（微生物与生化药学专业论文）表达β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白工程菌的构建.pdf

摘要 摘要 b 干扰素是干扰素家族中的一员，具有抗病毒、抗增殖和免疫调节作用，已经成功 地应用于治疗多种疾病。为了提高p 干扰素在体内的半衰期，我们构建了i f n p h s a 融 合蛋白，将其在毕赤酵母系统中进行表达，并对融合蛋白进行了鉴定、活性分析和初步 的纯化。 从人外周血白细胞中提取基因组d n a ，参照数据库中i f nb 基因序列，设计一对特 异性引物，利用p c r 方法，从基因组d n a 中扩增i f nb 基因，通过限制性酶切位点勋 和肺h 饥，将其插入到克隆载体p b l u e s c r i p t i i k s ( + ) 中，构建重组质粒p b l _ u 2 k s p i f n p ， 进行测序。测序结果显示克隆得到的i f nb 基因与g e n e b a n k 数据库中登记号为 n m0 0 2 1 7 6 的序列完全一致。 利用重叠p c r 技术，体外拼接i f nb 和h s a 基因，将其插入到克隆载体 p b l u e s c r i p t l ik s ( + ) 中，构建重组质粒p b l u 2 k s p i f n p h s a ，进行测序，用髓o ri 和d fi 双酶切重组质粒p b l u 2 k s p i f n p h s a ，回收i f n p h s a 片段，将其插入到毕赤 酵母表达载体p p i c 9 k 中，构建表达载体p p i c 9 k - i f n p h s a 。结果表明p c r 拼接得到的 i f n p h s a 融合基因与预期的一致，构建的表达载体p p i c 9 k i f n b h s a 经限制性酶切 分析表明，融合基因已经成功地插入到载体p p i c 9 k 中。 表达载体p p i c 9 k i f n p h s a 经勋，i 线性化后电击转化毕赤酵母 ：m 7 l ，用m d 平 板进行初筛，含g 4 1 8 的m d 平板复筛，得到的重组子进行进一步的诱导表达分析筛选， 将表达量较高的重组毕赤酵母进行表达产物鉴定和抗病毒活性分析，优化诱导时间和诱 导剂浓度后，对融合蛋白进行初步的分离纯化。经g 4 1 8 筛选得到能耐受3m m lg 4 1 8 重组菌1 2 株，进一步的诱导表达筛选得到表达量较高的4 株重组菌r m l 、r i h 2 、r i h 4 和r i h 8 ，w e s t e m 杂交显示表达的融合蛋白i f nb h s a 具有很好的h s a 抗原性，分子 量约9 0k d a ，采用w i s h s v 系统测定发酵液中融合蛋白活性为6 4 0i u m l ，发酵液经 超滤浓缩、分子筛层析后，分离得到的融合蛋白纯度约为9 0 。 关键宇：干扰素，长效，融合蛋白，克隆，毕赤酵母 a b s t r 虻t a b s t r a c t t h ei m e r f e m n ( i f n ) i so n eo f t h ep o t e n tm u l t i f u n c t i o n a lc ”o k i n e s 向n i i y ，w h i c hp o s s e s s e s a “d em n g eo f a 1 1 t i v i r a l ，i m m u n o r e g u l a t o r ya r i dg m w t l li n h j b i t o r yp r o p e r t i e s a sam e m b e r o fi m e r f e m nf 狮l y ，i m e r f e r o nbh a db e e na p p l i e dt ot r e a tm a l l yd i s e a s e s ，s u c ha sm sa n d h e p a t i t i s t bp r o l o n gt h eh a l f 1 i f 爸o fi f npi nv f v d ，、v ed e v e l o p e dal o n g a c t i n gi f np ( i f n p - h s a ) b ya l b 岫i nf u s i o nt e c h n o l o g yt h ef h s e dg e n ei f n p h s aw a se x p r e s s e di n p f c 矗蛔p 口s r d ，括c o n f i r m e di tb yw e s t e mb l o ta n da n t i v i r a la n a l y s i s ，m e 向s i o np r o t e i nw a s p u r i f i e dp r e l i m i n a r i l y p c r t e c h n 0 1 0 9 yw a se m p l o y e dt o 锄p l i f yt h ei f npg e n e ，w i t hap a i ro f p r i m e r sd e s i g n e d a c c o r d i n gt om en u c l e o t i d e ss e q u e n c eo fi f npg e n ep r e s s e di ng e n b d a n ka n dt h et e m p l a t e d n ae x t m c t e df b mh u m a nl e u k o c y t e t h ei f n8g e n er e c o v e r e df r o mp c rw a sc i o n e di n t o p l a s m i dp b l u e s c r i p ti ik s ( + ) a t 勋，ia 1 1 d 觑”饥i ir e s t r i c t i o ne n z y m es i t e s ，a n dt h e n s e q u e n c e d t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h en u c l e o t i d e ss e q u e n c eo fc l o n e di f nbg e n ew a s i nc o r r e s p o n d e n c ew i t hi f nbc d n ap r e s s e di ng e n b d a n kw i t ha c c e s s i o nn u m b e r n m0 0 2 1 7 6 a r e r s p l i c i n gi f npa n dh s ag e n e si nv f ，r db yo v e r l a p p i n gp c rt e c h n o l o g y ，m em s e d g e n e w a sc l o n e d i n t o p l a s m i dp b l u e s c r i p t i i k s ( + ) a 1 1 d 山e ns e q u e n c e d t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dw a sn a m e dp b l u 2 k s p i f n b h s a t h ec o n f l r m e dm s e dg e n ew a sr e c o v e r e df r o m t h ed l a s m i dw i t l lr e s t r i c t i o ne n d o u n c l e a s e e c d 尺ia n d r 0 ，i a n dt h e ni n s e r t e di ti n t o e x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kt oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k i f n b h s a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec l o n e df u s e d2 e n ew a si nc o r r e s 口o n d e n c ew i t ho u ra n t i c i p a t i o n ， a n de x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t m c t e dc o r r e c t l y t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k i f n b h s al i n e a r i z e ds d ，ir e s t r i c t i o ne n d o n u c i e a s ew a s t r a n s f - o r m e di n t ok m 7 1s t r a i no f p f c 矗f 口口口s r d ，如b ve l e c t r o p o r a t i o n a n dt h er e c o m b i n a n t s t r a i n sw e r es c r e e n e db yh i sl i m i t a t i o n 、g 4 18r e s i s t a n c ea 1 1 de x p f e s s i o nl e v e l b ys t e pt os t e p t h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gs t r a i nw i mr e l a t i v eh i 曲e x p r e s s i o nl e v e lw a si d e n t i f i e db yw e s t e m b o l ta 1 1 da n t i v i r a la n a i y s i s a r e ro p t i m i z i n 2m et i m eo fi n d u c e m e n ta n dt h ec o n c e n t r a t i o no f i n d u c e lt h es e c r e t e df u s i o np m t e i ni f n b h s aw a sp u “f i e db yt h ei s o l a t e dp m c e d u r eo f u l t r a n l t m t i o na n dg e lf i l t r a t i o nc l l r o m a t o 鲈a p h y ，r e s p e c t i v e l y f i n a l l y ，1 2s t m i n sw e r e s c r e e n e do u t 仔o mc o m a i n e d3m 2 m lg 4 l8m dp l a t e ，i nw h i c h4s t r a i n sc o u l ds e c r e t em s i o n p r o t e i ni f n b h s ai nr e l a t i v eh i g hl e v e l w e s t e mb l o ta 1 1 a l y s i sw i t hh s aa n t i b o d ys h o w e d t h a tt 1 1 ef u s i o np r o t e i ni f n b h s aw a so n9 0 k d am o l e c u l a rw e i g h t t h es p e c i n ca c t i v i t yo f c u l t u r es u p e m a t a l l tw a sa b o u t6 4 0r u m la s s a y e db yt h es t a n d a r da 1 1 t i v i r a la c t i v i t yt e s to n w i s hc e l l sc h a u e n g e dw i t hv s vv i r l l s t h ef u s i o np r o t e i n 、v a sp u r i f i e dt oap u r i t vo fa b o u t 9 0 k e y w o r d ：i n t e r f b r o n ，l o n g a c t i n g ，如s i o np r o t e i n ，c l o n e ，p f c 妇p 日蚰d r 括 i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：日期：年月 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名； 日期： 9 t 争 年月日 第一章绪论 1 1 干扰素 1 1 1 干扰素概况 第一章绪论 1 9 5 7 年l s a a c s 和l i n d e l l i t l 嘲利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时发现受病毒感 染的细胞能产生一种可溶性蛋白，作用于其它细胞时能干扰病毒在细胞中的复制，因而 将其命名为干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 。随着对干扰素研究的不断深入，人们发现干 扰素除了具有广谱的抗病毒活性外，还具有抑制细胞生长和免疫调节等生理作用。自 1 9 8 6 年干扰素被f d a 批准成为第一个应用于l 临床的细胞因子以来，目前已经有5 7 个国家 批准生产使用重组干扰素制剂，治疗多种肿瘤、病毒性感染方面的疾病。 1 1 2 干扰素分类及性质 根据干扰素的抗原性和细胞来源不同可以将干扰素分为a 、8 和y 等三类，其中i f n 来由白细胞产生，i f nb 来自于成纤维细胞，它们约有2 5 3 0 的同源性，具有相 似的生物活性，共用同一个细胞表面受体，被统称为i 型干扰素。i f ny 与它们有较大 的差别，属i i 型干扰素，主要由特殊抗原或丝裂原刺激活化t 细胞产生和病毒感染时 n k 细胞产生，因而也被称为免疫干扰素【2 “。干扰素的一般性质如表l 一1 表卜l 干扰素的一般性质 t a b l e 卜lg e n e r a lp r o p e r t yo fi n t e r f e r o n 8 江南大学硕士学位论文 1 1 3b 干扰素基因和蛋白 人i f np 基因定位于人染色体短臂9 p 2 1 位点，在i f n 旺基因群的远端。在i f np 基因的 转录起始位点上游1 1 0 b p 以内存在基因的调节区一干扰素基因调节元件( i n t e r f e r o n r e g u l a t d r ye 1 e j i l e n t ，i r e ) ，其中包括4 个重叠排列的正调节区( p o s i t i v er e g u l a t o r y d o m a i n ，p r d ) p r di 到p r d 和负调节区( n e g a t i v er e g u l a t o r yd o m a i n ，n r d ) n r di 与n r di i 。每个调节区都能与一个或几个转录因子结合，控制转录起始和转录后基因关 闭。p r di ( 一7 7 6 4 ) 和p r d i i i ( 9 4 7 8 ) 都含有干扰素调节因子( i n t e m r o nr e g u l a t o r y f a c t o r ，i r f ) 心l 和i r f 2 的结合序列5 a a g t g a 3 ；p r d i i ( 一6 6 5 5 ) 含有n f k b r e l 转录因子的识别位点5 g g g a a a n c 3 ( 保守序列5 g g g r n n y y c c 一3 ) ；p r d 与 活化转录因子a t f 2 结合；n r d ( 一6 0 一5 0 ) 与p r d 儿部分重叠，可以抑制p r d i i 介导的基 因活化，病毒r n a 、d s r n a 等可以通过诱导这些于调节区结合调节蛋白来活化或抑制i f n b 基因的转录【4 ，“】。 i f np 基因转录出的m r n a 长7 5 7 b p ，编码1 8 7 氨基酸残基的i f np 前体，其中包括2 1 个氨基酸残基信号。成熟的i f nb 为糖蛋白，在a s n 8 0 处存在n 糖基化，分子量在2 0 k d 2 3 k d 之间，糖约占2 0 。k a r p u s a s 等【1 2 j 测定了2 2 a 分辨率下的h u i f np 晶体结构。结果 显示它具有典型的i 型干扰素折叠方式，属于长链螺旋细胞因子家族如图1 1 。 图l - 1 np 晶体结构 f i 昏l lt h ec r ”t a l l o g n p h i co f h u 邛npd i m m e r 研究糖基化对i f np 理化性质和生理活性影响，表明去糖基化的i f np i a 在结构上虽 与天然i f np 相似，但活性却只有天然干扰素i f np 1 a 的l 1 0 1 1 5 。而且去糖基化的i f n p - 1 a 热稳定较天然i f nb 1 a 差，易在分子间形成二硫键、聚集沉淀。类似的情况也在i f n p 一1 b 中出现，但由于i f np 1 b 没有了c y s l 7 ，在分子问的疏水残基相互作用导致聚集时不 会形成二硫键1 4 】。 在i f np 蛋白中含有c y s l 7 、c y s 3 1 和c y s l 4 13 个c y s 残基，其中c y s 3 l - c y s l 4 l 形成一 对二硫键。s h e p a r d 等【1 5 】对这对二硫键的突变研究发现，c y s 3 1 c y s l 4 1 二硫键对于i f np 活性至关重要，c y s l 4 l 用t y r 取代后得到的产物，完全丧失抗病毒活性。而第1 7 位的c y s 第一章绪论 对保持i f nb 的空间结构无明显的作用，该c y s 被s e r 替代后不但对其生物学活性无影响， 反而因减少其与第1 4 1 位c y s 形成二硫键的机率，使其分子更加稳定。美国f d a 已于 1 9 9 3 年批准i f np ( s e r l 7 ) 用于治疗多发性硬化症。 1 1 4 干扰素生理活性及作用机理。3 。”1 l 刚是多功能蛋白，可以直接作用或者通过诱导、活化其他蛋白，而引发并调节多种反 应，不同i f n 亚型能够刺激不同的但可以重叠的基因，然而总的表型反应是相似的。 1 抗病毒作用 在细胞内建立抗病毒状态是i f n 的基本作用，尤其对于高等脊椎动物的抗病毒感染尤 其重要。对于不同的病毒感染，在它们不同的复制周期，具有多种不同的抗病毒路径。i f n 发挥抗病毒作用主要是通过潜在的抗病毒基因的表达，使细胞产生一种抗病毒状态。 ( 1 ) p k r 系统：这可能是i f n 诱导的最具有特征性的抗病毒路径。p k r 主要存在于多数细胞的 胞浆中，部分位于胞核。i f n 通过p k r 启动子区i s r e 与g a s 的介导，能够迅速刺激p k r 基因 的表达。p k r 的氨基末端含有2 个保守的d s r n a 结合位点，d s r n a 能够活化p k r ，导致p k r 的 构象改变，激活p k r 的激酶活性，活化的p k r 能够磷酸化真核翻译起始因子( e i f 2 一q ) 。 ( 2 ) 2 5 寡聚腺苷酸合成酶r n a s e l 系统：这是一个多酶系统，包括3 种独立的成：2 5 寡聚 腺苷酸合成酶、r n a 酶l 、2 57 腺苷磷酸二酯酶。这些成分在静止细胞中低水平存在，i f n 作用时能被强烈诱导。病毒来源的d s r n a 能够激活本系统，最终导致r n a s e l 的活化， r n a s e l 能够降解所有单链r n a ，因而抑制了以i 斟a 作为中介的病毒复制。2 5 腺苷磷酸 二酯酶通过催化2 5 寡聚腺苷酸的降解调节整个过程。由于2 5 腺苷系统主要在胞浆发 挥作用，因而能够在e m c 病毒、痘病毒与h i v 1 的感染中发挥作用，而对于在胞核复制的病 毒，如水泡性口腔炎病毒( v s 、单纯疱疹病毒( h s v ) ，可能没有作用。 ( 3 ) m x 系统：m x 是i f n 诱导的g t p 酶。能够在转录水平及其他水平干扰流感病毒以及其他负 链病毒的复制。m x 的确切作用方式尚不完全清楚，认为它能够干扰病毒聚合酶活性。 2 抗增殖作用 i f n 能够通过直接或者间接( 免疫系统) 作用抑制肿瘤细胞，导致细胞生长阻滞，但其 确切的作用机制尚不清楚。没有特异的基因与i f n 的抗增生活性相关，但认为s t a t l 与这 种作用有关，在肿瘤中，这种基因往往是缺失的。细胞周期阻滞机制尚不明确，但被认 为可能是作用于细胞周期控制的成分，包括诱导c d k 抑制基因如p 1 5 局1 6 以及 印1 w a f l c i p 。 3 免疫调节作用 i f n y 是主要的免疫调节干扰素。另外，i 型i f n 虽然是重要的抗病毒作用的细胞因 子，但是也通过免疫系统来发挥清除病毒感染的作用。i f n 一能够增强n k 细胞活性，促 进b 细胞的增生，增强体液免疫反应。i f n o 也能上调细胞表面m h c i 类分子的表达，增 强c d 8 细胞毒性t 细胞反应。另外，i 型i f n 能上调t h 细胞上i l 一1 2 受体i l 一1 2 rb 的表达， 而t h l 对c d 8 + 细胞毒细胞的扩增及增生的诱导发挥作用，因而能够上调c t l 细胞的产生并 江南大学硕士学位论文 增强t h l 反应。某些i f n n 亚型可能增加m h c i i 类分子的表达。 1 1 5b 干扰素的临床应用 目前，i f nb 1 b 己广泛用于病毒性感染、恶性肿瘤、以及自身免疫性疾病的治疗或 实验性治疗。1 9 9 3 年美国f d a 批准了先灵公司( c h i r o n1 1 1 c ) 制造的i f np 1 b 上市销售， 用于治疗多发性硬化症、神经系统疾病，其商品名称为b e t a s e r o n 。亚洲的日本、新加坡、 欧洲的意太利、西班牙等国家已批准i f nb 用于多发性硬化症、肝炎或其它病毒性感染 的治疗。 多发性硬化( m u l t i p l es c l e r o s i s ，m s ) 是一种常见的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，其 病因和发病机制至今尚不清楚，临床上也缺乏特别有效的治疗方法。目前大家认为本病 是一种自身免疫性疾病。人外周血t 细胞受抗原刺激激活后释放多种细胞因子，然后穿 越血脑屏障到达中枢神经系统。通过释放细胞因子、促进炎症反应和募集其他免疫细胞 等作用而产生病理损伤。目前，在临床上使用b 干扰素治疗m s ，取得了较好的效果。 其治疗机制可能有以下几种【l9 】：抑制抗原递呈：恢复细胞因子之间的平衡：抑制 基质金属蛋白内切酶的生成；减少粘附因子和趋化因子的生成；促进淋巴细胞凋亡 等机制发挥其治疗作用。一项为期2 年设有安慰剂对照的多中心双盲研究证明；隔日皮 下注射8 0 0 万单位i f nb 1 b 可将多发性硬化症的复发率下降约1 3 ，另外核磁成像( m r i ) 研究表明，它可减缓病人脑部损伤的进展【2 。 用于治疗慢性乙型或丙型肝炎的临床实验表明i f nb 1 b 可抑制肝内病毒的复制，使 有关的生化指标恢复正常。日本己批准静脉注射i f nb 用于治疗以上两种病毒性肝炎【2 ”。 己有的研究结果表明，在治疗慢性乙型、丙型病毒性肝炎的长期效果方面，i f nb 至少 等同于己批准使用的重组i f nd 。在治疗慢性丙型病毒性肝炎病人时，每日静脉注射6 0 0 万单位或更大剂量的i f nd ，连续使用8 周或更长时间后，其持续有效率仍可维持在 3 0 q o 。用i f nb 治疗慢性乙型肝炎，5 0 一6 0 病人的肝脏酶学指标恢复正常且活动 性病毒复制的指标丧失【22 1 。在h c v 急性感染的早期，静脉注射i f nb 进行治疗，可使 8 0 以上的病人体内的h c v 得以清除；在治疗急性h c v 感染的研究中，用i f nb 治疗 8 周，每日静脉注射6 0 0 万单位，8 3 的病人生化指标及病毒学指标恢复正常口”。更令 人振奋的是欧洲的研究表明i f nn 治疗无效的慢性乙型病毒性肝炎患儿，用i f nb 治疗 时表现出了一定的疗效1 2 。 在治疗尖锐湿疣方面，i f np 亦表现的十分有效。另外，美国已在进行i f np 治疗 肺癌、结肠癌及其它疾病方面的i i 期、i i i 期临床实验。 1 2 长效重组蛋白 1 2 1 研究背景 生物技术的发展极大地促进了多肽蛋白药物的研发，截止2 0 0 4 年2 月，美国f d a 批 4 第一章绪论 准了6 4 种重组多肽蛋白类治疗药物上市。药代动力学研究表明多肽蛋白类药物主要通 过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。其中分子量小于2 0 k d a 的多 肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过；通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降 解并从尿中排出，因而半衰期短。以b 干扰素为例，肌肉注射的体内半衰期般在2 h 一4 h 左右，即使大剂量给药六个半衰期( 2 4 h ) 后，其f f i l 药浓度己无法达到抑制病毒复制的 目的。为了达到的治疗效果，需要频繁的大剂量用药，长期的频繁注射不仅增加了病人 的痛苦和治疗费用，而且易引发一系列严重的毒副作用。长效多肽蛋白类药物的开发 己成为对第一代基因工程多肽蛋白药物进行二次开发的重要方向。目前延长蛋白药物半 衰期的主要基于增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；减少异源蛋白的免疫原性， 从而减少其体内清除率；持续缓慢释放维持药物浓度，延长药物作用时间等三个方面考 虑。常用技术有：制备缓释制剂、构建突变体、化学修饰以及基因融合等【2 5 ，”j 。 1 2 2 长效制剂“7 。喇 对于半衰期短的多肽蛋白类药物可以采取改变剂型来延缓其在体内的释放，达到延 长药物作用时间。这些剂型包括：埋植剂( 分为可降解和非降解) 、微球注射剂等。k 萄i h a r a 等1 3 0 j 用硅胶制备了的口干扰素埋植剂，主要工艺是采用人血清白蛋白( h s a ) 作保护剂， 与干扰素一起混匀后用冷冻干燥，将冷冻干燥的h s m f n 、硅胶和固化剂混合，经 真空干燥成型后，装入聚四氟乙烯管。由于h s a 在体内安全性好，用h s m f n q 粒子 制各埋植剂可将载药量进一步提高。研究发现，载药量提高、h s a i f n a 粒径增大可显 著提高释药速率和总释药量。此外，在处方中加人一定量的甘氨酸，也可通过提高渗透 压的方式进一步增大释药速率。实验发现，干扰素在制成棒状埋植剂后活性仍保持原活 性的9 4 以上，小鼠皮下植入含i f n 4 ，7 l o7 i u 该棒状埋植剂后缓释效果可达6 0d 。 同时抑制裸鼠背部肿瘤的药效学试验也表明缓释效果明显，皮下植入含i f n a 5 5 1 0 6 i u 的该制荆与连续皮下给药2 1d 每天注射l 1 0 5 i u 的i f n 溶液抑制肿瘤增殖效果相当。 干扰素埋植剂制备工艺条件大多比较温和，避免使用有机溶剂、加热、剧烈搅拌等 操作，有效地保持了干扰素制剂的活性，但非降解埋植剂需要手术埋植和摘除，增加了 病人的痛苦，目前研制的几种干扰素埋植剂，其缓释效果也远未达到避孕药物埋植给药， 可维持控速释药几年的效果。可降解埋植剂仍需手术埋植，且由于体积较大，释药随着 埋植剂的降解也难以控制。采用生物可降解聚合物如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸一羟乙 酸( p l g a ) ，聚丙交酯乙交酯( p l g g ) ，聚乙二醇聚乳酸( p e l a ) ，聚己内酯、聚羟丁酸等，特 别是p l g a 为骨架材料，包裹多肽、蛋白质药物制成的可注射微球剂，是近年来研究的 新领域。p l g a 除具有良好的生物相容性、无免疫反应、安全性较高外，可通过改变两 单体比例及聚合条件调节聚合物在体内的降解速度，近1 0 多年来，作为微球、微囊的 骨架或包衣材料的应用报道越来越多。合成聚合物理化性质稳定，控制工艺条件可得到 所需规格，批间质量差异小，这些都是天然聚合物无法比拟的优点。 江南大学硕士学位论文 1 2 3 构建突变体 利用突变技术，引入一些稳定蛋白质结构和提高活性的因素，可以有效提高蛋白稳 定性，增加药物半衰期。如前文所述，i f n p 的c y s l 7 被s e r 取代后，消除了由c y s l 7 配对形 成错误的二硫键，减小了因形成分子之间的二聚体或多聚体而对活性和稳定性产生的影 响，活性实验表明，i f n p ( s e r l 7 ) 与天然i f n p 相似，而其稳定性较无糖基化的i f n p 有 了很大的提高，一7 0 存放的稳定性实验显示i f n b ( s e r l 7 ) 1 5 0 天后活性不减，而物无 糖基化的i f n b 7 5 天后抗病毒活性就明显降低【l “。t p a 是一种多结构的丝氨酸蛋白酶，全 长5 2 7 个氨基酸，由5 个不同的结构单元组成，即指区( f i n g e r ，f ) 、生长因子区( g r o 州h f k t o r ，g ) 、两个铰链区( k n 9 1 e ，k 1 、k 2 ) 及丝氨酸蛋白酶结构域( p ) 。实验表明 删除f 、g 、f 与g 或k 1 区；f 区的定点突变、g 区6 7 6 9 位氨基酸缺失，得到的突变体在 体内的清除速率有不同程度降低，最大清除速率降低了9 1 ，同时也伴随着酶活性损失。 而对糖基化位点的定点突变a s n l l 7 g l n ，突变体体内清除速率降低了5 0 ，并表现出正 常的酶活性。目前两种t p a ( k 2 一t p a 、t n k t p a ) 已被欧洲和美国批准上市。k 2 一t p a 保 留了t p a 卜3 及1 7 6 5 2 7 位氨基酸的肽段，缺失k 1 区、f 区和g 区，半衰期延长4 5 倍； t n k t p a 突变体是将t p a1 0 3 位t h r 变成a s n ，1 1 7 位a s n 变成g 1 n ， l y s 2 9 6 一h i s 2 9 7 一a r 9 2 9 8 一a r 9 2 9 9 替换成4 个a l a ，该突变体血清清除速率降低4 倍左右”“。 1 2 4 化学修饰 化学修饰是改变重组多肽蛋白类药物性状的有效方法。蛋白质的免疫原性是由其分 子上的抗原决定簇决定的。应用亲水惰性高分子分子与蛋白质的非必需基团共价结合， 将这些抗原决定簇屏蔽，使它作为异源性物质在体内不被免疫系统识别，不产生相应抗 体，解除异体蛋白免疫原性。由于免疫原性被解除，因而不会因为在体内产生抗体而被 清除：同时由于大分子修饰物在蛋白质表面的遮蔽作用，使得蛋白质不易被蛋白酶降解： 另外蛋白质被修饰以后，其分子量大大提高，不易被肾小球过滤。由于上述几个因素共 同作用的结果，使得修饰后蛋白质在体内半衰期延长。目前用作蛋白质的修饰剂很多， 如右旋糖苷、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯基酸、多聚唾液酸、p e g 等其中以p e g 类 修饰剂最为常用。 利用p e g 修饰后的蛋白质在临床应用中显示出优良的性质，具体表现为：热稳定性 增强，对各种蛋白酶的敏感度降低，在机体内的循环半衰期明显延长，免疫原性与抗原 性显著降低以及毒性的减小等等。j o s e 等1 3 2 】采用4 0 k d a 分支聚乙二醇修饰i f n 2 b ，纯化 得到单聚乙二醇分子修饰的i f n q 2 b 。由于聚乙二醇修饰，阻断了疏水作用诱导的降解， 同时产生了非特异的空间位阻阻碍了分子间的相互作用，使得该产物在6 0 下的半衰期 为9 6 1d ，较i f n a 2 b 提高了1 7 倍。此外对胰蛋白酶的敏感程度降低，利用e l i s a 测定方 法显示，特异性i f n 旺2 b 的单克隆抗体对其的识别能力降低。大鼠药代动力学实验表明聚 乙二醇化干扰素体内半衰期为2 3 1h ，平均保留时间为7 7 9h ，分别较普通i f n 旺2 b 提高了 3 3 0 倍和7 0 8 倍。 6 墨= 要堕笙 目前已上市的p e g 化的蛋白药物如p e g 化的l 一天冬酰胺酶( e i l z o n 公司的o n c a s p a r ) 、 p e g 化的i f n 旺2 b ( s c h e r h 培公司的p e g i n 仃o n ) 、p e g 化的i f n 2 a ( r o c h e 公司的p e g a s y s ) 和p e g 化的g c s f ( a m g e n 公司的n e u l a s 回。它们经p e g 修饰后的特征，见表l ： 表l - 2 已上市的p e g 化蛋白药物p e g 修饰前后体内半衰期比较 t a b i e1 - 2c o m p a r i s o o f b a l f - f eo f p m t e i nd m 铲j nt b em a r k e tb e f b mm o d 讯e da n dp o s t - m o d j n e d b yp e g y h 6 0 1 2 5 基因融合 通过构建融合蛋白技术增加多肽蛋白类药物分子量延长药物半衰期。目前常用的融 合蛋白载体主要有人血清白蛋白( h u m a l ls e r u ma l b u i l l i n ，h s a ) 和抗体i g g 重链f c 段。 人血清白蛋白是血液中含量最高的蛋白( 达4 0 9 l ) ，是人体血浆的主要成分，在体内具有维 持血液渗透压，结合内源性和或外源性配体( 包括激素、有毒代谢产物和药物) ，无酶 活性和免疫原性，人体相容性好，分子量大( 约为6 6 k d a ) ，半衰期长约1 9d 。由于这些优点， 以白蛋白为载体的融合蛋白技术一白蛋白融合技术( a l b u m i n l s i o n t e c l l l l o l o g y ) 倍受关 注。 1 9 8 8 年，p o z l l a i l s b 等【3 3 j 利用化学方法将猪生长激素与血清白蛋白交联，修饰后的生 长激素稳定性增加了2 0 4 0 倍，同时体内分布也发生了变化，主要经肝脏代谢，经肾的 排泄减小。 1 9 9 2 年，y e h 等1 3 4 j 受白蛋白化学交联方法启发，利用基因工程手段，构建了h s a c d 4 ，使白蛋白位于h s a 的位于c d 4 的n 端，避免了化学法的非特异交联而产生的产物 不均一性。融合基因在克鲁维酵母中进行分泌表达，纯化得到的融合蛋白在大鼠体内半 衰期相对c d 4 提高了1 4 0 倍，同时保留了很好的抑制h i v 感染的活性。 1 9 9 5 年，n o m u r a 等【3 5 】发现将人a p o e 与h s a 融合后，以前非常不稳定而且很难在酿 酒酵母分泌表达的a p o e ，表达量有了很大的提高。他们分析认为h s a 在这其中充当了 分泌表达的信号序列的作用，同时也保护了a p o e 不受宿主蛋白酶降解。 1 9 9 7 年，s y e d 等【3 6 】利用水蛭素( h i r u d i n ) 与兔血清白蛋白融合，将水蛭素置于融合 蛋白的n 端，在c 0 s l 中表达，以得到折叠正确和二硫键形成正确的重组蛋白。结果显示 该融合蛋白能很好的抑制凝血酶的降解纤维蛋白原的活性，同时也保留了白蛋白的染料 江南大学硕士学位论文 结合能力，药代动力学分析表明该融合蛋白将水蛭素的体内半衰期提高了近两个数量 级， 同年英国d e l t a 公司1 9 9 7 年申请了h s a 与人生长激素( h g s ) 的融合蛋白的专利o ”。 2 0 0 1 年，美国h g s 公司研制了h s a 与n 2 干扰素、人生长激素、i l 2 的融合蛋白分别 进入临床试验，其中人生长激素l 每床前数据表明其体内清除速率较融合前降低了5 0 倍。 2 0 0 3 年至2 0 0 5 年，国内外相继申请了多篇白蛋白融合蛋白方面的专利。 2 0 0 5 年，美国h g s 公司的a 1 b u f e m n 2 a 是h s a 基因和i f n 2 融合蛋白在加拿大进行i i 期临床试验，共有5 6 名病人，随机分成5 个给药组( 2 0 0m c g ，4 5 0 m c g ，6 7 0m c g ，9 0 0m c g ， 1 2 0 0m c g ) 。临床试验结果表明，a l b u f e m l l 2 a 平均半衰期1 4 8 小时，比p e g a s y s 平均半衰期 8 0 小时( 5 0 1 4 0 小时) 和p e g i n t m n 平均半衰期4 0 小时( 2 2 6 0 小时) 更长。它有很好的抗病 毒活性，安全性和耐受性，p e g i f n 与h s a i f n 的比较列于表2 【2 5 】，病人用药后产生对 h s a 抗体为1 7 ，但未用药者存在h s a 抗体达3 4 ，并且在抗体产生副反应，抗病毒反 应和药代动力学之间没有明显的相关性【3 ”。 表l - 3p e g n 与h s a 邛n 的比较 t a b l el - 3c o m p a r i 3 仙b e 押np e g na n dh s a 一n 白蛋白融合技术与p e g 修饰相比，不需要额外的化学修饰，生产工艺简单，产物物均一 质量控制相对容易，延长药物半衰期的效果可能比p e g 修饰更有效。 1 3 立题背景及研究内容 干扰素是一类具有抗病毒、抗增殖和免疫调节活性的细胞因子。目前已有5 7 个国家 批准生产、使用重组干扰素制剂，治疗3 0 多种肿瘤、病毒感染性疾病，并取得了很好 的效果。同时临床使用中也发现了干扰素存在的问题，由于干扰素组织特异性差，体内 半衰期短，治疗时大多采用全身性、大剂量给药，直接导致了毒副作用严重，治疗费用 的提高。以i f nb 为例，肌肉注射的半衰期一般在2 h 一4 h 左右，为了达到治疗效果，一般 需要隔日一次，每次注射6 1 0 6 i u 。为了克服i f nb 体内半衰期短的缺点，人们已经采 用多种方法来对干扰素的性质进行改进，以在保留干扰素的活性的同时提高半衰期。这 其中包括制备缓释制剂、构建突变体、化学修饰以及基因融合等。这其中又以基因融合 技术中的白蛋白融合技术最为突出，基于该技术制备的融合蛋白具有生产工艺简单、成 本低、产物均一、免疫原性低和体内半衰期长等特点。 基于以上考虑，本论文采用白蛋白融合技术，构建i f n b h s a 融合蛋白。主要研究 内容是从人基因组d n a 中克隆i f nb 基因；利用重叠p c r 技术体外拼接i f n b 和h s a 基因；将融合基因插入到分泌表达载体p p i c 9 k 中，转化毕赤酵母k m 7 1 ；利用g 4 l8 抗 r 第一覃绪论 性筛选高拷贝整合重组子，并对这些重组子诱导表达，进一步筛选，表达量相对较高的 重组毕赤酵母；对表达的融合蛋白进行鉴定和抗病毒活性分析，进行初步的分离纯化。 具体研究分为以下几部分： 一i f n b 基因的克隆 表达载体d p i c 9 k 一1 f nb h s a 的构建 毕赤酵母重组菌的构建和产物的初步纯化 参考文献： 1i s a a c sa l i n d e n m a n nj v i n l si m e r f e i 。e n c e ，i t h ei n t e r f e r o n p r o c r s o c l a n d b 1 9 5 7 1 4 7 ： 2 5 8 - 6 7 2 孙志宏，陈正礼干扰素研究进展【j 】延安大学学报：自然科学版，2 0 0 0 ，1 9 ( 1 ) ：7 6 7 9 3 屈艾，汪承润干扰素及其研究进展【j 】徐州师范大学学报：自然科学版，2 0 0 2 ，2 0 ( 2 ) ：5 7 6 0 4g a n e sc s ，p e t e rl t h ei n t e r f e r o ns y s t e m ：ab i r d se y ev i e wo fi t sb i o c h e m i s t r y j 】 t h ej o u r n a lo fb 1 0 l o g i cc h a e l mi s t r y ，1 9 9 2 ，2 6 7 ( 8 ) ：5 0 1 7 5 0 2 0 5 张惠展主编基因工程概论【m 】上海：华东理工大学出版社，】