（农业生物环境与能源工程专业论文）光合细菌产氢系统热效应实验研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 学位 文题目光合细菌产氢系统热效应实验研究 级别 硕士 学生学科农业生物环境与能导师 姓名 荆艳艳张全国教授 专业源工程姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：剩转心师签导师签名丌懈y 粼 日期：d 万年6 月2 0 日日期：口子年6 月) o 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：剥敞导师签名：多糊目学院领导签名：榭 日期：p 了年6 月加日日期：西年6 月如日日期：秒寥年历月矽日 一 致谢 本论文是在导师张全国教授的悉心指导、热情鼓励下完成的，在此，我向张 老师表示最衷心的感谢。感谢三年来他在学习、生活、科研等方面给与我的大力 支持和帮助，特别是在论文的选题、结构、实验及撰写的过程中给与的宝贵意见。 导师张全国教授高瞻远瞩、治学严谨、孜孜不倦、对工作认真负责的态度，都是 我学习的典范。三年来，我不仅从张老师身上学到了许多宝贵的科学文化知识， 更重要的是学到了许多为人处世的道理，这些都使我在今后的生活中终身受益。 感谢农业部可再生能源重点开放实验室的杨群发、李刚、郭前辉等老师在论 文实验过程中所给予的指导和帮助。 在论文选题和完成过程中，我得到了机电工程学院能源与环境工程系的张百 良、刘圣勇、赵廷林、焦有宙、杨世关、尤希风、徐桂转、岳建芝、王艳锦等领 导和老师们的帮助，他们兢兢业业的工作精神、孜孜以求的科研态度激励着我， 他们无私地将知识传授给我，在这里我对他们表示衷心的感谢。还要感谢师兄师 玉忠、范振山、刘振波，师姐王素兰、周汝燕、原玉丰、李鹏鹏、杨茹，同学周 磊、王森、舒伟、曹东辉、文l j d , - - ，师弟王毅、王晓东、李德峰、黄俊，师妹安 静、申翔伟等同学在研究过程中提供的大量的无私的帮助。 十分感谢一直以来默默支持我的男友孙兵兵和含辛茹苦养育我的家人，感谢 他们多年来的关心、支持和鼓励，使我能够有更多的时间，安心地进行课题研究。 最后再次感谢所有关心、帮助、支持过我的老师、同学和朋友! 荆艳艳 2 0 0 8 年6 月 摘要 光合细菌在产氢过程中系统产热，会使光合反应器产生温度应力变形，影响光合制氢体 系的产氢量和产氢速率，更重要的是光合细菌产氢放热的同时，酶的活性有所变化，它直接 影响产氢的效率，所以对光合细菌产氢系统热效应的研究是非常重要的。 本文是国家自然科学基金项目“光合生物制氢体系的热效应及产氢机理研究”的主要研 究内容( 项目编号：5 0 6 7 6 0 2 9 ) ，主要是依据生物热效应的原理和光合细菌制氢的特点，利用 课题组筛选的光合细菌，研究了在光合细菌产氢过程中，系统产热速率的变化规律，并进一 步研究了光合生物制氢体系在热效应的影响下，光合细菌产氢能力的变化规律，还研究探讨 了热效应对光合细菌固氮酶和放氢酶活性的影响作用。结果表明： 1 光合细菌产氢时初始条件对系统产热速率有不同程度的影响，同一条件下，系统温 度随产氢时间的延长呈增加趋势，产热速率随产氢时间的延长呈先增大后减小的趋势。 2 热效应对产氢能力的影响：初温低于2 7 。c ，热效应有利于产氢能力提高，温度高于 2 7 ，不利于产氢；在热效应的影响下，5 0 0 一- - - 3 0 0 0 l x 光照强度范围内，光合细菌的产氢量 和产氢速率都随光照强度增加呈增加趋势；接种量小于2 0 时，热效应有利于产氢能力的 提高，接种量大于2 0 ，产氢能力有所降低，并且在产氢过程中出现二次产氢现象；同一 碳源，有热效应影响的系统产氢能力大于无热效应的系统，在实验所选择的四种碳源中，葡 萄糖是最好的产氢碳源，热效应影响下葡萄糖浓度为3 0 时，产氢能力最好；n h 。+ 浓度小 于0 6 9 l 时，热效应有利于产氢能力的提高，n l i 。+ 浓度为0 8 9 l 时，热效应不利于产氢能 力的提高，但有利于细菌的生长繁殖。 3 固氮酶活性和放氢酶活性呈正相关关系，固氮活性越高，放氢活性也越高。热效应 对酶活性的影响表明：初始温度为2 7 ，固氮酶和放氢酶活性的活性表达最为显著；光照 强度在5 0 0 一- - 3 0 0 0 l x 范围内，增加光照强度，有利于固氮酶和产氢酶活性的提高；接种量为 5 9 6 , - - - 2 0 时，热效应能够促进固氮酶和放氢酶活性的提高；除葡萄糖浓度为0 5 时，放氢酶 活性不表达外，其他以葡萄糖为碳源的光合细菌有较高的固氮酶和放氢酶活性，葡萄糖浓度 为3 0 9 6 时，固氮酶和放氢酶的活性最高，分别是4 9 5n m o l c 2 n 。m l 菌液h 、9 2 5n m o l h 2 m l 菌液h ，蔗糖次之，而以乙酸和乳酸为碳源，光合细菌有比较低的固氮酶和放氢酶活性；不 同n h 4 + 浓度，热效应能够促进酶活性的表达，n h 4 + 浓度为0 4 9 l 时活性表达最为显著。 4 热效应对氢气浓度的提高有明显的促进作用。系统温度升高越多，氢气浓度也越高。 5 以葡萄糖为碳源，光合细菌的增长速度最快，其次是蔗糖，乙酸，然后是乳酸。葡 萄糖浓度为0 5 时，光合细菌只发生色素变化不产氢，在8 0 7 n m 和8 6 3 n m 处的吸收峰不随时 间延迟而消失。 关键词：光合细菌，产氢系统，热效应，酶活性 河南农业大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 研究背景 随着社会进步和工业化程度的提高，经济发展对能源的需求日益增加，世界能源理事会 在题为“决定未来- 2 0 5 0 年之前的能源政策前景”的能源政策报告中指出，2 0 5 0 年全球能源 的需求量将增加一倍【1 1 。按目前世界能源的开采量计算，全世界的石油储量只能供应4 6 年 使用，已探明的天然气开采为6 0 年，铀矿可开采大约4 0 年，加上远景储量也不过6 0 年， 而经济上有开采价值的煤炭资源则可维持2 4 5 年，远远不能满足世界对能源的需求。此外化 石燃料燃烧所产生的污染物如二氧化碳、二氧化硫、氮氧化合物、烟尘、飞灰和其它有机化 合物进入大气还都造成了严重的环境污染【2 l 。所以随着世界人口的不断增加、能源短缺时期 的提前到来和为了经济发展而争夺能源引发的地区政治不稳定状况日益加剧的情况下，解决 经济发展和能源短缺、环境污染之间的问题逐渐成为现代社会发展的主要问题，为了人类社 会的可持续发展，必须寻找和开发清洁的可再生能源【3 】。 在能源领域，许多以生物质为原料的清洁能源如氢能、生物质柴油等不断被开发出来。 其中氢能的燃烧热值高，燃烧产物为水，不污染环境，可以实现真正的“零排放”，是一种 清洁、高效的绿色能源【4 。】，而且能量密度高，是汽油的2 6 8 倍，将氢能转化为动力，热 效率比常规化石燃料高3 0 - 6 0 ，另外原料来源丰富，便于运输，在各种能源中氢能的输送 成本最低，损失最小，优于输科引。由于氢能的上述优点，其应用日益广泛，需求不断增加， 氢能经济( h y d r o g e ne c o n o m y ) p , 经逐渐被美国、欧盟、日本、中国等列上了发展日程川。 美国2 0 0 3 年拨款1 2 亿美元用于氢能的研究，美国总统布什也表示美国向氢经济过渡的路线 图的最终目标是氢能用于燃料电池汽车技术，使得美国的汽车不再依赖于石油；欧盟也制定 了氢能发展战略，拨专款用于其氢能和燃料电池的研发；美国、德国已做好了建设氢气战的 准备；日本和德国已开发出了以高压氢气为燃料的汽车；我国也把氢气发展列为中长期发展 规划蛐1 。也可以预见，未来的十年是氢能技术取得重大突破和进入市场的关键时期旧1 。 近年经过对氢能制取的研究，发现制氢的方法很多，主要有煤、焦炭气化制氢、水分解 法制氢、水电解制氢、水煤气转化制氢及甲烷裂解制氢、生物制氢等劓。但化石燃料法主 要是以消耗煤、天然气等无法再生的能源为基础，在生产过程中排放大量的有害物质，污染 环境。电解法所用的原料水虽然可以再生，但耗电量惊人，成本太高，所以研究开发适应社 会发展需要的生物制氢技术是目前的当务之急。 生物产氢的现象在1 0 0 多年前已被发现，细菌产氢的基础性研究始于2 0 世纪2 0 年代， 而生物制氢应用性研究的想法最先是由l e w i s n 副于1 9 6 6 年提出的，其研究与开发主要是围 绕绿藻、蓝细菌和光合细菌的光解产氢及发酵产氢两大类群展开的。因为生物制氢技术可利 用的原料广泛，而且大多可采用工农业废弃物和各种污水为原料，所以不仅成本低，而且在 生产氢气的同时净化了环境，具有废弃物资源化利用和减少环境污染的双重功效，成为国内 河南农业大学硕士学位论文 外制氢技术的一个主要发展方向。生物制氢技术的研究首先开始于美国、法国等发达国家n 氐 1 7 1 ，在我国开展得较晚，近几年来我国一些高校和科研单位也开始了生物制氢的研究，而且 进展迅速，特别是哈尔滨工业大学在发酵生物制氢技术各方面的研究，使我国的生物制氢技 术在前沿性技术领域占有了一席之地n 文1 9 1 。任南琪在1 9 9 0 年提出以厌氧活性污泥为制氢原 料，利用碳水化合物发酵生物制氢，经测试实现了连续长期持续产氢的成功，标志着我国的 生物法制氢技术领先世界水平啪1 。 目前对生物制氢的研究主要集中在生物制氢技术佐“2 2 1 和产氢机理的研究乜3 1 。研究发现 厌养发酵细菌产氢速率较高，对条件要求较低，具有直接应用的前景，但光合细菌产氢的能 量利用率比发酵细菌高，而且能将产氢与光能利用、有机物的去除有机地耦合在一起，因而 相关研究也最多心 2 引，也是最具有潜在应用前景的制氢方法之一。 1 2 光合细菌产氢的研究现状 光合细菌简称p s b ( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) ，是具有原始光能合成体系的原核生物 的总称，也是一群能在厌氧光照或好氧光照条件下利用有机物作供氢体兼碳源，进行光合作 用的细菌，而且具有随环境条件变化而改变代谢类型的特性。按照光合细菌在生理代谢过程 中是否产氧，可以把光合细菌分为产氧光合细菌( 蓝细菌) 和不产氧光合细菌两大类，这里我 们所说的指的是不产氧型的光合细菌。在伯杰氏细菌分类手册中，不产氧光合细菌包括有紫 细菌( p u r p l eb a c t e r i a ) 、绿细菌( g r e e nb a c t e r i a ) 和日光杆菌属( h e l i o b a c t e r i u m ) 、红色杆菌属 ( e r y t h r o b a c t e o 等。其中紫细菌包括着色菌科( c h r o m a t i a c e a e ) 、外硫红螺菌科 ( e c e o t h i o r h o d o s p i r a c e a e ) 、红螺菌科( r b o d o l s p i r i l l a c e a e ) ，共l6 属，4 9 种；绿细菌中则包括绿 菌科( c h l o r o b i a c e a e ) 、绿曲菌科( c h l o r o f l e x a c e a e ) ，共9 属，1 7 种，并且近几年来还陆续有一 些新种的报道【3 0 1 。 光合细菌进行产氢的生理活动和蓝、绿藻产氢一样都是在光能驱动下光合作用的结果， 但是光合细菌只有一个光合作用中心( 相当于蓝、绿藻的光合系统i ) ，由于缺少藻类中起 光解水作用的光合系统i i ，所以，只进行以有机物作为电子供体的不产氧的光合作用，而且 光合作用的原始供氢体不是水，而是h z s ( 或一些有机物) ，这样光合细菌制氢的主要产物是 氢气和二氧化碳，没有氧的作用b ，并且分解了有机物，同时还能固定分子氮生成氨。光合 细菌在自身的同化代谢过程中，又完成了产氢、固氮、分解有机物三个自然界物质循环中极 为重要的化学过程，而且光合细菌产氢可以利用不同的废料，可利用的光谱范围比较宽，这 些独特的生理特性都使光合细菌在生态系统中的地位显得极为重要。利用光合细菌产氢是目 前最具发展前景的一类生物制氢系统。其主要优点有： l - 可以以多种有机废弃物为产氢原料； 2 可利用的太阳能光谱范围比较宽； 3 产氢需要克服的自由能较小，乙酸光合细菌产氢的自由能只有+ 8 5 k j m o l 比； 4 终产物氢气组成可达9 5 以上； 2 河南农业大学硕士学位论文 5 产氢过程中也不产生氧气。 光合细菌产氢是一种最具发展潜力的生物制氢方法，因而得到了众多研究者的关注。厦 门大学的龙敏南等人研究了光合细菌( c h r o m a t i u mv i n o s m ) 的可溶性氢酶的理化性质及初 级结构。中科院化学所的马淑华、张小东等人从2 0 0 0 年开始对红假单胞菌的光合反应中心电 子传递的机理、结构以及结构与功能之间的关系进行了较为深入的研究。浙江农大、山东大 学、中科院微生物研究所等单位在光合制氢技术各方面亦取得了重大进步。河南农业大学农 业部可再生能源重点开放实验室在光合细菌利用猪粪污水作为原料的高效产氢菌群的筛选 与培养、产氢工艺条件、固定化方法、太阳能光合产氢细菌光谱耦合特性等方面进行了较系 统的深入研究，并取得了一些重要进展。 由于光合细菌产氢需要供光，发酵液产氢容易引起水污染，所以近年来的主要研究问题 是光合细菌与光谱的偶合，并采用固定化技术提高产氢速率和光的穿透能力m 一3 1 ；光合细 菌的产氢主要是固氮酶的功能，而氧气对固氮有强烈的抑制作用，所以主要研究的另一问题 是反应器的设计引，减少氧气的抑制效应，及时去氧；为了提高产氢速率选择高效的产氢菌 株5 j ，或采用基因操作技术，通过控制光合蛋白的表达来提高光转化效率口引，但目前对光 合基因的调控机制还知之甚少，调控因子的性质及其作用方式，不同启动子的结构及其调控 方式，不同基因之间的相互协调控制，相关基因的协调表达等问题都需要进一步的研究；另 外研究最多是光合细菌产氢的工艺条件口7 删。 1 氢酶活性对产氢的影响：参与光合细菌产氢的酶有两种，氢酶和固氮酶，其中氢酶 又分为可逆性氢酶和不可逆性氢酶两种。可逆性氢酶既可以吸氢也可以释放氢，不可逆性氢 酶则只能吸收氢气。对于光合细菌而言，可逆性氢酶虽然可以放氢，但主要行使的是吸氢的 功能，其吸氢活性是其放氢活性的1 0 0 倍。因此可通过对氢酶活性的抑制而相应地提高产氢 量。 2 固氮酶活性对产氢的影响：光合细菌光照条件下产氢主要是由固氮酶催化的，这已 得到广泛的认可附4 引，因此固氮酶活性的高低及其调控，直接关系到光合细菌放氢活性的高 低h 副。固氮酶的基因表达及其活性受多种因素的影响，研究发现不论对光合厌氧生长的菌体 还是好氧生长的菌体，n l h + 均能导致固氮酶的阻抑；n c 是固氮酶表达的决定因素，但n c 比 因碳源种类不同而相差甚远；固氮酶的合成并非是严格的需光，但光照对固氮酶活性具有显 著的促进作用；光合细菌固氮酶活性并非严格的受氧限制，在氧气浓度很低的情况下，固氮 酶仍然能表达一定的活性。 3 底物对产氢的影响：一般情况下，常以葡萄糖作为光合放氢的底物，但不同菌株光 照放氢对底物有一定的选择性h 引，如乳酸是英膜红假单胞菌( r c a p s u l a t a ) 放氢较好的底物， 而且乳酸盐还具有缓解氨盐抑制作用的效果h 引，而沼泽红假单胞菌则以乙酸作为底物时，产 氢活性最高1 。 4 另外氮源、温度、光照度、p h 、接种量、氧气等对光合细菌产氢的的影响也很显著， 3 河南农业大学硕士学位论文 目前的研究也比较多。 1 3 生物热效应研究现状 2 0 世纪7 0 年代以来，生命科学成为主导学科，处于优先发展的地位，解决生命科学的 问题主要依靠与多学科性的共同探索。生物代谢过程是生命活动的重要内容之一，作为近代 物理化学的重要研究手段，热动力学的相关方法在这一领域应用广泛。 一 热动力学是2 0 世纪初发展起来的，它是融量热学、化学热力学和化学动力学于一体的 综合性学科，热动力学的概念源于对化学变化过程的研究h 。因此，它正成为化学反应、生 化过程与化学工程中一种有效的研究方法，并已在物理化学、生物化学、有机化学和无机化 学等众多领域中展示出广阔的应用前景。 1 3 1 量热法应用及优点 自然界所发生的一切物理变化，化学变化和生物代谢过程常伴随着热效应的发生。对于 任何一个化学反应，在反应发生的过程中都伴随着热量的产生，所以如果我们使用具有足够 灵敏度的微量热计对生物代谢的过程进行进行探测，就可提供一种研究活细胞代谢过程及有 关特性的新方法，同时还可以获得细菌代谢的热动力学和动力学信息。目前关于热动力学的 研究方法有多种，量热法是热动力学研究中最基本的一种方法。量热计用于微生物研究早在 1 9 1 1 年h i l l 利用量热法研究酵母细胞对蔗糖的作用时就已被应用，距今已有9 0 年的历史。 随着人们对生物体系认识的不断加深以及高精度、微量化、自动化、商品化的微量热计的发 展，到本世纪7 0 年代，生物量热的理论和技术日趋完善，为微量量热法在细胞水平上的研 究奠定了基础。量热法用于生命科学研究有许多优点h 例： 1 广泛性：量热法可以应用于任何的物理变化，化学变化和生物代谢过程，可以有目 的地加入有关物质，以研究该物质对生物体产热的影响，而生物体不受加入物质的影响； 2 非特异性：量热法测定的是反应体系的总热效应，可以直接检测生物个体、离体的 组织和悬浮液等复杂体系； 3 非破坏性：量热法不引入干扰生命体系正常活动的因素，其结果真实、准确、可靠； 4 连续性：量热法可以自动地、连续地、动态地跟踪整个反应过程，可以原位、在线、 不干扰地监测生化反应的进行； 5 定量性：量热法测得的结果是定量的，从而能定量评价复杂反应体系中未知或未预 料的新现象和规律。 微量热法用于生物体系代谢过程的热量测量有许多独到之处咖1 ，在测量过程中不用添加 任何试剂，即能直接监测生物系统所产生的热效应，所以不会干扰生物系统的正常活动和生 理代谢噶；可以根据需要有目的地加入有关物质，研究该物质对生物体产热的影响；可直接 测量离体的组织和悬浮液，而不用制成清澈透明的溶液，而且测量后不破坏溶液原有的性质， 可以对溶液做进一步的分析研究；虽让生物微量热法本身没有特异性，但因研究对象具有特 异性，所以这种测定方法可以得到某些特异性方法无法得到的结果。而且微量热法还可以用 4 河南农业大学硕士学位论文 于生物系统的静态连续测定，对研究体系没有任何的特殊要求，还可以补充必要的后继分析， 得到热功率一时间曲线( 简称热谱图) 嘞闺1 ，用热动力学的方法对热谱图进行分析，可获 得生物体系生长代谢的热力学和动力学信息m 1 。 1 3 2 热动力学的基本原理和模型 热动力学方法就是根据热量计的输出函数( t ) 来确定其输入函数q ( t ) ，再从输入函 数获取化学反应的动力学信息。热动力学的理论模型见式( 1 1 ) 。 q r “警“a o a + a “。1 式中，q l 为反应产生的热功率；人为热容常数；k 为冷却常数；为温差电信号；v 为 流速；v 为混合池的体积。 因为生物的生理代谢活动是一个极其复杂的过程，可以用多种数学模型来表示。目前在 国内有关细菌代谢过程动力学模型的研究，主要集中在武汉大学屈松生教授所领导的热化室 等研究机构，他们主要对细菌生长代谢、内源代谢、静息代谢的动力学特征进行了系统的研 究6 0 删，并得到了一系列有规律性的热动力学方程。张洪林等也进行过这方面的研究工作口， 这些方程主要有指数式生长模型、限制性生长模型、m i c h a e l i s - m e n t e n 动力学模型、h a l d a n e 动力学模型。在均匀的液体培养条件下，营养物质和环境条件都能满足所有细菌的需要，而 代谢产物的抑制作用又可以忽略不计，在此条件下生物群体所进行是在非限制条件下的生长 5 弱1 。在有限的生长空间内和营养条件下，细胞是无法实现无限生长的啼引。在细胞生长初 期，由于本身还不够强大，增大的速率比较低，而后期由于衰老和环境的制约，增长速率也 降低，只有在发展中期，才处于增殖高峰，增长速率较快，所以生长曲线是一条s 形的曲线 嘲一引，对于细菌的生长，只有在局部、短时间内符合指数生长特征。所以对有限生长，曲 线可设计三种方程式以适合有限生长的特征：单分子、自催化或简单逻辑、g o m p e r t z 方程式 即：( 1 ) 有一个生长极限值，l i m n = 虬；( 2 ) 有一个开始时的生长速率b ；( 3 ) 有一个生 长常数k 。另外还有代谢抑制模型和药物对微生物抑制作用的热动力学模型。 1 3 3 光合产氢系统热效应的研究 目前对生物热效应的研究很多，包括动物、细菌、微生物等，也构建了许多与不同生物 活动相适应的模型，在生物热效应领域取得了很大的进步。光合细菌产氢体系能够产生热量， 引起系统温度、细菌生长、产氢能力及产氢酶活性发生变化。但目前对于光合细菌产氢体系 热效应的研究报道的很少，河南农业大学用热动力学的方法对光合产氢菌生长代谢过程中产 热规律进行了分析，获得了太阳能光合产氢菌生长代谢的热动力学信息，建立了表征光合产 氢细菌生长情况的热动力学特征的模型h 引，但对光合细菌制氢体系的产热速率的变化规律， 热效应与光合细菌的产氢能力，光合细菌制氢体系与不同种类光合细菌分布状况之间的关系 及光合细菌产氢时热效应对酶活性的影响等都未见报道。 在光合细菌制氢过程中，光能穿过反应器照射到光合细菌反应体系，被光合细菌生物体 5 河南农业大学硕士学位论文 系接受的物理因子一部分转化为热能直接释放出来，一部分被生物体系吸收增加了细胞的新 陈代谢水平，同时释放热能，由此引起的生物效应，即光合细菌产氢体系的热效应。光合细 菌产氢体系因涉及到生化反应、光源导入、温度控制等多种因素，因此热能传递途径较多， 在制氢过程中，菌种和基质是在设定的温度下接入，可忽略菌种和基质接入引起的热传递， 产氢过程中系统一直处于封闭状态无需补气，因此不必考虑气体流入所携带的热量，反应又 是在常温、常压下进行，气体流出带出的显热和蒸发热可忽略不计。因此在光合细菌产氢时， 系统地热能传输如图1 1 所示。 吖 图1 1 光合细菌产氢系统的能量传输 f i 9 1 1t h ea p p r o a c ho f h e a tt r a n s m i s s i o no f p h o t o b i o r e a t o r q g 一光照带入的热量； q 卜光合细菌产氢释放的热量； q w - 光合细菌反射或折射等物理变化直接产热； q i 基质反射或折射等物理变化产热； q e 一反应系统与周围环境之间的传热： 光合细菌产氢反应其系统的热量平衡方程见式( 1 2 ) 。 q g + q e q r + q w + q j ( 1 2 ) 即光合细菌产氢反应其系统热量平衡时光照带入的热量和从环境吸收的热量之和等于 光合细菌产氢释放的热量，光合细菌生物体系接受的物理因子转化为热能直接释放的热量和 基质产热之和。在进行光合细菌产氢热效应实验研究时所用的实验装置如图2 1 所示，由于 采用了温度自动跟踪( 具体操作见2 1 1 ) 避免了反应系统和环境之间的传热，而空白对照 实验使光照带入得热量和基质反射或折射等物理变化产热可以忽略不计，因此实验测得的系 统温度变化和产热速率变化规律是由光合细菌产氢释放热量和光合细菌反射或折射等物理 变化直接产热引起的，都是系统产热。 6 河南农业大学硕士学位论文 1 4 本文研究的目的和内容 光合细菌产氢属于放热反应，在产氢的过程中由于系统产热释放热量，系统温度将会有 所升高，同时影响产氢酶活性的强弱，而且热效应引起的温度的变化会使光合反应器产生温 度应力变形，影响光合制氢体系主要是光合反应器的研制和产氢量，最重要的是在光合细菌 产氢放热的同时，产氢酶的活性有所变化，它直接影响产氢的效率，所以对光合细菌产氢系 统热效应的研究是非常重要的。本文主要通过对光合细菌产氢系统热效应的实验，利用课题 组自己筛选的光合细菌研究光合细菌产氢时产生的热量累积效应以及热量释放速度，加深对 生物制氢过程中光合细菌的产氢能力和酶活性与环境因素等相关关系的认识，提出光合生物 制氢的热效应基本理论，为光合细菌制氢技术的工业化以及提高产氢酶活性和产氢速率提供 理论依据，为光合生物制氢反应器运行过程中的温度控制系统设计提供依据和科学参考。本 论文深入研究不同初始条件的系统温度变化及系统热量释放速率的大小，进一步探讨研究热 效应对光合细菌产氢能力的影响，揭示热量累积效应对光合细菌产氢过程中固氮酶和放氢酶 活性的影响规律，并探讨了固氮酶和放氢酶活性两者之间的相关关系。 7 河南农业大学硕士学位论文 2 实验方法 2 1 实验装置及仪器设备 2 1 1 光合细菌产氢的实验装置- 本文采用自制的如图2 1 所示的实验装置研究光合细菌产氢时系统产热速率的变化规律 及热效应对产氢能力的影响。将培养基放入容积为5 0 0m l 的抽真空反应瓶4 中，待接入适 量的处于对数生长期的光合细菌后，用橡胶塞密封，并在瓶口处涂上适量的石蜡，用透明胶布 固定，为使产氢反应能在稳定的环境中进行，将反应瓶置于恒温箱3 中，恒温箱为改造过的与 计算机相连的特殊保温设备，当温度计感应器感应到真空反应瓶的温度发生变化时，将信号 传递并在精密数字温度计7 上给与显示，并进一步传递给计算机，通过设置的程序和自己改 造的电路，又把温度变化的信号反馈给恒温箱，恒温箱利用本身的调控能力进行恒温箱内温 度的调节，以保证恒温箱内的温度和反应瓶内的温度有最小的温差。导气管2 插入反应瓶上 部的余留空间，并在导气管上安装一阀门。产生的气体用排水法收集。恒温箱内的光源i 采 用2 5 、4 0 、6 0 、i o o w 白炽灯组合，均匀的分散在恒温箱内，以保证反应瓶内光合细菌受光均 匀。 图2 1 光合细西产氢受热效应影响的实验装置 、 f i g 2 ii l l u s t r a t i o no f e x p e r i m e n te q u i p m e n to f t h eh y d r o g e np r o d u c t i o ns y s t e mo i lt h e r m a le f f e c t 1 光源2 导气管3 恒温箱4 抽真空反应瓶5 收集瓶 6 贮水瓶7 精密数字温度计8 计算机9 温度计感应器 在任何的反应中只要存在温差就有热量的传递，尽管实验采有的是抽真空的绝热反应瓶， 并对恒温箱进行了改造，采用了温度自动跟踪，但反应瓶是玻璃制品不能保证在产氢反应的 过程中不存在热辐射和来自于光源的热量对反应过程产生的影响，同时温度的自动跟踪仍然 具有滞后性，所以为保证产氢反应能在一个相对比较稳定的环境中进行，保证测试更加准确， 为此除将绝热反应瓶放在恒温箱之内采用温度自动跟踪的方法外，实验还采取了空白对照的 方法，即在相同的条件下，在同样的设备仪器内放入另一没有接入光合细菌的反应瓶，并记 录此反应瓶的温度变化，用绝热瓶内反应液的温度减去对照瓶内反应液的温度，就是光合细 菌产氢反应过程中光合细菌实际生理代谢使系统温度发生的变化。 8 河南农业大学硕士学位论文 为了研究光合细菌产氢时，热效应对产氢能力的影响规律及影响程度的大小时，实验设 计将有热效应影响的系统和无热效应影响的系统产氢能力进行对比，从而分析出热效应对光 合细菌产氢能力影响的具体体现。而无热效应影响的实验装置图和2 1 相同，原理为：实验 时采用容积为5 0 0m l 的普通反应瓶，并预先给恒温箱设置一反应的温度，当温度计感应器 感应到反应瓶的温度发生变化时，将信号传递给精密数字温度计，并进一步传递给计算机， 通过设置的程序和自己改造的电路，又把温度变化的信号反馈给恒温箱，恒温箱利用本身的 调控能力进行恒温箱内温度的调节，只要反应瓶内的温度大于或小于预先设定的温度，系统 就会自动进行制冷或加热，使反应瓶内的温度始终等于预设的温度。 2 1 2 主要实验仪器 2 1 2 1 绝热反应瓶 绝热反应瓶采用郑州通亚化玻设备有限公司生产的5 0 0m l 抽真空绝热反应瓶。 2 1 2 2 温度计 温度计采用南京桑力电子设备厂生产的s w j ic 精密数字温度计，测温范围2 0 - 一1 0 0 c ， 分辨率o o l 。 2 1 2 3 照度计 光照强度采用欣宝科仪生产的l x l 0 1 0 b 数字式照度计测定，测量范围1l x , - - , 5 0 0 0 0l x 。 2 1 2 4p h 测量仪 p h 值采用由广州德润仪器科技有限公司生产的d e l t a 3 2 0 型酸度计测定，p h 测量范围 0 1 4 0 0 p h ，分辨率0 0 1 p h 。 2 1 2 5 生化培养箱 生化培养箱采用广东省医疗器械厂生产的l r h - 2 5 0 - g s 型培养箱，控温范围1 0 - 4 5 1 2 ， 温度精度1 5 。 2 1 2 6 分光光度计 分光光度计采用上海安捷伦科技有限公司生产的h p 8 4 5 3 型紫外可见光光度计。 2 1 2 7 气相色谱分析仪 气相色谱分析仪采用上海安捷伦科技有限公司生产的6 8 2 0 g c 1 4 b 气象色谱仪。氮气做 载气，标准气为9 9 9 9 9 的高纯氢气，色谱柱填料为5 a 分子筛。 2 2 实验材料 2 2 1 产氢菌种来源 本文实验采用的光合细菌是由本实验室的研究人员在四个季节分别从郑州污水处理厂、 郑州新大牧业养猪厂、郑州市西流湖、郑州市郊豆腐加工厂、河南农科院实验田、郑州市金 水河六个地点取样后，按照不同科的细菌的生长条件进行富集、分离、培养、筛选而获得。 9 河南农业大学硕士学位论文 2 2 2 培养基 蒸馏水1 0 0 0 m l ；n a c l0 2 9 ；m g s 0 4o 1 8 9 ；k h 2 p 0 41 5 9 ；c a c l 20 0 5 9 ；k 2 h p 0 40 6 9 ； 乙酸钠3 9 ；酵母膏2 9 ；微量元素l m l ；生长因子l m l ；p h 值7 0 ；除了研究y l - i 4 + 浓度 对产氢能力的影响时，n h 4 c l 的含量按实验设计的要求配比，其它条件选择0 4 9 。 微量元素：c u s 0 4 6 h 2 00 0 5 m g ；f e c l 3 6 h 2 05 m g ；m n c l 2 4 h 2 00 0 5m g ；z n s 0 4 7 h 2 0 l m g ；h 3 8 0 4l m g ；c o ( n 0 3 ) 6 h 2 00 5m g ；蒸馏水1 0 0 0 m l ；过滤除菌。 生长因子：维生素b t0 0 0 1 m g ；尼克酸0 1 m g ；生物素0 0 0 1 m g ；对氨基苯甲酸0 1 m g ； 蒸馏水1 0 m l ；过滤除菌。 2 2 3 培养工艺【2 7 ，3 5 】 在5 0m l 的三角瓶内，加入生长培养基，接种5 0 生长良好的光合细菌，塞上橡皮塞 放置于3 0 c 的恒温箱中厌氧培养，直至光合细菌生长至对数生长期( 以菌体均匀、颜色鲜 红、不出现菌体沉淀为准，一般为5 0 h 左右) ，以备产氢实验所用。 2 3 主要参数的测定 2 3 1 温度的测定 将s w j ic 精密数字温度计的探针插在绝热反应瓶的橡胶塞内，检查探针是否触及瓶 壁，并密封接触点，以保证温度计所测温度即反应溶液的温度。 光合细菌产氢过程用温度变化率来衡量光合细菌产氢时代谢放热的程度，温度变化率的 计算公式见式( 2 1 ) 。 温度变化率= 箜查塑号；竽 ( 2 - ) 2 3 2 光照强度的测定 将l x i o i o b 数字式照度计置于绝热反应瓶表面，对称取不同方位的点进行光照强度的测 定后取平均值。 2 3 3p h 值的测定 用蒸馏水冲洗p h 计两电极后，用滤纸轻轻吸干电极上残余的溶液( 也可以用待测液冲洗 电极) ，然后将电极浸入放有待测溶液的烧杯中，并轻轻摇动烧杯，待溶液混合均匀后，按下 读数开关，指针所指的位置即为待测溶液的p h 值。重复几次，直到数值达到稳定为止。 2 3 4 产热速率的测定 光合细菌产氢过程系统产热速率的大小，按照式( 2 2 ) 计算h 引。 产热速率：兰! 垒三! 9 1 2 ( 2 - 2 ) f v o 色合反应器内反应液的容积，l 5 河南农业大学硕士学位论文 p 一反应液的密度，本文p 为0 9 4 k g m 3 ； 1 - _ 在一小段时间内系统温度的变化值，； c 一反应液质量热容，本文c 为3 8 7 7l d k g ； t - 时间，h 。 2 3 5 细胞生长的测定 用消过毒的针管抽取适量的菌液放入光径为l c m 的比色皿中，用h p 8 4 5 3 型紫外可见光 光度计测定6 6 0 n m 处的吸光度值，用吸光度值表示光合细菌的生长情况。吸光度值越大，光 合细菌的数量越多。 2 3 6 氢气产量和含量的测定 排水法测氢气产量，气相色谱法测氢气含量。 气相色谱采用6 8 2 0g c - 1 4 b 型气相色谱仪。检测器为热导池，5 a 分子筛填充柱，高纯氮 气为载气，柱温8 0 ，检测器温度1 5 0 ，进样量5 0 0l ll ，标准气体采用h z 含量为9 9 9 9 9 的 高纯氢。产氢能力用产氢量( m l ) 和产氢速率( m l h 2 l h ) 两个指标来表示。 氢标准曲线的绘制盯：取5 个1 0 0 m l 密封注射器，用标准样品抽取几次，将注射器中空气 和杂质排除干净，然后分别抽取标准气体：5 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 m l ，用氮气稀释，配制成浓度为 5 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 的一组标准气体。 在上述色谱条件下，分别对不同浓度的标准气体进行色谱分析，并测定各t l 的峰面积。然 后以氢气浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制氢气标准曲线，其他各氢气含量根据标准曲 线采用外标法以峰面积计算，如图2 2 所示。 1 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 释 嚏6 0 0 0 0 0 掣 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 o 4 05 06 07 08 09 0 氢气浓度( ) 图2 2 氢标准曲线 f i g 2 2s t a n d a r dc u r v eo fh y d r o g e n 图2 2 氢标准曲线的回归方程为y = 1 0 7 9 8 x + 1 3 9 2 6 8 ，相关系数为0 9 9 9 1 ，所以峰面积和 氢含量之间有很好的线性相关性。 在进行氢气浓度的实验时，测试样品选择每个样品每天分别在7 h 、1 1h 、1 5 h 、1 9 h 、 河南农业大学硕士学位论文 2 3 h 各取两次进行测量，直到产氢终止，按平均值计算氢气的平均浓度。实验测量氢气的产 量和产氢速率都是按纯净的氢气量计算。 2 3 7 放氢活性的测定【7 1 1 在自制的5 0 0 r a l 反应瓶内装入产氢培养基，并接种适量种子液，塞上橡胶塞后抽掉空气 充入氩气，并以石蜡密封瓶口。分别选择实验所需的光照强度和温度，光照震荡反应7 2 h ，用 气相色谱测定氢气含量，同时进行固氮酶的活性测定。 2 3 8 固氮酶活性的测定 固氮酶活性的测定采用乙炔还原法盯“7 2 1 。 取5 m l 菌液立即放入灭过菌的2 0 r a l 玻璃瓶中，塞上无菌橡皮塞，排除空气后，用注射器 抽注入2 m l 乙炔，瓶口处以石蜡密封。在光照强度为2 0 0 0 l x ，温度为3 0 c 时反应1 5 h ，然后取 出1 0l ll 的反应气体，用气相色谱测定生成的乙烯量，换算成固氮酶活性单位。 2 3 9 乙烯的测定 乙烯含量的分析采用日本岛津公司生产的g c - 1 4 b 型气相色谱仪。检测器为火焰离子化 检测器( f i d ) ，毛细管柱( h p l o t q ) 3 0 m * 0 5 3 m m ，以高纯氮气为载气，柱温5 0 ，检测器 温度1 5 0 ，进样量5 0ul 。，在此条件下，乙烯和乙炔的出峰事件分别在2 8 m i n 和3 1 m i n 左右，分离效果良好，如图2 3 所示。 2 8 0 5 3 1 3 4 图2 3 乙烯、乙炔气相色谱图 f i g 2 3t h ep i c t u r eo fg co ne t h c n ca n de t h y n e 乙烯含量采用外标法以峰高计算，所绘制的标准曲线图盯，如图2 4 所示。 1 2 河南农业大学硕士学位论文 1 2 0 0 0 1 0 0 0 0 8 0 0 0 巷6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 0 o2468 乙烯浓度( ) 1 2 图2 4 乙烯标准曲线 f i g 2 4s t a n d a r dc u r v eo fe t h e n e 由图2 4 可以看出，乙烯标准曲线的回归方程为：y = 9 6 9 i i x + 7 9 5 9 3 ，相关系数为 0 9 5 3 3 ，故当乙烯浓度为1 1 0 时，峰高和乙烯浓度之间有比较好的相关性。 1 3 河南农业大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 光合细菌产氢系统产热速率的研究 光合细菌的产氢反应属于放热反应，在产氢过程中生物体的新陈代谢也会释放一定的热 量，从而引起反应系统温度、细菌生长及产氢能力、酶活性等发生一定的变化。 3 。1 1 初始温度对光合细菌产氢系统产热速率的影响 在进行温度对光合细菌产氢系统温度和产热速率变化的影响单因素实验时，光照强度选 择2 0 0 0 l x 、接种量为1 0 、p h 值为7 0 、接种物选择培养4 8 h ，o d 值为0 4 0 6 处于对数生 长期的光合细菌，以3 0 9 l 葡萄糖溶液为产氢基质，初始环境温度分别设定为为2 4 、2 7 、3 0 c 、3 3 1 2 。实验得出光合细菌产氢不同初始温度时系统温度的变化如图3 1 所示，不 同初始温度的产热速率如图3 2 所示。 3 6 3 4 3 2 p3 0 瑙2 8 赠 2 6 2 4 2 2 o24681 01 21 41 61 8 2 02 22 42 6 时间( h ) 图3 1初始温度对系统温度的影响 + 2 4 + 2 7 + 3 0 一3 3 f i g 3 i e f i e c to f i n i t i a lt e m p e r a t u r eo nc h a n g ei nm m p e m m r eo f t l l es y s t e m 不同初始温度光合细菌进行产氢实验时，系统温度会发生不同程度的提高，1 2 h 以前不同 初始温度，光合细菌产氢的系统温度都有较大程度的提高，1 2 2 0 h 系统温度上升缓慢，2 0 h 以 后，基本保持不便。其中初始温度为2 7 c 时，系统温度上升最大，达到3 0 4 3 ，温度变化率为 0 1 3 2 ，并且6 h 以前的温度变化率低于6 一- - - 1 0 h 的变化率；初始温度为3 0 时，系统温度变化 次之，达到3 3 3 2 ( 2 ，温度变化率为0 1 2 8 ，并且1 0 h 以前温度变化率比较均匀；初始温度为 2 4 时，系统温度变化较小，但仍然明显，温度上升到2 6 5 6 ，变化率为0 0 9 8 ) 而初始温度 为3 3 时，系统温度变化最小，温度上升到3 3 8 9 c ，温度变化率仅为0 0 2 8 。即不同初始 温度下光合细菌进行产氢实验，系统温度都会发生不同程度的变化，但系统温度的变化率并 不随初始温度的增加或减少而呈现规律性的变化，系统温度变化大小顺序依次为2 7 、3 0 、2 4 、3 3 。 1 4 河南农业大学硕士学位论文 上 一 卜1 l 褥 瑙 瘊 定 1 4 1 2 o o 24681 01 21 4 时间( h ) + 2 4 + 2 7 + 3 0 - 一3 3 图3 2 初始温度对产热速率的影响 f i g 3 2i n f l u e n c eo f i n i t i a lt e m p e r a t u r eo nh e a tp r o d u c t i o nv e l o c i t yo f t h es y s t e m 由图3 2 知，光合细菌产氢时系统产生大量的热，初始温度不同产热的速率和速率变化 趋势也有所不同，但产热速率变化的大体方向是产热速率随时间的延长呈先增加后减小的趋 势，直到系统达到热平衡为止。由图可知，在产热的第2 h 初始温度为2 7 。c 的系统的产热速 率最大，其次是初始温度为3 0 c 的系统，然后是初始温度为2 4 c 的系统，而初始温度为3 3 的系统产热速率最小。2 - 8 h 各系统产热速率快