（植物学专业论文）细胞外钙调素对雪松花粉萌发和花粉管生长的影响.pdf

独创声明 y 5 9 8 8 5 0 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 导师签字：乒8 签字日期：2 0 0 3 年护月彩日签字日期：2 0 0 3 年l 朋谚日 隶爱作翥、导孵冀箍 锺垒文公宿 、钐 旁 山东师范大学硕士论文 中文摘要 本文采用光学显微镜，激光扫描共聚焦显微镜，s d s p a g e 及显微红外光谱 分析技术，利用不能透过细胞膜的钙调素的单克隆抗体和大分子拮抗剂 w 7 一a g a r o s e ，对裸子植物雪松( c e d r u sd e o d a r a ) 花粉离体培养时，萌发率、生 长速率、胞内钙离子分布、蛋白质表达及细胞壁成分的变化进行了观察，表明胞 外钙调素在雪松花粉萌发和花粉管生长过程中发挥重要的作用。 在培养基中分别加入钙调素的单克隆抗体和w 7 一a g a r o s e 后，与生长在正常 培养基中的雪松花粉相比，花粉的萌发率和生长速率明显降低，萌发所需要的时 间加长，并伴有花粉管的形态异常现象。钙调素的拮抗剂处理后，通过显微红外 光谱( f t i r ) 分析，发现细胞壁酯类物质的含量增加，而酸性果胶质和蛋白质的 含量下降。使用s d s - p a g e 技术，发现在培养中添加钙调素的单克隆抗体后，花 粉管总蛋白的含量下降，这与f t i r 检测到的蛋白质含量下降的结果一致，并且 发现几条特定蛋白的含量随着钙调索单克隆抗体浓度的增大而逐渐减少。另外， 通过在花粉管中装载钙离子荧光指示剂f l u o 一3 a m ，利用激光共聚焦显微技术研 究了细胞外钙调素对花粉管顶端游离钙离子分布的影响。发现钙调素的单克隆抗 体使得花粉管顶端的钙离子梯度消失，由于花粉管顶端的钙离子梯度在花粉萌发 和生长过程中起到关键作用，它的消失会抑制花粉的萌发和花粉管的生长，所以 我们推测胞外钙调素可能通过影响花粉管顶端钙离子的梯度分布，进一步影响花 粉的萌发、蛋白质表达以及形态建成。 关键词：外源钙调素花粉萌发花粉管生长细胞壁激光共聚焦显微镜显微红 外光谱分析 分类号：9 4 5 6 山东师范大学硕士论文 a b s t r a c t t h ei n v o l v e m e n to fe x t r a c e l l u l a rc a l m o d u l i n ( c a m ) i np o l l e n t u b e g r o w t h o fc e d r u s d e o d a r a ( r o x b ) l o u d ，a c o n i f e r o u s t r e e ，w a s i n v e s t i g a t e db yu s i n gt w om e m b r a n e i m p e r m e a b l ec a mi n h i b i t o r s ，a n t i 7 c a m a n dw 7 一a g a r o s e p o l l e ng e r m i n a t i o na n dt u b e g r o w t hw e r ei n h i b i t e db y a n t i c a mi na d o s e d e p e n d e n tm a n n e r ，w h i l et h es a m ea m o u n to fm o u s e n a t u r a ls e r u mh a dn oe f f e c to ne i t h e rp r o c e s s p o l l e n g e r m i n a t i o n a n dt u b e g r o w t hw e r ea l s oi n h i b i t e db yt h ec a ma n t a g o n i s tw 7 一a g a r o s e f t i r m i c r o s p e c t r o s c o p ya n a l y s i ss h o w e dt h a tad e c r e a s ei nc a r b o x y l i ca c i da n d a ni n c r e a s ei ns a t u r a t e de s t e ra n dp r o t e i ni nt h ew a l l so fa n t i - c a m ， w 7 一a g a r o s et r e a t e dc e i l s w h e np o l l e ng r a i n sw e r eg r o w ni nt h ec u l t u r e m e d i u ma d d e dw i t ha n t i c a m ，t i p f o c u s e dc y t o s o l i cc a l c i u mi np o l l e nt u b e d i s a p p e a r e da sl o a d e dw i t hf l u o - 3 a m ( af l u o r e s c e n tc 矿i n d i c a t o r ) i n a d d i t i o n 。t h ea m o u n to ft h et o t a lp r o t e i ne x p r e s s i o nw a sr e d u c e da n d s e v e r a ls p e c i a lb a n d sw e r ed i s a p p e a r e da f t e ra n t i - c a mt r e a t m e n t t h e s e r e s u l t si n d i c a t e dt h a te x t r a c e l l u l a rc a mp l a y sap i v o t a lr o l ei np o l l e n g e r m i n a t i o na n dt u b eg r o w t h k e y w o r d s ：e x t r a c e l l u l a rc a l m o d u l i n ，p o l l e ng e r m i n a t i o n ，p o l l e nt u b e g r o w t h ，c e l lw a l l ，c o n f o e a lm i c r o s c o p e 。f t i r c l c ：9 4 5 6 2 山东师范大学硕士论文 一、综述 植物生殖生物学是在植物胚胎学的基础上，结合一些新的细胞生物学和分子 生物学技术和方法，旨在阐明植物生殖发育过程机理的一门学科。当前有关植物 生殖发育的研究应该说是植物发育生物学中最熟的研究领域之一。高等植物的有 性生殖是植物生殖生物学的一个重要分支，同时也是显花植物生活史中的重要环 节。花粉在柱头上萌发，花粉管穿入柱头，经过花柱、子房等雌蕊组织到达胚珠， 并有生殖细胞分裂的一对精子释入胚囊，是有花植物实现受精的重要前提。两花 粉作为雄性生殖单位的载体，它的萌发和花粉管生长等一系列活动直接影响着受 精过程的完成。近年来，花粉管作为生物技术领域理想的细胞体系和研究细胞生 长分子调控机理的体系，同时鉴于花粉萌发和花粉管生长具有极性生长的特性， 越来越多地受到研究者地关注。 l 、花粉及花粉管研究进展 1 1 花粉的形态结构 花粉是一种具有特殊结构和功能的微小生命有机体，一般由2 - 5 个细胞组 成，结构简单，易于离体操作，是研究细胞极性、命运、分化和发育较为理想的 体系。花粉发育和结构的研究一直是国际上生殖生物学家热衷研究的领域，并己 发展为一门专一的学科花粉生物学“。”。早期的花粉发育研究主要集中在对 花粉发育一般性的描述上，积累了大量的资料，为以后的研究打下了坚实的基础。 随着现代生物学技术的迅速发展和广泛应用，对花粉发育生物学的深入研究也起 了重要的促进作用，主要表现在对花粉发生和发育过程中细胞质成分及内部结构 的研究，其中包括细胞质遗传，细胞质分化，脱分化，再分化以及细胞质骨架等 方面的研究。近十几年来，特别是针对花粉发育中的分子机理也开展了大量的工 作，例如花粉发育特异基因的表达和调控等方面均取得了一些重要的研究进展 。3 。为了使入们对花粉发育有一个比较系统的研究，下面就以下几个问题的研究 进展作一简要综述。 山东师范大学硕士论文 1 1 1 花粉的一般结构 花粉即小孢子，是雄配予体( m a l eg a m e t o p h y t e ) 的第一个细胞，在被子 植物中更多应用于指称2 一细胞或3 一细胞的雄配子体，以与小孢子区别。对于被 子植物，一粒成熟的花粉粒包括萌发孔、花粉壁、一个营养细胞、一个生殖细胞 或两个精子，一般不具有气囊；而对于裸子植物的成熟花粉粒，壁的结构与被子 植物相似，但其中包含四个细胞，及两个半月型的原叶细胞( 形成后开始退化) ， 位于细胞中央的体积较小的生殖细胞和一个位于远极端的较大的管细胞。一般具 有气囊( 如图l 所示) 。 图l 不同类型的花粉示意图( 引自被子植物胚胎学和松树形态结构与发 育“1 ) 1 1 2 花粉壁结构和物质成分 对于大多数的花粉，碳水化合物是细胞壁主要的干物质组成成分。多糖， 其中淀粉是壁的主要构成成分，可以占花粉干重的5 0 以上。小分子的碳水化合 物平均占花粉细胞干重的4 - 1 0 。但碳水化合物的畲量因种类的不同而存在差 异。对于裸子植物，比如松树花粉，其总的碳水化合物含量比较低，而被子植物 中，一般三核的花粉碳水化合物含量比较高，比如三核的玉米花粉，而两核花粉， 其碳水化合物含量没有一定的规律，某些种类高，某些种类含量较低。所以， 花粉中含碳水化合物的量与其所含细胞核的数目没有明显的相关关系。另外，花 粉中含有还原糖和非还原糖，一般地，对于受蜜蜂采集的被子植物花粉，其还原 糖的含量比直接从树上分离的花粉高，而非还原耱含量却相应的比较低，所以， 还原糖可能是吸引蜜蜂的主要原因，而非还原糖含量的降低可能反应了蜜蜂采集 花粉期间花粉本身的代谢比较活跃。 花粉的可溶性糖含量是随着贮藏条件的改变而发生变化，其含量高低可以 反应花粉生活力的高低。比如葡萄糖，在花粉贮藏1 5 年后其含量明显降低，所 4 山东师范大学硕士论文 以这些可溶性小分子糖含量可以作为测定花粉生活力的一个指标。 花粉中含有许多蛋白质和各种氨基酸，油脂，维生素( 以b 族维生素居多) ， 生长调节物质，酶( 主要是水解酶，转化酶和氧化还原酶) ，色素( 主要是类胡 萝h 素和类黄酮化合物) 和盐类等物质。这些营养物质和生理活性物质对于保证 花粉的进一步萌发和花粉管的生长是必须的，特别是各种生长调节物质，他们对 花粉的萌发和花粉管的生长更为重要，可归纳为下几点： 抑制剂可以抑制花粉的生长，甚至花粉在适合的抑制剂下变为完全不活 动： 植物生长素与花粉管生长至卵细胞的方向有关： 赤霉素能活化淀粉酶，当花粉管向前生长的时候，淀粉水解为糖以支持 花粉管生长； 从花粉扩散出的生长物质可以刺激与雄细胞融合之间的卵细胞的成熟性 和可接受性； 生长调节物质可以通过许多方式控制花粉管的生长，其中之一是辅助壁 的生长。 成熟花粉粒的壁上有萌发孔或萌发沟，这是当外壁形成时形成的开i z l 。当 纤维索的原外壁出现时，在某些区域是不连续的，所成的空隙奠定了萌发孔的部 位。花粉壁可以分为外壁和内壁两层，主要成分是孢粉素、胼胝质、果胶质、纤 维素以及蛋白质，图2 是松属花粉壁的结构和主要成分模式图( 引自 4 5pm o l l ) 使微丝解聚，细胞器的运动减慢，所以钙梯度可 以通过控制微丝的组装来影响细胞器的运输：第三：高浓度的钙与花粉管定向生 长有关，花粉管顶端高浓度的游离钙离子会抑制肌动蛋白肌球蛋白调控的运动 使囊泡沉淀，如果在花粉管一侧增加胞质游离钙浓度，会使花粉管改变原来的生 长方向，向高钙浓度一侧生长呻1 。 3 2 1 花粉管中游离钙振荡 花粉管中尖端高钙离子浓度随着花粉管生长有高低的振荡，这与花粉管生 长的行为密切相关。钙振荡及花粉管顶端钙内流与花粉管生长的振荡( 花粉管也 有脉冲式生长) 有同样的周期。“。由此认为两者间有直接的因果关系，但不知是 山东师范大学硕士论文 钙的变化促使花粉管生长的振荡，还是生长的变化导致了钙振荡。为了解释两者 间的关系，f r a n k l i n - t o n g ”“提出了果胶钙库模型，认为花粉管细胞壁果胶是一 个钙库，果胶结合钙离子的速度有周期性变化，由果胶甲酯酶的活性来控制。当 细胞壁中的钙离子与果胶交联时，进入胞内的游离减少，分泌囊泡的外排活性降 低，花粉管生长缓慢。 4 细胞内游离钙离子测定方法 细胞内游离钙离子在细胞内具有重要功能，测定细胞内钙离子浓度变化成为 细胞生物学研究中最重要的手段之一。钙离子测定方法很多，物理方法主要有原 子吸收光谱法、x 射线微区分析技术、离子选择性微电极技术、核磁共振波谱技 术、同位素示踪技术等。其中有些技术不能区分结合钙和自由钙离子，有些方法 对细胞有损伤，所以在钙信号研究中应用较少。 荧光测定法是近年来发展起来的一类钙离子浓度测定方法，其原理是一些与 钙离子特异结合的化学分子与钙离子结合后。其光学性质发生变化，在一定波长 的激发光下发出特定波长的荧光，荧光强弱与溶液中的钙离子浓度相关。因此可 以通过测定荧光强度来反映细胞中钙离子的浓度啪“”。 4 1 钙离子荧光指示剂的种类 4 1 1 水母发光蛋白 水母发光蛋白是在水母体内发现的一类蛋白，与钙离子结合后可以发出很强 的荧光。这类蛋白由一个2 2 k d 的蛋白和一个疏水辅基组成，应用时往往利用显 微注射的方法直接将发光蛋白装载细胞中。随着分子生物学的发展，水母发光蛋 白的基因已经被克隆出来，并且可以通过基因重组将其基因整合到多种细胞中， 在这些细胞中表达出发光蛋白；这些蛋白的基因经过修饰重组、连接特定的导引 序列之后，可以表达产生带有特定序列的发光蛋白，在这些序列的指引下，水母 发光蛋白可以定位于细胞内的特定部位( 如细胞质、内质网、线粒体、细胞核等) ， 从而使钙离子定位更加准确邮一。水母发光蛋白与钙离子亲和力高，所发出的荧 光比较强，目前钙离子测定方法中，水母发光蛋白法定位最准确，测量精度最高。 但由于基因的克隆、重组、表达过程比较复杂，使这种方法测定钙离子浓度时前 山东师范大学硕士论文 期准备工作较多，应用范围受到一定限制。 4 1 2 钙离子荧光探针 钙离子荧光探针是以钙离子鳌合剂e g t a 为母体发展而来的一类荧光指示 剂，能选择性地与钙离子结合，与钙离子亲和力高，荧光量子产率高，检测限度 低，应答迅速。这些分子无论是否与钙离子结合均由荧光产生，但是与钙离子结 合后荧光强度大幅度增强，根据其光学性质可以将其分为单波长钙离子荧光探针 和双波长钙离子荧光探针。 4 1 1 1 单波长荧光探针 单波长钙离子荧光探针在未结合钙离子时与结合钙离子后其最大吸收波长 和发射波长都是相同地，所以成为单波长钙离子荧光探针。但是未结合钙离子之 前其自身地荧光强度比较低，而结合钙离子之后其荧光强度大幅度升高。如 f l u o - 3 ，结合钙离子之后其荧光强度升高几百甚至上千倍，在这种情况下，荧光 探针本身地基础荧光对钙离子测定不会造成影响。这类指示剂主要包括f l u o 一3 、 q u i n 一2 、c a l c i u m 、o r a n g e 等，随着钙离子荧光探针不断的发展，一些新型的单 波长钙离子荧光探针被开发研制出来( 如f l u o - 4 、f l u o - 5 等) 。单波长荧光探针 使用起来方法简单，可以测定低浓度的钙离子，其激发光在可见光区域，光源价 格便宜；与钙离子具备高亲和力，对钙变化的反应敏感，在应用于钙离子的动态 变化、钙离子分布特点的测定时具备较强的优势，但是由于单波长荧光探针的荧 光强度除了与细胞内游离钙浓度有关之外，还受到细胞内p h 、蛋白质与钙离子 荧光探针的结合、荧光探针的光漂白等因素的影响，其荧光强度与钙离子荧光探 针的结合、荧光探针的光漂白等因素的影响，其荧光强度与钙离子浓度之间的对 应关系不稳定，不能准确地测定游离钙离子的准确浓度，所以在钙离子定量方面 的应用受到了一定限制。 4 1 i 2 双波长荧光探针 双波长钙离子荧光探针与钙离子结合后，其分子结构发生变化使其最大吸 收波长或最大发射波长发生改变，这类探针主要有i n d o i 、f u r a 一2 、f u r a r e d 山东师范大学硕士论文 等。其中i n d o 一1 在结合钙离子后，其最大吸收波长没有改变，而最大发射波长 由4 9 0 n m 转为4 0 5 n m ，因此被称为双发射波长荧光探针，f u r a - 2 和f u r a r e d 在 结合钙离予之后，其最大发射波长没有改变，但是最大吸收波长改变了( f u r a 一2 由3 4 0 n m 变成3 8 0n m ，f u r a r e d 由4 4 0 n m 变成了4 9 0 n m ) ，所以被称为双激发波 长荧光探针。 4 2 钙离子荧光指示剂的装载方法 利用荧光指示剂测定细胞内游离钙离子的浓度、分布特点和动态变化时，将 钙离子荧光指示剂装载进入细胞是实验成功的前提条件。目前开发的钙离子荧光 探针主要有三种形式，分别是盐形式、酯化形式和大分子偶联形式。盐形式的荧 光探针是有机酸与钾离子或氨根离子结合形成的盐，在水溶液中自行分解，酸根 离子与溶液中的钙离子结合而产生荧光。酯化形式的荧光探针是有机酸经乙酰甲 酯化( a m ) 作用形成的酯由于是脂溶性分子，所以可以自由穿越细胞膜进入细 胞内。大分子偶联形式的钙离子荧光探针是利用化学方法将荧光探针与分子量巨 大的葡聚糖( d e x t r a n ) 偶联在一起形成的大分子复合物，由于其分子量巨大， 使得它不能穿越细胞质膜，在进入细胞质之后，既不能从细胞内泄露出来，也不 会进入细胞内的各种细胞器中，可以有效地保证细胞质中钙离子荧光探针浓度， 更真实、准确地反映细胞质中游离钙离子的变化。不同种类、不同形式的染料的 装载方法各有不同，在实验过程中，要根据所用材料、测定目的选用合适的染料 形式和相应的装载方法。 4 2 1 损伤装载法 在利用水母发光蛋白和d e x t r a n 偶联的荧光探针时，由于它们不能自由透 过细胞膜，必须通过某些方法在细胞上打孔才能使指示剂分子进入细胞，目前常 用的方法有电击法和显微注射法。 电击装载法利用高压脉冲电场在细胞膜上形成暂时的小孔，指示剂分子可 以通过小孔进入细胞。这种方法对细胞损伤大，现在一般不用。 显微注射装载指示剂进入细胞的方法，可以保证有足量的荧光指示剂进入 细胞内，装载效果可靠；在采用其他方法将指示剂装载细胞时，采用这一方法可 山东师范大学硕士论文 以很好地解决。但这种方法对细胞有一定程度的损伤，另外操作复杂、工作量大、 成功率低、不适用于个体较小的细胞，不适用于批量细胞等缺点都限制了这一方 法的广泛应用。 4 2 2 非损伤装载法 这是目前比较常用的一类方法，在不对细胞的结构和功能造成破坏的前提 下，通过调节细胞的内外环境条件，使钙离子荧光指示剂进入细胞内。非损伤装 载方法主要有以下几种，分别适用于不同形式的钙离子荧光探针。 ( 1 ) 酸化装载法 盐形式的荧光探针在溶液中水解为阳离子和酸根离子，酸根离子带有电荷， 不容易穿过细胞膜。在周围介质呈酸性条件( p h 4 5 ) 酸根离子与氢离子结合成 为不带电的分子形式，可以穿越细胞质膜进入细胞内部，而细胞内的酸碱度接近 中性，在这样的环境中探针又重新解离，酸根离子可以结合细胞质中的钙离子丽 产生荧光。这种方法有成功的报道，但是也有一些报道表明有些细胞无法用此法 装载m 3 。 ( 2 ) 酯化探针孵育法 a m 酯化型的探针分子是脂溶性的，可以穿过质膜进入细胞内，细胞内的非 特异性酯酶可以将其分解，产生的酸根离子与细胞内钙离子结合而产生荧光。这 种方法简便易行，对细胞的影响很小，适用于大批量细胞的装载，是目前最常用 的方法，在动物细胞中应用尤其广泛，植物细胞中的细胞壁中存在着非特异性酯 酶，会迅速将酯化型探针分解成为离子，使之无法进入细胞，影响装载效果，为 了消除细胞壁对装载的影响，在多数实验中人们都采用原生质体做材料以解决这 一问题。 z h a n g 等报道了一种改进的低温孵育装载方法，其原理与常温孵育法相 同，只是在装载过程中先进行低温( 4 ) 处理，在此温度下细胞壁中酯酶活性 受到抑制，不能有效水解酯化探针，酯化探针向细胞内扩散是一个物理过程，受 低温影响不大，低温处理一段时间后，细胞内积累了足量的酯化形式的探针，然 山东师范大学硕士论文 后将细胞转到常温状态( 2 5 。c ) 下，此时细胞内非特异酯酶活性提高，可以迅速 水解积累于细胞内的酯化探针，这种方法省去了去除细胞壁的步骤，使植物细胞 内荧光探针的装载过程变得非常简单，有着广阔的应用前景。 二 雪松花粉在不同培养条件下花粉管生长状况的研究 1 材料和方法 1 1 材料 裸子植物的代表树种雪松花粉于2 0 0 2 年4 月2 0 日取自中科院植物所成年树 种，一2 0 1 2 保存。 1 2 培养基的配制 1 2 1 不同营养成分培养基的配制 所有的溶液均用无离子水配制，浓度是质量体积( w v ) a ：1 5 蔗糖+ 0 0 1 h 3 b 儡+ 0 0 1 c a c l 2 b ：1 5 蔗糖+ 0 0 1 h 出儡 c ：1 5 蔗糖+ 0 0 1 c a c l 2 d ：1 5 蔗糖+ 0 0 1 i t s 鹏+ 0 0 1 c a c l2 + o 0 1 l ( n 0 3 + o o i m g c l 2 1 2 2 不同c a c l ：浓度的培养基配制 a ：1 2 蔗糖+ 0 0 1 h 3 8 0 3 b ：1 2 蔗糖+ 0 0 1 h _ 3 8 0 3 + 0 0 0 1 9 6 c a c l2 c ：1 2 蔗糖+ 0 0 1 h 3 8 0 3 + 0 0 1 c a c l 2 d ：1 2 蔗糖+ 0 0 1 h 3 b o ，+ 0 1 c a c l ： e ：1 2 蔗糖+ 0 0 1 h 3 b 仉+ 1 c a c l ： 1 3 花粉离体培养 贮藏的雪松花粉在培养之前，先在室温下平衡3 0 m i n ，然后花粉分别在上述 所配的培养基中悬浮培养，室温2 5 c ，摇床转速l o o r p m 。 山东师范大学硕士论文 i 4 观察、统计 花粉萌发后1 2 h ，在普通光学显微镜和测量光学显微镜下观察和测量不同培 养基中花粉的萌发情况和花粉管生长情况，并对萌发率和花粉管长度进行统计， 花粉管长度大于花粉粒直径的萌发花粉属于统计数据之列。 2 实验结果 2 1 不同营养成分的培养基中雪松花粉的萌发情况 从图i 中可以看出a 培养基即1 5 蔗糖+ 0 0 1 9 6h 3 8 0 3 + 0 0 1 c a c l ：中雪松 花粉的萌发率最高，达到9 8 ：第二种培养基b 与a 培养基相比少了0 0 1 c a c l ：， 萌发率差别不大，但生长速率却有所降低( 图2 ) ；第三种培养基c 与a 培养基 相比少了o 0 1 h 3 8 0 3 ，萌发率下降到9 2 ，生长速率明显降低( 图2 ) ；第四种 培养基d 成分最丰富，然而萌发率和花粉管生长速率却是最低的( 图1 ，图2 ) 。 2 2c a c l 。浓度不同的培养基中雪松花粉的萌发和花粉管生长状况 图3 是不同c a c l 。浓度下雪松花粉的萌发率。可以看出，不同c a c l ：浓度下 花粉的萌发率差别不大，均达到8 0 以上。图4 是不同c a c l ：浓度下雪松花粉的 生长速率，从图中我们可以看出，花粉在培养1 8 8 小时，花粉管基本停止生长后， 含有0 0 0 1 c a c l 。的培养基中花粉管平均长度最长；不含有c a c l 。的培养基中花 粉管的平均长度次之；培养基中c a c l ：的浓度为0 0 1 、0 1 、1 时，花粉管的 平均长度依次减少。 3 讨论 花粉的萌发和花粉管的伸长是开花植物生殖过程中的一个重要环节。花粉的 萌发和花粉管伸长受许多因素的影响，如c a 2 + 、硼、蔗糖、培养基渗透势等。对 于大多数的被子植物，其花粉离体培养时，一般需要营养成分较丰富的培养基， 如烟草花粉除了有蔗糖、c a 2 + 和硼酸外，还需要提供k + 、m 9 2 + 才能很好的萌发呻1 。 但对于雪松，其花粉离体培养时，培养基要求比较简单，只需要蔗糖、硼酸和 c a 2 + ，其它的营养成分对雪松花粉的萌发和花粉管生长有抑制作用。花粉在b 培 养基( 1 5 蔗糖+ o 0 1 h , b o , + 0 0 0 1 c a c l z ) 和a 培养基( 1 5 蔗糖+ o 0 1 h 3 8 0 3 ) 山东师范大学硕士论文 中生长的前j 天，萌发率和生长速率都相差不大，但在花粉生长的后期，b 中培 养基的花粉生长状况较好。推测在花粉管生长初期细胞本身的c a 2 + 浓度可以满足 花粉的萌发和生长需要，但不能维持花粉管的后期生长，需要在培养基中添加一 定浓度的钙离子。培养基中的钙离子浓度不能过高，否则会抑制花粉管的生长。 三钙调素抑制剂对雪松花粉萌发和花粉管生长的影响 1 材料和方法 1 1 材料 雪松花粉于2 0 0 2 年4 月2 0 日取自中科院植物所成年树种，一2 0 保存。 f l u o - 3 a m 、钙调素单克隆抗体均购自s i g m a 公司，钙调素抑制剂w 7 一a g a r o s e 由 尚忠林老师惠赠。 1 2 主要仪器设备 恒温摇床，光学显微镜，激光共聚焦显微镜，i i a g n a7 5 0f r i r 光谱仪，电 泳仪，自动凝胶成像系统，离心机 1 3 培养基成分 选择最适的培养基成分：1 2 蔗糖+ 0 0 1 1 3 b 仉+ o 0 0 1 c a c lz 1 4 钙调素单克隆抗体和钙调素抑制剂对花粉萌发率和花粉管长度的影响 在正常培养基中分别添加0 ，0 8 ，1 ，2pg m 1 钙调素的单克隆抗体和o ，2 0 ， 4 0 ，6 01 1 1 m 钙调素的抑制剂w 7 一a g a r o s e ，2 5 。c 下摇床培养( 1 0 0 r p m ) 5 7 天， 实验结束时将花粉放在一3 0 冰箱中快速冷冻使花粉管停止生长。统计萌发率和 花粉管长度，计算萌发率时一般统计5 0 0 - 6 0 0 粒花粉，测定花粉管长度时一般 统计5 0 一6 0 个花粉管。 山东师范大学硕士论文 1 5 花粉管细胞f l u o 一3 a m 的装载 花粉在对照培养基( 1 2 蔗糖+ o 0 1 h 。b 。+ 0 0 0 1 c a c i ：) 和添加了1 5 p g m l 钙调素单克隆抗体的培养基( 1 2 蔗糖+ 0 0 1 h 。b 0 3 + o 0 0 1 c a c l ：+ 1 5 m 1 ) 中分别培养3 天，然后各取1 0 0 ul ，加入f l u o 一3 a m 母液( 1 m m o l l ，用 污无水d m s o 配置) 至终浓度为2 0um o l 1 ，混匀后置于4 冷室中避光放置2 h ， 取出后用萌发液离心洗涤2 次，于2 5 。c 室温下避光放置l h 。将装载了荧光指示 剂地花粉溶液滴于载玻片上，加盖玻片，放在激光共聚焦显微镜( b i o r a d ，u s a ， m r c l 0 2 4 ) 的载物台上，以波长4 8 8 n m 的激光对花粉管进行连续光切片扫描。 1 6 花粉管的显微红外光谱分析( f t i r ) 在正常培养基中分别添加1 5 肛g m l 钙调素的单克隆抗体和3 0 删、4 0 州 w 7 一a g a r o s e ，2 5 。c 下摇床培养( 1 0 0 r p m ) 3 天，实验结束时将花粉放在一3 0 冰箱中快速冷冻使花粉管停止生长。用去离子水洗3 次。样品被均匀分敦在b a f 2 晶片上于室温下干燥。 红外光谱分析采用m a g n a7 5 0f t i r 光谱仪，配用同一公司的显微镜，m c t 检 测，光谱分辨率8 c m - ，测量范围2 0 0 0 8 0 0c m - ，扫描次数1 2 8 次。 1 6 花粉蛋白的凝胶电泳分析( s d s p a g e ) 将5ug 花粉放在8 m l 培养液中摇床培养3 天，培养液中添加了不同浓度的钙 调素单克隆抗体( 0 ，0 8 ，1 ，1 5 m 1 ) 。蛋白提取液为：6 5 m mt r i s ，1 s d s ， 5 甘油和2 5 b 一巯基乙醇，调p h 至6 8 啪1 。萌发的花粉用真空泵抽真空3 0 分钟，然后5 0 0 x g 室温离心2 分钟，以出除去培养液。然后将花粉放x 2 5 0 n 提 取液中，1 ，5 0 0 x g 室温离心2 分钟，煮沸5 分钟，液氮冰冻1 4 , 时，之后解冻，再 煮沸5 分钟，再离心( 1 5 ，0 0 0 x g ) 3 0 分钟。将上清液转至e p 管中留做蛋白质测 定m 1 和进行s d s - p a g e 。用牛血清白蛋白( s i g m a ，s t l o u i s ，m o ，u s a ) 作为标 准进行蛋白质浓度的测定“”。s d s - p a g e 采用1 2 凝胶，凝胶厚度为1 o m m ，缓冲系 统参n l a e m m l i 嘲，银染。每个泳道的上样量为5 “1 ，标准分子量为( 6 5 2 0 5 k d a ，s i g m a ) 。 山东师范大学硕士论文 2 实验结果 2 1 钙调素的单克隆抗体对花粉管生长的影响 花粉在正常培养基中在悬浮培养5 4 j j 、时后，萌发率可以达到7 5 。而花粉在添 加了0 8 “g m l 和l 肛g m l 钙调素单克隆抗体的培养基中，萌发率分别为6 2 和5 5 ， 并且花粉萌发所需要的时间延长，培养基中钙调素单克隆抗体的浓度越大，花粉 萌发所需要的时间越长。培养基中添加0 8 “g m l 钙调素单克隆抗体时，花粉萌 发需要6 6 4 , 时，而在含有l p g m l 钙调素单克隆抗体的培养基中则需要7 6 小时。当 钙调素单克隆抗体为2p g m l ，花粉的萌发完全受到抑制，而相同浓度的鼠非免 疫血清对花粉的萌发没有影响。钙调素单克隆抗体处理后，花粉管的长度同样受 到抑制( 图5 ) ，花粉悬浮培养1 2 0 4 、时后，正常培养基中花粉的生长速率为 5 6 7l li l l ，而在含有0 8i lg m 1 和1pg m 1 的培养基中生长速率分别下降为3 7 5 um h2 5 8u h ，另外，还发现有少量的花粉管形态异常现象。 2 2 钙调素的大分子抑制剂w 7 一a g a r o s e 对花粉管生长的影响 钙调素的大分子抑制剂同样能抑制花粉的萌发和花粉管生长，抑制的程度随 着抑制剂浓度的增高而增大。当抑制剂浓度为6 0l im 时，花粉的萌发完全被抑制。 在正常培养基中花粉管形态正常，直径均一，生长状况良好( 如图6 a ) 。当培养 基中添加2 0i lmw t - a g a r o s e 时，花粉管的生长出现许多畸形，比如花粉管顶端 膨大，顶端破裂，花粉管分支和弯曲等( 如图6 b f ) 。 2 2 钙调素的单克隆抗体对花粉管内钙离子分布的影响 f l u o - 3 是一种单波长钙离子荧光指示剂探针，其结合或未结合钙离子的最 大吸收波长和发射波长均相同，但后者的f l u o 一3 自身荧光强度比较低，而结合 钙离子后荧光强度大幅度增高，并且在激光激发后产生的荧光，荧光探针自身的 基础荧光对钙离子测定不会造成明显的影响。单纯的f l u o 一3 不能透过质膜， 因此设计使用脂溶性的f l u o - 3 l ，可以较容易穿越质膜并在胞内酯酶作用下水 解成f l u o 一3 啪1 。但常温下由于细胞壁区域酯酶的水解作用使装载进去的f l u o 一3 数量很少，难以有效地检测细胞内游离钙离子的变化。因此本实验采用低温孵育 的方法，使细胞壁酯酶保持较低的活性，保证有足够数量的f l u o 一3 进入细胞， 山东师范大学硕士论文 以便更准确地反映细胞内游离钙离子的变化。 在激光共聚焦显微镜下观察，正常培养基中生长的花粉管，花粉管顶端的 钙离子浓度高于花粉粒和花粉管的其它部分，且顶端的钙离子呈极性分布( 图 7 a ) 。而a n t i c a m 处理后，钙离子在花粉管中的分布没有规律，花粉管顶端钙离 子的极性分布消失( 图7 0 ) 。 2 3 钙调素的单克隆抗体和抑制剂对花粉管细胞壁物质成分的影响 傅立叶显微红外光谱可以有效的检测细胞壁成分m 。在红外光谱中，饱和 酯的吸收峰为1 7 4 0 c m - “，蛋白质酰胺i 带和酰胺i i 带的吸收峰分别在1 6 5 0 和 1 5 5 0 c m l “，羧酸的吸收峰为1 6 0 0 和1 4 1 4 c m l ，碳水化合物的吸收峰为1 2 0 0 和9 0 0 c m l 1 0 “。 当培养基中加入钙调索的大分子抑制剂w 7 - a g a r o s e 后，某些吸收峰的吸收 强度发生变化，并发生位移( 图8 a ) 。饱和酯类的吸收峰( 1 7 4 5 c m 1 ) 明显增强， 增强的幅度随着w 7 - a g a r o s e 浓度的增大而增大，果胶质的吸收峰( 1 4 1 4 c m l ) 也 有所增强；蛋白质的吸收峰( 1 6 5 0 c m 1 和1 5 5 0 c m - ) 有所降低，碳水化合物的吸 收峰( 1 0 5 0 1 0 2 2c m l ) 大幅度下降。钙调素单克隆抗体处理后的结果与 w 7 - a g a r o s e 的处理结果相似( 图8 b ) 。 2 4 钙调素的单克隆抗体对花粉管蛋白的影响 从s d s - p a g e 图谱中( 图9 ) 可以看出，在培养基中添加0 8 、1 1 t g m l 钙调 素的单克隆抗体后，与对照相比，花粉总蛋白质含量差异不明显，而当钙调素的 单克隆抗体的浓度增大到5ug m l 时，总蛋白质的含量明显降低。 从蛋白条带来看，经过1 5ug m la n t i c a m 处理后，分子量为2 5 k d 和2 6 k d 的蛋白消失，0 。8 、1ug m la n t i - c a m 处理后没有明显的差异。有趣的是，分子 量为2 1 k o 的蛋白经过0 8ug m l 钙调素单克隆抗体处理后含量降低，当抗体的 浓度为lug m l 含量进一步降低，抗体浓度增大为1 5ug m l 时2 1 k d 蛋白消失， 2 1 k d 蛋白已被证实是一种钙调素结合蛋白“；另外。分子量为1 7 k 0 的蛋白质仅 在对照中出现，钙调素的单克隆处理后均消失。由于钙调素的分子量为1 6 7 k d ， 山东师范大学硕士论文 所以初步断定此蛋白可能为钙调素。 3 讨论 p o l i t o ”最先发现外源钙调素及钙调素抑制卉哪可以影响花粉萌发，g o n g ” 等用特异性更强的抑制剂证实了这一点，在g o n g 的论文中曾经提到钙调素作为一 种有1 4 8 个氨基酸组成、分子量达到1 6 7 k d 的蛋白质分子很难透过细胞膜，但两 个人的实验均选择了一些可以透过细胞膜的钙调素拮抗剂，无法区分外源钙调素 作用位点在细胞内还是细胞外。马力耕等嘛唧用大分子的钙调素拮抗剂与抗血清 处理，发现这些不能透过细胞质膜的钙调素抑制剂能够抑制花粉萌发和花粉管生 长，证明钙调素的作用位点在细胞外。此外，根据药理学实验结果，细胞外钙调 素有可能通过调控细胞内游离钙离子的水平起到上述作用。 钙离子在花粉萌发和花粉管生长过程中发挥重要的作用，其中钙离子内流 在上述过程中是必须的“+ “”。“”h o 。近年来，在生长的百合花粉管顶端 已证实存在钙离子梯度，在花粉管顶端的钙离子浓度较高，向花粉粒方向钙离子 浓度逐渐降低“3 。在生长细胞中存在的钙离子梯度与细胞生长和方向的调 节有关“。1 。另外，钙离子梯度在停止生长的花粉管中消失，而梯度的消失 则会抑制花粉管的生长“删。已经有实验表明钙调素的抑制剂能够驱散花粉管顶 端存在的钙离子梯度“”。与此结果相类似，我们的实验表明，钙调素的单克隆 抗体处理花粉后，花粉管顶端的钙离子梯度消失，推测这可能是由予抑制了钙离 子的内流。f r a n k l i n - t o n g 发现花粉管顶端的钙离子梯度是钙离子内流的结果 ”。钙离子的内流可能需要先激活外源钙调素，它可能通过控制g 蛋白偶联的 钙离子通道的活性来介导钙离子内流。 花粉粒到达柱头表面，然后萌发，进而生长出花粉管，是植物实现受精的 前提，而花粉的萌发和随后的花粉管生长需要合成大量的蛋白质i l l 2 0 我们的实 验发现，钙调素的单克隆抗体处理后花粉蛋白的表达受到抑制，尤其是分子量为 1 7 k d ，2 1 k d ，2 5 k d ，2 6 k d 蛋白的表达。我们推测分子量为1 7 k d 的蛋白是钙调素， 因为钙调素的分子量为1 6 7 k d ，它们之间的分子量非常相近，并且在钙调素的单 克隆抗体处理后1 7 k d 蛋白的表达量减少。据报道在当归悬浮培养细胞的提取液中 山东师范大学硕士论文 检测到了2 1 k d 的钙调素结合蛋白，并且主要存在于当归的细胞壁中“删。通过凝 胶电泳，我们发现钙调素的单克隆抗体处理后，2 1 k d 蛋白的表达量减少，并且钙 调素单克隆抗体的浓度越高，2 1 k d 蛋白的表达量越少，推测2 1 k d 蛋白的表达量与 钙调素的表达量有关，2 1 k d 蛋白可能是由钙调素诱导产生的。另外，钙调素的 拮抗剂降低雪松花粉的萌发率，使花粉形态出现异常，花粉生长缓慢。钙调素拮 抗剂的浓度增高，花粉的萌发率急剧下降，当钙调素单克隆抗体的浓度增大到2 灶g m l ，钙调素的拮抗剂w 7 一a g a r o s e 的浓度增大到6 0 州，花粉的萌发完全受到 抑制。这些结果表明，雪松花粉管生长所需要的蛋白并不存在于未萌发的花粉粒 中，花粉萌发后为了维持花粉管的生长，需要合成新的蛋白。与被子植物萌发只 需要几十分钟相比，雪松萌发所需要的时间很长，大约要两天，生长速率仅为 5 6 7i jm d , 时，裸子植物花粉这种缓慢的生长速率可能是由于花粉萌发后没有合 成足够的蛋白。 f t i r 显微红外光谱分析是研究细胞壁成分的一种非常可靠的方法，它已被 用来分析在不同培养基中生长的花粉管的各种化学成分n 1 ”。我们的实验结果表 明，钙调素的单克隆抗体和拮抗剂w 7 - a g a r o s e 处理后，与正常花粉管相比，位 于1 7 4 0c m - 1 的相应于酯化果胶质的红外吸收明显有所增强，说明钙调素的抑制剂 处理导致了酯化果胶质含量的增加。在细胞中，酯化果胶质是作为细胞壁物质的 前体被合成并转运到生长区的。质外体钙离子的变化会改变细胞壁中果胶质分子 的结构和新陈代谢。“1 ，同时质外体钙离子能够增加细胞壁的强度“”1 。通过本文 的研究以及其它的研究“1 ，我们推测外源钙调素可能通过介导钙离子内流而导 致质外体钙离子缺乏，而质外体钙离子缺乏进一步导致细胞壁的松散，最终导致 了花粉管的破裂和膨胀。 山东师范大学硕士论文 k r o h a n dk n u i m a nb 1 9 8 2 o fv o b a c c oo f p o l l e n 参考文献 u 1 t r a s t r u c t u r a lo fc e l lw a l la n dp l u g s t u b e sa f t e rc h e m i c a le x t r a c t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s p l a n t a 1 5 4 ：2 4 1 2 5 0 2 n a k a m u r ana n dy o s h i d ak 1 9 8 0 ap e c t i cs u b s t a n c ee x t r a c t e df r o mt h e p o l l e nt u b ew a l lo fc a m e l l i aj a p o n i c a j a p a nj p h y s i 0 1 2 5 ：1 卜1 6 3 a n d e r s o nm a 1 9 8 7 i m m u n e g o l dl o c a l i z a t i o no fa l - a r a b i n o f u r a n o s y l r e s i d u e si np o l l e nt u b e so fn i c o t i a n aa l a t al i n ke to t t o p l a n t a 1 7 1 ： 4 3 8 - 4 4 2 4 胡适宜1 9 8 2 被子植物胚胎学高等教育出版社北京 5 中国科学院植物研究所形态细胞室比较形态组1 9 7 8 松树形态结构与发育 科学出版社北京 6 s t a n l e y rga n dl i n s k e n shf 1