（分析化学专业论文）烤肉中多环芳烃的检测.pdf

摘要 摘要 多环芳烃( p a h s ) 是一类可诱发皮肤癌、阴囊癌和肺癌的有机污染物。石油、煤 炭的不完全燃烧、汽车尾气的排放均可产生p a h s ，导致其在食品、环境中广泛存在。 本研究分别建立了高效液相色谱法( h p l c u v ) 、微乳毛细管电动色谱法( m e e k c ) 、 胶束电动色谱场放大样品堆积法( m e k c f a s s ) 3 种方法分析烤肉中p a h s 类物质， 旨在建立切实可行的快速分析肉制品中p a h s 类物质的方法，对p a h s 含量的控制和人 类健康的保障具有积极意义。 h p l c u v 法分析烤肉中1 3 种p a h s 。由于烤肉中含有大量的脂质、疏水蛋白质等 物质不仅干扰p a h s 的定量分析，甚至会引起液相色谱柱的污染，因此本实验对烤肉的 前处理过程进行考察。经过优化确定了前处理的过程：超声波提取，2m o l lk o h 的甲 醇：水( 9 ：1 ：v v ) 溶液皂化，环己烷液液萃取，c 1 8 固相萃取柱净化、浓缩。样品经 上述方法处理后进行高效液相分析，色谱柱n u c l e o d u rc 1 8 ，5i l t m ，2 5 0m i n x 4 6m m ，流 动相为甲醇：水( 9 3 2 ：6 8 ；v ) 进行等度洗脱。紫外检测器波长2 5 4n l n 。方法线性 关系良好( r 、田9 9 ) ，萘、二氢苊、芴、菲、葸、荧葸、芘、苯并( a ) 葸、苯并( b ) 荧葸、苯并( k ) 荧葸、苯并( a ) 芘、二苯并( a ，h ) 葸、苯并( g ，也i ) 芘的检出限分别 为6 8 腭l 、8 9t t g l 、0 2 鹏几、0 3 熠几、0 6 鹏几、0 8 “g l 、1 4 肛g l 、o 2 烬皿、1 3 腭几、0 7p g l 、o 1p g l 、0 6t t g l 、0 3 陷l ，日内精密度r s d 5 ，可应用于多种p a h s 的同时分析。该方法用于烤肉中p a h s 的测定，回收率在6 8 5 1 0 3 之间。 m e e k c 法分析烤肉中6 种强致癌p a h s 。由于在m e e k c 中不存在色谱柱污染的 问题，因此样品经超声波提取、c 1 8 固相萃取的简单处理后进样分析。采用未涂层石英 毛细管6 5c m x 5 0l u n ，微乳缓冲液组成：0 4 ( m m ) 正己烷- 1 8 ( m m ) s d s 2 0 ( v v ) 正丁醇2 2 ( v v ) 乙腈2 0m m o l lp h 9 2 4 硼砂缓冲液，3 0m b a r 压力阳极进样6s ，检 测波长2 8 0n m ，运行电压2 0k v ，柱温2 0 。该方法线性关系良好( 1 o 9 9 ) ，日内精 密度r s d 0 9 9 ) a n dp r e c i s i o ni n t e r - d a yv a r i a b l i t y ( r s d 0 9 9 ) a n dp r e c i s i o ni n t e r - d a yv a r i a b i l i t i e s ( r s d 吡啶乙醇 丙酮 乙醇 - - 氯甲烷 g o 环己烷 石油醚 丙酮乙醇环己烷 氯仿 四氢呋喃。目前肉制品中p a h s 的提取过程主 要包括索氏提取、超声波提取和加速溶剂萃取等。 ( 1 ) 索氏提取 索氏提取( s o x h l e te x t r a c t i o n ) 法自出现已有百年历史，作为经典的样品预处理方 法，广泛应用于残留危害物质的提取i 卅。国家标准法【3 5 】也采用索氏提取作为提取方法。 但其存在样品量大，提取种类多，需要进一步的纯化的缺点 3 6 1 ，现在用于食品中p a i l s 的测定中并不多见。 ( 2 ) 超声波提取 超声波提取( u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ) 法【3 7 1 是e p a ( 美国环境保护局) 推荐的p a h s 提取方法之一( e p as w - 8 4 6 3 5 5 0 ) 3 8 】，超声波提取是依靠超声波在液体中振动时产生 的一种空化作用而使样品中有效成分提取溶出。除了空化作用，超声波的多种次级效应 ( 如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应) 都有利于样品中的有效成分在短时间内 转移、和溶剂充分混合，从而增加提取效率。超声提取法一般在常温下进行，避免了高 温对某些提取成分的影响，目前食品中p a h s 的提取大多采用超声波提取法【3 9 1 。 ( 3 ) 加速溶剂萃取法 加速溶剂萃取法( a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ，a s e ) 是一种利用高温和加压方 法来增加物质溶解度和溶质扩散效率，提高萃取效率的前处理新技术。该方法与传统的 萃取方法相比，具有快速、溶剂少、萃取效率高、全自动安全操作等特点，极具应用前 景，已在食品、环境、药物、化工等各方面得到了广泛的应用。l u c i a 删等建立了a s e 提取、凝胶渗透色谱( g p c ) 净化方法来分析鱼肉中2 4 种p a h s ，达到了良好效果。 1 3 2 纯化方法 2 第一晕绪论 有机溶剂提取得到的提取液中不可避免地含有一些干扰p a h s 分析的杂质，因此需 要进一步的浓缩和纯化【3 朗。 ( 1 ) 亲水与亲脂性化合物的分离 亲水与亲脂性化合物的分离是通过利用两种物质在同一种溶剂中的分配系数( k ) 不同而实现。k 值越大，需要的分配次数越少。使用的溶剂主要有环己烷、二氯甲烷、 丙酮、石油醚和乙烷等，其中，以环己烷和二氯甲烷的使用较普遍。 ( 2 ) 脂肪族与芳香族的分离 目前分离脂肪族与芳香族的主要方法为固相萃取法，吸附分离是根据各种溶质( 如 p a h s ) 与吸附剂的亲合力和洗脱剂( 或流动相) 的解吸作用的强弱，通过反复吸附和 解吸，将不同特性的化合物分离开来。常用的填充物有氧化铝、硅胶、s e p h a d e xl h 2 0 或l h 6 0 分子筛凝胶和硅镁型吸附剂等【4 1 - 4 2 1 。 ( a ) 硅胶柱层析 该方法在p a h s 的纯化分离中的应用最为广泛。硅胶需要先活化，可以采用2 5 0 下活化6h ，也可采用在1 3 0 活化1 6h 。硅胶具有多孔性，比表面积约为4 0 0m 2 g ， 具有良好的吸附性能。进行层析的提取液须用环己烷或正己烷等弱极性的有机物作溶 剂，提取物转移至层析柱中后，用环己烷或苯等洗脱p a h s 。 ( b ) 氧化铝柱层析 层析用的氧化铝吸附剂是三水合氧化铝( a 1 2 0 3 3 h 2 0 ) 在低于7 0 0 下脱水而成的， 具有很强的吸附能力。所有的有机溶质，除了脂肪烃外，都可能被极性氧化铝表面基团 有一定程度的吸附。p a h s 是非极性的，它们被氧化铝的吸附是借助氧化铝表面晶体破 损，与铝原子带的兀电子形成较强的范德华力。氧化铝填充柱不利之处是洗脱时间长， 某些化合物在该吸附剂上有一定的分解作用，重现性较差。 ( c ) 弗罗里矽土硅镁型吸附剂 将经过干燥( 常用无水n a 2 s 0 4 ) 的提取液直接倾至弗罗里矽土上，提取液中的p a h s 及其他干扰组分都被吸附在弗罗里矽土中，然后用洗脱剂如二氯甲烷丙酮( 1 ：1 ；v v ) 浸泡、洗脱，洗脱液经浓缩后进行分析。弗罗里矽土层析法操作简单，重现性较好，较 适合分析p a h s ，但是回收率较低。 1 3 3 分析检测方法 p a h s 的测定方法很多，对于肉制品中p a h s 的分析测定大多采用色谱法，包括高 效液相色谱法( 紫外可见、二极管阵列、荧光检测器) 、气相色谱法( 火焰离子化检测 器或质谱检测器) 、毛细管电泳法等h 3 4 5 1 。 ( 1 ) 气相色谱法( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 气相色谱法应用于化学分析领域已有近六十年，是一种较成熟的分析手段。其具有 江南大学硕士学位论文 高效率、高选择性、高灵敏度等优点，是分析复杂组分混合物的有效方法。g c 一般与 氢火焰离子化检测器( f i d ) 和质谱检测器( m s ) 联用，f i d 灵敏度高，和碳原子质量 成线性响应，但抗干扰能力弱，且对样品前处理要求较高；m s 可直接对样品进行定性 分析，但样品纯度要求很高。g c m s 是目前最常用的检测易挥发和半挥发性有机污染 物的方法，该方法简便易行，可同时进行定性和定量分析。p o c r s c h m a n n t 4 7 1 采用g c m s 检测烟熏香肠中的p a h s ，样品经皂化、液液萃取、固相萃取柱净化浓缩，检出限在o 5 1 0 a g k g ，p a h s 回收率为6 9 1 2 1 。李永新【4 8 】等建立了g c m s 法测定熏肉中的p a h s - 样品经正己烷丙酮( 1 ：l ；v v ) 超声提取、氧化铝柱净化，用g c m s 分离测定。j i r a j 采用c , c m s 检测烟熏肉产品中的p a h s ，检出限可达0 0 1 1 0 0 0p g k g 。目前人们将 g c - m s 与固相微萃取技术相结合，大大缩短了分析时间，减少了人为误差。但是，g c m s 法不仅对样品纯度要求高，而且对于含有4 6 个苯环的高沸点p a h s 的分离尚存在困难。 ( 2 ) 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) h p l c 是二十世纪六十年代后期发展起来的一种新颖、快速的分离分析技术。近十 多h p l c 越来越受到色谱工作者的重视，特别是高沸点化合物的测定，在技术上取得了 很大的发展。h p l c 在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面都达到了和 g c 相媲美的程度，并保持了经典液相色谱对样品使用范围广、可供选择流动相种类多 等优点1 5 0 1 。 与气相色谱或气质联用相比，高效液相色谱法的主要优势是高分辨、高灵敏和高选 择性。h p l c 法不受挥发性和热稳定性的限制，有分离效果好、定量准确等优点，尤其 对于p a h s 中同分异构体的分离分析效果良好。近年h p l c 法已广泛应用于食品中p a h s 的测定【5 1 。删。h p l c 常用的检测器有紫外检测器( u v ) 、二极管阵列检测器( p d a ) 、蒸 发光散射检测器( e l s d ) 、荧光检测器( f l d ) 和质谱检测器( m s ) 等。 ( 3 ) 毛细管电泳法( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) c e 是近年出现的一种分析技术【5 5 】，利用物质离子在电场中的迁移速度不同来进行 分离检测，常用的检测器为紫外检测器。c e 具有高效率、高灵敏度、高速度、易实现 高自动化等特点。与h p l c 相比，c e 所需的样品量极岁堋，运行成本底，应用范围广， 几乎可以分离除挥发性和难溶物之外的各种物质。x u e 【5 7 l 等采用胶束毛细管区带电泳， 在激光诱导荧光检测下分离测定了6 种p a h s 。y a h 弼】等采用填充柱毛细管电色谱，在 4 5r a i n 内分离出了1 6 种p a h s 。 ( 4 ) 其他分析法 对p a h s 的分析，h p l c 和g - c m s 是目前最为广泛应用的两种方法。c e 技术是一 种新兴的分析方法，前景广阔。此外还有薄层色谱( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) 、 纸色谱( p a p e rc h r o m a t o g r a p h y ，p c ) 、免疫学方法等。薄层色谱法是二十世纪五十年代 发展起来的一种色谱技术，常用硅胶或氧化铝作为固定相吸附剂；纸色谱法则采用乙酞 化滤纸作固定相【s 9 】。t l c 和p c 设备简单、操作方便、易于掌握和推广，适合基层试验 4 第一章绪论 室应用。缺点是影响因素多、灵敏度低、分离度和重现性差，对p a h s 异构体不能有效 分离，只适宜分析成分简单的p a h s 。 1 3 4p a h s 的研究意义 对于肉类食品，许多人喜欢采用直接烤制来增加风味，改善色泽，以得到长时间的 保存，但这种加工过程容易使肉制品生成污染物p a h s ，p a h s 是脂溶性的化学性质稳定 的强致癌物。随着社会的发展，肉制品中p a h s 的污染己成为世界各国广泛关注的问题。 对肉制品中的p a h s 进行快速、准确的检测是关系到人类健康的重要问题。我国进人 w t o 以后，建立食品安全检测体系，建立与国际相关实验室互认的检测方法，确立食 品安全技术规范，成为迫在眉睫的问题。目前用于p a h s 的分析、检测方法较多，如高 效液相色谱、气相色谱质谱联用等，但还没有形成一套完整的检测体系，因此，需要 建立一套准确、快速的检测方法，能够对肉制品中p a h s 进行定性和定量分析。 1 4 毛细管电泳 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ，c e ) ，又称高效毛细管电泳( h p c e ) ，是一 类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，迅速发展 于八十年代中后期。它依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异来实现分离1 6 0 - 6 3 。 毛细管电泳不仅具有高效、快速等特点，还有易实现自动化、溶剂消耗少、操作简便和 环境污染小等优点，因而一出现便受到科学界的广泛关注 6 4 - 6 7 1 。 1 4 1 胶束电动色谱法 胶束电动色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ，m e k c ) 是在毛细管区带电 泳的基础上发展起来的一种基于胶束作用与电动移动的新型色谱。在过去的2 0 余年里 m e k c 因其操作简便、分析速度快、高效低耗、抗污染等特点越来越受到人们的重视， 并且因其在分离中性分子方面有其它毛细管电泳方法无n - i e g 拟的优势咿一o 】而在各方面 得到了广泛的应用，发展前景广阔。m e k c 所用的仪器与毛细管区带电泳( c z e ) 所用 的仪器相同，只是用胶束溶液代替c z e 中简单的缓冲溶液，从而引起电泳行为和分离 机理上的差异。在胶束电动色谱中，存在着以胶束形式存在的假固定相和作为载体流动 相的缓冲溶液，溶质与准固定相和流动相的相互作用的差异产生差速迁移，使得不同性 质的物质产生分离【7 1 7 4 】。 1 4 2 微乳毛细管电动色谱法 微乳毛细管电动色谱( m e e k c ) 是在胶束电动色谱( m e l ) 的基础上发展起来 的电泳新技术。这种方法通常以水包油( o w ) 型微乳液作为分离介质，根据溶质在微 乳液滴及水相间分配系数的差异来进行分离。m e e k c 通过电泳和色谱的共同作用，可 以分离水溶性、脂溶性、带电或不带电的物质【7 5 7 6 】。 m e e k c 的分离机制与m e k c 相似，它们的主要区别是微乳液中添加了亲脂性的有 机溶剂，这种有机溶剂进入胶团并包裹在胶团中心从而形成微乳粒子。微乳粒子的形成 提高了脂溶性化合物在微乳液中的溶解度，而大量物质的迁移使得m e e k c 具有较好的 江南大学硕士学位论文 分离效果。基于其高分离效率、高选择性、低消耗等优点，m e e k c 在药品分析【7 7 7 引、 手性分离7 9 1 、中性物质分析【8 0 1 、维生素的分离8 1 8 3 1 及环境分析等领域都有广泛的应用， 有望成为分析领域的又一个重要技术。将m e e k c 与高灵敏的激光诱导荧光检测器和质 谱检测技术联用，可提高分析检测能力，扩展其在环境领域的应用范围唧一5 1 。 1 5 毛细管电动色谱的富集方法 2 0 世纪后期，毛细管电泳技术已被广泛应用于不同领域的分析检测。但是较差的灵 敏度限制了毛细管电泳在痕量分析方面的应用。为了满足痕量分析的要求，需要提高 c e 的检测灵敏度。经过不懈的研究和探索，目前主要通过3 种方法来提高毛细管电泳 的检测灵敏度：通过增加光程来提高检测灵敏度，这种方法可以将紫外检测的灵敏度 提高1 0 倍至几十倍【婚蚓，但进一步发展的潜力较小。采用高灵敏度的检测技术，如 激光诱导荧光和电化学检测【8 嘲，但是前者仪器昂贵，后者则要求样品具有电化学活性。 采用样品富集技术，这种方法因无需对商品仪器进行改造从而更可行，通过对样品、 背景缓冲溶液的组成以及进样程序进行简单的调控而实现。近年已经发展了许多样品在 线富集的方法 9 3 一0 4 ，利用这些方法可以提高检测灵敏度，降低样品的浓度检测限，拓 展c e 在痕量分析领域的应用。 1 5 1 样品堆积技术 样品堆积法是毛细管电泳中应用最广泛的在线富集方法之一【1 0 5 1 0 6 1 。样品堆积的基 本原理是：将样品溶解在低电导溶液中引入毛细管，此时低电导的样品溶液和高电导的 背景缓冲液同时存在于毛细管中。在毛细管两端施加电压，由于样品区带的电导率低从 而形成高电场，样品离子的迁移速度加快。当样品离子穿越样品溶液和背景缓冲液的界 面时，由于电导率的增高，电场强度突然降低，样品离子亦瞬间减速，导致样品区带压 缩，样品浓度提高，各组分得到富集。 样品堆积方法又可以分为常规堆积模式( n o r m a ls t a c k i n gm o d e ，n s m ) 、大体积样 品堆积模式( l a r g ev o l u m es a m p l es t a c k i n g ，l v s s ) 、场放大样品堆积模式( f i e l d - a m p l i f i e d s a m p l es t a c k i n g ，f a s s ) 和p h 调制堆积模式( p h - m e d i a t e ds t a c k i n g ) 等。其中n s m 和l v s s 采用流体力学进样，f a s s 和p h 调制堆积采用电动进样【1 0 7 。 ( 1 ) 常规堆积模式( n s m ) n s m 是一种最简单的样品堆积模式，在n s m 中，由于分离效率和分离度的限制， 样品区带的长度必须较短，进样区带长会导致峰展宽。n s m 方法能得到的富集倍数只 有1 0 左右。 ( 2 ) 大体积样品堆积( l v s s ) l v s s 方法由c h i e n 和b u r # 提出，其进样体积比n s m 大很多( 样品的区带长度可 以达到整个毛细管长度的1 3 1 2 ) ，但是不会造成分离效率的明显降低。由于进样量增 大，为了保证分离效率，一部分样品基质必须排出毛细管。l v s s 的缺点是，不能同时 分离阳离子和阴离子，且对低淌度组分的分离有限制。l v s s 方法能得到的富集倍数在 6 1 0 0 以上。 ( 3 ) 场放大样品堆积( f a s s ) f a s s 方法最早由m i k k e r 提出。f a s s 采用电动进样，由于电动进样会产生样品歧 视，所以一次进样中只能进同种电荷的离子。电动进样是通过电渗流引入分析物，可以 大幅度提高分析的灵敏度，而且电动进样本身就具有一定的预富集效果1 0 8 。1 1 1 1 。 ( 4 ) p h 调制堆积 p h 调制堆积法最早是由l u n t e 等提出的。l v s s 和f a s s 方法都是将样品溶解在低 电导缓冲液中，对于含盐( 如尿液或血液等) 的电导很高的样品则很难适用。p h 调制 堆积法可以避免由于样品区带的导电性高于缓冲溶液而出现的去堆积现象。p h 调制堆 积法采用在样品电动进样后，电动进样一段强酸中和样品溶液而产生一个中性样品区 带，使该区带的电导大大降低，样品离子的迁移速率加快，在样品区带与背景缓冲液的 界面产生堆积。 1 5 2 扫集技术 扫集法( s w e e p i n g ) 由q u i r i n o 和t e r a b e 提出，它是一种在胶束电动色谱模式下在 线富集非极性分子的方法。该方法中，背景缓冲液是含有表面活性剂的胶束缓冲溶液， 而样品溶解在不含胶束的缓冲液中，当胶束穿过样品区带时，样品在胶束相中进行分配、 富集，富集的样品按胶束电动色谱进行分离。该方法可同时富集中性物质和带电物质， 且方法简单、富集效率高。在线s w e e p i n g 富集技术针对分析物的不同，可以使用不同 的表面活性剂作为胶束相来进行富集【1 1 2 川3 1 。 1 6 研究目标与基本思路 目前食品中p a i l s 的分析主要存在以下困难：痕量存在，且在萃取和纯化过程中 容易损失；杂质多，干扰定性和定量检测；( 要) p a h s 类物质结构相似，分离困难。本 实验分别建立h p l c u v 、m e e k c 、m e k c f a s s3 种检测方法来分析烤肉中的p a h s ， 并针对h p l c u v 对样品纯度的要求对烤肉的前处理进行优化考察。 ( 1 ) 高效液相色谱法分析前处理方法考察 h p l c u v 法是目前最常用的分析检测p a h s 的方法。但是由于肉制品中含有大量 的脂质、疏水蛋白质等物质不仅干扰p a h s 的定量分析，甚至会引起液相色谱柱的污染， 因此本实验针对烤肉的前处理过程进行考察，具体内容如下：考察了实验皂化的必要性、 固相萃取柱填料、洗脱溶剂选择与用量，建立适合分析烤肉中痕量p a h s 的前处理方法。 按照优化后的方法对市售烤肉进行预处理并进行高效液相分析检测，同时考察烤制时间 对烤肉中p a h s 含量的影响。 ( 2 ) 微乳毛细管电动色谱法分析烤肉中6 种p a h s m e e k c 中不存在色谱柱污染的问题，因此样品经超声提取、c 1 8 固相萃取柱的简单 7 江南大学硕士学位论文 处理后进行m e e k c 分析。本实验在m e e k c 的经典微乳体系的基础上进行改进，大幅 度增加助表面活性剂的用量，减少表面活性剂的用量，建立一种新来能够快速分析6 种 强致癌p a h s 的微乳体系。并通过对仪器条件的摸索与改进，对分析电压、分析温度、 进样时间等参数进行比较设定，选取最合理适用的仪器条件来分析烤肉中的p a h s 。 ( 3 ) 胶束电动色谱法场放大堆积富集法分析烤肉中6 种p a h s 由于紫外检测器的灵敏度较低，无法检测到烤肉样品中的痕量p a h s ，因此本章实 验在胶束电动色谱的基础上采用场放大样品堆积富集技术对6 种p a h s 进行分析检测。 首先通过对表面活性剂、有机添加剂( 乙腈) 、缓冲液p h 的条件摸索，建立一套合理的 分析烤肉中p a h s 的胶束电动色谱方法。再利用胶束粒子在不同电导率的溶液中迁移速 率不同，从而在两种溶液界面堆积富集的原理浓缩样品组分。通过对场放大样品堆积技 术中进水时间、进样量、进样电压等条件的优化，提高富集倍数，使检出限达到欧盟的 检测要求。按照优化后的方法对市售烤肉进行简单预处理并进行m e k c f a s s 分析检测。 通过对以上3 种分析方法的比较，建立切实可行的快速分析肉制品中多种p a h s 的 方法。 第二章h p l c 法分析烤肉中p a h s 第二章h p l c 法分析烤肉中p a h s 2 1 引言 随着经济的迅速发展，各国之间的竞争愈演愈烈。近年来一些发达国家不断采取以 安全、卫生、健康为由制定越来越高的技术法规和标准来限制他国产品进口，保护本国 利益。我国食品和其他出口产品常常被进口国以各种借口封关、扣留、退货、销毁，甚 至对我国实行全面禁止进口。针对以上情况，我们应该加强分析检测技术以应对国外对 我国设置的贸易壁垒。 多环芳烃类物质具有高持久性、半挥发性、生物蓄积性和潜在危害性，己引起国内 外学术界的广泛关注。因此实现食品中p a h s 的快速分析的研究是具有积极意义的。 高效液相色谱法是目前最常用的分析检测p a h s 的方法。但是由于肉制品中含有大 量的脂质、疏水蛋白质等物质不仅干扰p a h s 的定性、定量分析，甚至会引起液相色谱 柱的污染，因此本实验针对烤肉的前处理过程进行考察，考察皂化的必要性、固相萃取 柱填料、洗脱溶剂选择与用量，建立适合分析烤肉中痕量p a h s 的前处理方法。按照优 化的方法对市售烤肉进行预处理并进行高效液相分析检测，同时考察烤制时间对烤肉中 p a h s 含量的影响。 2 2 实验材料、仪器和试剂 2 2 1 材料 本实验所采用材料均为里脊肉，购自无锡市石塘疏导点。 2 2 2 仪器 多功能食品加工机：s q 2 1 1 9 ，上海帅佳电子科技有限公司； 电子分析天平：j a 2 0 0 3 ，上海分析天平仪器厂； 超声波：h s 3 1 2 0 d ，天津市恒奥科技发展有限公司； 旋转蒸发仪：r e 5 2 c ，巩义市英峪高科仪器厂； c s g 固相萃取柱：5 0 0r a g 6m l ，河北津杨器材厂； 针头式微孔滤膜过滤器：淮阴汉邦科技有限公司； 微孔聚丙稀滤膜：o 4 5 岬，上海市新亚净化器件厂； 高效液相色谱仪：w a t e r s515 型，u s a ； 检测器：w a t e r s2 8 4 7 型紫外检测器，u s a ； 色谱柱：n u c l e o d u rc 1 8 ，5p m ，2 5 0m m x 4 6m m 。 2 2 3 试剂 甲醇：色谱纯，江苏汉邦科技有限公司： 正己烷、丙酮、环己烷、二氯甲烷：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司； 9 江南大学硕士学位论文 中性氧化铝( 2 0 0 3 0 0 目) 、氢氧化钾、浓硫酸：中国医药集团上海化学试剂公司； 层析硅胶( 1 0 0 - 2 0 0 目) ：青岛海洋化工； p a i l s ：萘、二氢苊、芴、菲、葸、荧蒽、芘、苯并t a ) 葸、苯并( b ) 荧葸、苯并( k ) 荧蒽、苯并( a ) 芘、二苯并( 钆h ) 葸、苯并( g ，h ，i ) 芘购于德国d r 公司。 2 3 实验方法 2 3 1 样品前处理 市售烤制猪肉经食品加工机粉碎( 重复粉碎三次，每次1r a i n ) 后称取6 0g 至2 5 0m l 锥形瓶中，加入正己烷丙酮( 1 ：1 ；v v ) 溶液1 0 0m l 超声提取3 0m i n ，移出提取液， 另取1 0 0m l 正己烷丙酮( 1 ：1 ：v v ) 溶液超声提取3 0m i n ，合并两次提取液，转入 5 0 0m l 烧瓶中，加入1 5 0m l 含有2m o l lk o h 的甲醇水( 9 ：l ；v v ) 溶液，水浴8 0 ，皂化6h 。皂化液冷却至室温，移入1l 分液漏斗中，2 0 0m l 环己烷分2 次洗涤回 流瓶后移入分液漏斗中，振摇lr a i n ，静置分层。下层水溶液用1 0 0m l 环己烷进行二次 分配，合并环己烷层，分别用3 0 0m l ( 分3 次) 甲醇水( 1 ：1 ；v v ) 和4 0 0m l 水( 分 2 次) 洗涤环己烷层，弃去甲醇水溶液。环己烷层旋转蒸发至4 0m l 左右，移入2 5 0m l 分液漏斗中，用6 0 硫酸1 0 0m l 分2 次洗涤，弃去硫酸液，水洗环己烷层至中性，旋 转蒸发浓缩至2m l ，氮气吹干，1m l 甲醇溶解残渣。固相萃取柱c 1 8 预先经过2m l 二 氯甲烷、5m l 甲醇、5m l 水处理。上样后，5r n l 去离子水清洗，氮气吹干，6m l 二 氯甲烷洗脱，收集洗脱液，氮气浓缩至o 5m l 。 2 3 2 标准溶液配制 将各p a h s 标准品溶于二氯甲烷中，配制成含萘、二氢苊、芴、菲、葸、荧蒽、芘、 苯并( a ) 葸、苯并( b ) 荧葸、苯并( k ) 荧葸、苯并( a ) 芘、二苯并( 巩h ) 葸、苯并 ( g ，k i ) 芘浓度分别为1 0 0 0p g m l 、2 0 0 0p g m l 、2 0 0p 酌：1 1 l 、1 0 0p g m l 、1 0 0p g m l 、 2 0 0p g m l ，1 0 0g g m l ，1 0 0 肛g m l ，2 0 0p g m l ，1 0 0p g m l ，1 0 0 肛g m l ，2 0 0i l g m i ， 2 0 0 “g m l 的混合标准溶液。 2 3 3 液相色谱条件 采用w a t e r s5 1 5 液相色谱仪分离，w a t e r s 2 8 4 7 紫外检测器检测，色谱柱：n u c l e o d u r c 1 8 ，5l u n ，4 6 x 2 5 0 衄。流动相为甲醇：水( 9 3 2 ：6 8 ；v v ) ，流速：0 5m i m i n ，柱 温：2 5 ，进样量：2 0 止。 2 4 结果与讨论 实验过程中，样品经简单的前处理( 超声提取、浓缩) 后进行液相色谱分析，得到 的色谱图图中基质干扰明显，且同一样品试液连续进样分析得到的色谱图无论是色谱峰 数还是峰保留时间都有较大差异，说明色谱柱被污染。实验结果表明肉类这种含有干扰 杂质较多的样品在进行液相分析前首先要进行一定的除杂处理来预防色谱柱的污染，因 此，本章实验对烤肉的前处理过程进行考察。 1 0 第二章 l c 法分析烤肉中p a i l s 2 4 1 前处理技术优化 ( 1 ) 皂化 猪肉作为一种脂肪含量较高的基质，在多环芳烃的分析过程中脂肪的去除显得尤为 重要。脂肪去除不充分会最终导致样品检测的干扰。由于脂肪的极性与多环芳烃相似， 很难通过传统的物理分离方法( 如液液萃取、固相萃取、柱层析等) 去除。本实验中通 过皂化反应将脂肪转化为水溶性的甘油和脂肪酸盐去除。尽管有关文献报导可以不经皂 化反应而快速测定多环芳烃，实验过程中发现对基质复杂的样品，皂化步骤必不可少。 如图2 1a 所示，当烤肉经过超声提取和浓缩处理后进行液相分析，大量干扰峰妨碍了 p a h s 的分析测定，并且有可能损坏液相色谱柱。而图2 1b 中样品超声后经过皂化处理， 干扰峰明显减少，目标物出现。同时，实验在研究皂化的过程中也考察了皂化时间对皂 化效果的影响，发现皂化时间达到6h ，基质方可完全皂化，所以本实验中选择皂化时 间为6h 。 040 岫 童 o 越40 岫 图2 - i 烤肉( 烤制4m i n ) 不经皂化反应( a ) 和经过皂化反应( b ) 的液相色谱图 色谱分析条件：r p c 埔柱( 2 5 0m m x 4 6 姗i d ，5g r n ，n u c l e o d u r ，u s a ) ；流动相：甲醇水( 9 3 2 ：6 8 ； v v ) ；流速：o 5m l m i n ；检测波长：2 5 4n m f i g 2 1i - i p l cc h r o m a t o g r a mo f s a m p l e sg r i i l e df o r4m i n u t e sw i t hs a p o n i f i c a t i o np r o c e d u r e ( b ) a n d w i t h o u t ( a ) t h eh p l cd e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw b g l ea sf o l l o w s ：r e v e r s e d p h a s ec - 1 8c o l u m n ( 2 5 0 m i n x 4 6 咖i d ，5t u n ，n u c l e o d u r ，u s a ) ；m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o l - w a t e r ( 9 3 2 ：6 8 ；v v ) ；f l o w - r a t e ： 0 , 5m l m i n ；d e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a ss e ta t2 5 4n m 。 ( 2 ) 固相萃取 样品经过皂化反应和液液萃取虽已经去除了大量的杂质，但是要分析烤肉中的痕量 多环芳烃还需要进一步的净化。固相萃取以其简单易行、费用低等优点而被国内外学者 广泛用于多环芳烃的预处理。硅胶、佛罗里土、氧化铝是经常采用的固相萃取填料。本 实验先后分别考察了用硅胶、中性氧化铝、c 1 8 进行固相萃取对净化效果的影响。 首先，实验考察了硅胶作为柱填料进行固相萃取对净化结果的影响。实验中使用自 制硅胶柱( 3 0 0m m x l om m ) 。取1 0g 硅胶( 用前2 5 0 下烘6h ) 装柱，上端覆盖2g 钌= 南大学硕士学位论文 无水硫酸钠( 用前1 2 0 下烘4h ) 。上样后用5 0m l 环己烷洗脱，洗脱液浓缩至0 5m l 进行液相分析。如图2 2a 所示，干扰峰明显减小，但同时目标物p a h s 的回收率也很 低。为了提高p a h s 的回收率，加大洗脱剂用量，但回收率仍未有明显改善。同时也考 察了用苯作为洗脱剂进行洗脱，但回收率均未得到明显的提高。实验表明，硅胶对于多 环芳烃的吸附作用太强，不适合作为固相萃取填料来净化肉制品。 实验同时考察了中性氧化铝作为填料进行固相萃取对净化结果的影响。试验中使用 自制氧化铝小柱( 1 0 m m x lm m ) 。取1 9 中性氧化铝( 用前6 0 0 下烘6 h ) 装柱，上端 覆盖0 2g 无水硫酸钠( 用前1 2 0 下烘4h ) 。上样后用1 0m l 环己烷洗脱，洗脱液浓 缩至0 5m l 进行液相分析。如图2 2b 所示，虽然峰数增多，但目标物多环芳烃却更少。 为了提高样品的回收率，同时也考察了加大洗脱剂用量和用苯作为洗脱剂洗脱，但均未 使回收率得到明显提高。实验证明中性氧化铝不适合作为固相萃取填料来净化肉制品。 o1 0 州n 0 帅 图2 - 2 烤肉( 烤制4m i n ) 经硅胶固相萃取柱净化( a ) 和经中性氧化铝固相萃取柱净化( b ) 的液 相色谱图色谱分析条件同图2 - i f i g 2 - 2i - i p l cc h r o m a t o g r a mo fs a m p l e sg r i l l e df o r4 m i n u t e sw i t hs i l i c ag e la st h ec o l u m np a c k i n g ( a ) a n d n e u t r a la l u m i n aa st h ec o l u m np a c k i n g ( b ) c h r o m a t o g r a p h i ce x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r et h es a m ea sf i g 2 - 1 最后，实验考察了c 1 8 固相萃取小柱对净化结果的影响。c 1 8 键合固定相极性弱，与 多环芳烃结合力强，但对干扰物( 如蛋白质) 的结合力却很弱。因此，样品装柱后，先 用水去除极性杂质，然后用弱极性溶剂二氯甲烷洗脱，收集目标物多环芳烃，浓缩至0 5 m l 进行液相分析。如图2 3 所示，杂质大大减少，基线相对平滑。实验证明，c 1 8 固相 萃取柱可以用来对烤肉进行前处理净化。此外，c 1 8 固相萃取柱还有可以在市场上购买 和再生容易的优点，更简单，方便。 第二章i - i p l c 法分析烤肉中p a h s o 1 0 , t o5 0 图2 3 烤肉( 烤制4m i n ) 经c 1 8 固相萃取柱净化的液相色谱图 色谱分析条件同图2 1 ，图中各峰分别为：l ，萘；2 ，二氢苊；3 ，芴；4 ，菲；5 ，葸；6 ，荧蒽；7 ， 芘；8 ，苯并( a ) 蒽；9 ，苯并( b ) 荧蒽；1 0 ，苯并( k ) 荧蒽；1 1 ，苯并( a ) 芘；1 2 ，二苯并( a , h ) 蒽；1 3 ，苯并( g ，h , i ) 芘 f i g 2 - 3h p l cc h r o m a t o g r a mo fs a m p l e s 鲥l l 酣f o r4m i n u t e sw i t hc - 18a st h ec o l u m np a c k i n g c h r o m a t o g r a p h i ce x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r et h es a m ea sf i g 2 - 1 p e a k si d e n t i f i c a t i o n ：l ，n a p h t h a l e n e ；2 ， a c e n a p h t h y l e n e ；3