（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕精氨酸激酶的功能初步研究.pdf

。蠡、e 卜 ，、 ：。， 。托 ， ， 。 一k _ ，“n督r 学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国 学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。 论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密口。 学位论文作者签名：石墨导辫 沙f ，年多月乡j 日 指导教师签名： ! ) | | 年易，v i ttv 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 p r e l i m i n a r yc h a r a c t e r i s t i cr e s e a r c ho nb o m b y x m o r i a r 2 f kinase(13mak)argininei r a n a s e 姓 2 0 1 1 年6 月 江苏大学硕士学位论文 摘要 精氨酸激酶是一种广泛存在于无脊椎生物并在能量代谢中发挥 重要作用的磷酸原激酶。目前，人们已经鉴定了多种生物的精氨酸激 酶基因，但是针对家蚕精氨酸激酶基因相关的报道还比较少。 本研究通过生物信息学与实验相结合的方法克隆到了家蚕精氨 酸激酶基因，并对它结构和功能进行了初步研究。主要结论如下： ( 1 ) 从g e n b a n k 中搜索到家蚕b r e a k 基l 因( g e n b a n k 登录号： q d 2 7 2 2 9 9 ) ，并运用相关的生物信息学软件对其进行了分析，结果表 明b r e a k 基因定位在家蚕第5 号染色体上，其c d n a 全长为1 2 6 8b p ， 含有两个外显子和一个内含子，5 和3 非翻译区分别为3 0 和1 7 0b p ， 开放阅读框( o 啪全长为1 0 6 8b p ，编码3 5 5 个氨基酸，相对分子量为 4 0k d a ，等电点为5 8 7 。b r e a k 蛋白在进化上非常保守，通过多重序 列比对发现它与其他9 个物种的a k 序列相似度较高。 ( 2 ) 根据序列设计特异性引物，采用p c r 技术扩增b m a k 全长基 因，采用p e t - 2 8 a ( + ) 载体在大肠杆菌r o s e t t a 中进行了融合表达，且 得到了可溶性蛋白。利用n i t n a 柱通过亲和层析法纯化出有活性的 蛋白质，通过质谱技术和w e s t e r nb l o t t i n g 实验进一步证实了质粒 p e t 2 8 a ( + ) - b m a k 在大肠杆菌r o s e t t a 中表达的重组蛋白为 h i s b m a k 融合蛋白。同时酶活力测定实验证明该重组蛋白具有消耗 a t p ，即转运高能磷酸基团的能力。通过细胞免疫荧光实验发现该基 因主要定位于细胞质或细胞质的某些组织上。 i 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 ( 3 ) r t - p c r 结果显示该基因在家蚕各组织和各发育阶段都有表 达，但在血淋巴、卵巢、精巢中的表达量较低，在脂肪体中的表达量 较高；除在二龄和三龄家蚕中的表达量较低外，其余各发育阶段都有 表达，尤其在五龄的表达量最高。利用抗核型多角体病毒家蚕品系 n b 、敏感性品系3 0 6 和用它们构建的近等基因系b c 8 研究了a k 在 家蚕抗核型多角体病毒病中所发挥的作用。我们对这些家蚕品系添食 病毒后2 4 小时的中肠样本进行了荧光定量p c r 检测，发现a k 基因 的转录在添食病毒的n b 和b c 8 两个抗性品系的中肠样本中呈现显 著性的升高，而在3 0 6 感性品系中的表达量在添毒前后变化不明显。 w e s t e r nb l o t t i n g 实验也进一步证明了该实验结果。这些结果都暗示 b m a k 可能参与到家蚕抗病毒的免疫应答过程中。 关键词：家蚕，精氨酸激酶，酶活力测定，细胞定位，荧光定量p c r ， 免疫应答 江苏大学硕士学位论文 a b s t ra c r a r g i n i n ek i n a s e ，ak i n do fp h o s p h a g e nk i n a s e ，i saw i d e l yp r e s e n ti n i n v e r t e b r a t e sa n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ne n e r g ym e t a b o l i s m t od a t e ， a kh a v eb e e ni d e n t i f i e di nm a n ys p e c i e s ，h o w e v e r , f e wr e p o r t sh a v eb e e n p u b l i s h e do na k i nb o m b y xm o r i0 3 m a k ) t j s i n g t h em e t h o d c o m p r i s e de x p e r i m e n t a n db i o i n f o r m a t i c s a p p r o a c h e s ，w ec l o n e da r g i n i n ek i n a s eg e n eo fb m o r i ，a n dm a d es o m e b a s i c a la n a l y s i so ft h eg e n ei nt h i ss t u d y t h er e s e a r c hp r o c e s sa n dt h e m a i nc o n c l u s i o n sa r ep r e s e n ta sf o l l o w s ： ( 1 ) w eg o t t h es e q u e n c eo fa k g e n ef r o mg e n b a n k ( g e n e b a n k a c c e s s i o nn o ：q d 2 7 2 2 9 9 ) a n da p p l y e dr e l e v a n tb i o i n f o r m a t i c s ，w h i c h i n d i c a t e dt h a tt h eb r e a kg e n el o c a t e do nc h r o m o s o m e5a n di t s f u l l l e n g t he d n a w a s1 2 6 8b p ，c o n t a i n i n gt w oe x o n sa n do n ei n t r o n ，5 a n d3 u n t r a n s l a t e dr e g i o nw e r e3 0a n d1 7 0b p ，r e s p e c t i v e l y t h eo p e n r e a d i n gf r a m ew a s1 0 6 8b p ，e n c o d e d3 5 5a m i n oa c i d so f4 0k d a ，a n d i s o e l e c t r i c p o i n to f5 8 7 b m a kp r o t e i n h a sh i g h l yc o n s e r v e di n e v o l u t i o n ，w h i c hs h a r e dh i g l ls i m i l a r i t yw i t hh o m o l o g o u ss e q u e n c eo f o t h e r9s p e c i e s ( 2 ) s p e c i a lp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yt h eb m a k b yp c r a n d e x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ir o s e t t aa s af u s i o np r o t e i nw i t ht h e p e t - 2 8 a ( + ) v e c t o r t h er e c o m b i n a n th i s t a g g e db m a kp r o t e i nw a s 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 e x p r e s s e di ns o l u b l ef o r mi nr o s e t t aa n dp u r i f i e db ym e t a lc h e l a t i n g a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , w h i c h w a sf u r t h e rc o n f i r m e d b y m a s s s p e c t r o s c o p i ca n a l y s i sa n dw e s t e r nb l o t t i n g a n dt h ee n z y m ea c t i v i t y a s s a yi n d i c a t e dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sa b l et ot r a n s f e rt h eg a m m a p h o s p h o r y lg r o u po fa t pt oa r g i n i n e i m m u n o f l u o r e s e n c ea n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tb m a kw a sm a i n l yl o c a t e dt ot h ec y t o p l a s mo rs o m e s t r u c t u r ei nc y t o p l a s m ( 3 ) t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fb m a k f l u c t u a t e si nv a r i o u sd e v e l o p i n g s t a g ea n dv a r i o u st i s s u eb yr t - p c r h e r e ，t of u r t h e ri n v e s t i g a t et h eb m o r ia n t i - b m n p vm e c h a n i s m ，w ec a r r i e do u tr e a l t i m ep c r a n a l y s i si n h i g h l yr e s i s t a n ts t r a i nn b ，h i g h l ys u s c e p t i b l es t r a i n3 0 6a n db c 8 ( t h e n e a ri s o g e n i cs t r a i nw h i c hi n h e r i t ss u s c e p t i b l eg e n e t i cb a c k g r o u n db u t w i t ht h er e s i s t a n tt r a i ta g a i n s tb m n p v ) ，a n di d e n t i f i e dg e n e se n c o d i n g a k w h i c hw a su p 。r e g u l a t e di nt h em i d g u t so fn ba n db c 8i n2 4p o s t i n f e c t i o nh o u r ( h p i ) o v e rt h e i rc o n t r o l s w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i su s i n g p o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tb m a k l u t h e rd e f i n e ds u c ho b s e r v a t i o n t h u s , o u rd a t as t r o n g l yi n d i c a t e dt h a tb r e a km a yb ei n v o l v e di nb m o r i i m m u n er e s p o n s ea g a i n s tb m n p vi n f e c t i o n k e y w o r d s ：b o m b y xm o r i , a r g i n i n e k i n a s e ，e n z y m a t i ca c t i v i t y ， s u b c e l l u l a rl o c a t i o n ，r e a l t i m e q u a n t i t a t i v ep c r ，i m m u n e r e s p o n s e 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 目录 1 1 1酶1 1 1 1 酶的概述1 1 1 2 酶的发现1 1 1 3 酶的应用2 1 2 磷酸原激酶。3 1 2 1 磷酸原激酶概述。3 1 2 2 磷酸原激酶研究概况4 1 2 3 磷酸原激酶的作用5 1 3 精氨酸激酶6 1 3 1 精氨酸激酶的研究概况。6 1 3 2 精氨酸激酶的进化研究。7 1 3 3 精氨酸激酶的催化活性8 1 3 4 精氨酸激酶的研究意义9 1 4 本研究的目的和意义1 0 1 5 主要研究内容和技术路线1 0 1 5 1 主要研究内容1 0 1 5 2 主要技术路线1 2 第二章家蚕a k 基因的生物信息学分析及克隆鉴定 2 1 材料与试剂1 3 2 1 1 质粒和菌株1 3 2 1 2 式剂1 3 2 1 3 试剂的配制。1 3 2 1 4 仪器1 5 2 2 实验方法。1 5 2 2 1 家蚕精氨酸激酶基因的克隆1 5 2 2 2 家蚕精氨酸激酶基因的分析。1 8 v 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 2 3 结果与分析1 8 2 3 1家蚕精氨酸激酶基因的序列分析。1 8 2 3 2 家蚕精氨酸激酶氨基酸序列分析及进化树的构建1 9 2 3 3b m a k 基因的克隆与鉴定2 2 2 4 讨论与小结2 3 第三章b m a k 基因在大肠杆菌中的表达、多克隆抗体的制备及亚细胞定位2 4 3 1 材料和试剂2 4 3 1 1 菌株和载体2 4 3 1 2 试剂2 4 3 1 3 试剂的配制2 5 3 1 4 仪器2 7 3 2 实验方法。2 7 3 2 1b m a k 表达载体的构建2 7 3 2 2b m a k 基因在大肠杆菌中的表达。2 8 3 2 3w e s t e r nb l o t t i n g 2 8 3 2 4 质谱分析。2 9 3 2 5n i n t a 亲和层析柱分离纯化蛋白质3 0 3 2 6 多克隆抗体的制备及纯化3 0 3 2 7 细胞免疫荧光3 1 3 3 结果与分析3 l 3 3 1 原核表达载体的构建3 1 3 3 2s d s p a g e 分析。3 2 3 3 3重组蛋白的质谱鉴定3 3 3 3 4 蛋白纯化，抗体制备与抗体的检测：3 4 3 3 5b m a k 的亚细胞定位3 4 3 4 讨论和小结3 5 第四章家蚕b r e a k 蛋白的可溶性表达及酶活力测定。3 6 4 1 材料与试剂。3 6 4 1 1 材料3 6 v i 江苏大学硕士学位论文 4 1 2 试剂3 6 4 1 3 试剂的配制3 6 4 1 4 仪器3 7 4 2 实验方法。3 7 4 2 1b m a k 原核表达条件的优化3 7 4 2 2b m a k 融合蛋白可溶性表达条件的摸索3 7 4 2 3 可溶性b r e a k 融合蛋白的分离与纯化3 8 4 2 4b m a k 酶活性的测定3 8 4 3 结果与分析3 9 4 3 1 重组b r e a k 融合蛋白表达i p t g 诱导浓度的优化3 9 4 3 2 诱导温度对b r e a k 表达量的影响。3 9 4 3 3 可溶性b r e a k 融合蛋白表达条件4 0 4 3 4 重组b r e a k 的分离与纯化4 0 4 3 5 重组b m a k 蛋白的酶活性分析4 1 4 4 讨论与小结4 2 第五章b m a k 基因在转录水平及蛋白水平的表达特征分析 5 1 材料和试剂4 3 5 1 1 材料4 3 5 1 2 试剂z l ：； 5 2 实验方法4 3 5 2 1b m a k 基因在家蚕不同组织和不同发育阶段的表达分析4 3 5 2 2 b m a k 基因在添毒后2 4h 家蚕中肠的表达分析4 4 5 2 3b r e a k 在添毒后2 4h 家蚕中肠的表达分析。4 6 5 3 结果与分析4 6 5 3 1b m a k 基因在家蚕不同组织中的表达分析4 6 5 3 2b m a k 基因在家蚕不同发育阶段的表达分析4 7 5 3 3 接种b m n p v 后b m a k 基因在家蚕品系3 0 6 、n b 和b c 8 中肠的 荧光定量分析4 7 5 3 4 接种b m n p v 后b r e a k 蛋白在家蚕品系3 0 6 、n b 和b c 8 中肠的 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 免疫印迹分析4 8 5 4 讨论与小结。4 9 第六章总结和展望 5 1 6 1 主要工作总结5 1 6 2 工作展望5 2 参考文献 参加课题 v 5 3 5 8 江苏大学硕士学位论文 1 1 酶 1 1 1 酶的概述 第一章绪论 酶( e n z y m e ) ，指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白 质组成( 少数为砌蛆) 。它能在机体内十分温和的条件下，高效率地催化各种生 物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和 生殖都是酶促反应过程。细胞新陈代谢包括所有化学反应几乎都是在酶的催化下 进行的，例如食物必须在酶的作用下降解成小分子，才能透过肠壁，被组织吸收 和利用。根据酶催化的反应性质的不同，将酶分成六大类：氧化还原酶类 ( o x i d o r e d u c t a s e ) 、转移酶类( t r a n s f e r a s e s ) 、水解酶类( h y d r o l a s e s ) 、裂合酶类 ( 1 y a s e s ) 、异构酶类( i s o m e r a s e s ) 、合成酶类( 1 i g a s e ) 。酶催化反应的实质主要 是降低反应的活化能( 用反表示) ，而酶作为反应的催化剂，本身在反应过程中 不被消耗，也不影响反应的化学平衡。 酶与无机催化剂都具有以下特点：1 ) 改变化学反应速率，本身几乎不被消 耗；2 ) 只催化已存在的化学反应；3 ) 加快化学反应速率，缩短达到平衡时间， 但不改变平衡点；4 ) 降低活化能，使化学反应速率加快；5 ) 都会出现中毒现象。 而作为生物催化剂，酶具有无机催化剂所没有特性，包括：1 ) 高效性，即酶的 催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；2 ) 专一性，即一种酶只能催 化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；3 ) 多样性，酶的种 类很多，大约有4 0 0 0 多种；4 ) 温和性，是指酶所催化的化学反应一般是在较温 和的条件下进行的；5 ) 活性可调节性，包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调 节、共价修饰调节和变钩调节等；6 ) 有些酶的催化活性与辅因子有关；7 ) 易变 性，由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。 1 1 2 酶的发现 所谓酶，在希腊语里是存在于酵母中的意思。因为人们在酵母中发现各种进 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 行着生命活动的物质，然后这样对它们命名。此时，“酵母 始终是活着的生命 体= 微生物、“酶 是活着的物质= 制造出生命活动的不可思议的物质。但是酶不 等于酵母，只可以说酵母是自然界所有生物体中单位体积内含酶种类及酶最丰富 的，尤其是啤酒酵母。酵母是单细胞微生物，内含有许多酶，酵母具备细胞组织， 而酶则是蛋白质，通常一个酵母菌里有数千冲蛋白质，所以说酵母中含有酶，但 是酶并不等于酵母。 酶的发现来源于人们对发酵机理的逐渐了解。早在1 8 3 3 年p e y e n 和p e r s o z 从麦芽的水提取物中，用酒精沉淀得到一种对热不稳定，能使淀粉转化成可溶性 糖的物质，他们称之为d i a t a s e ，意为“分离 ，但对于其对应的机理则并不了解。 1 8 3 5 1 8 3 7 年b e r z e l i u s 提出了催化作用的概念，这对以后有关酶学的研究起到 了很大的促进作用。到了1 9 世纪中叶，法国科学家路易巴斯德对蔗糖转化为 酒精的发酵过程进行了研究，认为酵母的乙醇发酵是由于酵母细胞的活动结果， 即在酵母细胞中存在一种活力物质，命名为“酵素 ( f e r m e n 0 。他提出发酵是这 种活力物质催化的结果，并认为该活力物质只存在于生命体中，细胞破裂就会失 去发酵作用。1 8 7 8 年，德国生理学家k i i h n e d i n g 首次提出了酶( e n z y m e ) 这_ 概念。 随后，酶被用于专指胃蛋白酶等一类非活体物质，而酵素则被用于指由活体细胞 产生的催化活性。但这种对酶的错误认识很快便得到纠正。1 8 9 7 年，德国科学 家b i i c h n e r 开始对不含细胞的酵母提取液进行发酵研究，并制备了不含酵母细胞 的酵母提取液，通过在柏林洪堡大学所做的一系列实验最终证明发酵过程并不需 要完整的活细胞存在，从而推翻了p a s t e u r 的只有活酵母细胞才能使糖发酵的理 论，他将其中能够发挥发酵作用的酶命名为发酵酶( z y m a s e ) 。这一贡献打开了通 向现代酶学与现代生物化学的大门，其本人也因“发现无细胞发酵及相应的生化 研究 而获得了1 9 0 7 年的诺贝尔化学奖。1 8 9 8 年d u c l a u x 提出在催化底物或者 反应类型的名字最后加上a s e 的后缀来表示酶的英文名称，而对应中文命名也采 用类似方法，即在名字最后加上“酶 。在此之后，酶和酵素两个概念合二为一， 并依据比希纳的命名方法，酶的发现者们根据其所催化的反应将它们命名。 1 1 3 酶的应用 2 随着对酶研究的发展，酶在医学上的重要性越来越引起了人们的注意，应用 江苏大学硕士学位论文 越来越广泛。由于人体内某些酶的缺乏可导致一些先天性或者遗传性的疾病，如 白化症是由酪氨酸羟化酶缺乏所致，蚕豆病或对伯氨喹啉敏感患者是因体内缺乏 6 一磷酸葡萄糖脱氢酶；而且很多中毒性疾病几乎都是由于某些酶被抑制所引起， 如常用的有机磷农药中毒时，就是因为它们与胆碱酯酶活性中心必需基团丝氨酸 上的一个o h 结合而使酶失去活性，而金属离子引起人体中毒，则是因为金属离 子( 如h 9 2 + ) 可与某些酶活性中心的必需基团( 如半胱氨酸的s h ) 结合而使酶 失活。 正常人体内酶活性较稳定，当人体某些器官和组织受损或发生疾病后，某些 酶被释放入血、尿或体液内引起酶含量的变化，因此酶还可以应用于疾病诊断。 如急性胰腺炎时，血清和尿中淀粉酶活性显著升高：肝炎和其它原因肝脏受损， 肝细胞坏死或者通透性增强，大量转氨酶释放入血液，使得血清转氨酶含量升高； 心肌梗塞时，血清乳酸脱氢酶和磷酸肌酸激酶明显升高等等。近年来，酶疗法己 逐渐被人们所认识，广泛受到重视，各种酶制剂在临床上的应用越来越普遍，如 蛋白酶、糜蛋白酶等，能催化蛋白质分解，此原理已用于外科扩创，化脓伤口净 化等。在心肌梗塞、肺梗塞等疾病的治疗中，可应用纤溶酶、尿激酶等以溶解血 块，防止血栓的形成等。一些辅酶，如辅酶a ，辅酶q 等，可用于脑、心、肝、 肾等重要脏器的辅助治疗。 酶在生产、生活中的应用也比较广泛。如酿酒工业中使用的酵母菌，就是通 过有关的微生物生产的酶将淀粉等通过水解、养化等过程，最后转化为酒精；酱 油、食醋的生产也是在酶的作用下完成的；用淀粉酶和纤维素酶处理过的饲料， 营养价值提高；洗衣粉中加入酶可以使洗衣粉效率提高，使原来不易除去的汗渍 等很容易除去等。 1 2 磷酸原激酶 1 2 1 磷酸原激酶概述 磷酸原激酶是一大类酶的总称，多位于动物体内能量消耗以及能量波动比较 大的组织，例如脑、神经、肌肉、复眼以及精子尾部等部位，对于动物体内能量 的代谢、储存和利用具有至关重要的作用【1 】。磷酸原激酶催化a t f 上的高能磷 3 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 酸基团可逆地转移至生物体内天然存在的一类胍基化合物上，分别生成对应的磷 酸原化合物以储存a t p 上高能磷酸键的能量。反应式如下： g u a n i d i n oa c c p t o r + m g a t e 卜_ p h o s p h a g e n + m g a b p + 矿 这一类磷酸原化合物目前包括磷酸肌酸( c p ) 、磷酸胍基乙酸( g p ) 、磷酸 脒基牛磺酸( 1 1 p ) 、胍乙基磷酸丝氨酸( ) 和磷酸精氨酸( a p ) f 2 1 。所对应 的磷酸原激酶分别称作：肌酸激酶( c k ) ，胍基乙酸激酶( g k ) ，脒基牛磺酸激 酶( t k ) ，胍乙基磷酸丝氨酸激酶( l l ( ) 和精氨酸激酶( a k ) 。磷酸原激酶广 泛存在于多种动物体内，一般认为胍基乙酸激酶、脒基牛磺酸激酶、胍乙基磷酸 丝氨酸激酶和精氨酸激酶主要存在于无脊椎动物体内，而肌酸激酶则主要存在于 脊椎动物体内。 高能磷酸原在能量储备方面起着关键的作用，因为当机体需要a t p 再生时， 可以在磷酸原激酶的催化下由磷酸原转化而来。另外，磷酸原激酶还参与调节糖 原分解【3 】，以及被用来在细胞内部不同部位之间迅速传递能量【4 】。因此，磷酸 原化合物不仅是一个能量储备库，而且在不断耗能的体系中它更是一个能量传递 体【5 】。 1 2 2 磷酸原激酶研究概况 第一个完整的磷酸原激酶的e d n a 序列是在1 9 8 4 年由p u m e y 公布的6 1 。 通过兔肌肌酸激酶的c d n a 序列得出了它的氨基酸序列。从这以后，对磷酸原 激酶的研究发展迅速，包括海参、海胆、海葵、蛤、鞭毛虫、蚯蚓等多种动物体 内存在的磷酸原激酶的c d n a 基因不断被克隆出来f 7 1 1 1 。目前研究的热点主要 集中在研究磷酸原激酶的进化_ e 1 2 1 6 1 。 通过对多种磷酸原激酶氨基酸序列比较发现，在所有磷酸原激酶中存在一段 特殊序列，序列中氨基酸数目的多少与对应胍基底物的大小成反比f 2 1 ，人们将 这段序列称作“胍基底物结合区”( g s 区) 1 7 。通过与已发表的c k 的晶体结 构f 1 8 1 进行比较，发现g s 区的一部分就位于小柔性环中，f r i t z w b l f 曾推测在催 化过程中，g s 区向活性位点靠拢以提供疏水环境 1 9 1 。这种运动已经被1 9 9 8 年 解出的a k 的底物结合过渡态( a k - t s a c ) 晶体结构所证实f 2 0 1 。进一步研究发 现，尽管双亚基a k 的序列在总体上与c k 的同源性比其它单亚基a k 的同源性 4 江苏大学硕士学位论文 高，但是恰恰在g s 区，其氨基酸数目却与单亚基a k 相同，都比c k 少4 个氨 基酸，由此进一步说明g s 区很可能对于磷酸原激酶特异性识别其对应的胍基底 物具有重要的作用f 2 】。而且，g s 区的大小很可能决定了磷酸原激酶的类型。将 各种磷酸原底物分子的大小以及g s 区进行比较可见，g s 区对于同一种磷酸原 激酶不但是高度保守的，而且对于同一种磷酸原底物其长度相同，且长度和磷酸 原底物的大小成反比，即磷酸原底物大小为：g p c p a k l k 2 。 1 2 3 磷酸原激酶的作用 w a l l i m a n n 概括了磷酸原及磷酸原激酶的生物功f l 邑 2 1 ：( 1 ) 具有能量暂时 缓冲作用；( 2 ) 具有空间能量缓冲作用：( 3 ) 可提高氧化磷酸化的效率。当生物 体消耗的a t p 量超过线粒体产生的a t p 量时，由磷酸原激酶催化磷酸原形成 a t p ，起到缓冲能量的作用；而能量的空间缓冲则是指心肌细胞等的线粒体磷酸 原激酶可将a t p 转化成磷酸原，扩散到细胞质中后，继而在磷酸原激酶的催化 下，重新形成a t p 。研究结果也显示，线粒体磷酸原激酶通过保持低浓度a t p 从而提高氧化磷酸化的效率。 磷酸原激酶对与生物能的代谢、贮存和利用至关重要。肌肉组织中存在丰富 的磷酸原激酶，可维持肌肉收缩过程中的a t f 稳态【2 2 1 。在组织安静时磷酸原激 酶将能量存储在磷酸原化合物高能磷酸键中，而当组织消耗大量能量而糖原分解 不能及时补充能量时，它们又迅速使磷酸原化合物分解用以补偿或者缓冲这些部 位的能量消耗及a t p 浓度的剧烈变化【2 1 】。磷酸原激酶在需要大量能量的组织如 脑、肾中也有大量表达，主要用于离子运输、突出传递【2 3 】。此外，生殖细胞精 子的运动型、肠内上皮细胞绒毛小突的收缩，同样受到c k 或者a k 的调控f 2 4 1 。 另外，也有研究发现细胞分裂后期的微观蛋白驱使纺锤体移动所需的a t p 与磷 酸原激酶也似乎有关 2 5 1 。 5 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 1 3 精氨酸激酶 1 3 1 精氨酸激酶的研究概况 精氨酸激酶( a r g i n i n ek i n a s e ，a t p 精氨酸n 磷酸转移酶，e c2 7 3 3 ) 是 一种磷酸原胍基化合物的激酶，主要存在于无脊椎动物的体内，可以催a t p 与 精氨酸之间磷酸基团的可逆性交换，生成a d p 和磷酸精氨酸，反应需要二价金 属离子如m 9 2 + ，m n “，反应式如下【1 ，2 6 】： l - a r g i n i n e + m g 册一一n - p h o s p h o l - a r g i n i n e + m g a d p 目前已经在许多种无脊椎动物中都发现了a k 的存在，例如有鳌节肢动物 ( c h e l i c e r a t ea r t h r o p o d ) l i m u l u sp o l y p h e m u s 2 7 ，腹足动物( g a s t r o p o d ) c e l l a n ag r a t a 和a p l y s i ak u r o d a i 2 8 】，海参s t i c h o p u sj a p o n i c u s 1 7 】，头足类动物n a u t i l u s p o m p i l i u s 2 9 ，龙虾( 1 0 b s t e r ) h o m a r u sv u t g a r t 譬 3 0 l ，海葵( s e aa n e m o n e ) a n t h o p l e u r a j a p o n i c u s 1 2 ，海湾对虾( g u l f s h r i m p ) p e n a e u s 彪勉淞【3 1 】以及家蚕( s i l k w o r m ) b o m b y xm o r i 3 2 等。 研究发现，精氨酸激酶在雄性火蚁的腹部表达水平最高，这可能和精子形成 及生殖对能量的需求有关。在其头部的表达量也很高，这可能和大脑、肌肉以及 神经都集中于此有关。各组织以及不同分工火蚁中该酶的表达情况也不同，表明 社会性昆虫中不同组织和不同分工的阶层对能量的消耗和产生也有所不同，这和 不同组织的生理活性以及不同分工社会性昆虫执行任务不同相关 3 3 1 。而在蜜蜂 的复眼中，精氨酸激酶的表达水平也很高，至少比脑中表达水平高两到三倍，这 表明在需要高的以及波动能量需求的视觉系统中，精氨酸激酶是能量释放机制的 重要组成部分 3 4 1 。在克氏锥虫中，有学者研究了精氨酸激酶在上鞭毛体中的活 性以及与其生长的关系，为研究精氨酸激酶的调节与寄生虫对数生长期培养基成 分的变化关系作了很好的铺垫【3 5 】。r 硼- 觚a r o j p o n g 等发现在感染黄头病毒( y e l l o w h e a dv i r u s ，聊) 的南美白对虾中精氨酸激酶的表达量呈现上调趋势 3 6 1 ； a s t r o f s k y 也在感染了白斑病毒( w h i t es p o tv i r u s ，w s v ) 南美兰对虾中发现了这一 现象 3 7 1 ，这些研究结果都暗示了精氨酸激酶极有可能参与到生物对抗病毒的免 疫应答当中。 6 江苏大学硕士学位论文 1 3 2 精氨酸激酶的进化研究 探讨精氨酸激酶的起源分化一直是研究磷酸原激酶的热点之一。目前人们已 经获得了多种生物体内磷酸原激酶的c d 蝴氨基酸序列。通过同源性分析初步 得出的结论是：磷酸原激酶都是由一个共同的祖先进化而来，具有很高的同源性。 在生物进化过程中，尤其是从无脊椎动物向脊椎动物的进化过程中，磷酸肌酸激 酶可被分为两个家族，眦家族( a k 型基因) 和c k 家族( c k 型基因) 。所有 的单亚基a k 都属于a k 型基因，而所有c k 以及两种目前已知的胍基乙酸激酶和 胍乙基磷酸丝氨酸激酶属于c k 型基因。不过有一点例外，仅在棘皮动物( 如海 参) 体内发现的双亚批，其序列和基因结构却与c k 型更为相似1 7 1 。现有的 研究表明a k 一般分为单亚基a k ( 分子量约4 0k d 舢和双亚基a k ( 分子量约为8 0 k d a ) ，另外还存在一种特殊的分子量8 0k d a 的a k ，有人认为是双结构域单亚基 f 1 2 1 ，也有人认为是一种四聚体 3 8 1 。和c k 家族相当保守的外显子内含子边界组 成序列相1 比 3 9 ，4 0 l ，a k 家族似乎发生了很大的分化，这表明在精氨酸激酶的进 化过程中很频繁的发生着内含子的获得和缺失f 4 1 1 。通过序列比较绘制得到的进 化树可以看出，双亚基a k 属于c k 型基因，它与c k 更为相似：一个比较合理的 解释撇的进化实际上可能分为两步，第一步首先是c k 型基因与a k 型基因的 分化，这次形成了c k 和单亚基a k ，第二步是c k 基因的内含子发生漂移，从而 演变成双亚基a k 1 7 1 。 双亚基a k 一般位于棘皮动物体内( 如海参【1 1 ，1 7 1 ，海1 n 4 2 等) ，因此棘 皮动物在磷酸原激酶进化中的地位显得非常特殊，人们一般由此认为棘皮动物是 a k 和c k 基因进化分化的分支点，尽管这种说法难以解释某些特例，但到目前为 止，符合大多数的发现。人们曾在海胆中发现单亚基c k 和双亚基a k 共存的现象， 其中单亚基c k 含有三个完整的a k 片段，虽然互不相同，但三个片段分别与其他 类型c k 的同源性都很高，被认为是c k 分化不完全而残留的进化证据f 1 5 1 。 实际上，在磷酸肌酸激酶的进化过程中，精氨酸激酶至少发生了两次演变： 在后生动物进化前磷酸肌酸激酶进化的早期阶段( 后代是单体的精氨酸激酶) ； 在后生动物进化的后期从肌酸激酶进化而来( 棘皮动物门的二聚体精氨酸激酶) 【4 3 。 7 家蚕精氨酸激酶的功能初步研究 1 3 3 精氨酸激酶的催化活性 m o r r i s o n 等人最早对a k 催化动力学进行了较详细的研究 4 4 】。a n o s i k e 和 m o r r i s o n 等人的结果表明镁离子对催化反应非常重要，而且催化动力学符合随机 双底物两个终态复合物快速平衡的动力学机制f 1 1 ，4 5 。然而，同位素交换实验 证实，此类酶也会在一定程度上缓慢催化a 1 1 p 与a d p 或者精氨酸与磷酸精氨酸之 间的磷酸基团的交换，这种催化机制属于乒乓机$ 1 j 4 6 。 早在1 9 9 8 年，z h o u 等人已经利用来自于马蹄蟹l i m u l u s p o l y p h e m u s 的单亚基 的a k 解出了结合有过渡态类似物的a k 的过渡态的晶体结构( 分辨率：1 8 6 a ) f 2 0 ，结果显示a k 由一个小的全a 一螺旋的n 端结构域和一个大的c 端结构域( 1 1 2 号- - 3 5 7 号残基) 组成。c 端结构域和谷氨酸合成酶的c 端结构域相似，8 股反平 行d 一折叠被7 个a 一螺旋包绕着( 见图1 1 ) 。从这个结构上看，过渡态类似物并 不是结合在两个结构域中间，而是结合在c 端结构域内部，也就是说a k 的活性 部位是在c 端。而t s o u 等在1 9 9 3 年提出酶的活性部位是处于一个比较柔性的部 位，这个部位的结构比别的部位更容易受到外界不利因素的影响，其结果是它能 导致酶的活性的丧失要比酶的整个结构的丧失更快、更容易f 4 7 1 。人们通过实验 证实了单体a k 中半胱氨酸【4 8 ，4 9 、组氨酸【5 0 】、赖氨酸【5 1 】和酪氨酸【5 2 】是胍基 底物及核苷结合所必需的残基。其中，赖氨酸残基是核苷与酶结合所必需的，而 酪氨酸是核苷和胍基底物与酶结合都必需的。姚翠鸾等提取和纯化了凡纳滨对虾 中的精氨酸激酶，通过研究发现儿纳滨对虾中该酶对温度的耐受性较高，在p h 6 o 8 0 时比较稳定，且对温度, t j 之p h 的稳定性与其他虾类表现出较高的相似