（水产养殖专业论文）养殖水体水质净化菌的筛选及特性研究.pdf

摘要 通过对四川多个地区的养鱼池水样和泥样富集培养后 得到1 0 株生存能力 相对较强的菌株 经复筛试验 最终获得1 株对有机物和氨氮具有显著降解能力 的菌株 该菌株对灭菌养殖废水中富含约3 0 m g l 有机物和5 m g l 氨氮的降解率 分别为5 6 8 和2 1 5 经细菌学鉴定 该菌株为坚强芽孢杆菌 b a c i l l u s f i r m u s 命名为s h 7 菌株安全试验结果显示 s h 7 菌株在含5 的兔血平板上生长后不溶血 用 浓度为1 1 0 9 c f u m l 的s h 7 菌液灌胃小白鼠 0 5 m l 次 3 次 天 1 4 d 后 无一 只小鼠死亡 鲤鱼在含l 1 0 8 c f u m l 的s h 一7 菌液的养殖水体中浸泡1 4 d 后 无一 尾死亡 体表无任何病理症状 抑菌试验结果可见 s h 7 菌株对水产条件性致 病菌一嗜水气单胞菌具有很强的抑制作用 p o 0 5 试验研究了温度 p h 值和装液量等环境条件对s h 7 菌株降解有机物和氨氮 能力的影响 当p h 为7 0 温度为3 0 c 时 菌株对有机物和氨氮的降解能力最 强 随着装液量的增加 菌株对有机物和氨氮的降解能力呈下降趋势 通过单因子试验和正交设计试验相结合的方法 筛选出了s h 7 菌株的最佳 液体发酵培养基成分为 葡萄糖2 5 9 l 豆饼粉2 0 9 l m g s 0 4 1 0 9 l c a c l 2 0 0 s g l k 2 h p 0 4 2 0 9 e l m n s 0 4 0 1 5 9 l 培养温度3 4 c 初始p h 7 2 在2 0 0 r m i n 摇床培养2 2 h 后 发酵液的活芽孢菌浓度达到1 6 4 x 1 0 1 0 c f u m l 和未优化前相比 活芽孢菌浓度提高了9 7 8 9 发酵液的使用量研究结果表明 当养殖水体中异养菌浓度为2 4 x1 0 4 c f u m l 时 发酵液的使用量为l m l m 3 在水族缸中使用发酵液后 s h 7 菌株在4 一 6 d 达到繁殖的高峰期 占异养菌总数的8 5 9 0 在1 0 1 4 d 时 试验组异养菌浓 度都低于对照组 对水质的监测结果显示 1 4 d 的试验结束后 试验组的氨氮浓 度 亚硝酸盐氮浓度和有机物浓度的增加量明显低于对照组 p o 0 5 关键词 养殖水体 有益菌 水质净化 筛选 特性 s c r e e n i n ga n ds t u d y i n go nc h a r a c t e r i s t i co fb a c t e r i au s e df o r p u r i f y i n gw a t e rq u a l i t yo fa q u a t i cw a t e r 一 g u oji n g d e p a r t m e n to fa q u a c u l t u r e d i r e c t e db yp r o f x i o n gy a n si c h u a na g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y a b s t r a c t w eo b t a i n10p r e p o n d e r a n tm i c r o o r g a n i s m sw i t hf o r tv i t a l i t yb ya c c u m u l a t i n g f r o mm u da n dw a t e ri nm a n ya r e a s f i s h p o n d si ns i c h u a n t h r o u g hs e c o n ds c r e e n i n g t e s t w eo b t a i n1m i c r o o r g a n i s mw h i c hc a no b v i o u s l yd e g r a d eo r g a n i cm a t t e ra n d a m m o n i a n i t r o g e n t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f t h es t r a i nr e a c h e s5 6 8 a n d21 5 i nt h e d e n i t r i f i e sa n t i s e p t i ca q u a t i cw a s t e w a t e rw h i c hc o n t a i n s30 m g lo r g a n i cm a t t e ra n d 5 m g la m m o n i a n i t r o g e n b yb a c t e r i o l o g i c a li d e n t i f i c a n t i o n t h es t r a i ni si d e n t i f i e d a sb a c i l l u sf i r m u sa n dn a m e da ss h 一7 t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es t r a i no fs h 一7h a sn oh a e m o l y t i c u so nr a t s 5 b l o o d p l a t e a f t e r1 4d a y s a l lt h em u sm u s c u l u sa l b u sa r eh e a l t h i l ya f t e r d r e n c h e d0 5 m lc u l t u r ef l u i dw h o s ec o n c e n t r a t i o no fs h 7i s1xl0 9 c f u m le v e r yt i m e a n dt h r e et i m e s p e rd a y m e a n w h i l e a f t e r1 4d a y s c a r p sa r es u r v i v a la n dh e a l t h ya f t e rs o a k e di na q u a t i cw a t e rw h i c hc o n t a i n s1 10 8c f u m lo fs h 7 t h ee x p e r i m e n ts h o wt h a tt h es t r a i no fs h 7h a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t o r ye f f e c to nt h ea q u a c u l t u r e c o n d i t i o n a lp a t h o g e n n i cb a c t e r i aa e r o m o n a sh y d r o p h i l a p 0 0 5 t h ee x p e r i m e n ts t u d yt h ei n f l u e n c eo fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r s u c ha st e m p e r a t u r e p ha n dd i s s o l v e do x y g e no nt h ed e g r a d a t i o nr a t eo fo 略a n i cm a t t e ra n da m m o n i a n i t r o g e n w h e nt h ep hi s7 0a n dt e m p e r a t u r ei s30 2 t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f t h es t r a i nt oo r g a n i cm a t t e ra n da m m o n i an i t r o g e ni ss t r o n g e s t a n dt h ed e g r a d a t i o nr a t eo ft h e s t r a i nd e c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s i n go fc u l t u r em e d i u mv o l u m e t h r o u g ht h ee x p e r i m e n tc o m b i n i n gs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a l w ec h o o s e t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n dm e d i u m g l u c o s e 2 5 9 l s o y b e a nc a k e 2 0 9 l m g s 0 4 1 0 9 e l c a c l 2o o s g m k 2 h p 0 4 2 0 9 l m n s 0 4 0 1 5 9 l t h ec u l t i v a n t e s t e m p e r a t u r ei s 3 4 c i n i t i a lp h i s7 2 s h a k i n ga t2 0 0 r m i n a f t e r2 2 ho f s h a k i n g a c u l t i v a t i o n t h en u m b e ro f b a c i l l u sr e a c h e sa t1 6 4 x 1 0 1 0 c f u m l c o m p a r e dt ot h en o n o p t i m i z e dm e d i u m t h en u m b e ro f b a c i l l u sh a si n c r e a s e d9 7 8 9 t h ed o s a g eo ft h es h 一7t e s ts h o w st h a t t h eo p t i m i z a t i o ni n n o c u l a t i o ni s1m l m w h e nt h ea q u a t i cw a t e rc o n t a i n s2 4 x10 4 c f u m lo fc h e m o h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a a f t e ru s i n gt h es h 7i na q u a r i u m t h en u m b e ro fs h 7i n c r e a s e di nc r e s t t i m ea f t e r f o u ra n ds i xd a y s t h ep e r c e n t a g eo ft h es h 一7i nt h en u m b e ro fh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a i s8 5 9 0 t h en u m b e ro fh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i ai nt e s tg r o u pi sl o w e ri nc o n t r o l g r o u pi n lo 14 d t h er e s u l to fm o n i t o r i n gw a t e rq u a l i t ys h o wt h a tt h ei n c r e m e n to f a m m o n i a n i t r o g e n n i t r i t e n i t r o g e na n do r g a n i cm a t t e ri nt e s tg r o u po b v i o u s l yl o w e r t h a nt h ec o n t r o lg r o u p p o 0 5 k e y w o r d s a q u a t i cw a t e r p r o b i o t i c s w a t e rp u r i f i c a t i o n s c r e e n i n g c h a r a c t e r i s t i c 论文独创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 学位论文中不包含其他个人或集体 已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或 证书所使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意 研究生签名 即磁 伽分年舌月矽日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描 等复制手段保存 汇编学位论文 同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学 位论文的全部或部分内容 研究生签名 导师签名 却磁 镌渤 矽8 年6 月 切多年易月蕊籼 1 前言 1 1 养殖环境的污染问题 水产养殖业迅猛发展 据统计 1 9 7 0 年以来 其养殖规模以每年平均8 9 的比例增长 而畜禽业每年的增长仅为2 8 预计 在未来2 0 年 为了满足人们 的营养需求 水产品的产量至少要增加5 倍 i 在集约化水产养殖业发展的同时 养殖环境污染问题也日益严重 在养殖过 程中产生了大量的污染物 包括未摄入的饵料和排出的粪便 2 1 释放到养殖环境 中的污染物包括不同种类的有机和无机化合物 如氨氮 溶解有机碳和有机氮等 3 o 鱼体每增重1 k g 需要1 3 k g 的干饲料 4 而投入的饵料大约有3 6 未被利用 以有机废物的方式沉积于养殖水体 摄入的n 大约有7 5 未被利用而被排出体外 5 鱼类的消化能力可以从消化系统的解剖特征上来分析 鱼类肠段的长度较短 肠长和体长之比相对较小 6 例如 鲤鱼的肠长是体长的2 0 2 5 倍 牛和羊的肠 长是体长的2 0 3 0 倍 人类的肠长是体长的3 4 倍 因此 鱼类的食糜只能在肠中 停留很短的时间 对营养物质的吸收就相对较差 鱼类主要利用蛋白质作为生长 的需要 而陆生动物主要利用糖类和脂肪 7 1 鱼类对蛋白质的需求量是哺乳动物 的2 3 倍 而氨氮是蛋白质代谢的主要产物之一 以上这些因素都会导致集约化 养殖水体中有机物和氨氮的大量积累 1 2 有机物和氨氮污染的危害 1 2 1 有机物的危害 高浓度的有机物会引起水质恶化 加快病原菌的滋生 增加其它病原菌的入 侵机会 8 1 邱德全等 明 2 0 0 5 的调查也表明 水体中的有机物含量过高时常造成 水质恶化 病原菌的大量滋生 导致鱼类生长缓慢 甚至死亡或泛池 马建新等 1 0 1 2 0 0 1 认为水体中有机物太高是诱发对虾病毒病暴发及流行的主要原因之一 并在实验中发现暴发病毒病的绝大部分虾池的有机物都较长时间处于1 3 m g l 以 上 而不暴发病毒病的虾池有机物则很少超过1 0 m g l 1 2 2 氨氮的危害 水体中的的氨主要以n h 4 和游离n h 3 存在 氨氮可以破坏鱼的鳃组织 使血 液中的红血球失去与氧结合的能力 呼吸机能下降 鳃丝颜色变深或呈紫黑色 体表黏液增多 皮肤充血 食欲下降 甚至失去活力 n h 3 还能通过鳃和皮肤进 入鱼的血液 干扰三羧酸循环 改变鱼体渗透压以及降低鱼体对水中氧的利用能 力 影响鱼的生长 研究表明养殖水体中氨氮过高 会导致养殖生物体内一些重 要的酶活性明显下降 女h s o d p o 溶菌酶 并且血细胞的数量也下降明显 1 1 1 n h 3 在水中与n h 4 呈一种动态平衡的关系 当水 p h 过高时 n h 4 将会转 化为n h 3 n h 3 对于鱼的毒害作用远大于n h 4 原因是n h 3 没有负荷 并且是可 溶解的脂质 因此更容易阻断生物膜 在大多数情况下 养殖环境中的n h 3 不能 超过1 5m g n l t l l l 因此 防止p h 值过高 是减轻n h 3 毒性作用的重要措施之一 1 3 治理污染的方法 1 2 在水产养殖上 常用来去除养殖池塘生态环境的污染物的方法主要有物理法 和化学的方法 1 3 1 物理方法 清淤法 就是在养殖池塘的养殖间歇期 将养殖池塘的水排净 然后利用人 工或机械的方法 将养殖池塘底部生态环境中沉积的各种有机物从养殖池塘底部 清除出去 从而将有机污染物从养殖池塘生态环境中清除 吸附法 就是利用多 孔性的固相物质 如活性炭 硅胶 沸石粉等的吸附特性 将其洒到养殖池 塘生态环境中去 这些物质在养殖池塘生态环境中能够对水体中有毒物质 如氨 氮等 固体悬浮物质进行吸附 固定 从而减少了水体中这些物质的浓度 而 起到了净化水质的作用 换水法 就是在养殖过程中将清洁的水注入到养殖池塘 生态环境中 而将污染的水排出养殖池塘生态环境 使得各种污染物随着水流而 排到养殖池塘生态环境外 从而减少养殖池塘生态环境的水质污染 1 3 2 化学方法 絮凝法 就是采用无机或有机化学试剂 使水中的微小颗粒及胶体凝聚成大 絮凝体 加速沉淀的方法 中和法 用生石灰或石灰水和草酸 醋酸等弱酸改变 水体p h 的方法 络合法 使用e d t a 等络合剂清除水中过高的重金属离子的方法 氧化还原法 采用含氯消毒剂 臭氧 双氧水 高锰酸钾等可以与水中的有毒物 质 如氰离子 硫离子 发生氧化还原反应 降低或消除其毒性 同时还可以杀灭 水中病原菌的方法 以上这些方法虽然在养殖池塘水质净化过程中起到了重要的作用 但仍存在 着一些弊端 使用各种消毒剂在去除水体中有害生物的同时 也必然会影响养殖 池塘中水生动物及其它生物的正常生长 采用换水的方法换去的水中污染物也会 给其它生态环境带来污染 并且换去的水中若含有水生动物的致病菌 就大大地 加速了致病菌的传播 总之 这些方法均不能从根本上解决高密度养殖所造成的 养殖污染 因此 很多学者提出利用自然环境中的有益菌来净化养殖环境 这不 仅不会形成二次污染 而且可以最大限度地分解转化养殖水体中的剩余饵料 鱼 虾排泄物以及其它有毒有害物质 使水质保持良好状态 养殖生物处于健康水平 1 4 益生菌作为水质净化剂的研究进展 1 4 1 水产益生菌的概念和特征 1 水产益生菌的概念发展 随着对益生菌的深入研究 其概念屡次被修订 1 9 7 4 年 p a r k e r 首次明确 地把益生菌定义为能促进肠道菌群平衡的微生物和物质 而f u l l e r 1 3 1 9 8 9 妣k 为益生菌是 添加于饲料中 通过改善动物肠道微生物平衡而对其发挥有利影响 的微生物活体 但t a n n o c k 1 4 1 9 9 7 发现在许多情况下并不能证明益生菌可改 善肠道菌群平衡 故又把益生菌定义为有助于增进动物健康的活微生物饲料添加 剂 此类定义均适用于陆生动物和人类 对水生动物而言 机体与其周围的水环 境不断地进行相互作用 曾有研究表明 水环境中的细菌会影响水生动物消化道 的微生物组成 肠道中出现的微生物种类一般都来自水环境或饵料中能在动物消 化道内生存并繁殖的类群 1 5 较之于陆生系统 微生物在水环境中存活的机率 更高 并尽可能在宿主消化道 鳃 皮肤等上存活或自由生活 而陆生动物则仅 限于可提供水分的生态环蝌1 6 由于水生动物更多地接触环境中的病原微生物 而且水体中的病原微生物可达到很高的密度 1 7 1 可随动物摄食或饮水时进入动 物体内 因此 通过改善养殖水体中的微生物组成也可增强动物健康 在总结水 生益生菌应用的基础上 g r a m 等 1 9 9 9 将益生菌的定义扩展为 一种活的微生 物添加剂 通过改善动物的微生物平衡而对其产生有利的影响 事实上 在水生和陆生环境中 动物机体与微生物的相互作用无论在质上 还是在量上均不相同 水生动物种类通常在水中产下无菌的卵 且不再与亲代进 一步接触 从而使其周围的细菌能轻易在卵表面附着和繁殖 而且刚孵化的幼体 消化系统发育并不完全 免疫系统亦还不完善 其肠道 皮肤和鳃上也没有微生 物定植 由于水生幼体早期阶段的菌群主要取决他们最初接触的养殖水体中的微 生物 1 9 故水中细菌的性质尤为重要 2 0 因此 v e r s c h u e r e 等口1 2 0 0 0 又对益生 菌的概念作了修改 将其比较科学地定义为 能改善与动物相关的或其周围的微 生物群落 能提高饵料利用率 增强饵料营养价值 增强机体对疾病的反应 能 改善机体周边环境质量的一类对动物有益的活菌 并广为应用 在此概念基础 上 水生益生菌可包括预防病原扩散到养殖种类表面 消化道和养殖环境中的微 生物群 包括有益于消化道并确保饵料最佳利用的微生物 也包括提高水质或刺 激宿主免疫系统的微生物 2 水产益生菌的特征 虽然水生动物益生菌在很大程度上与陆生动物的益生菌有差异 但是作为 益生菌 它们也有一些共同的特征 这些特征是益生菌共有的特征 也是在研究 实践中鉴定益生菌的很好标准 f u l l e r t l 3 1 1 9 8 9 年提出 益生菌应该具有以下 特征 能为水产动物带来益处 如促进生长 抵抗病害等 应当是无毒无害的 在 我们不知道其确切作用剂量的条件下 必须在宿主体内外保持有活力的大量活 体 能在l 氐p h 值及有机酸存在等恶劣的肠道环境中存在并正常生活 能在储存 保藏条件下较长时间地保持稳定并维持活力 国内田允波等 2 2 1 1 9 9 9 也提出 了作为饲料用益生菌的菌种所应具有的特征 无病原性 无毒性 无毒副作用 不与病原微生物产生杂交种 体内外繁殖速度快 具有很强的竞争优势 能在低 p h 值的无机酸 有机酸及胆酸存在的情况下存活并定植在胃肠道内 能产生乳 酸 过氧化氢等肠道致病菌的抑制物 加工后存活率高 混入饲料后室温下稳定 性好 能促进动物的生长发育 1 4 2 益生菌作为水质净化剂在水产养殖中的应用 国外水产养殖发达国家在高密度集约化养殖中大都采用了微生物来净化养 殖环境 以达到养殖用水循环利用或降低排放废水中的有害物质的目的 如美国 a m 公司开发a l k e nc l e a r f l a 美菌方 在美国和其它一些欧美国家以及泰 国 菲律宾等国家都有许多成功的应用实例 2 3 泰国在对虾养殖中也普遍采用 微生物水质净化剂 以达到生态养殖的目的 我国在应用微生物制剂净化养殖水 体方面的研究起步较晚 但发展较为迅速 中国科学院水生生物研究所 黄海水 产研究所等单位先后研制开发了包括光合细菌 芽孢杆菌等在内的一系列微生物 修复剂产品 目前已有一些e m 有效微生物 被制成商业化产品 用于水产养殖 的净水及修复 如广东 西菲利 养水王 湖北 科利尔 益池保 净水菌 等 目前 已报道作为水质净化剂的益生菌按菌种特性来分主要包括光合细菌和 化能异养菌菌剂 用光合细菌净化养殖环境 国内外专家学者在这方面进行了许多有益的探索 和研究 邱宏端等 2 4 2 0 0 2 将耐盐红螺菌科光合细菌应用于淡水斑点叉尾鲴 的池塘养殖中 使用结果表明 氨氮下降率约为2 5 亚硝酸盐下降率约为7 0 左右 实验池鱼苗平均重量为6 6 9 较投苗时增重7 2 3 对照池鱼苗平均重量 6 o g 较投苗时增重5 6 6 光合细菌提高3 5 0 倍 亚硝化细菌提高3 倍 硝化 细菌提高4 5 倍 斑点叉尾鲴养殖池的主要异养细菌肠杆菌科细菌提高9 4 气 单胞菌属降低7 5 赵玲等 2 5 1 2 0 0 5 直接施光合细菌1 5 咖3 每周一次 1 0 0 d 后 两个实验池的平均增重分别为1 2 4 7 9 和11 8 7 9 高于相应对照池的9 7 8 9 和 9 7 o g 成活率分别为9 6 9 和9 7 2 高于相应对照组的9 9 和9 7 崔战利 等 2 6 2 0 0 4 在鱼池中施用光合细菌量为5 1 0 m l m 3 处理6 9 天的条件下 水 体溶解氧增 b n 3 9 1 有机物降低1 2 2 氨氮降1 氐3 6 1 水体的透明度升高 异养细菌的总数下降了5 0 林东年等 2 7 2 0 0 7 在罗非鱼的池塘养殖中投以光 合细菌后 水体p h 稳定 氨氮 亚硝酸盐 硝酸盐和有机物的含量降低 促进 水体n 的循环 由于芽孢杆菌同化吸收氨氮的能力强 速度快 2 8 1 在改善养殖水体生态环 境中的作用越来越受重视 胡菊香掣2 9 2 0 0 3 在养殖水体中投以芽孢杆菌后 能增加水体透明度 降解氨氮 降低化学耗氧量 冯俊荣等 3 0 2 0 0 5 在牙鲆 幼鱼池中施入芽孢杆菌后 能显著降低水体中的氨氮和有机物 f e il i u 等 3 u 2 0 0 4 用枯草芽孢杆菌处理对虾养殖废水后 有机物和氨氮的降解率分别为5 7 7 士5 5 和8 5 m a c e y 等 3 2 2 0 0 5 在鲍鱼养殖池中加入芽孢杆菌后 成活率和生长率均 有明显的提高 此外 芽孢杆菌往往是复合微生态制剂的首选菌株 李卓佳等 3 3 1 9 9 8 将以芽孢杆菌为主体的复合微生物投入主养罗非鱼的池塘 发现水质条件 明显改善 溶解氧增加 氨氮和亚硝酸盐浓度降低 优良单胞硅藻数量增加 养 殖水色优良 可促进罗非鱼的生长 薛恒平等 3 4 2 0 0 3 使用以芽孢杆菌 光合细 菌 蛭弧菌组成的复合菌剂按l g m 3 投入对虾池 结果试验池对虾病毒病发病时 间较对照池延迟1 0 d 产量增加4 0 阎斌伦等嘲 2 0 0 5 在中华绒螯蟹育苗中使 用 复合型活菌生物净水剂 结果水中氨氮含量比对照组降低3 9 4 4 亚硝酸氮 下降3 7 5 0 减少换水量8 5 减少用药量5 0 以上 综合以上应用和研究可知 在精养池塘等高密度养殖水体中施用益生菌 可 以提高水中溶氧和降低氨氮 亚硝酸盐和有机物的含量 并能改变水体中的菌群 结构 减少疾病发生 提高成活率和生长率 但由于不同微生物菌株的生长 繁 殖条件不同 不同的水质条件菌株能否发挥作用 值得进一步深入研究 1 4 3 益生菌作为水质净化剂的作用机理 1 降解有机质 有些微生物具有丰富的蛋白酶 脂肪酶 淀粉酶 脱氢酶 氧化酶等 这些 酶类能够将养殖池塘生态环境中的残饵 养殖动物及其它生物的粪便 死亡的生 物体分解为小分子的中间产物 最后分解成为二氧化碳和水及其它小分子的物 质 从而降低了化学耗氧量和生物耗氧量 增加水中溶氧 研究发现在添加芽孢 杆菌的水体水质检测中发现 革兰氏阳性芽孢菌在转化有机物为c 0 2 方面较革兰 氏阴性菌更有效 且益生阳性菌转化的c 0 2 还可促进浮游植物的生长 3 6 1 芽孢杆 菌 不动杆菌 专性厌氧的脱硫弧菌 假单孢菌 产碱杆菌 黄杆菌 无色杆菌 微球菌 动胶菌等有生物絮凝作用 它能互相粘连在一起 构成菌胶团 担负氧 化分解的任务 将有机物结合成絮状 使其沉淀 从而使水体得到净化 3 7 3 8 3 9 2 分解 转化有害物质 微生物可以通过n 的吸收同化作用转化有害物质 h a r t 等 4 叫 2 0 0 1 的研究表 明 微生物是水环境中重要的第二生产力 微生物不断吸收n 素包括n r h n 0 3 等进而合成氨基酸 蛋白质和其他含n 物质以供生长需要 这使微生物活体成为 巨大的动态n 库 光合细菌可以生长在以n h 4 为氮源的媒介上 n h 4 可结合到谷 氨酸合成酶 g s 谷合酶 g o g a t 和0 酮戊二酸 0 k g 上 尤其g s 对 n h 4 有较高的亲和力 底k m 如下式所示 n i h 谷氨酸 g s 一谷酰氨 g o g a t e t k g 一2 谷氨酸 从而起到转化氨氮的效果 微生物还可以通过硝化 和反硝化作用来转化有害物质 硝化细菌将水中氨氧化成亚硝酸盐 继而氧化成 为硝酸盐 降低水体氨和亚硝酸盐含量 4 1 删 对于一般的化能异养菌而言 也可 以发挥硝化细菌的功能 通过硝化和反硝化作用来降低水体中的氨氮和亚硝酸盐 的含量 删 从而达到改善水质的目的 3 稳定水体p h 值 有益微生物能促进水体中生态的平衡 并在代谢过程中能分解利用小分子有 机酸 对水体的p h 值有缓冲作用 避免t p h 值剧变而对鱼虾类的危害 增强了 鱼虾类的抗应激反应能力和忍耐力 1 4 4 水质净化剂的发展前景及趋势 微生物水质净化剂属于一种天然产品 它可改善养殖水体环境 保证水质良 性循环 更为重要的是在改善水质的同时 可以有效地减少抗生素 消毒剂等化 学药剂的使用 降低化学药物在水产动物体内的残留 减少对人类健康的危害 在人们对食品安全 环保意识日渐增强的今天 微生物水质净化剂具有无毒 无 害和无残留等优点 全面合理使用微生物水质净化剂已是水产养殖业健康 可持 续发展的必然趋势 虽然微生物水质净化剂的研究和应用存在一些问题 但是随着分子生物学深 入而广泛的应用 应用先进的技术方法 从细胞 核酸 激素等多个角度解决水 产动物微生物水质净化剂的这些问题 如 使用荧光 酶标记技术 对微生物水 质净化剂菌株作标记 探测菌株在水产动物机体内混合的微生物群落中的定位 定量分析 明确净水剂菌株在养殖水体内的作用机理 在加强相关基础研究的同 时 还要研究新的加工工艺来保障微生物水质净化剂的质量和大规模的生产 在 应用方面要研究科学的使用方法和添加剂量 同时研究针对不同水产动物 不同 养殖阶段的专用微生物水质净化剂 另外还应研究微生物制剂之间以及与化学益 生素 如寡糖类等 联合运用 以保证其发挥更好的效果 可以预见 微生物水质 净化剂在水产养殖生产中的应用前景将十分广阔 1 4 5 研究和应用中存在的问题 1 菌种的筛选 尽管许多益生菌制剂己用于水产养殖 但多数为陆生动物设计 其菌株并不 适合在水生系统中增殖 4 5 1 专用于水产养殖的益生菌种相当缺乏 目前已确认 可作为水生用的益生菌种只有乳酸杆菌 芽孢杆菌 酵母菌 假单胞菌 双歧杆 菌等少数菌种 m a e d a 等h 6 1 1 9 9 2 曾发现海水中的许多细菌可抑制鱼苗的生长 因此 在筛选益生菌时应注意菌株来源 着重考虑养殖水体或者淤泥中的内源菌 其次 在筛选菌种时 应该从经济方面和降解能力考虑 所选菌种要容易培 养 生产费用低 要具有彻底矿化污染物的能力 具有宽的底物范围 降解性能 稳定 在污染环境中有较强的生存和竞争能力 因此 有学者提出在选择益生菌 时应更注重那些具有营养竞争优势的菌群 4 7 再者 将益生菌应用于养殖生产时应对其进行长期监测以确保菌株不发生致 病突变 目前的水产益生菌主要源于肠杆菌科 弧菌科和假单胞菌属 其中包含 许多致病菌 如溶藻胶弧菌既可能是益生菌又可能是致病菌 只是菌株间的基因 型存在差异 4 引 p i z z u t o 等 4 9 1 1 9 9 5 认为哈维氏弧菌 v h a r v e y i q b 真正具有毒性基 因的菌株并不多 一些菌株表现为致病性是由于毒性基因转移造成的 另外 对 益生菌株的抗药性问题亦不容忽视 生产上已发现将抗药菌株作为益生菌的现 象 2 产品的质量 微生物制剂是一类活菌产品 产品中的活菌数量的高低是产品质量的最重要 的指标 微生态制剂的应用基础是微生态平衡 必须有足够数量的活菌才能达到 优势菌群建立的目的 但目前 微生物水质调节剂还没有统一的国家或行业标准 各类菌种的活菌数没有统一指标 再加上生产和加工工艺较为简单 贮运过程中 受外界条件的影响 造成活菌数不足 产品质量参差不齐 进而影响微生物水质 净化剂的应用效果 因此 应将提高单位微生物数量和筛选高效微生物结起来 3 应用技术 在使用剂量 使用浓度 使用时间 使用频率 使用方法及使用的注意事项 外界环境条件 等方面均未形成一套的科学的标准和方法 使微生物水质净化剂 的应用效果大打折扣 1 5 本研究的目的与意义 1 从养殖水体和淤泥中筛选出生存能力强 具有高效 稳定降解有机物 和氨氮的优良菌株 为开发高效的水质净化剂提供更多的备选菌 2 研究株株的特性 并优化菌株的培养条件 从成本的角度探讨菌株的 使用量 为水质净化类微生物产品的正确使用提供理论依据 3 将菌剂应用于水族缸小水体中 初步检测菌株的繁殖情况和净水效果 为开发高效的水质净化剂提供理论依据 2 实验材料 2 1 供试样品 本试验所用样品主要来源于 四川成都 眉山等地养殖区的底泥和水样 四 川农业大学养殖区的底泥 2 2 培养基 富集培养基 鲤鱼饵料2 0 9 研磨成细粉 0 0 5 不同的小写字母表示差异显著 p 0 0 5 由表6 可知 与对照组相比 s h 7 菌株的不同接种浓度在不同的培养时间 段对嗜水气单胞菌的抑制效果都显著 p o 0 5 在不同的培养时间段 随着 s h 7 菌株接种浓度的变化 其对嗜水气单胞菌的抑制效果是有区别的 在o 2 4 h 时 s h 7 菌株三个接种浓度组间的抑菌效果差异显著 p o 0 5 4 5 环境因素对菌株降解能力的影响 4 5 1p h 对菌株降解能力的影响 由图7 可知 当p h 为6 5 8 0 之间时 s h 7 菌株都能使其中的有机物和氨氮 得到较好的的降解 尤其是p h 为7 0 时 s h 一7 株菌的降解效果最佳 当p h 大于8 5 时 s h 7 菌株的降解能力下降最快 有机物 氨氮 摹 v 褂 琏 遴 6 577 5 8 8 59 p h 图7 p h 对菌株降解率的影响 f i g 7 e f f e c to fp ho nd e g r a d a t i o nr a t eo ft h es t a i n 4 5 2 温度对菌株降解能力的影响 由图8 可知 在2 0 3 5 的温度范围内 s h 7 菌株都能使其中的有机物和氨 加加o 氮得到较好的的降解 尤其是温度为3 0 c 时 s h 7 株菌的降解效果最佳 当温 度小于1 5 和大于3 5 c 时 s h 7 菌株的降解能力下降最快 有机物一氨氮 摹 v 糌 琏 逝 1 5z oz 53 0 54 0 温度 1 2 图8 温度对菌株降解能力的影响 f i g 8 e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nd e g r a d a t i o nr a t eo ft h es t a i n 4 5 3 装液量对菌株降解能力的影响 装液量的多少间直接说明培养基与氧气接触机会的多少 装液量越多 菌株 在生长过程中可利用的氧气越少 由图9 可知 随着装液量的增加 s h 7 菌株对 有机物和氨氮的降解能力呈下降趋势 特别是装液量为6 0 8 0 m l 时 其降解能 力下降最快 十有机物 氨氮 摹 v 1 i i 罄 遨 2 0 4 06 08 0 装液量 i n l 图9 装液量对菌株降解能力的影响 f i g 9e f f e c to f c u l t u r em e d i u mv o l u m eo nd e g r a d a t i o nr a t eo ft h es t a i n 4 6 菌株的液体发酵条件的优化 4 6 1 菌株的生长曲线 由图1 0 可知 0 4h 间s h 7 菌株处于生长迟缓期 镜检可见菌体小 在6 1 6h 间 菌株进入对数生长期 镜检可见菌体变大 在1 8 2 0h 菌株处于生长 伯 如 加加o 加 的蚰 加m 0 稳定期 镜检可见有芽孢大量形成 2 2 h 以后 细菌开始进入生长衰亡阶段 镜 检可见部分芽孢开始脱落 由于在生产中通常选用处于对数生长期的菌体作为种 子 此时的种子既保持有旺盛的增殖能力 又达到高浓度 以缩短发酵周期 因 此 选定细菌的最佳接种时间为1 2 h o o o 2 468 1 01 21 41 61 82 0z zz 4 时间 h 图l o 菌株的生长衄线 f i g 1 0 t h eg r o w t hc u r v eo f t h es t r a i n 4 6 2 碳源的优化 在培养基成分中 碳源是影响芽孢形成的主要因素 在基础培养基中分别添 加淀粉 葡萄糖 蔗糖和乳糖2 0 9 l 由图l1 可知 葡萄糖是最佳碳源 其芽孢 的形成数量最大 为1 5 9 1 0 8 c f u m l 3 善 詈 v 籁 跫 敞 淀粉葡萄糖蔗糖 乳糖 图l l 碳源对芽孢数的影响 f i g 1 1 e f f e c to f c a r b o ns o u r c eo nt h ev i a b l en u m b e ro f b a c i l l u s 不同浓度的葡萄糖对芽孢的形成有很大的影响 在基础培养基中分别添加葡 萄糖的量为0 2 o 5 1 o 1 5 2 0 2 5 3 o 和1 0 0 由图1 2 可知 随着葡萄糖浓度从0 2 逐步升高 芽孢形成数量呈增加的趋势 而葡萄糖浓度在 2 5 以上时 芽孢数量反呈下降的趋势 当葡萄糖浓度为2 5 时 芽孢的形成 o o 0 o 0 0 o o o 8 6 4 2 o 8 6 4 2 o 1 1 1 数量最大 为2 1 3 x 1 0 8 c f u m l o 2o 5 l 1 5 2z 531 0 葡萄糖不同的浓度 图1 2 不同浓度葡萄糖对芽孢数的影响 f i g 1 2 e f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s eo nt h ev i a b l en u m b e ro fb a c i l l u s 4 6 3 氮源的优化 培养基中不同的氮源也影响芽孢的形成 在基础培养基中分别添加蛋白胨 牛肉膏 豆饼粉和酵母膏3 0 9 l 由图1 3 可知 豆饼粉为最佳碳源 其芽孢的形 成数量最大 为4 4 x1 0 8 c f u m l 蛋白胨牛肉膏 豆饼粉 酵母青 图1 3 氮源对芽孢数的影响 f i g 1 3 e f f e c to fn i t r o g e ns o u r c eo ut h ev i a b l en u m b e ro fb a c i l l u s 培养基的其它条件和成分不变 将豆饼粉的浓度分别设为0 5 1 o 1 5 2 o 2 5 3 0 3 5 和1 0 o 由图1 4 可知 豆饼粉的最适添加浓度为2 o 此时的芽孢的形成数量相对较大 为8 2 x 1 0 8 c f u m l 沥 加 坫 m 5 o im f18 籁避羝 蛎蚰 衢加垢加0 o i善r 匠u乞一 籁震妆 o 51 522 533 5 豆饼粉不同的浓度 图1 4 不同浓度豆饼粉对芽孢数的影响 f i g 1 4 e f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fb e a nc a k eo nt h ev i a b l en u m b e ro fb a c i l l u s 4 6 4 初始p h 的优化 由于摇瓶发酵过程中p h 难以控制 因此只能控制培养基的初始p h 将培养 基的初始p h 分别调至7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 矛1 1 8 0 由图1 5 可知 p h i 7 2 时 芽孢的形成数量最大 为9 2 5 x 1 0 8 c f u m l l o o 9 0 3 8 0 董 7 0 己6 0 罢5 0 4 0 籁 3 0 怼 2 0 烬 1 0 0 77 27 47 67 88 初始p h 图1 5 初始p h 对芽孢数的影响 f i g 1 5 e f f e c to fp ho nt h ev i a b l en u m b e ro fb a c i l l u s 4 6 5 培养温度的优化 选取3 0 3 2 3 4 3 6 3 8 和4 0 c6 个温度作为摇床培养温度 由图1 6 可知 菌株的培养温度为3 4 c 时 芽孢的形成数量最大 为l1 2 x 1 0 8 c f u m l 2 5 加 如 趵加0 jm f1邑奄 x 籁津妆 3 墨 导 v 赧 耀 祗 3 03 23 43 63 84 0 温度 图1 6 温度对芽孢数的影响 f i g 1 6 e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nt h ev i a b l en u m b e ro fb a c i l l u s 4 6 6 正交设计法优化培养基的无机盐成分 按单因素确定的最优发酵条件 将菌液接种到按表2 安排的培养基中 摇床 培养后测定其芽孢菌数 试验结果见表7 芽孢数结果为4 次平均值 表7 正交设计试验测定结果 t a b 7r e s u l to fo r t h o g o n a lt e s t 根据表7 数据 采用s a s 软件进行方差分析 得出方差分析的总模型极显著 p o 0 1 x l x 2 x 3 x 44 个因素均非常显著 各水平下的均数分别为 x l 1 0 8 1 0 2 9 1 x 2 1 1 1 9 5 9 4 x 3 1 1 5 l o 3 8 4 x 4 7 1 1 0 3 1 2 7 因所测指标是芽孢菌的浓度 所测值越大越好 在所设的范围内 x 1 2 x 3 均取第1 水平 x 4 取第3 水平时 芽孢的形成数量最大 理论优化方案为 x li x 2 i x 3 i x 4 3 根据表7 数据 采用s a s 软件进行线性回归分析 得出回归方程 v 1 6 5 一1 8 x l 加 加 o 一1 6 1 x 2 3 1 x 3 5 6 7 x 4 回归方程极显著 p o 0 1 将理论优化方案代入方程 得出理论芽孢菌浓度为1 6 2 x 1 0 1 0 c f u m l 为检验理论优化结果的准确性 进行 了3 次验证试验 试验实测平均值为1 6 4 x 1 0 m c f u m l 而未优化的普通肉汤培养 基中芽孢菌浓度为1 5 2 x 1 0 9 c f u m l 优化后 活芽孢菌浓度提高了9 7 8 9 本试验芽孢菌液体发酵条件为 葡萄糖2 5 9 l 豆饼粉2 0 9 e l m g s 0 41 o g l c a c l 20 0 5 9 e l k 2 h p 0 42 0 9 l m n s 0 4 0 1 5 9 l 培养温度3 4 c 初始p h 7 2 在 2 0 0r m i n 摇床培养2 2h 4 7 发酵液使用量的确定 由表8 可知 在异养菌浓度为2 4 1 0 4 c f u m l 的养殖水体中 随着投菌浓度 的增加 其对有机物和氨氮的降解能力也升高