（作物遗传育种专业论文）山丹新麦草多倍体诱导研究.pdf

摘要 本试验以山丹新麦草为材料 进行了组织培养再生体系及多倍体诱导的研究 通 过研究和筛选新麦草离体成熟胚愈伤组织诱导培养 继代增殖和分化培养的最佳激素 配比 建立了从愈伤组织到再生小植株的再生体系 通过秋水仙素处理萌动种子 胚 芽 二倍体植株幼苗 成熟胚愈伤组织以及再生小植株的染色体加倍研究 探讨了不 同诱变材料的适宜处理浓度和时间 并获得了山丹新麦草多倍体植株 试验结果表明 n 成熟胚愈伤组织诱导的最佳激素配比是m s 2 4 d2 0m g i 出愈率为9 1 7 f 2 继代增殖培养的最佳激素配比是m s t 2 4 一d1 5m g l k to 5m g l 愈伤组 织平均日增重1 4 3 3 分化培养的最佳激素配比是m s 十2 4 一d2 0m g l 十n a a1 0m g l 其绿色 芽点率和出苗率分别为7 8 5 和4 9 5 白化苗率为2 5 4 不同材料经秋水仙素诱变处理后 其染色体的加倍效果明显不同 其中 以 处理二倍体植株幼苗效果最好 加倍率最高 达6 2 5 其次为处理胚芽和愈伤组织 加倍率均为5 0 处理萌动种子加倍率最低 为1 4 3 5 采用各种方法诱变后染色体加倍的当代植株均为二倍体 2 n 2 x 1 4 和四倍 体 2 n 4 x 2 8 的混倍体 个别加倍植株中还鉴定出三倍体 2 n 3 x 2 1 细胞 6 加倍植株叶明显变长 变宽 叶色浓绿 其苗高 叶长和叶宽分别为对照植 株的1 2 6 4 7 1 2 3 8 0 和1 0 2 9 7 关键词 山丹新麦草 秋水仙素 染色体加倍 s t u d i e so nt h ep o l y p l o i di n d u c t i o no f p s a t h y r o s t a c h y s p e r e n n i sk e n g c v s h a n d a n a b s t r a c t t h ep s a t h y r o s t a c h y ap e r e n n i sk e n g c v s h a n d a nw e r eu s e df o rt h e s t u d yo ft i s s u e c u l t u r er e g e n e r a t i o ns y s t e ma n dp o l y p l o i di n d u c t i o n b ys t u d ya n df i l t r a t i o nt h eb e s t h o r m o n ea s s o r t e d p r o p o r t i o n o fc a l l ii n d u c t i o n c u l t u r e m u l t i p l i c a t i o n c u l t u r ea n d d i f f e r e n t i a t i o nc u l t u r eo fm a t u r ee m b r y o w h i c he s t a b l i s h e dr e g e n e r a t i o ns y s t e mf r o mc a l l u s t or e g e n e r a t i o np l a n t l e t s s t u d i e so nc h r o m o s o m ed o u b l i n gb yc o l c h i c i n e sl i q u i dt r e a t i n g g e r m i n a t i n gs e e d s e m b r o y d i p l o i ds e e d l i n g s c a l l ia n dr e g e n e r a t i o np l a n t l e t s d i s c u s s i n gt h e s u i t a b l et r e a t m e n tc o n c e n t i o na n dt i m eo fd i f f e r e n ti n d u c t i o nm a t e r i a l t h ep o l y p l o i dp l a n t s o f p s a t h y r o s t a c h y ap e r e n n i sk e n g e v s h a n d a nw e r eo b t a i n e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g 1 t h eo p t i m a lh o r m o n ea s s o r t e dp r o p o r t i o nf o ri n d u c i n gm a t u r ee m b r y oc a l l u sw a s m s 2 4 d2 0m g l c u l t u r ea n dt h eg e r m i n a t i o nr a t ew a s9 1 7 2 t h eo p t i m a lh o r m o n ea s s o r t e dp r o p o r t i o nf o rm u l t i p l i c a t i o nc u l t u r ew a sm s 2 4 一d1 5m g l k t0 5m g l t h ed a i l ya v e r a g em u l t i p l i c a t i o nr a t ew a s1 4 3 3 t h eo p t i m a lh o r m o n ea s s o r t e dp r o p o r t i o nf o rd i f f e r e n t i a t i o nc u l t u r ew a sm s 十 2 4 一d2 0n q i g l 十n a a1 0m l t h eg r e e nb u dr a t ew a s7 8 5 a n ds e e d l i n gr a t ew a s 4 9 5 w h i l et h ea l b i n i s mr a t ew a s o n l y25 4 t h ed o u b l i n ge f f e c tw a sd i f f e r e n to b v i o u s l yb yc h r o m o s o m et r e a t i n gw i t ht h e d i f f e r e n tm a t e r i a l s t h ed o u b l i n ge f f e c tw a sb e s ta n dt h et h ei n d u c t i o nf r e q u e n c yv a sh i g h e s t 6 2 5 b yt r e a t i n gd i p l o i ds e e d l i n g t h ei n d u c t i o nf r e q u e n c yv a s5 0 o b yt r e a t i n ge m b r o y a n dc a l l u s w h i l et h ei n d u c t i o nf r e q u e n c yv a sl o w e s t1 4 3 b yt r e a t i n gg e r m i n a t i n gs e e d s 5 a l lp l a n t sw i t hd o u b l e dc h o r o m o s o m en u m b e rw e r em i x o p l o i d si n c l u d i n gd i p l o i d s 2 n 2 2 x 1 4 a n dt e t r a p l o i d s 2 n 4 x 2 8 t h e r ea r ec h o r o m o s o m eo f 2 n 3 x 2 1i n i n d i v i d u a ld o u b l e dp l a n t s 6 t h el e a v e so ft h ed o u b l i n gp l a n t sb e c a m el o m g e ra n dw i d e ro b v i o u s l y a n dt h e y w e r e1 2 3 8 0 a n d1 0 2 9 7 o f t h ec o n t r o l t h ep l a n t sh e i g h tw a s1 2 6 4 7 o f t h ec o n t r o l r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s p s a t h y r o s t a c h y ap e r e n n i sk e n g c v s h a n d a n c o l c h i c i n e c h o r o m o s o m e d o u b l i n g d ir e c t e db y p r o f h o uj i a n h u a a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e z h a n gx iu ii c r o p g e n e t i c b r e e d i n g c o l l e g eo f a g e r i c u l t u r e i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y h u h h o t0 1 0 0 18 c h i n a 缩略词表 c o l c o i c h i c i n e 6 一b a 6 一b e n z y l a d e n i e 2 4 d 2 4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d n a a n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d k t k i n e t i n m s m u r a s h i g ea n ds k o o g 1 9 6 2 m e d i u m 秋水仙素 6 一苄氨基嘌呤 2 4 一二氯笨氧乙酸 萘乙酸 激动素 m s 培养基 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 人工诱导多倍体在育种中的研究进展 多倍体生物指的是细胞内含有三套或三套以上染色体组的生物 1 9 1 6 年w i n k e r 在研究s o l a n u mn i g u m 嫁接时得到了来自愈伤组织的四倍体植物 而首先引入了多倍 体这一概念 多倍体在植物中非常普遍 大约一半以上的被子植物 三分之二的禾本 科植物都是多倍体 小麦 烟草 油菜 棉花等都是自然形成的多倍体 因为多倍体 在植物中的普遍存在 所以多倍体常被认为是一个高度动态的过程并在植物多样化过 程中起着重要作用 1 9 2 6 年日本学者k i h a r a 和o h o 涮在他们的经典论文中首先将多倍体进行分类 即 同源多倍体和异源多倍体两类 并提出同源多倍体就是二倍体染色体组加倍 异源多 倍体就是两个不同的染色体组加倍而来 现在看来 这种说法不太确切 因为大多数 自然产生的多倍体介于他们所说的同源多倍体和异源多倍体之间 现在通常认为同源 多倍体就是指增加的染色体组来自同一物种 如桑 葡萄等 异源多倍体就是指增加 的染色体组来自不同物种 如小麦 烟草 菊花 棉花 郁金香等 多倍体育种是采用人工诱导方法获得多倍体植株 并利用其变异选育新品种的方 法 它是一种有效的育种途径 是改良品质 获得优质高产新品种的重要手段之一 人工诱导多倍体的研究开始于2 0 世纪初 当时采用的方法主要是物理方法 但其诱变 率较低 1 9 3 7 年b l a c k e s l e e 和a v e r y 利用秋水仙素诱导蔓陀罗四倍体获得成功 从此 人工诱导多倍体进入了一个崭新的时代 半个多世纪以来 育种学家们对人工诱导多 倍体进行了广泛的研究 并取得了显著的成效 目前 世界各国育种工作者采用各种 加倍方法获得了1 0 0 0 余种多倍体植物 国外多倍体育种在蔬菜 水果 花卉等凸 1 领 域取得了显著的成绩 我国对多倍体植物育种及研究报道主要有甜菜 燕麦 水稻 甘蔗 莲 杨树 小白菜 高梁 葡萄 玉米 普通小麦 黑麦草 蒙古冰草 荷花 君子兰等4 0 余种植物n 蚰 1 1 1 人工诱导多倍体的方法 1 1 1 1 物理方法 高温 低温 离心 超声波 射线照射等都可以诱导多倍体产生 秦金山等 将 枸杞 l y c i u mb a r b a r u m 未授粉的子房置于o 一4 低温下4 8 h 后培养 得到了6 株四倍 体植株 1 1 株非整倍体植株 张新忠等 将桃 p r u n e sp e r s z 李 p r u n e sc e r a s i f e r a 的花枝在减数分裂前期i 进行3 2 1 2 h 热激处理 获得了约2 0 的2 n 花粉 比对照 1 高出1 9 倍 在中粒种咖啡 c o f f e ac a n e p h o r a 花粉母细胞减数分裂时期 应用骤 变低温 8 1 0 直接处理花器官 可获得大量二倍性花粉粒n 虬 此外 变温处理 反 昼夜生长 干旱处理等也有诱导产生2 n 配子的报道 2 山丹新麦草多倍体诱导研究 1 1 1 2 切伤 摘心或嫁接法 植物组织被切伤或嫁接后 往往在切口处产生愈伤组织 某些愈伤组织细胞染色 体能自然加倍 因此在愈合处产生的不定芽因染色体加倍而发育成多倍体枝条 例如 番茄 l y c o p e r s i c u me s c u e n t u m 用切伤的方法使单倍体变成二倍体的成功率达到3 2 二倍体变成四倍体的成功率达到3 6 c 用反复摘心法和切伤作用一样 也可以 产生多倍体 在茄科植物中常见 如把茄属植物的梢端切断 再除去长出的侧芽 从 切断部愈伤组织长出的不定芽发育成的枝条 有1 0 为四倍体汹 用种间和属间植株 进行嫁接 在接口愈合的地方常常产生多倍体 例如用番茄 l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u m 嫁接马铃薯 s o l a n u mt u b e r o s u m 往往会产生多倍体植株 1 1 1 3 化学方法 化学方法诱导产生多倍体植物是目前广泛应用的最有效方法 具有操作简便 诱 导作用专一 诱变谱广等特点 据报道 用化学诱变剂处理植物种子 幼苗和无性繁 殖器官等都获得了多倍体植株 常用的化学诱变剂有秋水仙素 水合三氯乙醛 富民 隆 引哚乙酸 队a 氧化亚氮 n 2 0 等 近年来 还发现几种除草剂 a p m t r i f l u r a l i n 和o r y z a l i n 也具有使染色体加倍的功能 其中秋水仙素是目前处理效果最佳 应用 最广泛的化学诱变剂 秋水仙素的作用在于抑制细胞分裂时纺锤体形成 使每个染色 体复制的两个姊妹染色单体不能向两极移动而留在一个细胞里 这样细胞染色体加倍 了 而同时对染色体结构无显著影响n 秋水仙素只能对正在分裂的细胞产生作用 目前 利用秋水仙素加倍植物细胞染色体的方法主要有 1 活体条件下的处理诱导传 统的染色体加倍方法常常选用萌动或萌发的种子 幼苗 正在生长的嫩梢 芽及处于 减数分裂的花蕾为处理材料 用一定浓度的秋水仙素水溶液或乳剂对材料进行浸渍 涂抹 滴液 注射等方法处理诱导 这些方法在国内外已广泛应用 并且在多种植物 上均有成功事例 余凤英等旧应用1 浓度的秋水仙素滴液法直接处理咖啡 c o f f e a c a n e p h o r a 花蕾获得了7 2 3 9 2 0 的二倍性花粉 苏超等m 在桑树 a l o r u sl 初蕾 期 用秋水仙素诱导性配子二倍化后 得到了三倍体苗木 发生率为1 5 5 3 但研 究发现 活体条件下诱导染色体加倍 受环境干扰大 易产生嵌合体 并常常发生回 复突变 2 离体条件下的试管诱导随着组织培养技术的发展 很多物种可以通过组 织培养再生植株 使秋水仙素在离体条件下诱导单个细胞染色体加倍成为可能 即以 单个细胞或少数细胞为诱变材料 再由诱导加倍的细胞分化成植株 离体组织细胞染 色体加倍方法容易控制试验条件和重复试验结果 提高了工作效率 减少或避免了传 统处理产生嵌合体的干扰 更容易获得同质多倍体 如周朴华等哺1 用组织培养方法诱 导出黄花菜的愈伤组织 再用秋水仙素进行处理 郑思乡等 用芦笋试管苗进行多倍 体诱导亦取得了很好的效果 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 1 1 1 4 花粉检出法 花粉粒直径大小与染色体倍性之间存在着极显著的相关性 这已在多种植物中得 到证实m 正常二倍体植株产生的未减数2 n 花粉比己减数的1 n 花粉粒大 可在显微 镜下挑选出来 给正常二倍体植株授粉 得到三倍体 例如 在二倍体桃 尸 姗u s p e r s i c a 2 n 2 x 1 6 的大量花粉中挑选出1 2 0 2 个大花粉粒 再给二倍体桃树授粉 得到7 株同源三倍体 2 n 3 x 2 4 杨树上 将花粉用4 0 u m 的筛子过筛后 大花粉粒 的纯度从4 9 提高到4 0 5 0 以上 用大花粉授粉得到三倍体轻 1 1 1 5 体细胞杂交法 用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞 得到大量无壁的原生质体 通过化学或物理 学方法诱导植物原生质体相互融合 成为异核体 异核体内的细胞核进一步融合为共 核体 经再生细胞壁成为杂种细胞 杂种细胞经培养产生愈伤组织 再诱导分化成为 杂种植株 通过这种方法多数得到异源多倍体植株 邓秀新等乜 利用p e g 聚乙二醇 诱导四倍体平户文旦柚原生质体与二倍体伏令夏甜橙胚性悬浮细胞系的原生质体融 合 发现1 3 1 再生的胚状体为三倍体 刘继红等 采用电融合方法诱导二倍体 2 n 2 x 1 8 澳洲指橘 e i c r o c i t r u sp a p u a n as w i n g l e 悬浮系原生质体与二倍体 2 n 2 x 1 8 槿桔 打u sr e t i c u l a t ab l a n c o 叶肉原生质体融合 得到了再生植株 染色体检查表明再生植株为四倍体 2 n 4 x 3 6 1 1 1 6 胚乳培养法 被子植物的胚乳是精子和两个极核融合的产物 大多数为三倍体细胞 植物的胚 乳组织细胞也具有一般植物细胞的全能性h 根据这一原理 将植物成熟或未成熟胚 乳组织的细胞分离出来 在培养基上培养 可得到三倍体植物m 石荫坪等m 用中国枣 的长红 圆铃 金丝小枣等品种的胚乳培养首次育成枣三倍体完整植株 桂耀林等 和黄贞光等n 町利用胚乳培养分别获得了猕猴桃三倍体植株 1 1 2 多倍体的特征特性 1 1 2 1 巨大性 巨大性 是多倍体最为显著的外部形态特征 早在3 0 年代 国外己报道了同源 四倍体番茄的根 茎 叶 气孔保卫细胞 以及花器 果实 种子都较二倍体大 四 倍体辣椒表现为植株高大 叶片 花冠 花蕾明显大于原品种 果实短而粗 子粒较 大b 刘惠吉 1 9 9 4 在南农矮脚黄四倍体不结球白菜新品种选育过程中也得出相同的 结论m 1 长期以来 人们把叶片 气孑l 等形态方面所表现出的巨大性作为鉴定多倍体植株 4 山丹新麦草多倍体诱导研究 的辅助 间接 方法 多数试验指出 四倍体细胞所含叶绿体数量较二倍体多啪 多倍 体的气孔保卫细胞直径及叶绿体数量有随倍数性提高而增加的趋势 而单位面积内气 孔的数目 却随倍性增加而递减 1 1 2 2 产量提高 品质改善 多倍体常表现新陈代谢旺盛 酶活性提高 合成能力提高 品质好 四倍体水稻 千粒重增加4 0 5 0 蛋白质含量和氨基酸总量明显提高 直链淀粉含量下降 营 养品质变得更好汹 同源四倍体苦荞新品系 4 x 的细胞和组织器官比原种 2 x 明显增 大 新品系 4 x 的产量和品质均超过原种 2 x 新品系 4 x 富含蛋白质 氨基酸 维 生素和多种矿质营养元素忡1 瑞典育成的菠菜四倍体新品种比二倍体产量提高3 4 且干物质含量提高5 1 四倍体辣椒v c 含量比二倍体增加1 5 7 0 干物质重和 粗蛋白的含量亦提高 四倍体漪菜氨基酸含量比二倍体高出9 3 5 叶绿素含量高 1 2 2 倍 且适应性强 抗逆性好 张建军 1 9 9 8 m 丹参多倍体与二倍体对照相比 药材 根 质量有较大幅度提高 丹参酮含量明显高于对照阳1 据c h icy 1 9 6 4 等报道 四倍体苎麻产量超过二倍体苎麻2 3 10 4 而纤维d 值大多低于二倍体 1 1 2 3 抗性增加 人工诱变的多倍体对不良环境有更好的适应性 其抗病性 抗逆性显著增强 容 易适应改变了的环境条件 四倍体水稻植株高度降低 茎杆粗壮 因而比较抗倒伏m 日本四倍体萝b 新品种 鱼雷一四 对根肿病的抗性较强 三倍体甜菜亦表现出较强 的耐丛根病性 刘惠吉等 的研究结果表明多倍体白菜具有更好的耐热和耐寒性 1 1 2 4 育性下降 人工诱变的多倍体育性较二倍体低 表现为花粉生活力下降 结实率低和种子发 育不良等方面 究其原因主要是四倍体材料在细胞分裂时染色体不均衡分配 四分体 联会不分开 从而导致配子不育或育性降低 进而影响到受精结实等问题 邓秀新皓习 等发现 四倍体柑桔的花粉活性仅为原二倍体的5 8 祁碧寂 等研究发现 四倍体 葡萄在减数分裂后期i 出现落后染色体的花粉母细胞数目和末期多分孢子出现的频率 远远大于二倍体葡萄 而二者与坐果率有显著的负相关性 因此造成了多倍体葡萄育 性较低的结果 1 1 2 5 同工酶变化 同工酶技术己在农作物遗传育种中普遍应用 同源四倍体苦荞新品系 4 x 的种子 蛋白质和叶片过氧化物酶同工酶的电泳图谱与原二倍体种有差异 王鸿鹤 1 9 9 9 等 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 对重瓣大岩桐过氧化物酶同工酶分析结果表明 多倍体植株的同工酶酶谱与二倍体有 很大差异 在四倍体的酶谱中观察到了两条新谱带睛4 1 有研究者认为 同工酶分析也 可作为多倍体间接鉴定的手段 1 1 2 6 细胞水平变化 在细胞水平 多倍体的花粉粒大 萌发孔数目多 花粉形状变化明显 这在枇杷 余 小玲 1 9 8 9 和高粱 t s v e t o 1 9 9 5 电有充分的体现 杨瑞芳等 1 9 9 8 研究莲多倍体时 还发现 莲花粉母细胞在减数分裂过程中 有环状染色体 落后染色体 减数分裂不 同步及双核仁等现象发生抽 1 1 2 7 基因水平变化 随着分子生物学技术的发展 人们开始从分子水平入手研究多倍体 b u c k g i b b s k a w a s a k i 等 1 9 9 1 用r tp c r r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r 方法在r n a 水平上研究 多 倍体复基因及基因家族的表达 王卓伟等 5 1 2 0 0 2 利用a f l p 分子标记技术从d n a 分子水平探讨二倍体桑 2 n 2 x 2 8 与秋水仙素诱变得到的同源四倍体桑 2 n 4 x 5 6 在遗传结构上的差异 研究结果表明 利用秋水仙素处理2 x 桑进行诱变加倍时 其结 果不仅是染色体数目加倍 同时d n a 分子序列结构也发生了一定程度改变 导致某 些材料二倍体与同源四倍体间存在较大的d n a 多态性和遗传距离 1 1 3 多倍体的鉴定 1 1 3 1 形态学鉴定 多倍体植株在外部形态及生长势上与二倍体有较大的差别 利用多倍体植株的外 部形态特征 如茎变粗 节间变短 分枝少 叶色深绿 叶片变宽变厚 叶表面粗糙 不平 花器增大 结实率下降等 可以初步鉴定倍性 大量的研究表明 形态学观察 和细胞学鉴定结果有较好的一致性 李立志等 根据黄皮西瓜处理植株的器官形态变 异 凭经验进行感官直接判断四倍体 准确率为9 1 3 1 1 3 2 生理生化鉴定 研究表明 一些生理生化指标可用于倍性鉴定 如植物的渗透压 呼吸作用 同 化作用 含糖量 v c 含量及矿物质含量等 但也有些研究指出 从生理生化方面鉴定 倍性并不可靠 1 1 3 3 气子l 花粉粒大小及保卫细胞叶绿体数目鉴定 气孔 保卫细胞及其内叶绿体均是由组织发生层的l 层衍生而来 可作为鉴定l 6 山丹新麦草多倍体诱导研究 层分生组织的倍性标志 李斌 石荫坪m 以苹果和梨的二倍体和多倍体为试材 比较 了气孔保卫细胞内叶绿体数目 气孔大小和气孔密度与倍性的关系 并分析各个性状 用于倍性鉴定的可靠性 结果表明 叶绿体数目和气孔长度鉴定倍性的可靠性较高 花粉粒是由组织发生层的l 层衍生而来 其大小与倍性密切相关 四倍体的花 粉粒一般l l 倍体大 杨晓红 对苹果属植物的花粉粒进行观察 发现四倍体的花粉 粒比二倍体大2 0 3 0 同时 多倍体花粉粒大小不均匀 还有小部分为畸形花粉粒 如葡萄四倍体脚 1 1 3 4 细胞学鉴定 1 花粉母细胞大小及减数分裂情况 在减数分裂的各个时期 多倍体的小孢子母细胞均显著大于二倍体的小孢子母细 胞 魏文娜呻 对巨峰葡萄花粉母细胞的减数分裂行为观察发现 部分花粉母细胞在减 数分裂期染色体落后或领先 同时还产生一些多分体 各小孢子数目不等 大小不一 致等异常现象 石荫坪 在研究苹果 梨三倍体和郑思乡等 1 研究苎麻多倍体时发现有 类似的现象 多倍体花粉母细胞在减数分裂中的这种异常行为 可作为鉴定l 层是否 变异的标志 2 染色体计数法 染色体计数法是确定倍性最基本和最精确的方法 目前常采用常规压片法和去壁 低渗法进行染色体标本制备 去壁低渗法有利于观察染色体数目较多的物种 在梨哺 猕猴桃泓 苹果属汹1 李属和杏属m 都应用过 常用的材料有根尖 茎尖 也有人采用 卷须或幼叶 植物不定根为l 层衍生 根据根尖染色体数可判定l 川层的倍性 3 石蜡切片法鉴定 采用梢端的石蜡切片 可以同时明确三个组织发生层的变异性 是芽变和诱变多 倍体早期鉴定的简便方法 三层细胞大小之间的差异性 是一种快速测定变异株是嵌 合体或同质多倍体的有效方法 1 1 3 5 分子生物学水平的鉴定 1 流式细胞分析法 该方法是通过流式细胞分析仪对大量处于分裂间期的d n a 含量进行检测 然后 经仪器附设计算机自动统计分析 最后绘制出d n a 含量 倍性 的分布曲线图 目前 已在柑橘 猕猴桃旧 西瓜旧 苹果m 草莓m 等植物上采用该方法进行倍性鉴定 该方法特别适合于样品较多的倍性检测分析 但这种仪器十分昂贵 目前还不能广泛 使用 2 r a p d 标记技术 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 该技术具有快速 简便 高效等特点 现已广泛用于植物遗传育种研究方面 k u n i a k s u g a w a r a m l 曾用此法鉴定了柑桔的嵌合体情况 1 1 3 6 其他方法 郭启高p m 设计的增殖系数法 高温胁迫法 低温胁迫法 是快速鉴定西瓜试管苗 四倍体的方法 可以节省大量时间和人力 李立志等 利用杂交鉴定法判断西瓜变异 株的倍性 1 1 4 多倍体的保持 1 1 4 1 利用无性繁殖保持多倍体 植物界特别是园艺植物中 许多物种是依靠营养器官进行无性繁殖的 这类植物 一经形成多倍体 也是通过无性繁殖的方式进行保持 并通过自然选择和人工选择 使优良的多倍体保存下来 如一些球根及宿根 花卉 果树 如三倍体香蕉 以及一些 依靠无性繁殖的蔬菜作物 如马铃薯 芋芳等 1 1 4 2 利用有性繁殖保持多倍体 人工诱变的多倍体一般具有育性下降甚至不育的特点 因而多倍体的有性繁殖具 有其特殊的方式 通常是通过品种间杂交提高多倍体的育性或通过蕾期授粉的方法提 高多倍体的育性 张纪增和赵培德 1 9 7 9 如四倍体黑麦品种间杂交可以显著提高结 实率 萝卜 甘蓝 八倍体的大丽菊 异源四倍体的秋园报春等都是经过有性繁殖保 持的 1 1 4 3 利用组织培养繁殖保持多倍体 许多结实率低又不能在自然条件下进行无性繁殖的种子植物 不易将植株或品种 保存下来 可以利用组织培养的方法将这些多倍体保持下来 目前已在甘蓝 花椰菜 白菜 黄山茶等作物上采用组织培养繁殖保存了一些品种或株系 1 2 多倍体诱导在植物育种中的应用 多倍体植物在形态特征 生理生化特性及产量 品质等方面都有所变化 其中有 一些优良特性是二倍体所没有的 因而被广泛应用于植物育种工作中 目前 育种学 家们把诱导的多倍体主要应用于 其一是增加一个种的染色体数目即诱导同源多倍体 人工诱发一些植物产生的同源多倍体 由于染色体加倍后的剂量效应 具有很多优良 性状 例如同源四倍体黑麦 其产量 籽粒 蛋白质含量 抗病 抗旱性均优于二倍 体黑麦品种 红三叶 杂三叶等豆科饲料作物 枝多叶嫩 青草产量高 第二年再生 8 山丹新麦草多倍体诱导研究 后 生长迅速 其二是增加种间杂种的染色体数目即诱导异源多倍体 利用远缘杂种 染色体加倍后产生的异源多倍体能够克服远缘杂种的不育性 提高远缘杂种的结实率 远缘杂交结合诱发多倍体 可以把不同种 属间的有益性状综合在一起 培育出优良 的作物和牧草新品系或品种 如我国鲍文奎等选育的八倍体小黑麦 从b b d d r r 由于 具有黑麦抗寒 抗旱 抗病 耐瘠薄 耐盐碱等优点 又具有小麦丰产优质的特点而 受到欢迎 其三是用作不同倍数性间或种间的遗传桥梁 导入野生种的遗传物质 给 栽培品种添加某些宝贵特性 如抗病性 抗倒伏性及增强抗旱性等 如用普通小麦和 节节麦杂交时 正反交均不成功 只有将节节麦加倍成同源四倍体后 杂交才能成功 但是由于生物体内遗传物质与其他物质之间在长期进化过程中形成了一定的平衡关 系 每一物种都有一个最适宜的染色体倍数 其数目并非越多越好 同时由于染色体 加倍会引起细胞体积增大和育性降低 有很多的多倍体育种未能达到预期的目的 另 外经人工诱导成功的多倍体 一般说来 还不能直接运用于生产 只可作为育种工作 的原始材料 因此 在确定诱导多倍体对象时 应该选择染色体数目少 以收获营养 体为主 异花授粉 多年生习性和营养繁殖 减少植物对种子生产的依赖性 的植物 以保证诱导多倍体的成功n 1 3 牧草多倍体育种研究概况 多倍体牧草一般生长繁茂 根茎叶比二倍体大 抗旱 抗寒力强 其主要缺点是 结实率低 这对以收获种子为目的的作物是致命的弱点 而对于以营养体为利用对象 的牧草与饲料作物则是一个提高产草量和质量的有效育种方法m 3 牧草多倍体育种已有许多成功实例 如小麦和黑麦杂交 然后将杂种用秋水仙素 处理 育成了产量高 抗性强的异源八倍体小黑麦n u 王桂花用秋水仙素处理巨大赖 草萌动种子获得多倍体植株m 上海农学院以美国俄勒冈多花黑麦草和2 8 号多花黑麦 草为原始材料 通过辐射诱变 在重盐圃中采用群体改良方法育成了上农四倍体多花 黑麦草 这种黑麦草具有植株高大 茎秆粗壮 叶片宽厚 叶色深绿 叶量大 品质 优良 适口性好 鲜草产量高等优点t t 在多年生牧草的雀麦属 b r o m u s l 冰草 属 a g r o p y r o n6 a e r t n 披碱草属 e i y m u sl 内通过种间杂交及染色体加倍已经产 生了一些人工双二倍体汹 t l a w r e n c e 等 1 9 9 0 利用秋水仙素处理二倍体新麦草萌 动种子 获得了四倍体新麦草 2 n 4 x 2 8 并被注册为栽培品种 t e t r a c a n t e t r a c a n 与二倍体新麦草栽培品种相比 具有种子大 穗大 叶宽等特征c a 但国内有关新麦 草多倍体育种尚未见报道 1 4 本研究的目的和意义 新麦草属 p s a t h y r o s t a c h y sn e v s k i 是禾本科 g r a m i n e a e 小麦族 t r i t i c e a e 中较小 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 的一个属 约1 0 种m 主要分布于欧亚地区的草原及半荒漠地区 为多年生异花授粉 植物 据遗传学家d e w e y 确认 新麦草 p s at h y r o st a c h y sj u n c e a 是小麦族中的二 倍体属 其染色体数2 n 1 4 染色体组为n n 山丹新麦草 p s a t h y r o s t a c h y s p e r e n n i sk e n g c v s h a n d a n 是中国农业大学草地 研究所于19 7 8 年从甘肃省山丹军马场天然草地采集野生种子 经在河北省承德地区围 场 丰宁县以及北京市等地区作适应性 产量 品质等项试验选育而成 1 9 9 4 年1 0 月通过全国牧草品种审定委员会审定 登记为野生栽培品种 具有抗寒 抗旱 耐牧 长寿命 返青早 分孽多 生长期长 根系庞大 耐盐碱等许多优点m 但叶量少 种子小 播种立苗困难是其不足之处 本研究采用秋水仙素对山丹新麦草进行多倍体诱导 试图提高其茎叶产量 增大 种子体积 改善其品质和适口性 增强抗逆性 扩大山丹新麦草的种植范围 丰富新 麦草的种质资源 为新麦草的育种提供新材料 2 材料与方法 2 1 试验材料 供试材料为山丹新麦草 腑f h y r o s t a c h y sp e r e n n i sk e n g c v s h a n d a n 2 n 1 4 n n 来源于中国农业大学 2 2 试验方法 2 2 1 成熟胚愈伤组织诱导及其分化 2 2 1 1成熟胚愈伤组织诱导 选取饱满的成熟种子 用自来水冲洗3 0 m i n 后用7 0 的酒精消毒5 m i n 无菌水 冲洗一次 再放入o 1 升汞溶液中消毒3 m i n 在超净工作台用无菌水冲洗5 次 最 后在灭菌的滤纸上剥取种子 取出胚 接种在诱导培养基上培养 盾片向上 培养室 温度为 2 8 2 黑暗条件下进行 m s 为基本培养基 蔗糖 3 0 9 l 琼脂粉 7 9 l 附加不同浓度的2 4 一d k t 6 b a p h 为5 8 接种后每天观察并记录外植体 开始膨大的时间 开始出愈的时间以及愈伤组织的生长情况 4 0 天后停止观察 统计 愈伤组织的出愈率和褐化率 通过观察比较愈伤组织的生长情况 选择出最佳诱导培 养基激素配比 2 2 1 2 愈伤组织继代 将成熟胚诱导出的生长旺盛的愈伤组织在无菌超净工作台上切割成3 m mx5 m m 的小切块 然后接种在添加不同激素种类和浓度的继代培养基上培养 每天1 2 h 小时 光照 光照强度为2 0 0 0 3 0 0 0 1 x 观察愈伤组织的生长情况 3 5 天后结束统计 从而 1o 山丹新麦草多倍体诱导研究 选择出最佳的继代培养基激素配比 2 2 1 3 愈伤组织分化 将每个继代组合的生长旺盛的愈伤组织分别接种于添加不同激素的各个分化组合 中进行培养 培养3 5 天 每天2 4 h 光照 光照强度为2 0 0 0 3 0 0 0 l x 比较不同继代组 合的愈伤组织在不同分化培养基上的绿色芽点率 成苗率和白化苗率 从而选择出最 佳的分化培养基激素配比 2 2 1 4 炼苗移栽 再生小植株移出三角瓶前 在自然条件下打开瓶口进行2 5 d 炼苗 再移栽到蛭 石加土1 1 中 保持一定的湿度和光照 以提高再生株移栽成活率 2 2 2 染色体加倍方法 2 2 2 1 秋水仙素处理愈伤组织 选取继代培养中生长旺盛的胚性愈伤组织 在无菌条件下切割成3 m mx3 m m 的 小块转移到添加浓度分别为o 0 1 0 0 5 o 1 o 2 秋水仙素溶液 过滤灭菌 的m s 继代培养基上 处理时间有l o d 2 0 d 3 0 d 三个梯度 不含秋水仙素溶液的 m s 培养基作为对照 每个处理为3 0 块愈伤组织 经秋水仙素处理过的愈伤组织转移 到不含秋水仙素分化培养基上再生出绿苗 2 2 2 2 秋水仙素处理萌动种子 首先将种子用0 1 的氯化汞浸泡1 5 分钟 用清水洗净后放入培养皿中 置2 5 黑暗的发芽箱内发芽 经2 3 天种子刚刚萌发 即胚根刚刚露出白尖时取出 在浓度 为o 2 秋水仙素溶液中 分别浸渍1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 7 h 8 h 以清水浸渍 种子为对照 每个处理的种子数为1 0 0 粒 2 2 2 3 秋水仙素处理胚芽 将种子用o 1 的氯化汞浸泡1 5 分钟 用清水洗净后放入培养皿中 置2 5 c 黑暗 的发芽箱内发芽至种子露白时 在淹水条件下进行9 6 h 暗培养 以促进种子的胚芽伸 长并抑制种根的伸长 待种子的胚芽鞘伸长至2 o c m 左右时 用0 0 5 秋水仙素分别 处理2 4 h 4 8 h 7 2 h 和9 6 h 接着用清水冲洗后移入花盆在沙土中继续培养 每个处 理的种子数为1 0 0 粒 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 2 2 2 4 秋水仙素处理二倍体幼苗 在二倍体幼苗长出3 5 个分孽时 留取根约2 一3 c m 并适当剪去一定长度叶片 然后在浓度为0 0 5 0 1 和0 2 的秋水仙素溶液中分别浸泡1 2 h 2 4 h 和3 6 h 使 分孽节以下部分没于药液 处理完毕后用自来水冲洗幼苗5 6 次 移栽于盆中沙土 保持高湿至成活 2 2 2 5 秋水仙素处理再生小植株 将成熟胚愈伤组织分化苗分别浸入浓度为0 0 1 0 0 5 o 1 和o 2 的秋水 仙素溶液中处理5 h 处理完毕后用自来水冲洗苗5 6 次 移栽于盆中沙土 保持高 湿至成活 2 2 3 植株倍性鉴定方法 2 2 3 1 形态学鉴定 观察处理植株的茎粗 叶片的长 宽 厚度和叶色等外部形态特征并与对照进行 比较 以茎增粗 叶片变宽 变厚 叶色浓绿等特征进行初步鉴定 2 2 3 2 体细胞染色体计数 当土培幼苗开始分蘖时 取出整个植株 将根系洗净 从根系中取出新鲜 光滑 白色透明的长度约1 5 c m 的根尖 放入冰水中处理2 4 h 然后用卡诺固定液 9 5 乙醇 冰醋酸 3 1 固定2 2 一2 4 h 1 nh c l 解离8 m i n 后用石炭酸品红溶液染色 压片 镜 检 观察统计不同根尖细胞的染色体数目 将分散相好的片子用o l y m p u s 显微摄影仪 照相 髓 2 2 3 3 保卫细胞长度和宽度的观察 在同等培养条件下 取同一部位的二倍体和四倍体植株叶片 用尖镊子撕取叶片 中部的下表皮 置于载玻片上 制作临时装片 夺4 0x 光学显微镜下 用显微测微尺 测量保卫细胞的长度和宽度 每个叶片随机测量l o 个气孔 取平均值进行比较汹 2 2 4 四倍体植株生物学特性的观察 2 2 4 1植株形态 比较观察二倍体和四倍体植株的生长势 当土培幼苗进入分蘖期后 测量其幼苗 高度 绝对高度 叶片长度 叶片宽度 用游标卡尺测量叶片厚度 并用c i 2 0 2 a r e a m e t e r 测量叶面积 随机测量l o 片叶片 取平均值 1 2 山丹新麦草多倍体诱导研究 2 2 4 2 结实性 待种子成熟后 随机选取二倍体植株和四倍体植株穗子各2 0 个 统计结实率 并 测量其千粒重以及穗长和穗宽 2 3 试验结果观察及计算标准 一 产生愈伤组织的成熟胚数 愈伤组织出愈率2 翥彖嘉翥蓉美兰篱善嚣 o 接种成熟胚数一污染成熟胚数 愈伤组织褐化率 褐化的愈伤组织数 愈伤组织日增重率 绿色芽点率 成苗率 白化苗率 愈伤组织总数 1 0 0 统计时愈伤组织重量一接种时愈伤组织重量 继代增值培养天数 产生绿色芽点的愈伤组织数 接种愈伤组织数一污染愈伤组织数 1 0 0 分化成苗的愈伤组织数 接种愈伤组织数一污染愈伤组织数 0 0 一 1 分化成白苗的愈伤组织数 接种愈伤组织数一污染愈伤组织数 0 0 l 变异率 堑墼型塑羔至坠 1 0 0 供试种子总和 成活率 成活植株数总和 处理植株 种子 数总和 多倍体诱变率 多倍体植株数 1 0 0 显微观察植株总数 1 0 0 3 结果与分析 3 1 成熟胚再生体系建立 3 1 1 不同激素及浓度配比对成熟胚愈伤组织诱导的影响 x1 0 0 内蒙古农业大学硕士学位论文 表1不同激素及浓度配比的m s 培养基对成熟胚愈伤组织诱导的效果 试验 编号 激素种类和浓度 m g 1 膨大时问开始出愈出愈率褐化率 2 4 dk t6 b a 天 天 愈伤组织生长情况 颗粒状 致密 淡黄色 生长快 颗粒状 致密 生长较快 致密 生长最慢 部分颗粒状 生长较慢 全部疏松 含水量大 生长慢 中l 础蕊外雏燃松软生愀 颗粒状 致密 生长快 颗粒状 致密 生长较快 较疏松 生长较伙 部分颗粒状 生长较快 颗粒状 疏松 生长慢 透明 松软 生长慢 透明 松软 生长慢 较紧密 生长较快 m s 培养基附加不同激素 2 4 一d k t 6 b a 及浓度配比水平下 均能有效地诱 导出愈伤组织 但愈伤组织发生的早晚 质地 形态特征 生长快慢因激素的种类和 浓度不同而不同 见表1 从表1 可以看出 在单独添加2 4 d 的a 1 a 2 两个处理中 随着2 4 一d 浓度的 增大 外植体开始膨大的时间和开始出愈的时间都延长 还出现了褐化现象 愈伤组 织的生长也变慢 a 3 a 5 两个处理2 4 d 浓度保持不变 随着k t 浓度的增大 外植 体开始膨大和开始出愈的时间都表现缩短 但愈伤组织的出愈率降低 而且褐化率升 高 a 5 a 6 两个处理k t 浓度保持不变 随着2 4 d 浓度增大 外植体开始膨大和开 始出愈的时间都在缩短 且愈伤组织的出愈率升高 褐化率降低 上述实验结果说明 2 4 一d 和k t 配比进行愈伤组织诱导较易产生褐化现象 a 7 a 1 0 四个处理 2 4 d 浓 度保持不变 随着6 b a 浓度增大 外植体开始膨大的时间缩短 但开始出愈的时间 基本不变 出愈率呈下降趋势 a l l a 1 4 四个处理 2 4 一d 浓度由a 7 a 1 0 的2 0 m g 1 增加到3 0 m g l 而且 随着6 b a 浓度增大 愈伤组织的出愈率基本呈上升趋势 但 是浓度为3 o m l 的2 4 一d 与6 b a 配比中出愈率最高为5 0 0 明显低于2 0 m 1 的 o 2 馏 卫 卫 0 o 0 o o o o o n t 加 四 四 硒 m n m n m n n n 7 7 7 8 8 8 o 5 6 3 5 0 o o l l 1 5 o 5 8 2 9 6 2 5 5 o 9 9 9 9 7 9 5 5 4 4 3 4 4 5 6 8 o 5 6 5 6 4 4 4 7 卜 7 4 4 6 7 4 5 4 4 3 3 2 6 5 5 3 5 o 0 0 5 o o o 0 l 2 3 o l 2 3 o o 5 5 o o o o o o l l 0 o o 0 o o o