（农产品加工及贮藏工程专业论文）高产γ氨基丁酸乳酸菌的筛选.pdf

湖南农业大学硕士学位论文 摘要 i ，一氨基丁酸( y - a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) 是一种广泛分布于动植物体内 的非蛋白质氨基酸，它对人体具有多种生理功能，g 一氨基丁酸是哺乳动物中神 经系统的主要抑制性递质，介导了4 0 以上的抑制性神经传导，参与脑循环生理 活动，具有抗心律失常功能，具有降血压、抗惊厥、镇痛、改善脑机能、精神安 定、促进长期记忆等功能，g a b a 可作为少年儿童智力的营养补充剂和促进剂。 促进生长激素分泌，肾功能活化，肝功能活化，抗疲劳等生理功能。 在国外利用乳酸菌发酵制作的富含g a b a 的食品配料，均可直接作为或者用 于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。在我国，有关利用生物技术生产 g a b a 的研究，主要集中在一些高校和科研院所。但其研究成果中产g a b a 能力都 不高，也很少能应用于工业化生产。筛选具有高活力g a d 的乳酸菌菌株以及探索 实用的乳酸菌生产g a b a 的途径和高效的提取纯化工艺将具有广泛的经济效益和 社会效益。本论文主要包括了以下几方面的研究； ( 1 ) 高产g a b a 乳酸菌的筛选 采用梯度稀释法从加有质量分数为1 的米糠的自然发酵泡菜中分离筛选出 产g a b a 的菌株，并对其进行鉴定，测定其发酵产g a b a 的产量，发现菌株b 2 产 量最高，可达1 2 m g m l 。 ( 2 ) 乳酸菌发酵液中g a b a 的定性与定量检测方法的研究 本文通过对纸层析法、比色法等定性与定量测定g a b a 的方法。在需要精确 测定g a b a 时，本文研究了p i t c 柱前衍生一紫外检测g a b a 的h p l c 法。确定 了定性检测g a b a 的纸层析方法：展开剂的配方为正丁醇：醋酸：水= 4 ：1 ：3 ， 内含0 4 的茚三酮；显色温度和时间为9 0 、l o m i n 。研究了p i t c 柱前衍生一 紫外检测g a b a 的 i p l c 法测定乳酸菌发酵液中的g a b a ，此法检出限为5 m g l ， r s d 为1 2 ，回收率为1 0 1 4 。 ( 3 ) 乳酸菌g a d 活性的研究 以实验室筛选所得的乳酸菌b 2 作为出发菌株，对其酶学性质进行研究，即 酶的热稳定性、p h 稳定性及温度、p h 、底物浓度、酶浓度与酶活性的关系，并 湖南农业大学硕士学位论文 考察了几种金属离子，酶的激活剂，抑制剂对酶的影响。确定该脱羧酶作用的合 适条件。为进一步对乳酸菌发酵条件优化指明了方向。 ( 4 ) 乳酸菌发酵条件的优化 主要以试验中所筛选的产g a b a 的乳酸菌菌株作为出发菌株，对其发酵产 g a b a 条件进行了摸索和探讨，主要从培养基的成分、配比、p h 值、发酵温度、 发酵周期等方面进行了试验。试验结果表明，最佳发酵培养基组成为：复合碳源 质量分数为2 ，其中乳糖与谷氨酸钠的质量比为1 ：1 ；复合氮源蛋白胨与酵母膏 的质量比为l ：1 ；碳源与氮源比为l ：1 。通过发酵条件优化可知，培养基的初始 p h 为7 0 ，培养温度为3 3 ( 2 ，谷氨酸钠的添加量为8 0g l ，p l p 的加入量为 5 0 u m o l l ，为最适于g a b a 的生成条件，并确定最佳发酵周期为3 d 。在最佳发酵 条件下，菌株b 2 产g a b a 量可达4 2 m g m l 。 关键词：y 氨基丁酸乳酸菌筛选谷氨酸脱羧酶发酵 v 湖南农业大学硕士学位论文 ， a b s t r a c t t h ey - a m i n ob u t y r i ca c i d ( g a b a ) ，i sak i n do f n o n - p r o t e i na m i n oa c i dw h i c hw i d e l y e x i s t si nt h eb o d yo f v e g e t a b l e sa n da n i m a l s i th a sv a r i o u sp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n st o t h eh u m a nb o d y ，g a b ai sa m a i nd e p r e s s o ro f t h em a m m a ln e r v o u ss y s t e m , l y i n gt o l e a d4 0 t or e s t r a i nn e r v ec o n d u c t i o na b o v e ，p a r t i c i p a t i n gi nt h ep h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e so ft h eb r a i nc i r c u l a t i o n , h a v i n ga n t i - o u to fg e a rr h y t h mo ft h eh e a r tt o d i s o r d e rf u n c t i o n , h a v i n ga n t i h y p e r t e n s i v e ，t h ea n t i - c o n v u l s i o n ，e a s ep a i n ， i m p r o v i n gt h ef u n c t i o no f t h eb r a i n , s p i r i ts t a b i l i z e ，p r o m o t et or e m e m b e ro v e ral o n g p e r i o do ft i m e ，t h eg a b ah a sb e c o m eay o u n gc h i l d i n t e l l e c t u a ln o u r i s h m e n t s u p p l e m e n ta n da c c e l e r a n tp r o m o t et h ee x u d a t i o no fg r o w t hh o r m o n e ，t h ea c t i v a t i o n o fk i d n e yf u n c t i o n , t h ea c t i v a t i o no fl i v e rf u n c t i o n , p h y s i o l o g yf u n c t i o no ft h e a n t i - t i r e dc t c i ti sr e p o r t e dt h a t ：f o o dw i t ht h ee n r i c h m e n tg a b aw h i c hm a k e su s eo f l a c t o b a c i l l u st of e r m e n tac m a t i o ng o e st o g e t h e rw i t ht oa n t i c i p a t e , a l lc a nb et h e f u n c t i o nf o o dw h i c hi l l sf o ra n t i - h i g hb l o o dp r e s s u r ea n dp r o m o t e sb r a i nf u n c t i o n a n dl i v e rf u n c t i o nd i r e c t l y i no u rc o u n t r y , t h es t u d yo nw h i c hm a k e su s eo ft h e p r o d u c t i o ng a b a o f t h eb i o t e c h n o l o g ya l s oh a v ei nr e c e n ty e a r s ，m a i nc o n c e n t r a t i o n i ns o m eh i g hs c h o o l sa n dr e s e a r c hs t u d i o b u ti tp r o d u c e sg a b aa b i l i t i e sa uv e r y g e n e r a l l y ，a l s oc a ns e l d o mb ea p p l i e di ni n d u s t r i a i i z a t i o nt op r o d u c e s e a r c h i n gt h e l a e t o b a c i l l u sg e r mo fh i g hv i t a l i t yg a ds t u ba n di n v e s t i g a t i n gp r a c t i c a ll a c t o b a e i l l u s t op r o d u c eg a b ap a t hw i l lh a v ee x t e n s i v ee c o n o m i cb e n e f i ta n ds o c i a ls i g n i f i c a t i o n w i t hw i t h d r a w i n gap u r ec h e m i c a le n g i n e e r i n gs k i l le f f i c i e n t l y t h i st h e s i sm a i n l y s e v e r a la s l ) e e t sf e r m e n t e dt op r o d u c eg a b at oc a r r yo nas t u d yt ot h el a c t o b a c i l l u s f r o mt h ef o l l o w i n g ： ( 1 ) t h es c r e e n i n go f al a e t o b a c i l l u sw i t hh i 曲p r o d u c t i o no f g a b a a d o p tas t e p sd e g r e ead i l u t i o nm e t h o ds e p a r a t i o ns i e v i n gt op r o d u c eg a b a g e r ms t u bf r o ma d dt oh a v eaq u a l i t ys c o r e t of e r m e n tp i c k l e sf o rl n a t u r e s a n da s v l 湖南农业大学硕士学位论文 t oi t s c a r r yo na u t h e n t i c a t i n g , m e a s u r e si tt of e r m e n tt op r o d u c eg a b ay i e l d , d i s c o v e rt h eg e r ms t u bb 2y i e l dt o p m o s t 锄r e a c ht o1 2r a g m e ( 2 ) t h es t u d yo nt h em e t h o df o rm e a s u r i n gg a b a i nt h el i q u i do f f e r m e n t a t i o n i nt h i sp a p e r , p a p e rc h r o m a t o g r a p h ym e t h o dc o l o r i m e l f i cm e t h o dl l i g hp r e s s u r e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw 雠s t u d i e do nq u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i t a t i v et e c h n i q u e o fg a b aw h i c hf e r m e n t e db yl a c t o b a c i l l u s w h i l en e e d i n gap r e c i s i o nm e a s u r e m e n t g a b a , t h i st e x ts t u d i e dp i t cp i l l a rd e v e l o p e db e f o r e t h eh p l cm e t h o do ft h e u l t r a v i o l e te x a m i n a t i o nc a r r i e do nt h ea c c u r a t eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s m a d es u r e p a p e rc h r o m a t o g r a p h y m e t h o d t o q u a l i t a t i v ea n a l y s i sg a b a m e t h o d ：t h e f o r m u l a t i o nw h i c hl a u n c h e si sap o s i t i v en - b u t y la l c o h o l：a c e t i ca c i d ： w a t e r - - 4 ：1 ：3 , c o n t ao 4 n i n h y d r i n ：t h et e m p e r a t u r ea n dt i m eo ft h ec o l o r d e v e l o p m e n ti s9 0 c 1 0 m i nr e s p e c t i v e l y t h eh p l cm e t h o do fp i t cp i l l a r - p u r p l e & 船t l n i n et h em e a s u r e m e n tl a c t o b a c i l l u so ft h eg a b ai nt h el i q u i do u t s i d e ，t h i s m e t h o dc h e c k st ol i m i tf o r t h e5m g l ，r s di s1 2 ，r e c o v e r yr a t ei s1 0 1 4 ( 3 ) t h er e s e a r c ho f a c t i v i t i e so f t h el a c t o b a c i u u sg a d u s et h el a b o r a t o r yl a c t o b a c i l l u sb 2g a i n e db ys i e v i n gb 2a st os e to u tg e r m s t u b ，a st oi t st h e 廿l z y m el e a r nap r o p e r t yt oc a r r yo nar e s e a r c h , n a m e l yh o t s t a b i l i t y ，p hs t a b i l i t ya n d，t h er e l a t i o no f t e m p e r a t u r e ，p ht h ed e n s i t yo f s u b s t r a t e e l l z y m ed e n s i t ya n dt a l l z y n l ea c t i v i t y , a n di n v e s t i g a t e daf e wm 吨l i s ，t h ee n z y m e a c t i v a t e s ，d e p r e s s o ri n f l u e n c e st ot h ee n z y m e t h ea s s u r a n c es h o u l dt a k eo f ft h e s u i t a b l ec o n d i t i o no ft h ef u n c t i o no fg a d f o rf u r o l e rf e r m e n t i n gac o n d i t i o nt ot h e l a c t o b a c i l l u se x c e l l e n tt u r ni tt ou n d e r s t a n d g i v i n gad i r e c t i o nt ot h es t u d yo f o p t i m i z a t i o no f t h ec o n d i t i o no f l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t a t i o n ( 4 o p t i m i z a t i o no f t h ec o n d i t i o no f l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t a t i o n u s et h el a c t o b a c i l l u sw h i c hc a np r o d u c eg a b as e a r c h e df r o mt h ef r o n t e x p e r i m e n t 勰t h es e to u t b a c t e r i ad os o m es t u d yo ni t sf e r m e n t e dc o n d i t i o na b o u t h o wt op r o d u e eg a b a ，m a i n l yf r o mc u l t u r em e d i u mo fc o m p o s i t i o n , g ot o g e t h e r w i t har a t i o ，p hv a l u e ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，f e r m e n t a t i o np e r i o de t c t oc a r r y o ne x p e r i m e n t t h es t u d ys h o w e dt h a tt h eb e s tc u l t u r em e d i u mi st h a tb e s tf e r m e n t c u l t u r em e d i u mt oc o n s t i t u t ef o r ：c o m p o u n dc a r b o ns o u r c eq u a l i t ys g o r ei s2 v 湖南农业大学硕士学位论文 ( a m o n gt h e m , t h eq u a l i t yo f l a c t o s ea n dt h ev a l l e ym m n o n i as o u rs o d i u mc o m p 鲫et o l ：1 ) ，r e u n i t et h en i t r o g e ns o i l r g ep e p t o n ea n dt h eq u a l i t yo f l c a v e t ic r e a mt oc o m p a r e t o1 ：1 t o t a l c a r b o n n i t r o g e n c o m p a r e i si ：i p a s s t o o p t i m i z e f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n ， t h er e s u l ti s t h eb e g i n n i n gp n7 0 ，t e m p e r a t u r e3 3 ，s o d i u mg l u t a m a t e8 0g l ，t h e p l pi s5 0 u m o l l ，a n dm a k es u r et h eb e s tf e r m e n t a t i o np e r i o di s3d a y s u n d e rt h e o p t i m i s t f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n , t h e g a b a y i e l d o f b 2c a n r e a c h t 0 4 2 m g m l k e y w o r d s ：t - a m i n ob u t y r i ca c i d l a c t o b a c i l l u sf i l t r a t eg l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e f e r m e n t a t i o n v i 湖南农业大学硕士学位论文 独创性声明与关于论文使用授权的说明 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢谳髟 时间：廊月f 细时间：妒年6 月f 鲳 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：诱i 7 1 0 节时间：妒7 年f 月彩召 翩躲棒争 ! i i 时间：) ，7 年6 月 泊 湖南农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 y 一氨基丁酸( g a b a ) 概述 蛋白质是一切生命活动的基础，氨基酸则是构成蛋白质的基本单元。目前己 发现的氨基酸的种类已达7 0 0 多种，其中包括天然氨基酸和人工合成的氨基酸。 常见的组成蛋白质的氨基酸有2 0 种，其中不能被人体直接合成的8 种氨基酸称 为“必需氨基酸”，对生物体维持机体正常发育有保健功能，是功能性氨基酸。 除了蛋白质氨基酸外，还有更多非蛋白质氨基酸，存在于各种组织和细胞中，并 且一般都具有特殊的生理活性，也是一类重要的功能性氨基酸。y 一氨基丁酸( y - - a m i n o b u t y r i ca c i d ，g a b a ) 是广泛分布于动植物中的一种非蛋白质氨基酸， 由谷氨酸( g l u t a m i ca c i d ，g l u ) 经谷氨酸脱羧酶( g l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e ，e c 4 1 1 1 5 ，简称g a d 或g d c ) 催化转化而来，是存在哺乳动 物脑、脊髓中的抑制性神经传递物质“1 。 g a 队作为一种化学物质来说，早在1 8 8 3 年就已被人工合成。其后又做过 一些在真菌、细菌和植物中代谢的研究。到1 9 5 0 年发现在哺乳动物正常脑内的 g a b a 浓度特别高，但其生理意义不明。随后，从牛脑中提取出一种含有未知物 的溶液，能抑制螯虾牵张感受器神经元产生冲动，并有抗乙酰胆碱对豚鼠及家兔 回肠的收缩作用，经证明此提取液中起抑制作用的组分就是g a b a 。又进而证实 在哺乳动物的中枢各部位，g a b a 具有普遍抑制作用。通过离子电泳将g a b a 注 射于猫皮层十字沟周围神经元，引起超极化，其电位与刺激皮层表面所产生的抑 制性突触后电位相同，并发现电刺激小脑浦氏细胞时，第四脑室灌流液中g a b a 含量增加3 倍，因而推测浦氏神经元释放的化学递质是g a b a 。但是，g a b a 的 意义和作用被真正确认是在1 9 7 5 年的第二届国际g a b a 专题讨论会上。在那次 会议上，g a b a 被正式确认为哺乳动物中枢的一种抑制性递质“1 。 g a b a 除了在哺乳动物中枢神经系统作为抑制性神经递质而起重要作用外， 在高等植物中也广泛分布。藻类、真菌、藓类、蕨类和有花植物中都有g a b a 存 在，且植物的各个部分都有。在一些固氮植物的根瘤中，g a b a 可达根瘤干重的 6 6 。在油草中，g a b a 只分布于开花器官，营养组织中则没有。在许多植物组 织中，g a b a 以高浓度( 0 0 3 3 2 5um o l g 鲜重) 存在，常超过许多蛋白质氨基 酸。人们对于g a b a 的研究，过去主要集中在哺乳动物，近几年发现g a b a 与植 湖南农业大学硕士学位论文 物的环境应激反应也有关嘲。 1 1 1g a b a 的结构与性质 g a b a ，又名4 一氨基丁酸( 4 - a m i n o b u t a n o i ea c i d ，4 a b ) ，y 氨酪酸，分子式 为c d t g n 0 2 ，相对分子量1 0 3 2 ；结构式如图1 - 1 眠r m 图1 1 g a b a 的结构 f i g1 - 1t h es t r u c t u r e so f g a b a g a b a 是一种白色或近白色结晶性粉末，极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷 乙醇、苯、乙醚，熔点( r n 力：2 0 3 2 0 4 c ( 分解) ，熔化分解成吡咯烷酮和水 如图1 - 2 ：g a b a 的解离常数：p k c o o r r = 4 0 3 ，p k n j t 3 = 1 0 5 6 ，无旋光性。 啊! ? 删嚣 v b 6 c a 。p l p 及v b 6 的浓度约为5 0um o l l 时对酶活的促进作用达到最高。随 着p l p 浓度的继续增高，对酶反应可能产生抑制作用，产生这种现象的具体原 因尚不明确，有待进一步研究。随着c a 2 浓度的提高，酶活力增加，但其浓度 达到2 0 0l im o l l 以后，进一步添加钙离子对酶活的促进作用不明显。 3 讨论与结论 3 1乳酸菌g a d 的最适温度为5 2 * ( 2 ，在最适温度左右酶的稳定性较好，7 0 保温3 0 r a i n 酶活几乎全部丧失。 3 2乳酸菌g a d 的最适p h 为4 5 ，在p h 4 0 5 0 之间酶活较高也较为稳 定，p h 达到6 时酶活降至一半，中性条件下几乎没有酶活，且不在最适p h 附 近，酶的稳定性也有所下降。可见p h 对乳酸菌g a d 酶活的影响具有很大的关系。 3 3考察几种对g a d 活性有影响的物质，由于p l p 是g a d 的辅酶，而v b 6 和 c a 又能促进p l p 对g a d 的作用，在添加这些物质时，本试验结果表明p l p 、v b 6 湖南农业大学硕士学位论文 及c 矿在一定浓度时都能促进酶活，在添加含量小于1 0 0 i im o l l 时，作用大 小依序为p l p v b c a z * 。反应体系中添加的乙酸浓度在0 0 5 m o l l 以下 时，也能提高酶活，但随着乙酸浓度的不断增加，酶活力下降。 湖南农业大学硕士学位论文 第五章高产g a b a 乳酸菌发酵条件优化 研究 引言 众所周知，微生物发酵生产影响因素都包括代谢机制和代谢条件。因此代谢 机制( g a b a 支路) 和代谢条件是g a b a 制备的决定因素。代谢机制一定时，代谢 条件显著影响g a b a 的制备速度和产率。代谢条件受如下因素制约：微生物代谢 产物的积累与其发酵底物的组成、发酵温度、时间、p h 值、发酵过程中添加物 的加入等有较大影响。因此本章以从前面试验所筛选的产g a b a 的乳酸菌菌株作 为出发菌株，对其发酵产g a b a 条件进行了摸索和探讨，主要从培养基的成分、 配比、p h 值、发酵温度、发酵周期等方面进行了试验。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种：本文从自然发酵泡菜液中筛选所得菌株：b 2 1 1 2 培养基 m r s 乳酸菌分离培养基各成分质量分数为：酪蛋白胨1 ，牛肉提取物1 ， 酵母提取物0 5 0 5 ，葡萄糖0 5 ，乙酸钠0 5 ，吐温一8 0 01 ，柠檬酸二胺0 2 。6 ， 磷酸氢二钾0 2 ，硫酸镁0 0 2 ，硫酸锰0 0 0 5 ( 固体培养基中加约1 5 琼脂) ， 调p h 6 6 “6 8 。 t y g 液体发酵培养基各成分质量分数为：胰蛋白胨0 5 ，酵母膏0 5 ，葡萄 糖1 0 9 6 ，丁二酸钠0 5 ，调p h 6 6 - 6 8 。 1 1 3 碳氮源 碳源：葡萄糖，乳糖，果糖，蔗糖，可溶性淀粉，丁二酸钠；氮源：胰蛋白胨 牛肉膏，酵母膏，蛋白胨，硫酸铵，硝酸钠。 1 1 4 仪器设备及药品 光学显微镜 二氧化碳培养箱，长沙长锦科技有限公司 生化培养箱，l r h 一2 5 0 a广东省医疗器械厂 高压蒸汽灭菌锅， ) 【1 q s g 4 6 2 8 型上海市实验仪器总厂 4 l 湖南农业大学硕士学位论文 超净工作台， 冰箱 层析罐， 分光光度计， 离心机 电子天平 高效液相色谱仪 精密p h 计 远红外快速恒温干燥箱 g a b a 标样 p i t c l g 1 u 磷酸吡哆醛( p l p ) 其他试剂均为分析纯。 1 2 方法 s w - c j - i b 标准型哈东联空气技术公司 伊莱克斯 7 2 2 型 l d 5 2 a 型 a b 2 6 5 - s p r o s t a r 2 1 0 p h s 一3 c 型 y h g 一5 0 x 5 5 一b s a r h p l c a r a r 上海第二分析仪器厂 北京医用离心机厂 s , i t z e r l a n d 瓦里安 上海实验仪器厂 上海跃进医疗器械厂 上海生化试剂有限公司 s i g m a 公司 上海生化试剂有限公司 上海生化试剂有限公司 1 2 1 菌种活化传代与接种方法 用凇s 固体斜面培养基进行菌种活化传代。3 5 培养2 4 h 后置于4 冰箱中 待用，菌株每两周转接一次。 1 2 2 发酵种子培养方法 从活化的m r s 固体斜面培养基上挑取适量菌体接入m r s 液体培养基中，3 5 活化培养1 6 h 。 1 2 3 发酵液中g a b a 的测定 精确定量分析： i p l c 法定量分析g a b a ( 具体方法同第三章1 2 3 ) 1 2 4 菌体生长量的测定 发酵培养过程中，取待测时间段的培养液以空白培养基作为对照，用7 2 2 分 光光度计于6 0 0 n m 处测定其吸光度嘲；使测定值在0 1 - 0 6 之间，如浓度过大可 用空白培养基稀释后再测。 1 2 5 对菌株进行培养基成分和发酵条件优化 1 2 5 1 对培养基中碳源和氮源的种类及碳氮比在菌株发酵产g a b a 中的影响进 湖南农业大学硕士学位论文 行探讨，确定最佳培养基成分及配比。 1 2 5 2 对发酵起始温度、p h 、发酵时间、发酵过程中添加物对发酵产g a b a 的 影响进行试验。确定最佳发酵工艺参数。 2 结果与分析 2 1 培养基优化 2 1 1 不同碳源对发酵的影响 以加入1 谷氨酸的t y g 培养基为基础。”，分别采用葡萄糖，乳糖，果糖，蔗糖， 可溶性淀粉，丁二酸钠作为唯一碳源进行试验，考察不同碳源对发酵产g a b a 的影 响。 试验结果( 见表5 - 2 ) 表明，乳糖和果糖作为碳源时菌体生长量及发酵液中 g a b a 含量相对较高，考虑到采用果糖的成本太高，则采用较为常用的乳糖作为主 要碳源，而且由表5 2 可以看出，丁二酸钠作为碳源时虽然菌体的生长情况不好， 但g a b a 的含量却相对较高，推测其对g a d 酶的生成有促进的作用，于是在培养基 中也加入，与乳糖一起作为复合碳源。 表5 2 ：不同碳氮源对菌株b 2 发酵产g a b a 量及菌体生长量的影响 t a b l e 5 - 2 ：e f f e c to f d i f f e r e mn i t r o g e no ng a b a p r o d u c t i o na n dt h a l l ig r o w t h 碳源g a b a 含量( m g m l ) 菌体量o d 6 0 0 氮源g a b a 含量( m g m l ) 菌体量o d 6 0 0 葡萄糖0 8 9 0 8 6胰蛋白胨0 7 01 0 1 乳糖0 9 8 0 8 9牛肉膏0 6 20 8 8 果糖 1 0 1 0 8 7酵母膏0 7 80 9 8 酵母膏0 7 8 0 9 7蛋白胨0 8 61 0 7 可溶性淀粉0 0硫酸铵00 0 2 丁二酸钠o 5 3 0 1 9硝酸钠00 0 1 2 1 2 不同氮源对发酵条件的影响 在以乳糖和丁二酸钠作为复合碳源的基础上，分别采用不同的无机氮和有机 氮作为唯一氮源进行试验，试验结果见表5 3 。由表5 3 可知，以硫酸铵和硝酸 钠作为氮源时没有检出g a b a 的生成；有机氮源都可以检测出g a b a 的生成，其中 以蛋白胨的效果最好。在以蛋白胨为氮源的培养基中添加部分其它氮源组成复合 氮源，试验结果见表5 3 。使用蛋白胨和酵母膏作为复合氮源时发酵液中g a b a 的含量及菌体量都最高，并且优于单独使用蛋白胨作为唯一氮源的情况，分析原 因可能是蛋白胨的丰富营养成分加上具有生长因子作用的酵母膏更适合菌体生 长的需要，并且促进了g a d 酶的作用，从而使发酵液中g a b a 的含量升高。 湖南农业大学硕士学位论文 表5 - 3 ：复合氮源对发酵液中g a b a 含量及菌体量的影响 t a b l e 5 3 - e f f e c t o f c o m p o u n d n i t r o g e n o n g a b a p r o d u c t i o n a n d t h a u i g r o w t h 复合氮源g a b a 含量( m g m l )菌体量0 0 6 0 0 2 1 3 培养基组成优化结果 根据上面试验所确定的氮、碳源，对培养基的整体组成进行优化，采用l 。( 3 4 ) 正交实验，因素与水平取值见表5 _ 4 ，其测定结果见表5 - 5 ，相应的极差分析见 表5 - 6 。 表5 - 4 ：因素与水平取值表 里塑! 堕兰! 垒! ! ! g 堡! 竖翌堡! 堕! 塑旦堕殳! ! 型生! 望竺堡i 鱼! ! 型! ! ! 坚 水平 因素 l23 a ：乳糖：丁二酸钠 1 ：12 ：13 ：1 b ：蛋白胨：酵母膏h1 2 ：13 ：1 c ：c nl ：l5 ：4 5 ：3 里! 堡塑量鱼兰盟! 堑兰堑! 堑 表5 5 ：发酵培养基整体优化正交实验结果l l “3 4 ) ! 型堕：! ! 堡! 竺! 望! ! 璺生皇些坐盟垫坚! 匹墅垄 塞墼塑呈垒堡曼巳鱼些垒宣重! 堡型里生1 1l l1 -11 6 6 2 3 4 5 6 7 8 9 l l 2 2 2 3 3 3 2 3 3 l 2 2 3 l 1 8 4 1 5 4 1 6 4 0 7 0 1 7 7 1 5 l 1 8 2 o 2 7 湖南农业大学硕士学位论文 表5 6 ：发酵培养基整体优化中各指标的极差分析结果 ! ! ! ! ! ! ：垒!堡竺坠! 鲤! 璺塑i 堕堡! 型羔坐 g a b a 含量( m g m l ) 指标 abcd 注：a b c d 见上表5 4 由表5 - 6 可知，4 个因素对发酵液中g a b a 含量的影响大小依次为d c a b ， 即培养基中碳源量对g a b a 的生成影响最显著，总碳氮比次之，复合碳源和复合 氮源比的影响程度相差不大。当碳源量增加到2 ( w w ) 后，再增加碳源量对g a b a 的生成反而有抑制作用，原因可能是营养物质过于丰富对酶的作用产生了不良影 响。由表可知4 个因素的最佳组合为a 。b 。c 。d 2 ，由于这个条件不在这9 次试验中， 所以补做实验a 。b 。c 。d 。，与最好的2 号实验进行比较，试验结果a ，b 。c 。d 2 中g a b a 的含量为2 8 2 m g m l ，确实要高于2 号实验，可以确定：复合碳源质量分数为 2 9 6 。其中乳糖与谷氨酸钠的质量比为l ：1 ，复合氮源蛋白胨与酵母膏的质量比为 1 ：1 ，碳源与氮源比为1 ：1 。为最佳的培养基组成配方。 2 2 发酵条件优化 2 2 1 初始p h 对发酵的影响结果 将优化后的发酵培养基用n a 0 h 或者h c l 溶液调成不同梯度的p h 值后接入菌 种，在3 5 进行培养，2 4 h 后测定发酵液中g a b a 的含量及菌体量。结果表明( 见 表5 7 ) ，培养基初始p h 以7 0 为宜，此时菌体生长情况最好，而且发酵液中g a b a 的含量也最高。初始p h 偏酸或偏碱对菌体生产及g a b a 的生成都不利。 表5 7 ：初始p h 对发酵的影响 t a b l e 5 7 ：e f f e c to f p t ir e g u l a t i o no f c u l t u r em e d i u mo ng a b ap r o d u c t i o n 2 2 2 培养温度对发酵的影响 采取经优化的液体发酵培养基调p h 至7 0 ，接入菌种，不同温度下发酵培养 湖南农业大学硕士学位论文 4 8 h 后测定发酵液中g a b a 的含量及菌体生长情况，结果见表5 - 8 。试验结果表明 培养温度为3 3 c 时发酵产g a b a 的量最高，说明菌体在3 3 c 时体内的g a d 能表现 出较高的酶活，温度偏低或偏高对菌体的生长及酶活的表现不利。 表5 8 ：培养温度对发酵的影响 t a b l e 5 - 8 ：e f f e c to f c u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r eo ng a b a p r o d u c t i o n 2 2 3 不同发酵时间对g a b a 产量的影响 采用最佳配方的培养基调p h 为7 0 ，在最适宜的温度3 3 c 下培养，在不同 时间测定发酵液中g a b a 的含量，结果如图5 1 所示。由图可知，随着发酵时间 的延长，发酵液中g a b a 的产量不断增加，在前3 d 产量增加幅度较大；3 d 后继续 培养增加幅度较小，考虑到发酵时间延长，生产的周期也延长，增加成本，所以 本试验确定3 d 作为生产g a b a 的最佳发酵周期。在最佳发酵条件下，达最佳发酵 周期时发酵液中g a b a 的量可达到3 1 0 m g m l 以上。 图5 - 1 ：不同发酵时间对g a 队产量的影响 f i 9 5 一l ：e f f e c to f f e r m e n t a t i o nt i m ec o u r s e o ng a b a p r o d u c t i o n 2 2 4g a b a 前体物质l _ 谷氨酸及l - 谷氨酸钠的加入对菌株b 2 产g a b a 量的影 响 乳酸菌产g a b a 的主要机理是由乳酸菌生成的谷氨酸脱羧酶( g a d ) 对谷氨酸 及其衍生物作用的结果，根据发酵过程控制理论我们可知，加大外源前体浓度有 助于提高终端产物浓度。以此作为出发点，本文对加入不同浓度谷氨酸对菌株 4 6 湖南农业大学硕士学位论文 b 2 产g a b a 量及菌体生长的影响做了试验，试验结果见图5 2 和图5 - 3 ，结果显 示随着谷氨酸的加入量的增大，底物中g a 队的浓度也加大了，当谷氨酸的加入 量超过8 0 9 l 时，菌体的生长量受到了明显的抑制。同样考虑到直接添加谷氨酸 成本太大，本试验中用谷氨酸钠( g s m ) 做了相似试验，试验结果见图5 - 4 和图 5 - 5 ，试验结果极其相似，所以本试验确定添加8 0g l 的谷氨酸钠作为发酵的前 体物质。 奄3 。 52 嘲 堡1 盏 舌0 02 04 06 08 01 0 01 2 0 l - g l u 的添加量( g l ) 图5 2 ：l 吨l u 的加入对g a b a 产量的影响 f i 9 5 - 2 ：e f f e c to f l - g i uc o n c e n t r a t i o no ng a b a o f p r o d u c t i o n 7 粤6 量5 星4 桶3 蠢2 靛1 0 0 2 0 4 06 08 01 0 01 2 0 l _ g l u 的加入量( g l ) 图5 3 ：l - g l u 的加入对对数期菌体0 d 值的影响 f i 9 5 3 ：e f f e c to f l g l uc o n c e n t r a t i o no i lt h a u ig r o w t ho f l o g a r i t h m i ct i m e 湖南农业大学硕士学位论文 童。 粤2 翟。 g 要o o 2 04 06 0 8 01 0 01 2 0 g s m 的加入量( g l )