（特种经济动物饲养专业论文）ftir对丝素蛋白构象的研究.pdf

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) 二阶导数谱变化，发现 加入乙醇后，首先肽链间1 3 结构减少，肽链内b 结构增加，部分丝素蛋白聚集为 白色絮状物。在这些絮状物小核诱导作用下，链闻b 结构再逐渐增加，丝素蛋白 溶液形成凝胶。定量分析的结果表明，丝素蛋白b 折叠结构的含量由溶液状态中 的1 7 7 9 上升到凝胶后的4 7 2 0 。热分析的结果显示，凝胶后丝素蛋白的热 稳定性增加。 探索研究丝素蛋白的构象特点、构象转变过程以及影响构象转变的因素等， 对于进一步开发利用丝素蛋白生物材料，解明家蚕成丝机理，拓展蚕丝蛋白用途 等具有重要意义，也能为研究其它蛋白的构象转变提供参考。 关键词：丝素蛋白；构象转变；分子量；分子间氢键；凝胶化；傅立叶变换红外 光谱；定量分析 2 新证大学硕士学位论文 a b s t r a c t p r o t e i ni sa r ti m p o r t a n tt o p i ci nl i f es c i e n c e s , a n dt h es t r u c t u r eo fp r o t e i n si so n e o f t h em o s ti m p o r t a n ta n dm m c m ta s p e c t s n o w a d a y s t h ec o n n e c t i o no f f u n c t i o na n d c o n f o r m a t i o na c q u i r e dm o r ea n dm o g ea t t e n t i o nw i t ht h es t u d i e so fm o l e c u l e c o n f o r m a t i o nd i s e a s e s 锄dm a n - m a d ep r o t e i nf i b e r s f t i rt e c h n o l o g yi so n eo ft h em o s tp o w e r f u lm 戗u bi ns t u d y i n gt h e “】n d 研 s u u c t u r eo fp r o t e i n s t h i sm e t h o dc , a l n et oaq u a n t i t a t i v es t a g es i n c et h e1 9 8 0 s w i t h t h et e c h n o l o g yo fd e c o n v o l u t i o n , s e c o n d a 】r yd e r i v a t i v ea n d 饿u v o - f i t t i n g , al a r g e n u m b e ro f q u a n t i t a f i v ei n f o r m a t i o no f p r o t e i n s s e c o n d a r ys u u c m r ew a so b t a i n e d s i l kf i b r o i ni sa l le a s i l yo b t a i l l e da n dc o m p a r a t i v e l ys t a b l em o d ep r o t e i n i t s e o n f o r m a t i o nc h a r a c t e r i s t i c ，t h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o np r o c e s sa n dt h ef a c t o r sa f f e c t t h ep r o c e 鹤w a ss t u d i e db yf t i r b ys t u d y i n gt h ee f f e c t so f d i f f e r e n ts o l v e n ts y s t e m so i lt h em o l e c u l a rw e i g h ta n d s t r u c t u r eo f s i l l 【f i b r o i n , i t sd i s c o v e r e dt h a t ：( j ) e f f e c to f d i f f e r e n ts a l ts o l u t i o n s ：l i b r h a sb e t t e rd i s s o l v i n gc a p a c i t yt h a nc a c l 2i nt h eg r l n ec o n d i t i o nw h e nd i s s o l v i n gs i l k f i b r o i n , a n dt h ed e c o m p o s t i o nd e g r e ei sh i g h e r e f f e c to f t e m p e r a t u r ea n dd i s s o l v e d t i l n e ：9 8 2 ( t h eb o i l i n gt e m p e r a t u r eo fa q u e o u ss o l u t i o n s ) i st h ed i s s o w i n g t 盘n p e r a t u mw h e nt h ep o l y p e p t i d e sc h a i n sw e r eb r e a kl l pt os h o r to n 髓w h e ni t s b e l o w9 8 + 2 ，t h es i i kf i b r o i nw a ss w e l l e db yt h es o l u t i o na n dm o s t l yd i s s o l v e dt o l o n gp o l y p e p t i d e s w h e nt h et e m p e r a t u r er e a c h e d9 8 2 1 0 t so f l o n gp o l y p e p t i d e s w 玳d e c o m p o s e dt os h o r tp o l y p e p t i d e sa n ds i n g l ea m i n oa c i & e f f e c to fa d d i n g o r g a n i cs o l v e n t s ：d i s s o l u t i o no fs i l kf i b e r sa n dd e c o m p o s i t i o no fa m i n oa c i df r o m p o l y p e p t i d e sw i l lb ea c c e l e r a t e d 诵血t h ea d d i t i o no fo r g a n i cs o l v e n t s h o w e v e r , t h e m o l e c u l a rw e i g h to fs i l kf i b r o i nw a su n c h a n g e d d i f f e r e n ts o l v e n ts y s t e m sh a v el i t t l e e f f e c to nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fs i l kf i b r o i n h o w e v e r t h es o l v e n ts y s t e m s ： l i b r ( 9 8 2 ) a n dc a c i 2 ( 9 8 2 ) ，w h i c hh a sab e t t e rd i s s o l v i n gc a p a c i t y , d e c o m p o s e ds i l kf i b r o i nt os h o r tp o l y p e p t i d e s t h e s es h o r tp o l y p e p t i d e sh a v eaw o l s e 妇l e 擎a l i t yi ns e c o n d a r ys m l c t u r e ，w h i c hr e s u l ti nd i f f i c u l t yi nf o r m a t i o no fn - h e l i x i t ss h o w e dt h a t 6 0 ，9 ，5 m o l l 的l i b rs o l u t i o ni st h eb e s tc h o i c ef o rp r e p a r i n gs i l k f i b r o i ns o l u t i o ni ns t u a , n gc o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n s e c o n d a r ys t r u c t u r eo fs i l kf i b r o i ni nd i f f e r e n ts t a t e s 慨s t u d i e db yf t i & t h e r e s u l tw a sv a l i d a t e db y 眦c o m p a r i n gt h es e c o n d a r yd e r i v a t i v es p e c t r u ma n d q u a n t i t a t i v ea n a l y s e s o ff i b r o i ni nd i f f e r e n ts t a t e s i t sf o u n dt h a tt h em a i n c o n f o r m a t i o ni nf i b r o i na q u e o u ss o l u t i o n sw a sr a n d o mc o i l s i nt h ef i b r o i na q u e o u s s o l u f o n s ( 1 y o p h i l i z e d ) d r y i n gf i l m sa n da i r - , k yf i l m st h em a i nc o n f o r m a t i o nw a s 浙江大学硕士学位论文 - h e l i x , a n di t sb s h e e ti nt h eo t h e rs t a t e s i t sa l s of o u n dt h a tw a t e tp l a y s 锄 i m p o r t a n tr o l ei nt h ec o n f o r m a t i o nf o r m a t i o na n dc o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n i nf i l e s o l u t i o n sa n dg e l s ，i n t r a m o l e c u l eh y d r o g e nb o n d sf o r m e db e t w c e l lf i b r o i nm o l e c u l e s a n dw a t e rm o l e c u l e sw i t hf i l ep r e s e n c eo f w a t e r s ot h e r e 黜m u c hi n t r a m o l e e u l e1 3 s t r u c t u r ei nt h e s et w os t a t e s ；w h e nt h ew a t e rw a sl o s i n ga n df i l mg r a d u a l l yf o r m e d , t h ei n t r a m o l e c u l eh y d r o g e nb o n d sd e c r e a s e d , t h eh y d r o p h o b i cr e g i o ne x p o s e da r , d i n t e r a c t e dt of o r mi n t e r m o l e e u l eh y d r o g e nb o n d s ，w h i c hm a i n l yh e l i xa n d1 3s t r u c t m - e w h e nt h et e m p e r a t u r el r o s e ，t h eu n s t a b l eh e l i xc h a n g e dt o1 3 - s h e e t , w h i c hr e s u l ti n m u c hr l l o l eb - s h e e ti nt h ed r y i n gf i l m st h a na i r 4 r yf i l m s w h e ns i l kf i b r o i nw 哦 l y o p h i l i z e d , c o n t e n to fb - s h e e tw a sd e c r e a s e da st h ew l t t e rw i l t sd i s a p p e a r e d t h es i l kf i b r o i ns o l u t i o nb e c a m eg e li n d u c e db ye t h a n 0 1 t h r o u g hi n v e s t i g a t i n g t h ec h a n g eo f t h es h a p ea n dt h es e c o n dd e r i v a t i v er e s o l u t i o ne n h a n c e m e n ts p c c t m mo f t h ea m i d ei ( 1 6 0 0c 1 1 1 1 _ 1 6 7 0c l n 。1 ) r e g i o n , w es h o w e dt h a ti n t r a m o l e c u l a r1 3 o s l r u e t u r ei ns i i kf i b r o i nd e c r e a s e dw h i l ei n t e r m o l e e u l a rb s l n l c i u i ei n c r e a s e da f t e r t h ee t h a n o lw a sa d d e d ，a tt h es a m et i m ew h i t ef l o ea p p e a r e d t h ei n t r a m o l e e u l a rb s l r u e t u r ei n c r e a s e dt h e ni n d u c e db yt h e s en l t l c | e a l s , a n dt h es i l kf i b r o i ns o l u t i o n b e 锄eg e lf o r m a t i o ng r a d u a l l y t h eq u a n t i t a t i v er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fb - s h e e ti n c r e a s e df r o m1 7 7 9 * - 4 , i ns o l u t i o nt o4 7 2 0 i nt h eg e l t h et h e r m a ls t a b i l i t y o f s i l kf i b r o i ne n h a n c e di nt h ep r o c e s sa st h ed s cr e s u l ts h o w e d e x p l o r i n gs t u d y i n go fc o n f o r m a t i o nc h a r a c t e r i s t i c ，t h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n p r o c e s sa n dt h ef a c t o r st h a ta f f e c tt h ep r o c e s si ns i l k f i b r o i nh a sai m p o r t a n t s i g n i f i c a n c ei ne x p l o r i n gt h eu t i l i z a t i o no fs i l kf i b r o i nb i o m a t e r i a l sa n de x p l a i n i n gt h e m e c h a n i s mo fs i l kp r o c e s si nb o m l r y xr a o r i , a n dp r o v i d i n gr e f e r e n c el ot h es t u d i e so f o t h e rp r o t e i n s k e y w o r d s ：s i l kf i b r o i n ；c o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n ；m o l e c u l a r w e i g h t ； i n t r a m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n d s ；g e lf o r m a t i o n ；f t i r ；q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s 4 浙江大学硕士学位论文 第一章绪论 擅要：简述了丝素蛋白的构象和晶型特征，综述了有关丝素蛋白溶液及丝索蛋白膜构象特 点和构象转变的研究进展。简要介绍了傅立叶变换红外光谱( f t l r ) 研究蛋白质结构的原 理及进展。阐述了本研究的目的意义及创新点。 关键词：丝素蛋白；二级结构；构象转变；傅立叶变换红外光谱 蛋白质是生命科学的重要研究对象。从细胞分裂到细胞运动，从代谢到免疫， 已知的生物功能没有一个是离开蛋白质能实现的。一个典型的细胞可能含有l o 万种左右不同的蛋白质，在细胞的生命中每一种蛋白质都有其自己的使命。蛋白 质分子是由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链，但是天然的蛋白质分子并不是走 向随机的松散多肽链。每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结 构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象“1 。一个特定蛋白质行使其功能的能 力通常是由它的构象决定的。 越来越多的研究表明，生命活动的许多过程都与蛋白的构象转变密切相关。 如近年来，研究发现导致人的克雅氏症和动物的海绵脑病( 如疯牛病) 的朊病毒 蛋白( p f i o n ) 在不致病时的正常细胞膜糖蛋白p r p c 含4 0 0 , 4 的。螺旋结构，只含 有3 0 折叠结构，而致病的病毒蛋i 白p r p 靳则含有4 3 的b 折叠及3 0 的a 螺旋 结构”1 。有关动物蛋白纤维的研究表明，蚕丝、蜘蛛丝优良的力学性能与其构 象有着密切的关系，蚕丝中b 折叠结构与纤维的强度相关，无规卷曲结构的含量 则与蛋白纤维的弹性有关阻8 因而研究蛋白质的构象与功能的关系、构象转变 等有着十分重要的意义。 家蚕丝是一种利用悠久的天然蛋白纤维，具有良好的力学性能，有着“纤维 皇后”的美誉”1 ，已广泛应用于服装、纺织、食品和医药等领域执8 一。蚕丝由丝 素与丝胶两种蛋白组成。其中，丝素蛋白作为一种容易获得又相对比较稳定的蛋 白质而受到广泛的关注与研究。 1 丝素蛋白的构象与晶型 蛋白质的二级结构是指肽链中局部肽段的构象，它们是完整肽链构象( 三级 结构) 的构象单元，是蛋白质复杂的空间构象的基础。二级结构分为规则的二级 结构、部分规则的二级结构和无规卷曲结构。n 螺旋和b 折叠结构是两种最常见 的规则二级结构，而b 折叠结构的走向，又分为平行b 折叠及反平行b 折叠结构。 此外还发现3 l o 螺旋、n 螺旋等规则二级结构。”。转角和环形结构属于部分规则 浙江大学硕士学位论文 的二级结构，其中b 转角结构最为常见。相对于前面所述几种规则或部分规则二 级结构，无规卷曲结构是不规则的，有着更大的任意性。一般认为，丝素蛋白 分子链主要包括无规卷曲结构、o 螺旋结构和8 折叠结构“” m s h i m i z u “4 首先发现家蚕丝素有两种结晶形态，分别称为q 型和b 型。其后 k r a t k y o “1 证明了两种结晶形态的存在，并指出丝素d 型的分子结构并非般蛋 白质中的a 螺旋结构。为避免把丝素口型与a 螺旋相混淆，一般分别将丝素的4 型和b 型称为s i l ki 和s i l k 。许多研究利用x 射线衍射技术证实了丝素蛋白 中的结晶结构“”，因此在分析丝素蛋白结构的过程中，经常用丝素蛋白的晶型 来表示。目前认为，蚕丝蛋白的晶型有3 种：s i l ki ，s i l k i i 和s i l k l i l “i 】。 在固体状态下，丝素蛋白中存在s i l l 【i 和s i l k i i 两种晶型，蚕丝纤维中丝素 蛋白以s i l k i i 形式存在”。由于s i l k l i 晶型发现早，而且比较稳定，因而其结 构研究得比较清楚m a r s h 等最早提出s i l k i i 以反平行b 折叠结构形式存在， 并推测每个晶胞单元仅包含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基，较大的氨基酸残基如 酪氨酸和亮氨酸存在于无定形区域内f r a s e r 等叫也描述了丝素蛋白晶型的特 点，他认为丝素s i l k l i 微晶沿丝素纤维轴向被拉伸。最近，t a k a h a s h i 等嘧1 通过研 究完善了这种反平行p 折叠结构模型，证明反极性一反平行1 3 折叠结构( a ab s h e e t ) 与s i l l 【结构最为吻合( 图1 1 、l - 2 所示) 。 鼻 p d r - 州f 舯憎l i f 矗矗 图卜i 反极性一反平行b 折叠结构模受 在家蚕吐丝过程中，随着丝素溶液失水浓缩，浓度的增加，丝素蛋白由无 规卷曲结构转变为s i l ki 结构，随着吐丝的进程，s i l ki 结构再转变为s i 收n 结构。 从家蚕丝腺中取出液晶状的丝素溶液。在没有外力干扰下让其自然干燥也能得到 具有s i l ki 结构的丝素膜。s i l ki 结构是一种亚稳态结构，极易转交为s i l k i i 结构， 因而用x - 衍射技术较难确定其结构。l o t z 等嘲依据其与( a l a - g l y ) n 多肽衍射结果 的相似提出了一种机轴( c r a n k s h a f t ) 样模型，这种模型中丙氨酸与甘氨酸残基 分别与墨折叠和a 螺旋结构中的相近。k o n i s h i 等汹提出了一种松散的螺旋结构 | 一 i _ 构霪 献一# 毒一 一翘一 t f，y?， “ o o土、耋h 薹 浙江大学硕士学位论文 模型，是一种介于a 螺旋与s i l k i i ( 反平行b 折叠结构) 之问的结构形式。f o s s e , 等嘲通过( a i a - g l y ) n 多肽的构象能量的计算，提出了一种片状结构模型，其中a l a 残基以一种右手片层结构存在，而g l y 以一种左手片层结构形式存在。a s a k u r a 等”别利用，c p m a sn m r 研究了s i l l 【i 的结构，通过比较s i l l 【i 与s i l ki i 的u c c p m a sn m r 化学位移，发现得到的结果与l o t z 等人的机轴模型不吻合。而最近， 舢a k u m 课题组哺州利用2 dn m r ( - - 维核磁共振) 技术，根据( a l a - o l y ) 1 5 多肽 模型，提出了s i l l 【i 以一种重复的b 转角的结构形式存在，如图1 3 所示。 l 蓁鎏爹篓 辫甏羹 l 图卜3a s a h r l l 的s i l k i 晶型模型 最近，v a i l - 7 7 1 等“1 利用透射电镜( t e m ) 和单晶电子衍射的方法发现， 浓度较低的丝素蛋白溶液在空气水或有机溶剂水的界面处形成一种很薄的液 晶膜，这种膜在外力作用下呈现了单轴导向的晶体结构。这是一种左手三折叠螺 旋结构。整个结构表现出表面活性剂的特点，一侧是亲水的丝氨酸残基与水作用， 一侧是疏水的丙氨酸残基突出于水面。丝素分子形成一种三角形断面的左手2 ，3 螺旋的形式，再组合成六边形结构。s i 衄结构在丝素蛋白中含量很少而且不稳 定，与s i l ki 一样在外力作用，加热或甲醇处理时会转变为s i l k l l 结构。这种结构 目前并无太大应用价值，但这种液晶结构的发现突破了丝素蛋白液晶态只能存在 于蚕的腺体这一局限。 以往认为，s i l k i i 主要包含1 3 折叠结构，而s n ki 主要包含a 螺旋及少量无规 卷曲及9 转角结构1 ，从上文的综述可知，这种归类方法不准确。实际研究中， 这种分类主要是根据研究手段而定。一般，利用x 射线衍射技术进行丝素蛋白结 构的研究，往往将丝素蛋白结构分为s i l ki 、s i l k i i 晶型进行研究。而利用傅立叶 变换红外光谱( f 1 1 r ) 、傅立叶变换拉曼光谱( f 1 r ) 以及圆二色性光谱( c d ) 等技术检测分析丝素蛋白结构时，常使用a 螺旋、b 折叠和无规卷曲结构来表示 丝素的二级结构。 7 浙扛大学硕士学位论文 2 丝素蛋白构象转变的研究进展 在研究丝素蛋白的构象变化过程中，研究最多的是丝素蛋白溶液与丝素蛋白 膜的构象变化。 2 1 丝素蛋白溶液的构象特点及构象转变 丝素蛋白溶液是开发利用丝素蛋白的加工前体物，较高浓度的丝素蛋白溶液 的构象特征与家蚕丝腺蛋白的构象相似，因而溶液状态下丝素蛋白的构象特点是 的研究的熟点。 c a n e t t i 等脚1 利用c d 研究认为丝素蛋白溶液主要以无规卷曲结构存在。周风 娟等滔1 研究了丝素蛋白溶液的圆二色性光谱。在波长1 9 5 n m 附近有明显豹无规卷 曲构象的特征负峰出现，此外在2 1 0 r i m 附近也出现了负峰，但峰值较低。显示溶 液中，丝素蛋白分子的构象以无规卷曲为主，但有少量的b 折叠结构。其它红外 卿与1 3 cn ：m r i s 。1 的结果也证实了这一点。 而i i z u k a 认为在丝素蛋白溶液中虽然丝素是一种不规则结构，但其分子没 有真正的无规卷曲结构松散程度高。进一步的研究表明蛋白分子结构的紧密度受 水溶液的组成所影响，在单价盐离子溶液中丝素分子结构更加紧密，而在有尿素 存在时更松散。a s a k u r a 等嘲利用1 3 cn m r ( 核磁共振) 研究了水溶液中家蚕丝 素的结构与链的动力学变化特点。通过与野蚕丝蛋白的丙氨酸碳原子的峰值的比 较，发现家蚕丝素蛋白溶液并不像野蚕丝蛋白一样含有q 螺旋结构部分。同时发 现。随着丝素蛋白浓度的增加会形成s i l ki 结构。k o b a y a s h i 等”1 的圆二色性( c d ) 光谱的研究数据也表明在质量浓度高于5 的丝素蛋白溶液中，丝素蛋白以一种 螺旋结构形式存在，这是一种松散的螺旋结构而非a 螺旋结构。 随着时间的变化，或在温度、p h 值、剪切力、金属离子和有机溶剂等因素的 影响下，丝素蛋白溶液会发生凝胶化，凝胶化的过程中蛋白分子构象发生了转变。 丝蛋白溶液的浓度、环境温度和p h 值都是丝蛋白溶液保存的重要参数，三者 对丝蛋白溶液的稳定性有重要的影响，也说明这些因素的改变都会引起丝素蛋白 构象的改变。东华大学纤维材料改性实验室的王洪等研究了浓度和温度对丝素 蛋白水溶液稳定性的影响。研究表明，随着溶液浓度和存放温度的升高，溶液的 稳定性迅速下降，最终使体系发生凝胶化。丝素蛋白溶液凝胶速度在2 7 的浓度 和2 5 时发生转变。 a y u b 等3 研究了丝素溶液的凝胶化过程，发现凝胶化是由于丝素溶液s i t k l l 结构的形成，而凝胶化取决于溶液的p t q 值，当溶液p h 值为3 o 4 0 时，两天内会 发生凝胶化，而p h 值在1 5 以下或1 3 以上时，不会发生凝胶化。胡国梁等研究 s 浙江大学硕士学位论文 了p h 值对凝胶速度的影响，认为当溶液p h 值在丝素蛋白等电点( p h = 3 9 ) 附近时， 凝胶速度最快。谢枸等”研究了p h 值对丝素蛋白构象转变的影响，发现p h 5 2 的酸性溶液有利于丝素蛋白从s i l ki 向s n k h 构象转变，而中性和碱性溶液 ( p h 6 9 和8 o ) 则对丝素蛋白构象转变影响甚小 外力的作用能使蛋白变性，改变蛋白构象，从而影响丝蛋白溶液的稳定性。 刘娜等1 研究了不同剪切作用下高浓度再生丝素蛋白水溶液的性质，并利用拉曼 光谱分析了丝素蛋白分子受剪切作用后的构象变化。结果发现，浓度和剪切作用 是影响再生丝素蛋白水溶液性质的两个重要因素。高浓度再生丝素蛋白水溶液经 过一定的剪切作用后，将呈现各向异性的性质，且随着溶液中丝素蛋白溶液的浓 度的增加，溶液出现各向异性现象所需要的临界剪切作用力减小；而在相同浓度 下，剪切作用力越大，再生丝素蛋白水溶液中丝素蛋白分子沿剪切作用方向的有 序程度也随之增加。在一定的剪切作用下，高浓度的再生丝素蛋白水溶液中，部 分丝素蛋白分子可由原来的无规线团和( 或) a 螺旋结构转变为1 3 折叠结构“孵。 m a n f r e dr o s s l e 等1 用广角x 一射线衍射仪研究了剪切作用下再生丝素蛋白的结 构变化，观察到增加剪切速度后，丝素分子链延长，并开始聚合。通过红外光谱 检测发现，形成的聚合相为无规卷曲和b 折叠结构。 复旦大学生物大分子课题组多年来一直研究丝蛋白构象转变机理和成丝机 理，并提出了与导致疯牛病的p r p ( 朊病毒) 蛋白变性过程类似的丝蛋白成纤化 的成核依赖性聚集过程。他们利用圆二色谱法观察了再生丝素蛋白溶液由无规线 团( s 订k i 结构) 向b 折叠( s i l k i i 结构) 的转变及其b 折叠的聚集过程，对此提出了 类似于病毒蛋白的神经性退变过程的成核依赖性机理。在这个机理中存在两个过 程：( 1 ) 成核过程，这是决定转交速率的一步，涉及无规卷曲向b 折叠转变及其 聚集成核的过程；( 2 ) 1 3 折叠聚集增长过程，该过程的增长速率对于无规卷曲的 蛋白质浓度遵循一级反应动力学。而且还证明了只有在核或称为种子引入的情况 下，温度升高方可明显加速b 折叠的聚集增长过程，否则该过程即使在温度很高 的情况下也进行很慢。他们推测在蚕和蜘蛛的吐丝过程中，丝蛋白分子链都存在 着这样一种具有成核依赖性的构象转变及聚集过程。这一工作为更深入地理解生 物体中的成丝过程提供了理论依据啡忉。 家蚕和蜘蛛丝腺体内的丝蛋白含有多种金属离子，且浓度随着腺体的部位不 同而发生变化。这些金属离子在丝蛋白凝胶一溶胶之间的转变及丝纤维形成中的 作用引起了广泛的关注。v i n e y 等最早根据电感耦合等离子体( i c p m s ) 技术推测 c a 2 4 的增加能使b 折叠的形成加速m 1 复旦大学邵正中课题组近年来研究了6 种金 属元素( n a ，k ，m g ，c a ，c u ，z n ) ，在丝腺中丝素溶液和再生丝素蛋白溶液 构象变化中的作用。研究发现m 9 2 + ，c l p ，z n 2 + 促进丝素蛋白p 折叠结构的形成， ca _ ”有助于形成稳定的蛋白网络结构，而n a + ，k + 能解离蛋白网络结构删。 9 浙江大学硕士学位论文 u n g - j i nk i m 等发现一定粒径的n a c i 晶体能促进再生丝素蛋白水溶液的凝 胶，并认为n a c i 以及k c i 体系能让水从丝素蛋白疏水基团的流失，引起丝素蛋白 链和链之间的相互作用，促进丝素蛋白从无规卷曲结构到b 折叠的转变。而c a c l 2 和m g c l 2 体系起到了相反的作用”1 此外，有机溶剂特别是甲醇、乙醇对丝素蛋白构象的影响受到了广泛关注。 闵思佳等研究了有机溶剂对丝素蛋白质溶液的影响，发现不溶于水的非质子有机 溶剂不与丝素蛋白质溶液相溶，因而对丝素蛋白质不产生影响。非质子极性有机 溶剂和质子型有机溶剂可能引起溶液中的丝素蛋白变性、b 化，使丝素蛋白质溶 液凝胶化。或丝素蛋白从溶液中析出，因而丝素膜溶解性下降嘲 2 2 丝素膜的构象特点及构象转变 丝素蛋白成膜后，丝素蛋白构象发生变化。马越淳隋町等研究发现，当丝素 溶液浓度低于5 ，成膜温度大于4 0 时，丝素膜中主要为s i l k i 结晶结构：而4 0 以下则为s i l ki 型结构。当丝素溶液浓度为2 0 ，成膜温度为4 0 时，则主要 形成s i l ki 型结晶结构，而4 5 c 以上则形成s i i l 【结晶结构。室温干燥后主要形成 s i l k 型结晶结构，但经过长时间的储存后仍形成s i l k i i 结晶结构；而在快速于燥 后，即使在4 0 以上，丝素膜也仍以无定型结构为主。 苏州大学李明忠等嘧叮也研究了丝素水溶液经不同方式干燥后，所得再生丝 素膜的精细结构，以及存放过程中丝素蛋白的结构变化。指出经3 0 ( 2 热风干燥或 经高于- 2 0 冷冻干燥后，所得到的丝素固体的结构是无定性和s i l kl 共存，在室 内温湿度环境中存放后，部分无定形结构转化为s i l ki ；丝素溶液经8 0 - - 2 0 c 冷 冻干燥后，所得到的丝素膜的结构主要是无定形，含少量s i l k h ，存放过程中部 分无定形结构转化为s i l ki ；室温放置所自然形成的丝素凝胶中，丝素的结构是 无定形和s i l k i i 共存；丝素蛋白水溶液表面膜中甘氨酸和丙氨酸的含量较高，其 结构主要是s i l ki 和s i i k i i ，结晶度高。 彭显能等”1 通过二维相关红外光谱，研究了再生蚕丝蛋白膜的构象及其转 变与温度之间的关系。将样品从1 3 0 c 升温到2 2 0 ( 2 、或在1 8 0 c 的恒温过程中， 丝素蛋白分子链的构象会发生变化，且不同构象对温度升高过程或1 8 0 c 恒温过 程响应的顺序是无规卷曲变化先于1 3 折叠、n 螺旋的形成。 i s h i d a 等”利用“cn m r 和d s c 研究了丝素膜在外力拉伸作用下的构象变 化，发现在一定的拉伸作用下，丝素蛋白膜中的无定型结构会部分转变为s i l k i i 结晶结构，从而提高结晶度。 吴徽字等将再生丝素溶液涂膜在室温下干燥得到含有s i l ki 结构的丝素 膜，用1 5 0 ( 2 的饱和水蒸气处理半小时，发现丝素蛋白发生了s i l l 【i 向s i l k h 的转 浙江大学硕士学位论文 变。m a g o s h i 等嘲研究了在2 0 c 1 3 0 条件下，丝素膜在水中的构象变化。在 6 0 以下，膜中丝素链就会从无规线团转化为q 螺旋结构；而当温度高于7 0 时，丝素链就会有q 螺旋和b 折叠构象( 或s i l ki 型与s i l ki i 型结晶共存) 共存。而 随着温度的增加，b 折叠构象增多。随着丝素膜在水中浸润时间的延长，无规线 团向b 折叠构象转变的速度升高，形成s i l k i i 结晶速度和含量都增加。 许多研究都发现极性的有机溶剂如醇类能引起丝素蛋白膜的构象转变，丝素 蛋白由s i l ki 型向s i l k i i 转变。m t s u k a d a 课题组研究了不同浓度的甲醇水溶液对 家蚕丝和柞蚕丝素膜处理后的结构变化，x - 衍射和拉曼光谱的结果显示，膜中1 3 折叠结构增加，丝素蛋白结构由s i l ki 句s i l k h 转变呻_ 同。陈新等m “运用时闻分 辨红外光谱研究再生蚕丝蛋白膜在高浓度醇溶液中( 醇含量 9 0 ) 的构象转变 过程。研究结构表明，丝蛋白膜在纯甲醇中可以发生构象转变，但是在纯乙醇和 异丙醇中却几乎不能发生构象转变。进一步研究发现，当乙醇和异丙醇溶液中的 含水量达到7 8 时，丝蛋白开始发生构象转变，在研究的醇溶液浓度范围中， 丝蛋白中发生构象转变的速率随醇溶液中水含量的增加而增大。 3 傅立叶变换红外光谱研究蛋白质结构 常用的分析蛋白质结构的技术主要有x - - 射线衍射、圆二色光谱( c i r c u k d i c h r o i s m ，c d1 、核磁共振( n l v l r ) 、红外光谱( m ) 、拉曼光谱( r a m a n ) 以及荧光和紫外光谱，这些技术各有其优势和局限性。 x 一射线衍射技术是最准确和最可靠的，但它需要制备合格的晶体，因而此 项技术的工作量大，成功率低，而且无法测定不同生理条件对蛋白质结构的影响 核磁共振技术能给出丰富的蛋白质分子结构信息，但一般只能测定分子量为1 5 2 5 k d 的蛋白质的结构。测定溶液状态下蛋自质的结构多用圆二色光谱法，它能 够获得溶液中蛋白质的一些重要的信息，但有由于圆二色光谱法是建立在已知三 维结构的聚多肽和蛋白质光谱为参考的基础上的，仅在含。螺旋成份较多的蛋白 二级结构测定中较为准确，而且只能应用在很窄浓度