动物源天然防 腐剂等天然有机化合物类型，主要有鱼精蛋白、壳聚糖类、抗菌肽类、乳酸菌类、蜂胶、 溶菌酶、香辛料提取物、琼脂低聚糖、甜菜碱、日扁柏醇、类黑精( 茶多酚) 、烟熏液、 苦瓜浸出汁、马皮提取物、林立叶提取物、重要提取物等 4 1 。微生物源的防腐剂目前主 要有纳他霉素、乳酸链球菌素、e 一聚赖氨酸等。美国允许使用的食品防腐剂有5 0 余种， 日本4 0 余种，我国允许使用的防腐剂为3 2 种。我国公布的食品防腐剂有：苯甲酸及其 钠盐、山梨酸及其钾盐、二氧化硫、焦亚硫酸钠、丙酸钠、丙酸钙、对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸丙酯、脱氢醋酸等【5 j 。 1 2 化学合成类防腐剂 目前我国市场应用的大多为化学防腐剂，常用的主要有：苯甲酸( 钠) 、山梨酸( 钾) 、 对羟基苯甲酸酯类、丙酸盐、亚硫酸及其盐类、硝酸盐及亚硝酸盐。 1 2 1 苯甲酸及其钠盐 苯甲酸又名安息香酸，是我国最大的防腐剂品种。其抑菌作用的机理是使微生物 细胞的呼吸系统发生障碍，使三羧酸循环( t c a 循环) 中乙酸辅酶a 一乙酸醋酸及乙酸 草酸一柠檬酸之间的循环过程难以进行，并阻碍细胞膜的正常生理作用 6 j 。苯甲酸在人 体内与氨基乙酸结合，生成马尿酸，在尿中排除，无蓄积作用。由于其有效成分是未解 离的苯甲酸分子，所以在酸性食品中使用效果好，对酵母、霉菌都有效。但因有叠加中 毒现象的报道，在使用上有争议，虽各国仍允许使用，但应用范围越来越窄。如在日本， 其进口食品中苯甲酸钠使用受到限制，甚至部分禁止使用，日本已停止生产。因价格低 廉，我国仍广泛使用，主要应用于汽水、果汁类、酱油、罐头和酒类的防腐。 1 2 2 山梨酸及其钾盐 山梨酸是不饱和脂肪酸，其抑菌机理是利用自身的双键与微生物细胞中酶的巯基形 成共价键，使其丧失活性，破坏酶系，从而抑制微生物的生长。山梨酸可参与体内正常 代谢，并最终被氧化为c 0 2 和水，对人体基本无害，且对食品风味亦无不良影响，是目 前国际上公认最安全的化学防腐剂之一，已为所有国家和地区允许使用。同样，由于其 2 第章绪论 有效成分是未解离的山梨酸分子，故在酸性条件下效果较好。山梨酸主要抑制霉菌和酵 母，但是在微生物过多的情况下发挥不了作用，因此它适用于有良好的卫生条件和微生 物数量较少的食品中使用【刀。山梨酸由于价格比苯甲酸类高，而且加热( 9 0 c ) 易升华， 使其应用受到限制，目前仅少数食品中有应用。 1 2 3 对羟基苯甲酸酯类 也称为尼泊金酯，其抑茵机理与苯甲酸基本相同，主要是使微生物细胞呼吸系统和 电子传递酶系统的活性受抑制，并能破坏微生物细胞膜的结构，从而起到防腐的效果。 对羟基苯甲酸酯类防腐效果不随p h 值而变化，在p h4 , - - , 8 范围内均有较好效果，又耐 热，故可被用于代替酸性防腐剂，且毒性低于苯甲酸( 但高于山梨酸) 。由于它具有酚 羟基结构，所以抗细菌性能比苯甲酸、山梨酸都强，对霉菌、酵母也有较强作用。最 大的缺点是有特殊气味，在水中溶解度差，其溶解度随酯基碳链长度的增加而下降( 如 甲酯为0 2 5 9 1 0 0 9 ，庚酯仅1 5m g 1 0 0 9 ) ，抗菌效果则与分子中烃链长度成正比；毒性与 烃链长度成反比【8 】。在胃肠中能迅速吸收，并水解成对羟基苯甲酸而从尿中排出。目前我 国国标规定，对羟基苯甲酸酯类系列中只有乙酯、丙酯可以应用于食品中。 1 2 4 丙酸盐 丙酸盐在体内转变为丙酸，单体丙酸分子可以在霉菌细胞外形成高渗透压，使霉菌 细胞内脱水，失去繁殖力，且还可以穿透霉菌细胞壁，抑制细胞内的活性。同时丙酸为 食品的正常成份，也是人体代谢的正常中间体，易被消化系统吸收，无蓄积性，不随尿 排出，它经一氧化后可与辅酶a 结合形成琥珀酸盐或酯而参加三羧酸循环代谢为c 0 2 和水。由于丙酸盐的有效成分是丙酸，所以它必须在酸性环境中才能产生抑菌作用。在 食品中主要用于面包、糕点类食品。其离解常数较低，对酵母无效，故不影响面包的正 常发酵【9 】。但是我国长期以来不能生产丙酸，主要靠进口，近几年我国才开始丙酸盐的 工业生产，但产量很低，制约了丙酸盐在食品中的应用。 1 2 5 硝酸盐及亚硝酸盐 使用少量硝酸盐或亚硝酸盐来腌制肉类和家禽，是人们常用的食物防腐方法。在 腌制腊味( 我国传统的腌制肉类) 方面，硝酸盐和亚硝酸盐是不可或缺的防腐剂，不 仅使食物具备独特的色香味，更具有抗微生物的作用，能抑制细菌生长及孢子形成，尤 其是肉毒杆菌。不过，n a n 0 2 在消化系统中很容易与脯氨酸形成一种强致癌剂n _ 亚硝 胺类化合物。食物中硝酸盐的含量一般很少，不会令人中毒，但人体肠道的细菌可把硝 酸盐转化为亚硝酸盐，而亚硝酸盐对人体健康的影响较大【l o l 。 1 3 天然型防腐剂 目前天然防腐剂大致有两类：一种是天然动植物的直接提取物，如果胶、中草药、大 蒜素等；第二种是生存子各种动物体且可以通过人工修正、分解、蒸馏等方法制得的产 品，如鱼精蛋白、壳聚糖等i l 。 江南大学硕士学位论文 一- i 。- 。- 。_ 。_ _ _ _ _ _ _ - _ _ i - _ i _ _ i i - _ _ - - _ - _ - _ - _ _ - _ _ _ - - _ - _ - _ - 。- _ 。_ 。- _ _ - - _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ - i _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。- _ 。_ 。i _ 。- _ _ - _ _ _ _ - - _ _ _ - _ _ _ - i _ - _ 一 1 3 1 果胶分解物 果胶是一种水溶性天然聚合物，一般从水果、蔬菜中提取，主要存在于柠檬、 橙、 柚、柑桔、葡萄等果皮中或甜菜、苹果等废渣中。果胶在食品工业中广泛作为增稠剂和 胶凝剂等食品添加剂使用。其生产是在酸性溶液中加温水溶解后，经过滤、沉淀、脱水、 干燥、粉碎即成产品。因为果胶的酶分解物在酸性环境中具有抗菌作用，在中性及碱性 下抗菌效果明显下降【1 2 l 。 1 3 2 荼多酚 茶多酚是从茶叶中提取的一种混合物。大量实验表明，茶多酚具有很好的防腐保鲜 作用。汪秋安等报道茶多酚对金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏 菌、铜绿色假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、口腔变异链球菌、大肠杆菌8 种致病菌的最低 抑制浓度分别为0 0 8 、0 0 1 、0 0 3 、0 0 4 、0 0 8 、0 0 8 、0 1 、o 1 ，对毛霉 菌、青霉菌、赤霉菌、炭疽病菌、啤酒酵母菌等真菌也有抑制作用，可添加于食品和药 物中【1 3 】。我国已批准将茶多酚用于食品抗氧化剂。但抗氧化剂主要使用在油性产品中， 茶多酚因多酚基团的存在，其水溶性高油溶性差的性质限制了它的使用。国外宣传茶叶 提取物，可作为食品配料使用。我国作为世界茶叶生产大国，茶叶深加工制取功能性食 品配料，具有发展前途【川。 1 3 3 香辛料 香辛料来自于植物的种子、果实、茎叶、树皮、花、蕾等，具有独特的刺激性气味， 能够矫正食品的异味、赋予香气，是一类天然植物性调味品。此外还有着色、抗氧化、 抗茵( 防腐) 以及生理药理作用，它是天然防腐剂的重要来源之一。从中筛选出高效、经 济的防腐物质作为天然食品防腐剂，具有广阔的应用前景。对香辛料的抗菌性已有利用， 近年来，人们开始从大蒜、生姜、丁香、肉桂、肉豆蔻等香辛料中提取有效成分，如大 蒜中的蒜氨酸、肉桂和肉豆蔻中的挥发油以及丁香中所含的丁香油，作为天然防腐剂， 既安全又有效：将香辛料以精油浸提液的形式添加在西式火腿、香肠、点心等食品中， 这不仅起到防腐作用，而且还有增加食品风味的效果。此外，将香辛料与少量的其他天 然防腐性物质如鱼精蛋白并用，可以大大提高防腐效果【i5 1 。大蒜含蒜氨酸，大蒜辣素和 大蒜新素，其中大蒜辣素和大蒜新素是大蒜中的主要抗菌成份，后者抗细菌的效力为前 者的5 0 i 1 6 1 。 1 3 4 壳聚糖 壳聚糖又叫脱乙酰甲壳质，它是蟹虾、昆虫等甲壳质脱乙酰后的高分子有机物，是 由葡萄糖胺单体及乙酰基葡萄糖胺单体按不同比例组成的直链分子。葡萄糖胺单体上带 有游离的氨基，因此壳聚糖带有正电荷，它通过干扰细胞表面的负电荷，导致细胞物质 外泄，使细胞死亡，分子较短的壳聚糖可以进入细胞内，并与d n a 结合和抑制m r n a 的 合成来抑制微生物细胞的活动1 1 7 】。 4 第一章绪论 1 3 5 鱼精蛋白 鱼精蛋白主要是在鱼类的精子成熟期间逐步表达并代替组蛋白而形成的，它是一种 分子量小及精氨酸含量高的强碱性蛋白【埘。鱼精蛋白的抗菌作用是在1 9 3 7 年才开始被 发现【1 9 1 。后来有人发现鱼精蛋白的抑菌机理是因为精氨酸是一种含有带正电荷胍基的碱 性氨基酸，在食品体系中，这些带正电荷的阳离子肽与细胞壁上带负电荷的胞壁酸或细 胞膜上带负电荷的磷脂产生静电作用，破坏细胞壁或细胞膜的通透性来抑制细菌生长 2 0 l 。最新研究表明：鱼精蛋白的作用机制是抑制细胞中电子传递系统中的些特定成分， 抑制一些与细胞膜有关的新陈代谢过程它可能定位在细胞膜表面，与膜中的涉及营养 运输或者是生物合成系统的蛋白质作用，使这些蛋白质受损，进而抑制细胞的新陈代谢， 最终导致细胞死亡。鱼精蛋白在中性和碱性介质中显示出很强的抑菌能力，而在酸性条 件下作用不太明显，但有较高的热稳定性，在条件下加热仍具有活性1 2 l j 。 1 3 6 蜂胶 蜂胶是蜜蜂从植物幼芽及树干上采集的树脂，混入上鄂的分泌物、蜂蜡等加工而成 的一种具有芳香气味的不透明胶状固体，呈黄褐色或灰褐色，味微苦，不溶于水，溶于 乙醇、乙醚等有机溶剂。据研究，蜂胶中含有大量活跃的还原因子，具有较强的抗氧化 性。蜂胶多酚类化合物具有抑制和杀灭细菌的作用，经过降解最终产物是苯甲酸，是一 种天然防腐剂瞄】。蜂胶的防腐保鲜机理目前认为是两个方面：第一，蜂胶的抑菌作用， 蜂胶对各种细菌、真菌、病菌和原虫都具有抑制和消灭能力。蜂胶中的高良姜素、山奈 菌、对香豆苯甲酸酯、蜂胶浸出物等均有抗菌活性，而且蜂胶中的树脂也具有抑菌作用； 第二，蜂胶的成膜作用，蜂胶是良好的成膜剂，它喷洒在果蔬表面可形成一层薄膜，这 层薄膜可以减少微生物的浸染，阻碍果蔬内部与外界的气体交换，从而抑制呼吸，降低 新陈代谢，减少果蔬表面的水分蒸发，因而推迟腐败，起到防腐保鲜作用【2 3 】。 1 4 微生物来源防腐剂 目前通过微生物工程得到的发酵产品主要有乳酸链球菌素、纳他霉素、聚赖氨酸 垄塞【2 4 l 可 1 4 1 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非纳他州的土壤中分离到纳塔尔链霉菌s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ，并从中分离出了一种新的抗真菌物质，称为p i m a r i c i n ( 匹马菌素) ；1 9 5 9 年， b u r n s 等人在美国田纳西州的土壤中分离到了一株恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e s c h a t t a n o o g e n s i $ ，并从其培养物中分离到了t e r m e c e t i n ( 田纳西菌素) 。此后的研究报道 证明匹马菌素和田纳西菌素为同一种物质，并被世界卫生组织w h o 统一命名为 n a t a m y c i n ( 纳他霉素) 【2 5 2 6 1 。 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌素剂，由s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s 和 s t r e p t o m y c e sc h a t a n o o g e n s i s 等链霉菌合成。n a t a m y c i n 对几乎全部真菌都具有抑制和 杀灭活性，抑菌谱系广泛，能有效抑制丝状真菌中黄曲霉毒素的形成，但无抗细菌活性。 江南大学硕士学位论文 所以纳他霉素作为一种天然的生物食品防腐剂可以广泛应用于易受真菌污染的食品工 业各领域1 2 丌。 纳他霉素的抑茵机理为：纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华 力和整个甾醇分子结合，形成抗生素一甾醇复合物，破坏细胞质膜的渗透性；分子的亲 水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，从而引起茵内氨基 酸、电解质等重要物质渗出而死亡幽j 。当某些微生物的细胞壁及细胞不存在这些类似固 醇的化合物时，纳他霉素就不产生抗菌活性，因此纳他霉素被列为抗真菌类产品。 纳他霉素是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类的多烯大环内酯 类抗生素，但没有抗细菌活性。纳他霉素对繁殖细胞的抑制效果很好，而对于休眠细胞 则需较高浓度，对真菌抱子也有一定抑制效果。1 9 5 6 年，t r e s n e 研究了纳他霉素对5 0 0 种霉菌的抗性，所有霉菌被抑制的浓度范围为1 一1 0 p p m 。虽然纳他霉素有较强的抑制真 菌作用，但对哺乳动物无毒，没有“三致 现象。纳他霉素很难被消化道吸收，由于其 在水和油脂中溶解度很低，大部分摄入的纳他霉素会随粪便排出。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等研究纳他霉素的急性毒性和慢性毒性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也不 产生伤害。1 9 7 3 年h a m i l t o nm i l l e 报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。 纳他霉素由于溶解度很低，一般用作食品表面防腐，主要用于奶酪、肉制品、葡萄 酒、茶饮料及果汁，不会影响食品成分变化，没有异味。它在食品中的抗真菌作用是双 效的：既可防止真菌引起的食品腐败，减少经济损失，又可防止真菌毒素的分泌。使用 方法一般有浸泡、喷洒或乳剂覆膜【2 9 】。与传统的抗真菌剂比较，纳他霉素有其独特的性 质，它在很低的浓度下仍具有活性，例如在奶酪中纳他霉素比山梨酸钾活性高4 0 0 倍。 在葡萄酒中，纳他霉素能取代山梨醇和其它抗真菌剂，它允许减少所使用的s 0 2 量【3 0 】。 目前，全世界已有三十多个国家采用纳他霉素作为食品防腐剂。瑞士、美国、欧盟，还 有南美、东欧、中东等地区的大部分国家1 3 l j 已经正式批准纳他霉素为食品防腐剂，我国 也已经批准n a t a m y c i n 为食品防腐剂( g b 2 7 6 0 - 1 9 9 6 ) 并规定食物中最大残留量为1 0 m g k g ，实际纳他霉素的使用量为1 0 由数量级，所以它是安全性、有效性都很高的生物 防腐剂。 1 4 2 乳酸链球菌素( n i s i n ) 1 9 2 8 年，美国的l a r o g e r s 等首次发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制部分细菌【3 2 】； 1 9 4 7 年英国的m a t t i c ka t r 发现一些乳酸链球菌( s t r e p t o c o c c u sl a c t i s ) 产生具有蛋白 质性质的抑制物，并将其命名为“n i s i n ，取自“n i n h i b i t o r ys u b s t a n c e ；1 9 5 1 年n i s i n 的第一批商业产品- n i s a p l i n 在英国上市，含有2 5 的n i s i n | 3 引。 乳酸链球菌素( n i s i n ) ，是一种多肽类羊毛硫细菌素，含有3 4 个氨基酸残基，相对 分子质量为3 5 1 0 道尔，活性分子为二聚体或四聚体。n i s i n 单体，其中含有5 种稀有氨 基酸：a b u ( 氨基丁酸) 、d h a ( 脱氢丙氨酸) 、d h b ( 1 3 一甲基脱氢丙氨酸) 、a l a - s a l a ( 羊 毛硫氨酸) 、a i a - s - a b u ( 1 3 一甲基羊毛硫氨酸) ，它们通过醚键形成5 个环1 3 4 。乳酸链球 菌素是一种由乳酸菌的某些亚属代谢产生的具有很强杀菌作用的代谢产物。它能够有效 抑制引起食品腐败变质的革兰氏阳性细菌( g + ) 及病原菌的繁殖，广泛应用于乳制品、 6 第一苹绪论 发酵饮料、罐藏食品、肉类及肉制品的防腐保鲜【3 5 】。 普遍接受的关于n i s i n 抑菌机理的观点认为，n i s i n 抑制细菌生长及芽饱萌发的原因 是其对细胞表面强烈吸附进而引起细胞质的释放。n i s i n 是带有正电荷的疏水短肽j 因 而它可以和g 十细胞壁中带负电的物质结合，从而破坏细胞壁结构并与细胞膜形成管状 通道，使得小分子量的细胞质成分从孔道中泄漏出来，导致细胞内外能差消失，使蛋白 质、多糖等的生物合成受到抑制。n i s i n 对细胞芽饱的作用主要是抑制其萌芽，并不是 杀死芽抱。而g 和g + 相比，其细胞壁成分复杂而且结构致密，n i s i n 无法通过，因而对 其不能发挥作用m j 。 n i s i n 对一定范围微生物有抗菌能力。n i s i n 对g 。菌、酵母和霉菌没有作用，仅对大 多数g + 细菌起作用f 。n i s i n 可以抑制葡萄球菌、链球菌等食品中常见的污染菌，尤其 是对梭菌和芽孢杆菌的抑制作用【3 8 3 9 训，这些产生内生孢子的细菌是食品的主要腐败 微生物。由于n i s i n 的杀菌谱比较窄，所以它在使用中多与其它防腐手段联合使用，以 弥补其抗菌谱窄的缺点，发挥广泛的防腐作用。最近的研究表明，n i s i n 与鳌合剂e d t a 联合使用对沙门氏菌和其它g - 细菌亦具有抑制作用1 4 l j ，与热处理可相互促进，n i s i n 也 可与辐射处理结合使用，也可与其他防腐剂如山梨酸等配合使用，以起到相互补充与相 互促进的作用 4 2 1 。 1 4 3 8 一聚赖氨酸( s - p o l y l y r s i n e ) 1 9 7 7 年日本学者s s h i m a 和h s a k a i 从放线菌培养过滤液中提取出一种含有2 5 3 0 个赖氨酸残基的同型单体聚合物。这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过a c o o h 和 - n i - 1 2 形成- 型酰氨键聚合而成，故称聚赖氨酸( _ p l ) 4 3 1 ，其分子结构如图1 1 所示。实际上多聚赖氨酸的合成早在1 9 4 7 年由k l e p r a i 首先完成的，但是化学合成 的聚赖氨酸为a 型，其赖氨酸残基之间的酰胺键是由a 氨基和洳羧基缩合而成，研究也 证明了叶p l 比8 _ p l 的抑菌活性差且有毒性，因此目前在国际市场上p l 已经取代了 仅p l l 4 4 。 n i l - - ( c 吼一一 吗 囝1 - 1o 一襄 炼雠黼 p i l - ll h es t r m c t u r eo fo 一，d ，r 1 】菌- 皇 - 聚赖氨酸为淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味，是赖氨酸的直链状聚合物。它不 受p h 值影响，对热稳定，能抑制耐热菌，因此使用后可耐受加热处理，但遇酸性多糖 类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因为结合而使活性降低。聚赖氨酸没有固定 的熔点，2 5 0 以上开始软化分解，极易溶于水、盐酸，不溶子乙醇、乙醚等有机酸。 对其表征进行红外光谱分析表明：在1 6 8 0 - - 1 6 4 0 c m - 1 和1 5 8 0 - - 1 5 2 0 e r a - 1 有强吸收峰m j 。 - 聚赖氨酸作为食品保鲜剂，具有很多优良的特点： 7 0 江南大学硕士学位论文 ( 1 ) 安全性能高； ( 2 ) 使用范围广：在中性微碱性范围抑菌效果好； ( 3 ) 抑菌谱广：聚赖氨酸除对革兰氏阳性菌有强的抑菌外，对革兰氏阴性致病菌、酵 母菌、霉菌也有很好的抑菌效果，并且对一些耐热性芽孢杆菌和病毒也有一定的抑制作 用； ( 4 ) 水溶性好：有利于在食品中添加使用； ( 5 ) 热稳定性好：它能承受一般食品加工过程的热处理，可随原料一同进行灭菌处理， 从而防止二次污染。 8 - 聚赖氨酸广泛的抑菌谱表现在，它不仅对g + 、g 细菌具有抑制作用，而且对真菌 和霉菌也具有很好的抑制作用【4 5 】。研究表明，- 聚赖氨酸对细菌的呼吸作用有一定抑制， 同时_ 聚赖氨酸还作用于细胞膜和蛋白合成系统，其与核糖体结合抑制蛋白和酶的合 成。因为细胞膜是微生物进行能量转化、物质代谢的主要场所之一，所以- 聚赖氨酸吸 附到细胞膜上，可破坏膜结构完整性，使细胞膜丧失对物质的选择性，并可导致胞内溶 酶体膜破裂而诱导微生物产生自溶作用，最终导致细胞死亡。研究表明，对于- 聚赖氨 酸生产菌株，其本身具有与菌体细胞膜紧密结合- 聚赖氨酸降解酶，该酶起到保护菌体 的作用即j 。s h o j is h i m a 等研究表明，- 聚赖氨酸的抑茵活性随肽链的缩短而降低，当肽 链长度少于十个赖氨酸残基，扣聚赖氨酸完全失去抑茵活性，因此可以推断十个氨基酸 是形成具有生物活性的空间构象所必需的；同时，还发现对_ 聚赖氨酸的氨基进行化学 修饰会消除其抑茵活性，说明分子中的碱性基团对_ 聚赖氨酸的抑菌活性有重要作用 4 7 1 o 聚赖氨酸是一种对人体无任何毒副作用的新型生物防腐剂【4 8 】，在人体内可分解为 l 赖氨酸，作为人体必需氨基酸被吸收，不存在任何毒副作用。另外，聚赖氨酸不仅 作为生物防腐剂在食品工业界得以广泛应用，而且可以作为生物材料广泛应用于药物载 体、基因芯片等领域【4 9 1 。因此，聚赖氨酸在近些年来引起了学者们的广泛关注。 目前工业上一般采用白色链霉菌s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 作为发酵生产菌株，除此之 外，s z o k 孤g 等发现一种丝状的麦角真菌c l a v i c e p s p u r p u r e a 能够积累麦角氨，其中含 有大量赖氨酸，其化学结构与s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 的产物不同【5 0 】；n i s h i k a w a m 等【5 1 】采 用一种简便的方法调查了土壤中各种聚赖氨酸产生菌，发现大多聚赖氨酸产生茵集 中在链霉菌科( s t r e p t o m y c e t a c e a e ) 几个不同的属和麦角真菌( e r g o t f u n g o 这_ 两类微生物 上，且不同菌株的产物其赖氨酸单体数也有所不同。 p l 在日本已经作为多种食品的防腐剂广泛使用。比如，在日本人传统日常菜肴中 ( 5 0 0 m g k g ) ，在天然加工食品如生鱼片、寿司中( 1 0 0 0 一- - 5 0 0 0 m g k g ) ，方便食品如 方便米饭、方便面、速食汤、速食蔬菜中( 1 0 - 5 0 0 m g k g ) ，以及在蛋糕、色拉、乳酪 等中的应用。近年来，美国也开始使用8 p l ，主要应用于方便食品的防腐，添加浓度 为5 - - - 5 0 m g k g 。- p l 作为一种新型食品防腐剂除了单独使用外，还可以与其它食品添 加剂混合使用，如氨基乙酸、醋、乙醇、维他命等，并且混合使用后可以大大提高一 聚赖氨酸的防腐能力。常用的配合物质可分为五类：酒精，使用量为3 0 - - - 7 0 ，主要应 8 第一章绪论 用于各种蛋制品；有机酸，常常使用的有机酸一般有：醋酸、苹果酸、马来酸、柠檬 酸、琥珀酸等，使用量在0 5 5 0 之间，主要应用于米饭，饮料，色拉，酱类等食品； 甘油脂，甘油酯多为低级脂肪酸酯，用量在0 0 1 - 5 0 9 6 之间，主要用于动物性蛋白， 乳蛋白较多的食品：甘氨酸，用量为0 0 1 - - 1 0 ，主要应用于牛奶防腐；其它天 然抑菌剂，如：鱼精蛋白、茶多酚等。徐红华等通过饱和试验设计研究了聚赖氨酸和 甘氨酸对牛奶