（微生物学专业论文）pga固定化及其基因的真核表达研究.pdf

摘要摘要青霉素g 酰化酶( p e n i c i l l i nga c y l a s e ，e c3 5 1 1 1 ，简称p g a ) 可以催化青霉素g水解生成6 氮基青霉索烷酸( 6 - a p a ) ，6 - a p a 是生产半合成青霉素的重要中白j 体。因此，p g a 具有重要的工业价值。本文根据g e n b a n k 中已有的巨大芽孢杆菌p g a 基因序列设计了上下游引物，通过p c r 扩增出巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 1 1 7 4 1 中p g a 基因。将所得的p g a基因克隆至1 r 7 i a c 启动子控制下的表达载体p y e s 2 ( a m p + , u f a l 中，构建了表达质粒p y e s 2 p g a ，并转化进酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) h 1 5 8 中表达，得到4 株重组菌株y 1 、3 ( 2 、y 3 、y 4 。在不需要苯乙酸诱导的发酵培养中，均在培养液中测到了青霉素酰化酶活性，其中y 4 的酶活最高，达到0 7 5u m l 。如果再进行发酵培养等优化，还有提高酶活量的潜力。将p y e s 2 p g a 进行测序，并将测序结果与g e n b a n k 中已有其它三株巨大芽孢杆菌的p g a 基因序列比对，表现出很高的同源性，分别达到9 7 1 、9 9 8 和9 9 8 。固定青霉素酰化酶在工业生产半合成抗生素中具有重要作用，本实验还采用包埋法将无机磁性粒子f e 3 0 。与有机材料海藻酸钠结合起来形成的一种复合磁性微胶囊，表面含有特征性功能基团。从而有效提高固定化青霉素酰化酶的稳定性和回收率。通过对青霉紊酰化酶的固定化研究，优化了固定化参数：给酶量为3 3 3 3u g ( 于载体) ，反应时目j 为4h ，p h 为7 5 ，反应温度3 7 。在此条件下固定化酶活性为1 7 3 6u 倌( 干载体) ，固定化效率为7 4 9 5 活性回收率为5 2 0 8 ，水解反应的最适p h 为7 5 ，最适温度为4 0 ，且固定化酶的储存和多次实验操作稳定性良好。除此之外，测定了酶促反应的动力学常数：溶液酶和固定化酶的米氏常数分别为0 2 4 5m 0 1 i 和0 4 2 1m o 川。关键词青霉素酰化酶：酿酒酵母：基因表达；固定化a b s t r a c tp e n i c i l l i nga c y l a s e ( p g a ) c a t a l y z e st h eh y d r o l y s i so fp e n i c i l l i ngi n t o6 -a m i n o p e n i c i l l a n i ca c i d ( 6 一a p a ) a s6 - a p ai st h ek e yi n t e r m e d i a t ei nt h ep r o d u c t i o no fs e m i s y n t h e t i cp e n i c i u i n s ，w h i c hi so fg r e a ti n d u s t r i a li n t e r e s t ap a i ro fp r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nt h ep u b l i s h e dp g ag e n es e q u e n c eo fb a c i l l u sm e g a t e r i u mi ng e n b a n lt h ep g a g e n ef r o mb a c i l l u sm e g a t e r i u m1 1 7 4 1w a sa m p l i f i e di nt h i ss t u d y c l o n e dt h ep g ag e n ei n t op y e s 2 ( a m p + u r a lv e c t o rc o n t r o l l e db yt 7 1 a cp r o m o t e ra n de x p r e s s e di ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eh 1 5 8 ( h i s 。t r p l e u u r a ) 4r e c o m b i n a n t so fy 1 ，y 2 , y 3 ，y 4w e r eo b t a i n e d t h ep g aa c t i v i t yw a sd e t e c t e di nt h ec u l t u r el i q u i dw i t h o u tt h ei n d u c e m e n to fp e n y l a c e t i ca c i d t h ep g aa c t i v i t yo fy 4i st h eh i g l i e s to fa i l ，r e a c h e dt o0 7 5u m l ，w h i c ha l s oh a sp o t e n t i a lt oe n h a n c ew i t hf e r m e n to p t i m i z a t i o n t h ep g ag e n es e q u e n c ew a sa l s od e t e r m i n e d ，w h i c hs h o w e dh i g hh o m o l o g yo f9 7 1 ，9 9 8 a n d9 9 8 w h e nc o m p a r e dw i t ht h ep g ag e n es e q u e n c e so ft h r e eo t h e rb a c i l l u sm e g a t e r i u mi ng e n b a n k t h ei m m o b i l i z e dp g ah a sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h em a n u f a c t u r eo fs e m is y n t h e t i ca n t i b i o t i c s e m b e dm e t h o dw a st o o kt om a k et h es u r f a c ef u n c t i o n a lm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sb yf e 3 0 4p a r t i c l e sa n dn a a i g t h ee n z y m em o l e c u l e sc a nb ei m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo ft h es u p p o r t s ，s ot h a tt oe n h a n c et h es t a b i l i t ya n db i n d i n ge f f i c i e n c y t h ee f f e c t so fi m m o b i l i z e dc o n d i t i o n sw e 陀i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea p p r o p r i a t ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n so fp g aa r ep h7 5 ，t h et e m p e r a t u r e3 7 ，t h er e a c t i o nt i m e4h ，a n dt h ea m o u n to fp g a3 3 3 3u g ( d r yw e i g h t ) u n d e rt h ea b o v ec o n d i t i o n st h ei m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t y ,b i n d i n ge f f i c i e n c ya n de x p r e s s i o na r e1 7 3 6u 猷d r yw e i g h t ) ，7 4 9 5 ，5 2 0 8 ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r eo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r e7 5a n d 加f o rh y d r o l y s i so fp e n i c i l l i ngr e s p e c t i v e l y t h ei m m o b i l i z e de n z y m eh a dg o o do p e r a t i v es t a b i l i t y i na d d i t i o n ，t h em i c h a e l i s m e n t e nk i n e t i cc o n s t a n t sw e r ee v a l u a t e df o rt h ei m m o b i l i z e da n dt h ef r e e l ys o l u b l ee n z y m e ，t h e yw e r eo 2 4 5m o 忉a n d0 4 2 1m 0 1 1 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d sp e n i c i l l i nga c y l a s e ( p g a ) ；s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；g e n ee x p r e s s i o n ； m m o b i l i z a t i o n独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅些盐些盘茎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名： 永文飘签字日期：矽d 7 年占月矽日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解盘a 垦盐些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权壅i 垦盎些盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：豫丧粗警字日期：矽年莎月- 7 , oe t# 位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：迎次签字e t 期渺7 年多月如日电话：邮编：1 绪论1 1 青霉素酰化酶概述1 绪论青霉素酰化酶( p e n i c i l l i ng a c y l a s e ，e c3 5 1 1 1 ，简称p g a ) 是一种酰胺键水解酶，其系统名是青霉索氨基水解酶( e c 3 5 1 u ) ，但习惯名如青霉素酰化酶、青霉素氨基酰基转移酶继续被沿用。最早从p e n i c i l l i nc h r y s o g e n u mq 1 7 6 分离得到。现已在多种微生物体内发现有该酶存在，如各种细菌、放线菌、真菌、酵母等i 。青霉素酰化酶在偏碱性环境下可以催化青霉素g 和头孢菌素g 水解，制备生产半合成，内酰胺类抗尘素所需的中间体：6 - 氨基青霉素烷酸( 6 - a f a ) 和7 氨基脱乙酰头孢烷酸( 7 a d c a ) ，在酸性或中性环境中，则可以催化6 a p a 、7 a d c a 发生酰基化反应制备半合成抗生素，因此p g a 在口内酰胺类抗生素工业中扮演了极其重要的角色。青霉素酰化酶催化反应大致可以分为三类【2 l ：酰胺的水解：酯类的合成；酰胺的合成。根据催化水解底物不同，可将该酶分为三类1 2 1 ：水解青霉素g 的青霉索酰化酶称为青霉素g 酰化酶( p e n c i l l i nga c y l a s e ，简称p g a ) ： 水解青霉素v 的青霉素酰化酶称为青霉素v 酰化酶( p e n c i l l i nva c y l a s e ，简称p 、，a ) ；水解a m p i c i l l i n 的青霉袭酰化酶称为a m p i c i l l i n 酰化酶( 简称a p c a ) 。青霉素酰化酶主要有两种来源，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中四种来源于革兰氏阴性菌的p g a ( 大肠杆菌青霉素酰化酶、类粪产碱卡t 菌青霉索酰化酶、克雷伯氏青霉素酰化酶) 已经克隆到大肠杆菌中进行了重组表达，并测定了序列。虽然抗生素工业上主要采用e s c h e r i c h i ac o l i 来源的p g a ，但是其他细菌来源的p g a 具有其他不同性质，如b a c i l l u sm e g a t e r i u m 来源p g a 可以作用于不同种类头孢菌素1 3 j ，a r t h r o b a c t e rv i s c o s u s和b a c i l l u sm e g a t e r i u m 来源p g a 可以在b a c i l l u ss u b t i l i s 中表达并分泌至胞外1 4 1 ，k l u y r e r ac r y o c r e s c e n s 柬源p g a 对p h 、温度、有帆溶剂等的稳定性非常高p i 。利用蛋白质工程手段改造只r e t t g e r ip g a ，从而使其具有头孢菌素c 酰化酶活性的工作也取得了些进展1 6 1 。c h o u 等将雷氏普罗威登斯菌青霉素g 酰化酶基因克隆到大肠杆菌中进行表达，酶活有大幅度提高1 7 1 。ec o l i 、kc i t r o p h i l a 、a v i s c o s u s 、且m e g a t e r i u m 来源的青霉素g 酰化酶( p g a ) 及b a c i l l u ss p h a e r i c u s 来源的青霉素v 酰化酶( p v a ) 已克隆并测定全部序列。其中。结构和功能研究比较清楚的是ec o l i 来源的p g a 。p g ai j | 2个亚基组成：2 0 2 3k d a 的含有侧链结合位点的亚基和6 5 6 9k d a 的含有催化位点的亚基，刚产生的p g a 是无活性的的体蛋白，包括信号肽、a 亚基、连接肽和鼻亚基，经过后加工，去除信号肽和连接肽，产生a 和口亚基，组装成有活性的p g a 。1 9 3 2 年，f l e m i n g 发现了青霉素g ( p c n g ) 。它高效广谱的抗菌效果使之在临床中广泛使用，但是在其使用过手【! l f t 许多微，l 物对青缳素产生了耐药性，导致青霉案g( p e n g ) 和青霉素v ( p e n v ) 种细菌的杀伤力越来越弱。并且由于青霉素g 在剧 i 不东北林业大擘顼士学位论文稳定，需要注射等原因，因此需要对青霉素g 进行改造1 8 j 。为了使p 内酰胺类抗生素具有新的疗效，可以在保持其抗菌结构母核的前提下，改变其侧链，使其成为对细菌敏感的具有疗效不同、作用时f b j 不同的抗生素。早在5 0 年代就已用微生物转化p e n g 成为6 -a p a 及苯乙酸【9 1 。随着各类青霉素衍生物：如苄青霉素( b e n z y lp e n i c i l l i n ) 、阿莫西林( a m o x i c i l l i n ) 、福米西林( f o r m i d a c i l l i n ) 等在医疗上的广泛应用，半合成肛内酰胺母核的需求量已经超过了青霉素。随着酶固定化技术的成熟，使得青霉素酰化酶在工业上的应用成为可能。除了生产6 - a p a 外，青霉素酰化酶在有机合成方面还有其它很大的用处。它除了催化p c n g 中的酰胺键水解之外，还能催化其它化合物中酰胺键、酯键的水解，用于有机合成中活性基团的保护。近年来利用它的底物专一性及对映体的选择来进行光学异构体的合成和拆分。此外，它还能催化水解反应的逆反应，即酰胺键的合成，把不同的侧链通过羰基连接到6 - a p a 和7 - a d c a 上，生成半合成的p 内酰胺类抗生素。这就说明，它不仅能合成青霉素类抗生素，还能合成头孢霉素类抗生素，在半合成口内酰胺类抗生素的生产方面显得更为重要1 1 0 i 。因此，各国科研人员对青霉素酰化酶的研究热情不减，主要集中在对青霉素g 酰化酶( p g a ) 的研究。1 1 。1 青霉素酰化酶的基因结构和表达调控以大肠杆菌青霉素g 酰化酶的基因为例，说明青霉索酰化酶基因结构。大肠杆菌、p g a 基因分为两部分：一部分是结构基因，另一部分是调控基因。结构基因由编码信号肽、口亚基、连接肽和口亚基的基因组成。在调控基因中，有两个c r p ( c y c i l ca m p r e c e p t o rp r o t e i n ) 结合位点、3 5 位点和1 0 位点、r b s 位点及三个不完全的回文结构( i m p e r f e c tp a l i n d r o m i cs e q u e n c e s ) 。结构基因的3 端存在一个r h o 依赖的发央结构作为终止子。结构如图1 - 1 所示：嘲铽幽1 - 1 人肠杆函青霉袁g 酰化酶的基冈结构f i g 1 - 1t h em a po fp g a g e n es l r u c i u r eo f e c o l i大肠杆菌p g a 基渊表达受三个方面的调宵：c a m p 受体蛋白，苯乙峻羊l i 度i n i 。1 绪论p g a 在大肠杆菌中的表达过程中，由引物延伸实验证明p g a 基因的转录是由单一启动子启动的。两个c r p 结合位点位于启动子邻近区域，对启动子起难调节作用：三个不完全的回文结构可能对启动子起负调节作用。这两个c r p 、启动子和三个不完全的回文结构的排列类似于碳源调节有关基因和操纵予的排列状况。有些碳源，如甘油、乳糖、果糖和葡萄糖对p g a 基因的表达有代谢抑制作用。另外，苯乙酸作为唯一的碳源对p g a 基因转录有诱导作用。这进一步说明p g a 基因的表达受碳源的调节1 1 2 1 。m a r i a 在确定和分析大肠杆菌编码与4 羟基苯乙酸降解途径有关的基因时，发现青霉素酰化酶基因存在于这个基因附近，表明p g a 具有提高大肠杆菌代谢底物广泛性的能力1 1 3 1 。1 1 2 青霉素酰化酶的结构( 1 ) 一级结构及序列比较不同来源的青霉素g 酰化酶都是由a 亚基和b 亚基组成的。其前体蛋白经过加工除去信号肽和连接肽，产生a 和8 两亚基，组装成有活性的p g a 。大肠轩菌p g a 结构基因全长2 5 3 8 个核苷酸，编码8 4 6 个氨基酸组成的前体蛋白。该前体蛋白包括2 6 个氨基酸组成的信号肽、2 0 9 个氨基酸组成的a 亚基、5 4 个氮基酸组成的连接肽和5 5 7 个氨基酸组成的b 亚基。革兰氏阴性菌大肠杆菌的p g a 基因信号肽由2 6 个氨基酸组成，其中，1 4 个氨基酸( 7 - 2 0 ) 残基组成疏水核。这个疏水核要比其它原核生物信号肽的疏水核大。成熟的革兰氏阴性菌的p g a 不存在半胱氨酸，但信号肽中含有半胱氨酸残基。大肠杆菌信号肽含有一个c y s 残基；2 4 2 6 位上的氨基酸序列a i a - l e u a l a 是保守的，它类似于蛋白酶切割a ia - x a l a 序列，b 哑基n 端序列前的2 8 3 - 2 8 5 位的l e u a g i y 在这两个p g a s 中也是保守的，它可能是蛋白水解释放b 亚基的信号。把连接肽缩短至1 1 个氨基酸并保留这个保守序列，仍能导致j j 体蛋白的非专一性加工。因此，这个l e u a l a - g l y 单独存在的序列不能决定蛋白水解与否，而是由前体蛋白的二级结构决定蛋白水解位点，从而产生有活性的p g a l l 4 1 。现在普遍认为，p g a 的加工是自催化反应。革兰氏阳性菌且m e g a t e r i u m 与革兰氏阴性菌ec o i lp g a 氨基酸序列相比，其同源性为2 5 ，差别较大，并且氨基酸序列长短也不同。信号肽中的保守序a l a l e u a l a 和连接肽上的保守序列l e u a l a g l y 都不存在。同样，不论是前体蛋白，还是成熟的p g a ，都没有c y s 的存在1 1 5 i 。( 2 ) 活性位点及其底物专一性位点ec o i lp g a 能完全被p m s f 所抑制。这表明，在催化反应中涉及到s e r 活性位点。s l a d e 和p d e t o 等人通过拆分a 和8 两亚基，定点突变以及紫外o d 光谱等方法证实：b - 亚基n 端s e r 为活性心：m e t l 6 8 残基涉及到底物与酶的相互作用，将m e t l 6 8 突变引起底物专一性的改变。出此可以认为，a ，亚基作为底物结合涯基，m e t l 6 8 参与了酶底物复合物和稳定过渡念，但它不参与化学催化反应1 1 6 1 。把四种不同来源的p g a s 与两种头孢霉鬃酰化酶相比较，发现b 亚基n 端含s e r - a s n 保守残让，由此说明，它们都能水解酰胺键或酯键，有相同的催化作用，但底物的专一性不同( 1 t 1 引。由此可以认为，b 亚基包含活性中心，a 亚基决定底物的专一性。1 1 。3 青霉素酰化酶的作用原理及水解催化机制( 1 1 作用原理青霉素酰化酶催化反应大致可以分为三类：酰胺的水解； 酯类的合成； 酰胺的合成。目前p g a 主要用于水解青霉素g 生成6 氨基青霉素烷酸( 6 - a p a ) 及苯乙酸，然后催化母核和不同的侧链间的合成反应生成口内酰胺类抗生素。青霉素酰化酶催化青霉素g 水解制各6 - a p a 的反应式如图1 2 所示。青霉素g 的裂解反应是一个典型的可逆反应，生成了等摩尔的6 - a p a 和苯乙酸( p a a ) ，可见，商浓度的底物、水解产物6 - a p a 和苯乙酸均会对反应产生抑制作用。目前，水解都是在较低的底物浓度下进行的。另外，在反应过程中还需滴加碱液中和苯乙酸，以恒定反应体系的p h 值，防止p a 变性失活。删进+ 啪些坚n ：一越。+ 一i 。m i ng秘 椭聊蝴抽删c 删陬甜愀蝴( p e - a o )仆 p ( 队 ，酗1 2 青霉素酰化酶催化青霉素g 水解制备6 - a p a 的反应式f i g 1 - 2t h em a po fp e n i c i l l i ngh y d r o l y z c dt o6 - a p ab yp g a( 2 ) 水解催化机制青霉素酰化酶的口亚基n 未端丝氨酸残基起着催化作用。浚酶与p m s f 发生反应而失活【1 9 l 。p m s f 是丝氨酸蛋白酶的亲核标记试剂。它共价修饰丝氨酸而使酶失活。青霉素酰化酶与丝氨酸蛋自酶很相似。丝氨酸蛋白酶通过酰化机制利用催化丝氨酸残基柬水解酰胺键和酯键。青霉素酰化酶通过它的口亚基n 术端丝氨酸残基柬发挥催化功能。它的转移酰基能力和动力学行为部与酰化酶中日j 体一致l 删由p m s f 和青霉素酰化酶复合物结构可以推出，酶促水解反应是通过四面体中日j 物而进行的，四面体磺酸基团与半缩醛非常相似。从青霉素酰化酶与苯乙酸复合物可以看到，f l l s e 钱基的0 叶处于有利于进攻羰基碳原子的位胃。这种酶催化反应是可逆的，虽然在酸性条件下有利于合成反应，但羧基的质子化使得羰基碳原子更易受到亲核进攻。1 1 4 青霉素酸化酶的应用( 1 ) 卢内酰股类抗生素合成方面的应用6 a p a 是半合成青霉素类药物，如a m p i c i l l i n ，a m o x i c i l l i n 的中问体。早先，6 -a p a 主要足j 遵过化学法从p e n g 和p e n v 脱酰基而束的。整个过私! 比较复杂，而且要，目到许多有毒试刺，如吡啶、五氯化磷和亚硝酰氯等。因此，要求川利，简便的方法进行i 绪论脱酰基反应。青霉素酰化酶的引入大大简化了这一过程1 2 l j 。且m e g a t e r i u mp g a 不仅能专一水解p e n g ，而且还能够水解苯乙酰7 - a d c a 、a l i l o x i c i u i n 、c c p h a l e x i n 和c e p h a l o t i n ，进而，通过控制p h 合成a m o x i c i l l i n 、c c p h a l e x i n 、c e p h a l o t h i n 和c e f a z o l i n 。在生产过程中存在一个问题，那就是产物之一苯乙酸对d h 及酶活力的影响，苯乙酸的不断产生使反应器p h 不断下降。为了保持酶活力的最适p h ，需要不断加碱，使反应体系处于酶的最适p h 。另外，苯乙酸作为竞争性抑制剂，使反应不能完全。通过电渗透的方法可以解决这个问题f 2 2 】。细菌和真菌中来源的青霉素酰化酶已经被广泛地应用于半合成青霉素和头孢霉素的合成研究。6 - a p a 。卜a d c a 与侧链化合物的缩舍反应都可以用青霉素酰化酶来催化。酶催化反应与化学催化酰化反应相比，优点是反应条件温和，易受影响的功能基团不需要保护。青霉素酰化酶催化酰化缩合反应是在酸性条件下进行的。部分酸化、酰基供体的溶解性、未转化试剂的再循环利用等方面的影响因素，限制了这个酶促反应的发展。由于肛内酰胺类抗生素具有广阔的前景，引起世界各国的科研人员对青霉素酰化酶及其合成反应的关注，从动力学和热力学的角度探索了酶法生产口内酰胺类抗生素，并取得了长足的进展，应用于工业化生产。目前在工业上应用较多的是p g a ，它的来源可参考s h e w a l e 的综述1 2 3 1 。另外，出于p v a 与p g a 相比具有一些独特的性质，如生产成本低，热稳定性更好、底物抑制浓度商而且不产生使肛内酰胺环破坏的芦内酰胺的，p v a的工业化应用币在吸引科研人员的注意i 硼。( 2 ) 在对映体合成上的应用大肠杆菌青霉素酰化酶对苯乙酸有高度的选择性，不仅催化青霉素类化合物中的苯乙酸的水解，还能催化苯乙酰基团从其他胺、醇及肽链上水解离去。p a 的对映体选择性可以用于氨基酸、a m i n o a l k y l p h o s p h o n i c a c i d s 、酯类及醇类的制备。在医药工业上，p a 的外消旋拆分和不对称合成的活性显得更为重要。在生物体内，许多与药物有关的过程，如酶抑制剂作用、跨膜运输、受体的连接等，都依赖药物的立体结构。药物的生物活性、毒性、代谢也因手性药物的对映体不同而不同。有许多这样的例子，某种手性药物的一种光学对映体有治疗作用，而另一种则无：一种对映体有毒，而另一种则安全：一种对映体是拮抗剂( a g o n i s t ) ，而另一种是抗拈抗剂( a n t a g o n i s t ) 。( 3 ) 其它应用青霉素酰化酶可以应用在水解保护基团方面。j 下确引入和去除保护基团，对有机合成来讲，是很重要的，并且常常要碰到的，尤其是在复杂、多功能分子的高度选择性合成巾，青霉素酰化酶广泛的底物专一性使它能够用于某些保护基团的连接和去除，应用于肽链合成中的脱保护基团。青霉素酰化酶脱保护基团具有许多优点：它在温和的温度，接近中性的p h ( 约8 1 ) 条件下进行；由于没有蛋白酶活性，肽链不被切割；脱保护幢团反应可以在某些非水溶剂存在下进行，因而苯乙酰基团很容易通过化学或酶学方法，j i 入：应用于赖氨酸侧链氨琏上保护基团的去除、筘内酰胺化合物中氨基缘护基团的去际、核苷酸上氨基保护基团的去除、琉基上保护基i 1 的去除等等。乐j e 韩业丈学碗士学位论文1 1 5 青霉素酰化酶产生菌菌种的改良近年来，用一些经典和现代的技术手段，对青霉素酰化酶产生菌进行改良，通过理化诱变，使酶活力提高：通过定点突变和化学修饰，将酶活性中心的丝氨酸变成半胱氨酸或含硒原子的半胱氨酸，使酶合成活力相对于水解活力大幅提高；通过基因工程技术提离酶的表达水平、促进分泌或改进尘产菌的缺陷。在构建重组p g a 产生菌时较多选择的是大肠埃希氏菌表达系统，其次是枯草芽孢杆菌表达系统【3 4 l ，和啤酒酵母表达系统阁。诱变是通过各种物理、化学方法对青霉素酰化酶产生菌进行诱变处理，通过筛选得到高酶活力的菌株。韩文珍等以巨大牙孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 为出发菌，经理化因子反复诱变处理，鼐到胞外青霉素酰化酶高产菌株。在适宜的发酵培养条件下，酶活达7 - 8u m l ，最高达8 2u m l 。发酵液经分离提纯，酶比活力达2 0u m g 以上，可直接用于固定化酶的制各i z l 。目前半合成的b 内酰胺类抗生素都采用化学合成法。化学合成过程复杂，需要在低温( 3 0 ) 下使用不稳定的底物和污染性很大的有毒化合物，如毗啶、二甲苯胺、二氯甲烷等，因此科研人员一直在探索用酶法合成来代替化学合成法。但由于青霉素酰化酶的合成活性低( 仅为水解活力的1 8 0 ) ，底物浓度和产率均较低，直未能在工业上德到成功应用。如果能用蛋白质工程改造酶，增加其合成活力，就有可能在工业上取代化学合成。戴明华等l4 j 对大肠埃希氏菌a t c c 2 1 1 0 5 的青霉素g 酰化酶活性中心的s e t 2 9 0 分剔进行了点突变和化学修饰。将活性中心的s e r 2 9 0 改变成c y s 或含硒原子的c y s p g a水解活力均大为下降，合成活力相对于水解活力提高了很多，两者之比分别为1 1 0 和l 3 。利用基因工程改良青霉素酰化酶产生菌是菌种改良的有效方法。利用d n a 重组技术将编码青霉素酰化酶的基因转移到合适的宿主菌中构建高产和分泌型产生菌，可以弥补原产生菌的生产缺陷。若同时采用高密度培养技术，还可以提高分泌产物青霉素酰化酶的比生产率和酶活力。例如：巨大芽孢杆菌能分泌p g a ，在工业提取上十分有利，但它的缺陷是在培养过程中需加入苯乙酸诱导产酶，且需变温发酵，即在2 8 培养2d ，再在2 5 诱导产酶。杨晟等用p c r 方法从巨大芽孢杆菌的基因组中扩增到编码p g a 的基因，装载到枯草芽孢杆菌表达质粒p p z w l 0 3 中，将其转化到枯草芽孢杆菌d b l 0 4 中进行表达。重组菌株产酶无需苯乙酸诱导。在3 7 培养2 4h ，培养液中酶活力可达6u m l 。1 0d 的连续传代实验表明重组菌株的稳定性很高。发酵液上清液中的p g a 经a 1 2 0 3 层析，再经苯基琼脂糖凝胶c l - 4 b 疏水层析，可将其浓缩百倍以上，两步总收率为7 9 ，可直接用来制备固定化酶埘。目前，国内外关于p g a 的蓬冈1 程研究大多基于大肠埃希氏菌的p g a 基因还有一些关于巨大芽孢卡t 菌、粪，“二碱阿l c a l i g e n e s 向e c a l i s ) 、嗜柠檬酸克吕沃尔氏荫( k l u y v e r ac i t r o p h i l a ) 、雷氏普梦威鹱j 昕菌( p r o v i d e n c i ar e t t g e r i ) p g a 基因遗传分析的搬l 绪论道。表l - 1 近年利h 4 基田i ：科技术改良的p g a 产生菌t a b l e1 - it h ef g ap r o d u c e dr e c o m b i n a n t si nr e c e n ty e a s1 2 酿酒酵母表达系统1 2 1 酿酒酵母的发展及遗传特性基因工程技术问世2 0 多年来已建立了多种表达系统，这些表达系统各有优缺点，其存在为我们表达某一特定基因提供了选择的可能性。每一种表达系统本身也在不断地发展完善，尽可能地扬长避短以适应基因工程表达外源基因的需要。酵母基因工程表达系统也是如此。酵母菌是一类单细胞真核生物。人类对酵母菌的应用，尤其是酿酒酵母，具有几千年的悠久历史。积累了大量的生物学和遗传学方两的资料。鉴于酵母菌生长旺盛和其独有的一些特性，它已被发展成为表达外源基因的重组表达系统。酵母作为单细胞生物一方面在操作和生产上具有细菌表达系统的特点；另一方面又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰过程。酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 名面包酵母，一直被称为真核生物中的“大肠杆菌”。酵母菌培养既简单、经济，又十分快捷，在营养丰富的培养基中，大约9 0r a i n的时蒯即可增值一代。很早就被应用于食品和饮料工业，也是人们最先建立的酵母表达系统。自1 9 8 1 年h i t z e m a n t 2 8 l 等首次报道了人重组干扰素基因在酿酒酵母中表达成功后，相继又有多种外源基因在该表达系统中表达成助1 9 j 。目前已发展和建立了几种浚表达系统的表达载体，但以整合体型( y i p t y p e ) 载体和附加体型( y e p t y p e ) 载体最为重要。整合型载体不含自主复制序列( a r s ) 。而是被整合到酵母宿主菌的染色体上。这类载体的优点是稳定性好，但它的缺点是拷贝数低1 3 0 1 。附加体型载体，由于含有来自酵母天然质粒2 u 复制起点序列，能够独立于酵母染色体外自主复制，拷贝数通常可达3 0 拷贝以j 二，但吞：非选择条件下多不稳定，发酵生产过f i i 中质粒丢失仍足问题1 3 l i 。酿渊酵母通常应用的选择性杯忠是野，七型丛因，f f l lu r a 3 ，l e u 2 。h i s 3 和t r p l 。东北林业大学硕士学位论文这些基因可以补偿酵母菌细胞中某一种特定的代谢缺陷( 营养缺陷) 。因此，与常用于细菌质粒中的抗生素抗性标记不同的是，这些标记必须与具有可被互补的适当突变的宿主菌株结合起来使用。尽管一些抗杀真菌剂如微管解聚剂或真核细胞毒物的显性标记已见报道，但它们并不能广泛的引入到表达载体中。酿酒酵母表达系统表达外源基因的优点有很多：酿酒酵母培养条件普通，生长繁殖迅速，用于表达基因工程产品时，工艺简单，能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产，有效降低生产成本，已广泛应用于酿酒和食品工业，它不会产生毒素，安全可靠，酿酒酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，特别适合于表达真核生物基因，这有利于保持生物产品的活性和稳定性1 3 2 拼l 。外源基因可在酿酒酵母中分泌表达，通常为将重组蛋白的成熟蛋白形式与结合信息素的p r e p r o 序列融合，p r o 序列可用k e x 2 酶的蛋白水解作用切去，这个步骤是广泛存在于真核生物中的，表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化川丽且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响。1 2 2 酿酒酵母表达系统的应用及前景利用酿酒酵母表达系统生产制备外源基因的表达产物已有2 0 余年的历史，酵母表达体系由于其操作简便，是基因工程领域最常用的宿主系统之一1 3 7 1 。酵母系统由于其本身不含有内毒素，且具有完整的真核蛋自表达和修饰功能，因而与表达量相对较大的大肠杆菌表达系统相比，在临床应用方面具有更明显的优越性。尽管人们利用酿酒酵母表达系统制备外源蛋白质取得了成功，但是实践中仍然发现有很多的外源基因不能在酵母表达系统中表达，具体原因目前还没有明确。另外，还没有彻底克服酵母表达系统制备外源蛋白质时发生的不均一现象。随着酿酒酵母基因组测序的完成及后基因组的发展，人们对酵母的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力将更加清楚，相信不久的将来，这些问题郜将得到解决1 3 8 - 4 0 l 。1 _ 2 3p y e s 2 载体p y e s 2 ( 5 9 0 0 b p ) 为酵母一大肠打菌多拷贝的穿梭质粒，可分别在曼c e r e v i s i a e 及ec o l i 中自主复制，是酵母附加体克隆载体。p y e s 2 含有如下多克隆位点：h i n di i i ，g p nl ，s a c i d i a m h l ，凰堵l ，艮嘏i ，b s t x i ，n o t i ，劢o l ，s p hl ，和x b ai 均是单切点。重组质粒在多克隆插入时，可通过l a c z 基因的插入失活来进行蓝白筛选，同时含有a m p的抗性基因。p y e s 2 含有酵母u r a 基因，是营养缺陷型的筛选标记。p y e s 2 的物理图谱见图1 - 3 。8 n a b幽1 - 3 酿酒酵母人肠杆目穿梭质粒p y e s 2 ( a m p + l i r a + 1 图谱f i g 1 - 3t h em a po fp l a s m i dp y e s 2 ( a m p + l i r a + 11 3 固定化酶研究概述应用磁性微胶囊进行固定化是近年束兴起的一种效果良好，应用潜力巨大的固定化方式。磁性微胶囊是指通过适当的割备方法使有机高分子与无机磁性粒子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性微胶囊由于具有良好的磁响应性和特异的表面基团，能与其他的分子或细胞等结合，并且在磁场的作用下可定向运动到特定部位或从介质中分离出来。磁性微胶囊一般为核一壳结构，其中大部分是由命属氧化物( 如铁、铂、镍等氧化物) 组成核，尤以f e ，0 4 磁流体为磁性材料居多，高分子材料作壳层：也有小部分是由高分子材料作核，无机磁性材料作壳层。此外还有三明治结构，即外层、内层均为高分子材料，中问夹层为无机离子。磁性微胶囊常用的高分子材料有氨基酸类，包括白蛋白，明胶、球蛋白、酶类、聚赖氨酸和聚谷氨酸等。聚多糖类包括淀粉、葡聚糖、聚甲壳塘、阿拉伯胶、蒯梧桐树胶、鹿角菜果胶、聚半乳糖醛酸、糖原和印度树胶等。其他材料有海藻酸钠、乙基纤维素、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、硅酮和聚苯乙烯等。这些材料大部分具有一定的生物相容性。1 3 1 磁性材料的研究现状铁氧体磁性材科制备与性质研究的迅速发展，为其在生物技术、医学诊断与治疗的应用奠定了基础。纳米磁性材料的发展，特别是铁氧体纳米材料因为具有很好的生物安全性与生物相容性以及由于纳米尺寸所导致的某北磁学性质的很大泥高和改善，在生物医学检测j 治疗等方均i 形成了相_ 】( t l t 较独它的领域。铁氧f 本磁性材料有许多种类，研究较多的且较典型的卡于料彳a f e 2 0 3 ，7 - f e l 0 3 ，东北林业大学硕士学位论文n i f e 2 0 4 ，f c 3 0 4 等等。上述铁氧体纳米材料的制备方法有许多种，比较常见的物理粉碎法、激光烧蚀法、真空镀膜法以及化学方面的微乳液法( 反胶柬法) 、高能射线或微波场辅助化学法、分子自组装法、喷雾热分解法、水解法、水热法、化学共沉淀法、溶胶一凝胶法、相转移法以及超临界法等。在已报道的各类磁性纳米粒子中，有关f c 3 0 4 纳米晶体的制各方法及应用研究尤其受到重视1 4 1 删，通过控制适当的反应条件，就能够制备出直径从几个纳米到几十个纳米级的磁性f e 3 0 4 粒子，由于共沉淀法所需设备简单、程序简便，所以在实验的过程中通常采用此法，共沉淀法有两种；种是m a s s a r t 水解法1 4 5 l ，即将摩尔比为2 ：1 的三价铁盐( f e 3 + ) 与二价铁盐( f e 2 + ) 的混合溶液直接加入到强碱性的水溶液中，铁盐在强碱性水溶液中瞬间水解结晶形成磁性f e 3 0 4 纳米晶体；另一种是滴定水解法1 4 6 卅，该方法是将稀碱溶液滴加到摩尔比为2 ：1 的三价铁 ；j ；：( f e 3 + ) 与二价铁盐( f e 2 + ) 混合溶液中，使铁盐溶液的p h 值逐步升高，达到6 7 时，水解生成磁性f c 3 0 t 纳米晶体。在这两种方法中，后者由于在反应过程中反应条件容易控制，所以比较简捷和优越。1 3 2 制备磁性高分子聚合物磁性高分子微球的制备方法主要有包埋法、单体聚合法、化学转化法、生物合成法等。包埋法是将纳米磁性粒子分散于生物大分子溶液中，采用交联、雾化、絮凝，沉积、蒸发等手段通过范德华力、氢键、磁颗粒表面的金属离子与高分子链的整合作用或共价键，使水溶性高分子链缠绕在磁性颗粒表面，形成纳米磁性高分子复合微球。包埋法一般用于制备磁性生物高分子微球，是常用的制备方法之一。安小宁等采用壳聚糖包埋磁粉，经戊二醛修饰、环氧氯丙烷交联制得高磁性壳聚糖微粒，并将其共价结合卵清粘蛋自得到磁性亲和吸附剂，应用于胰蛋白酶的亲和纯化l 蛐i 。m e n a g e r 等1 4 9 l 将双分子层蟒脂膜包覆在纳米f e 3 0 4 。颞粒表面制成8 0n m 的磁性脂质体。李风尘等唧j 采用滴定水解法，用氨水水解f e c l 3 与f c a 2 的混合溶液制备出纳米f e 3 0 4 ，然后采用离子凝聚反应法，在分散有纳米f c 3 0 4 的壳聚糖溶液中，加入适量的三聚磷酸钠溶液制得包覆有纳米f e 3 0 4 的壳聚糖复合微球。陔复合微球具有磁响应功能并具有可生物降解特性。邱广亮等1 5 1 i 将明胶溶入重蒸水中然后与氯化亚铁及过氧化氢溶液混合，并通过滴定、过滤，制备了核一壳式纳米级磁性明胶微粒。包埋法制备纳米磁性高分子微球，由于高分子的包裹，粒子的表面自由能降低，小磁性粒子划的相互聚集受阻，有利于磁性高分子微球的形成，方法简单。单体聚合法是指在磁性粒子和有机单体存在的情况下，根据不同的聚合方式加入引发剂、稳定剂、表面活性剂等物质进行聚合反应，得到内部包有一定量磁性粒子的高分子微球。这种方法是制各磁性高分子微球最常用的方法，通过这种方法可以得到粒径均匀、表面活性官能团多样的磁性微球。常见的功能单体有丙烯酸、丙烯醛、丙烯酞胺以及它们的衍生物。l 绪论根据采用的聚合途径不同，主要有；悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法。其中悬浮聚合因聚合工艺过程简单。聚合热易于排除，操作控制方便，聚合物易于分离、洗涤、干燥，产品也较纯净，特别易用于工业生产所采用