（发酵工程专业论文）瑞士乳杆菌对小鼠肠道粘膜免疫的影响.pdf

摘要益生菌作为一种活的有机体，存在于肠道粘膜上，并对肠道黏膜有保护和调节作用，可以治疗各种肠道疾病。益生菌可直接作用于宿主的免疫系统，诱发肠道免疫，并刺激胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官的发育，促进巨噬细胞活力或发挥佐剂作用，活化肠粘膜内相关淋巴组织，使s i g a 分泌增加。益生菌在体液免疫和细胞免疫中发挥着调节作用，其保健作用的机理成为近年来研究的重点内容。本文选用瑞士乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6 ) 作为研究菌株，系统地研究了其对小鼠肠道粘膜免疫的影响。本研究首先采用了改良培养基的方法，选择了瑞士乳杆菌的最适培养基；接着利用蛋白质的溶解特性和梯度离心的方法建立了菌体细胞分离纯化技术；然后采用选择性培养技术系统研究了小鼠肠道微生物区系；用放射性免疫( r i a ) 和酶联免疫( e l i s a ) 检测技术系统评价了小鼠肠道粘膜中s l g a 和肠道粘膜中的分泌细胞因子；同时观察条件致病菌僻c o l i ) 灌胃组对小鼠粘膜免疫的影响，研究瑞士乳杆菌对小鼠肠粘膜免疫系统的作用方式。实验结果表明：瑞士乳杆菌的最适培养基为溴甲酚绿指示剂培养基。瑞士乳杆菌对小鼠肠道微生物区系调节的最佳灌胃剂量为2 1 0 7 c f u d 。长期灌胃瑞士乳杆菌对小鼠肠道粘膜中s i g a 含量的影响：瑞士乳杆菌灌胃组小鼠肠道粘膜中s i g a 的含量在第1 0 孑达到最大值，和对照组相比差异极显著( p o 0 1 ) ，肠道粘膜中s i g a 含量显著升高。短期潜胃瑞士乳杆菌对小鼠肠道粘膜中s i g a 含量的影响：瑞士乳杆菌灌胃组小鼠肠道粘膜 s i g a 含量在2 4 h 内持续上升。长期灌胃瑞士乳杆菌对小鼠肠道中细胞因子的影响：瑞j乳杆菌灌胃组小鼠肠道中四种细胞因子和比对照组明显升高( p 0 0 5 )肠道免疫功能未出现异常；大肠杆菌灌胃组则出现了异常。大肠杆菌灌胃组则出现异常。短期灌胃瑞士乳杆菌对小鼠肠道中细胞因子的影响：i l 2 和i l 6 在第6 h 达到最高点；i l -在第1 h 达到最高点；i f n 叫, 在第3 h 达到最高值；t h 2 型细胞因子比t h l 型的多，于是i以推测出t h l 型t 细胞可能是比t h 2 型的少一些，这是由于t 细胞短时间内不同分化方晴造成的。和长期灌胃组相比短期灌胃组细胞因子的波动比较大，而长期灌胃组的结果更台反映瑞士乳杆菌对小鼠肠道粘膜免疫的调理作用。关键词：瑞士乳杆菌，肠道微生物区系，s i g a ，细胞因子a b s t r a c tp r o b i o t i c s 嬲o n ek i n do fl i v e l yo r g a m s me x i s t si ni n t e s t i n a lm u c o s ao fl i v e s i th a sp r o t e c t i v ea n dm o d u l a t o r ye f f e c tt oi n t e s t i n a lm u c o s a ；a l s oi ti sa b l et oc u r ev a r i o u si n t e s t i n a ld i s e a s e s p r o b i o t i c sc a l la c to nh o s t si m m u n i t ys y s t e m ，s t i m u l a t ei n t e s t i n a li m m u n i t ya n di m m u n eo r g a n sg r o w t hs u c h 嬲t h y m u s ，s p l e e na n db u r s a ，i tp r o m o t e sm a c r o p h a g e s a c t i v i t yo re x e r t si m m u n o a d j u v a n t s ，a tt h es a n l ei tc a na c t i v et h el y m p h o i dt i s s u ei ni n t e s t i n a lm u c o s aa n di n c r e a s et h es e c r e t i o no fs i g a p r o b i o t i c sp l a y si m m u n o r e g u l a t o r yr o l e si nh u m o r a li m m u n i t ya n dc e l l u l a ri m m u n i t y , i t sm e c h a n i s mo fh e a l t hc a r ef u n c t i o nb e c o m e st h ei m p o r t a n tc o n t e n ti nr e c e n tw o r k i nt h i st h e s i sw ec h o s el a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6a sc u l t u r a lb a c t e r i a l ，a n ds y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt h ee f f e c t so fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6o ni n t e s t i n a li m m u n i t yi nm i c e f i r s to fa l l ，w eu s e di m p r o v e db o u i l l o nm e d i u mt oc h o o s et h ea p p r o p r i a t em e d i u mf o rl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6 ，c o n s t i t u t e dt h ep u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo fb a c t e r i a lc e l lw i t hc e n t r i f u g a t i o na n ds o l u t i o no fp r o t e i n ，a n dt h e na p p l i e ds e l e c t i v ec u l t u r a lt e c h n i q u et or e s e a r c hi n t e s t i n a lm i c r o f l o r as y s t e m a t i c a l l y , e v a l u a t e dc y t o k i n e sa n ds i g ai ni n t e s t i n a lo fm i c ew i t hr i aa n de l i s a w eo b s e r v e dt h ei n f e c t i o no fe c o l ia sw e l l t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a t ，t h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rt a k i n gc o u n to fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6i sb r o m c r e s o lg r e e ni n d i c a t o rc u l t u r em e d i u m t h ea p p r o p r i a t ed o s ef o rf e e d i n gm i c ei s2 10 1 c f i g d t h ee f f e c t so fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6o ns i g ai ni n t e s t i n a lm u c o s ao fm i c ef o r15d a y s ：t h eb e s tt o l e r a n c et i m eo fm i c et ol a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6i s10 d a y s ，c o m p a r e d 谢t hc o n t r o lg r o u pt h el e v e lo fs i g ai nl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6g r o u pi ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( p 0 01 ) t h ee f f e c t so fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6o ns i g ai ni n t e s t i n a lm u c o s ao fm i c ef o r2 4h o u r s ：t h el e v e lo fs i g as t i l lr o s ei n2 4h o u r sa f t e rf e e d i n gm i c e 、析ml a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6 t h ee f f e c t so fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6o nc y t o k i n ei ni n t e s t i n eo fm i c ef o r15d a y s ：c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pt h el e v e lo ff o u rc y t o k i n ei nm i c e si n t e s t i n eo fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6g r o u pi sh i g h e r ( p 0 0 5 ) ，b e f o r et h et h j r dd a yt h ev a l u eo ft h lt y p ec y t o k i n e ( i l - 2 ，i f n - 1 ) w a su pt ot h e i rt o p ，a n dt h ev a l u eo ft h 2 ( i l 一4 ，i l 一6 ) r e a c h e dt ot h em a x i m u l na tt h ef i f t hd a y , t h ep r o p o r t i o no ft hltc e l la n dt h 2t ) ，p etc e l li ni n t e s t i n eo fm i c ew a sv e r yn o r m a l t h ee f f e c t so fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6o nc y t o k i n ei ni n t e s t i n eo fm i c ef o r2 4h o u r s ：t h ev a l u eo fi l 2a n di l 6r e a c h e dt ot h em a x i m u ma tt h es i x t hh o u r , t h el e v e lo fi l 一4w a su pt oi t sh i g h e s td e g r e ea tt h ef i r s th o u r , a n di f n 吖o b t a i n e di t st o pa tt h et h i r dh o u r t h ev a l u eo fi f n - q di l 一4i sl o w e ri np r o b i o t i c sg r o u p ，i tm a yb eb e c a u s et h ed i f f e r e n td i f f e r e n t i a t i o no ftc e l l c o m p a r e dw i t l ll o n gt i m e f e e d i n gg r o u p ( 15d a y s )t h ec y t o k i n eo ft h es h o r t - f e e d i n gg r o u p ( 2 4h o u r s ) f l u c t u a t e dm o r es e r i o u s ，s ot h el o n g - f e e d i n gg r o u pi sm o r es u i t a b l et or e f l e c tt h er e g u l a t i o no fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6t om i c e si n t e s t i n a lm u c o s ai m m u n e t h u sw ec a ne v a l u a t et h ei m m u n er o l eo fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st s 2 0 6m o r ed e e p l y k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ，i n t e s t i n a lm i c r o f l o r a ，s i g a ，c y t o k i n e论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明一、发表论文1 益生菌和肠道粘膜免疫关系的研究进展食品科学，2 0 0 7 ，2 8 ( 8 ) ：5 3 7 5 4 2 2 用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用食品科学，2 0 0 7 ，2 8 ( 9 ) ：3 7 4 3 7 8 3 瑞士乳杆菌菌体的分离以及对小鼠肠道粘膜s i e a 影响的研究食品研究与开发，2 0 0 8 ，2 9 ( 5 ) ：5 0 - 5 3 二、学位论文使用授权声明本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。6 0五安捆如d 窝s第一章前言1 1 课题研究背景第一章前言1 1 1 益生菌研究的相关背景1 1 1 1 益生菌简介早在1 8 9 9 年法国巴斯德研究院的t i s s i e r 教授首先发现益生菌，到目前已经有1 0 0 多年的历史【l 】，因此，益生菌是一个“古老而新兴”的家族。前期益生菌的研究进展一直比较缓慢，但已经有初步的研究，5 0 年代后随着科学的进步，技术的快速发展对益生菌的研究趋于更深入全面，并从最初的形态学研究发展为细胞水平和分子水平的研究，使以往存在的许多问题得到解决，并使认识进一步深化。这些问题包括形态学研究、微生物学研究、分类学研究及微生态学研究，同时还发展了微生态制剂的研究，科学界积累了大量的资料，证明这是一个具有发展前景的高新技术领域。1 1 1 2 益生菌的概念益生菌( p r o b i o t i c s ) 是指对人和动植物机体有益的菌。1 9 0 5 年，俄国微生物学家发现食用含有乳酸菌的酸奶可以长寿。2 0 世纪2 0 年代后期，人们逐渐用能在肠道内生存的嗜酸乳杆菌生产酸奶。2 0 世纪6 0 年代，随着厌氧微生物的分离和培养技术的改进，人们逐渐对益生菌有了更深入的研究，并且随着研究的进行人们对益生菌也越来越重视。随着科学研究的深入，益生菌的定义也在不断的变化。l i l l y 和s t i l l w e l l 首先在1 9 6 5 年提出“益生菌这一说法，把益生菌描述为一种微生物产生的可以刺激其它微生物生长的物质，是与抗生素作用相反的物质2 1 。1 9 7 4 年p a r k 定义为：益生菌是有利于肠道平衡的有机物质，这一定义将抗生素也包括在内。1 9 8 9 年f u l e r 进一步完善了益生菌的概念，认为益生菌是“一种活的微生物菌，通过喂饲来调节肠道微生菌的平衡，能够对宿主产生有益的影响”这是目前人们最常用的定义【3 】。1 9 9 4 年有人对益生菌的定义又作了修订：“益生菌是含活菌和死菌包括其组分和产物的细菌制品，经口或其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制”。目前在世界范围内，学者们对其定义还存在着争议。目前普遍认为作为益生菌的细菌应该具备以下条件【4 】：( 1 ) 对宿主有益；( 2 ) 无毒性作用和无致病作用；( 3 ) 能在消化道存活；( 4 ) 能适应胃酸和胆盐；( 5 ) 能在消化道表面定植；( 6 ) 能够产生有用的酶类和代谢物；( 7 ) 在加工和贮存过程中能保持活性；( 8 ) 具有良好的感官特性；( 9 ) 有效浓度不低于1 0 6 c f u m l 。l第一章前言1 1 1 3 益生菌研究现状目前对于益生菌的研究，在国外益生菌方面的产品，一种是食品，另一种是膳食补充剂，含有益生菌的食品几乎全部是奶制品，所用菌种主要为乳酸菌和双歧杆菌；近几年国内的益生菌产品也主要集中在乳制品上。在美国另一种益生菌产品是生物治疗剂，它是在医生推荐下食用用来缓解某些不适。益生菌用于免疫调节作用的研究方面尤其热烈，益生菌是通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物。益生菌对健康的有益作用是俄国科学家m c t c h n i k o f - 酋先提出的，他认为肠道乳酸菌能够通过防止腐败菌的生长而起到延长寿命的作用。到目前为止，人们已经发现益生菌可以改善肠道菌群结构，抑制病原菌，消除致癌因子，提高机体免疫力，降低胆固醇。益生菌与人体的健康有着密切的关系，在牛奶中添加益生菌可以改善消化功能，促进胃肠蠕动，减轻人体乳糖不耐受症，防止婴幼儿的腹泻和消化不良，对婴幼儿的营养与健康有重要的作用。在医学上，益生菌可以用于急性轮状病毒引起的腹泻，便秘，结肠功能失调以及放射性治疗引起的负作用，还可以用来抗肿瘤和抗癌。由于益生菌制剂无毒性、无残留、无污染、不产生耐药性，能克服使用抗生素引起的菌群失调和二重感染，从而避免使用抗生素等产生的不良后果；在使用抗生素后，再使用益生菌剂对恢复动物机体微生态平衡有明显的调节促进作用。近3 0 年来，人们对益生菌的特性、分类、分布与营养意义等研究取得了很大的进展，发现益生菌在增强免疫功能、抗肿瘤等多方面，具有重要的有意义的生物学功能。尽管观察到了益生菌对人类有益，但对益生菌的分子作用机制一直了解甚少。在近几年来分子生物学技术迅速发展的基础上，一些研究者对益生菌的分子作用机制进行了研究，并取得了一定的成果。1 1 1 4 益生菌的来源及种类益生菌来源主要是动物肠道正常生理性菌和非肠道菌。1 9 8 9 年美国食品和药物管理局( f d a ) 及美国饲料监察协会( a a f c o ) 公布了4 1 种可用于饲料的安全菌株。我国农业部1 9 9 6年公布了6 种【5 】：乳酸杆菌、粪链球菌、双歧杆菌、酵母菌、d m 4 2 3 腊样芽孢杆菌和s a 3 8腊样芽孢杆菌可用于动物微生态调节剂。在制剂中，有的为单一菌种，有的为多种菌联合使用，几种菌种联合使用有增多的趋势。目前常用的益生菌菌种有双歧杆菌、乳酸杆菌和一些链球菌。其中，双歧杆菌有青春双歧杆菌、短双歧杆菌等；乳酸杆菌有嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、胚芽乳杆菌、短乳杆菌、纤维二糖乳杆菌和乳酸乳杆菌。其他用作益生菌的链球第一章前言菌有：粪链球菌、乳链球菌、嗜热唾液链球菌和乙酸乳酸双链球菌。此外，还有明串球菌属、足球菌属、丙酸杆菌属和芽孢杆菌属的菌种也可用作益生菌。通常应用于人体的益生菌有双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌等。1 1 1 5 益生菌的作用机理和功能1 6 j( 1 ) 益生菌的作用机理益生菌对生物可以产生如下有利的作用：促进动物生长；改善动物的健康水平，尤其是刺激有益菌增殖，产生竞争性排斥作用，控制幼龄动物的消化道疾病；消化分解抗营养因子，如植酸、胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素和非淀粉多糖等。竞争性排斥作用益生菌可以占据宿主动物消化道的定植位点，从而降低其他微生物( 病原) 的侵染机会。大肠杆菌是人体消化道内正常细菌，但是如果过度繁殖就会使人发病，定植于胃非分泌上皮的乳酸菌是控制大肠杆菌生长的重要因子；另外，定植于嗉囊上皮的乳酸杆菌可以和大肠杆菌、沙门氏杆菌以及其他病原菌发生竞争性排斥作用。当有乳酸杆菌或其他非病原性微生物时，宿主动物的整个消化道都可以发生竞争性排斥作用。嗜酸乳杆菌对肠道上皮的亲附能力非常强，从而减少大肠杆菌与肠道上皮结合的机会。改善体内外生态环境，减少疾病的发生和氨、胺等有害物质的产生给母猪喂养有益生物后，能显著地降低肠道中大肠杆菌、沙门氏菌的数量，使机体肠道内的有益微生物增加、致病微生物减少，因而排泄、分泌物中的有益微生物数量增多，致病性微生物减少，从而净化了体内外的环境，减少疾病的发生。氨、胺、吲哚、硫化氢等物质在动物肠道粘膜对细胞有明显的毒害作用，乳酸菌在肠道生长繁殖能产生有机酸，过氧化氢、细菌素等一些物质，可抑制肠内腐败细菌的生长，降低脲酶的活性，进而减少胺、氨等有害物质的产生，有利于动物的健康和生长。促进营养物质的产生、代谢和利用a 直接产生营养物质益生菌在动物消化道内生长、繁殖和活动，能直接产生多种营养物质如维生素、氨基酸、短链脂肪酸、促生长因子等，参与动物体的新陈代谢，有的微生物在动物体内生长繁殖时能合成核黄素、泛酸、叶酸、v b l 2 等b 族维生素，参与机体某些重要的代谢反应。b 促进饲料中营养物质的代谢益生菌在体内可产生多种消化酶如淀粉酶、葡萄糖苷酶等，促进了营养物质特别是下消化道营养物质的消化。这一作用被认为是益生菌促进动物生长最有力的证据。乳酸菌不3第一章前言仅可以产生多种酶类，而且能通过产酸，提高钙、磷、铁的利用率，促进v d 的吸收和利用。( 2 ) 益生菌的功能益生菌的健康功效包括促进乳糖消化、抗肠道致病菌等等。研究表明，益生菌对乳糖不耐症的减缓和抗腹泻效果非常明显，抗癌和免疫调节效果比较乐观，但具体的情况还有待更多的临床实验证明。改善肠道功能肠道紊乱轻者会有腹泻、肚疼等苦恼，严重的会危及生命。益生菌可以改善肠炎。益生菌摄入量达1 0 9 1 0 1 1 c f u d 的水平，可起到降低某些肠道疾病的发病率、持续时间和病情严重性的效果。抗癌功能癌症发病率的高低和膳食组分密切相关，而含益生菌的膳食已被证明具有明显降低癌症发病率的功效；另外益生菌具有阻碍结肠和其他器官中发生的非基因型和基因型突变的功能，其机理是益生菌或其代谢副产物通过影响结肠上皮细胞的变化历程，来达到降低癌细胞增殖的目的。免疫功能益生菌能通过激活巨噬细胞、增强k i l l e r 细胞活性和增加免疫球蛋白( 特别是s i g a ) 的水平等来增强非特异性免疫和特异性免疫应答。益生菌的活菌细胞、死细胞或是发酵产物都具有调节免疫的功能，特别值得一提的是益生菌的免疫调节不会带来有害的炎症反应。抗过敏功能益生菌具有调节某些过敏反应的功效，它是通过改善肠粘膜屏障功能作用来实现的。有关特异治疗和食品过敏反应研究表明：通过恢复肠粘膜透过性，调节区域免疫反应及应用能改变食品抗原的微生物，免疫反应能被引导恢复至正常。抗高血压益生茵制品确实能起到一定程度上控制血压的效果，其抗高血压效果在先天性高血压老鼠实验中得到证实。k a n a g a w a 从啤酒酵母和瑞士乳杆菌发酵乳中分离的三肽物质( v a l p r o p r o 和l i e p r o p r o ) 具有抑制血管紧张素转移酶i 活性的作用，这里起作用的是益生菌的发酵产物，而不是活益生菌。其他功能益生菌对人体的健康促进作用还包括：促进泌尿系统健康、调节体内胆固醇水平、减弱放射性同位素作用、降低与酒精中毒性肝疾病相关内毒素的作用等。第一章前言1 1 2 肠道粘膜免疫系统研究的相关背景1 1 2 1 肠道粘膜免疫概述肠道不仅是消化、吸收营养物质的场所，而且其粘膜还具有重要的免疫功能。这是由于多种微生物在肠道形成菌丛，肠道在与这些微生物共存的同时，可识别入侵的有害微生物以及被肠粘膜上皮吸收的异己物质，并加以排除。所以，肠道粘膜免疫是机体防止感染的第一道防线。肠道粘膜免疫系统包括肠道相关淋巴组织( g u ta s s o c i a t e dl y m p h o i dt i s s u e s ，g a l t ) 和有关细胞、分子成分，如淋巴细胞、巨噬细胞、各种白细胞、粒细胞和抗体、溶菌酶、抗菌肽等。g a l t 是粘膜免疫的主要部位，g a l t 由p p ( p e y e r s p a t c h e s ) 、肠系膜淋巴结( m l n ) 以及分散在粘膜固有层( l p ) 和肠上皮中的大量淋巴细胞组成。在肠道p e y e r 淋巴结滤泡上皮中含有m 细胞，m 细胞与肠上皮细胞紧密排列在一起，m 细胞为一种特化扁平上皮细胞，肠上皮细胞形成规则的微绒毛而m 细胞形成不规则的微折叠，因此又称其为微褶皱细胞( m i c r o f o l dc e l l ) 。p p 是免疫系统的诱导部位，l p 是免疫系统的效应部位【| 刀，故p p 和粘膜相关的淋巴细胞直接参与肠道抗原的识别、呈递和免疫效应，它们的功能和状态直接地反映了肠道粘膜免疫系统功能和状态【8 】。g a l t 的主要特征为：具有特殊的集合淋巴结( 又称p e y e r sp a t c h e s ，p p ) ；具有黏膜归巢受体，即淋巴细胞通过再循环又回到黏膜的模式；是i g a 十b 细胞和记忆t 细胞定位的所在地：所分泌的免疫球蛋白主要是s i g a 【9 】，它可抵御细菌、病毒和毒素从消化道入侵，肠黏膜抗体形成细胞占体内的抗体细胞的7 0 8 0 ，产生免疫球蛋f j a ( i g a ) 的量比体内其他i g 类型的总量还要多。肠道与单核巨噬细胞系统、肝、脾等免疫功能器官相比是最大的免疫器官，肠道淋巴组织最大，超过所有组织。肠道黏膜面积巨大，约1 0 0 倍于皮肤表面，每时每刻黏膜都要接触大量抗原，担负着重要免疫功能。p e y e r sp a t c h e s 是肠道内的主要感应位点，在它之上抗原具有与各种特定细胞结合的能力，从而诱导激活在巨噬细胞和树突状细胞，b 淋巴细胞和t 淋巴细胞之间的免疫反应。许多t 细胞存在于弥散淋巴系统中的粘膜固有层中，一旦抗原穿过了常态上皮细胞层，它就有可能呈递和激活粘膜固有层中的t 细胞，从而引发免疫应答。粘膜免疫应答被诱导产生时，初始t 细胞和b 细胞就会通过淋巴系统，经由胸腺进而进入外周血液循环中。1 1 2 2 肠道粘膜免疫机理( 1 ) 诱导部位g a l t 中p p 是产生特异性免疫应答的初发区之一，在肠粘膜免疫中起着关键性的作用，第一章前言故是诱导部位中研究最多的。m l n 与p p 通过淋巴管道相连，又经胸导管外通血液，是粘膜与外周免疫系统的中转站【1 0 】。在p p 中除各种类型的淋巴细胞外，还有一种特殊的细胞( m 细胞) ，其主要功能是摄取和转运抗原。抗原经肠道m 细胞进入胞内形成吞饮泡转送入细胞内。经抗原提呈细胞( a p c ) 加工提呈。被活化的b 细胞经m l n 进入血液，通过血液循环大部分被带到l p ，少部分进入其它外分泌组织细胞在固有层定居下来，并在抗原、t细胞和细胞因子作用下增殖为成熟的分泌i g a 浆细胞，产生大量s i g a 。在无菌动物肠道内喂服双歧杆菌可产生i g a ，表明产生i g a 细胞的生成在肠道抗原刺激下逐渐增加【l l j 。然而m 细胞是启动免疫应答与分泌免疫效应物质的第一步，而p p 和m l n 是诱导的部位( 位点) 。( 2 ) 效应部位效应部位的t 细胞如果说p p 和m l n 是诱导位点，那么l p 和上皮中的淋巴细胞就是局部免疫效应部位( 位点) 。该部位的研究主要集中在l p 的t 细胞，此细胞与其它细胞及微环境的相互作用直接调节粘膜免疫应答1 2 】。肠粘膜免疫系统诱导部位t h l 、t h 2 细胞均参与肠粘膜免疫应答的调节【13 1 。t 细胞在肠粘膜中分布较多，一些t s t 细胞亚群分泌i f n - 7 、t n f a 、i l 1 2等细胞因子，促进细胞免疫应答，表现t h l 的作用；另一些亚群则分泌i l 2 、i l 一4 、i l 5 、i l 一6 、i l 1 3 等细胞因子，促使粘膜淋巴组织中的b 细胞活化、增殖、分泌大量抗原特异性s i g a ，表现t h 2 的作用；因此t 细胞分泌的细胞因子对粘膜免疫应答有重要的调节作用1 4 】。效应部位的b 细胞p p 中被活化的b 细胞经肠系膜淋巴结、胸导管到血循环，然后迁移至粘膜固有层进一步分化为具有分泌功能的浆细胞。肠粘膜固有层淋巴细胞分化处于活跃状态，其中含有大量的浆细胞1 5 1 ，该细胞分泌的i g a 通过粘膜和浆膜上皮细胞向外分泌时，与上皮细胞产生的分泌片连接成完整的s i g a 释放至分泌液中，并与上皮细胞紧密连接在一起分布于粘膜和浆膜上发挥免疫作用。1 1 3 肠道微生物群系与人类健康的关系1 1 3 1 肠道微生物的分类人体中生活着大量细菌，仅肠道内就有约1 0 1 4 个细菌，达5 0 0 余种。肠道内有大量的细菌，主要为厌氧菌，对于人体健康而言，正常存在于肠道中的细菌大致可分为三类。( 1 ) 有益细菌如各种双歧杆菌、乳酸杆菌等，数量最多，对人体有益无害，是人体健康不可缺少的第一章前言重要因素。它们的作用主要表现在：( 1 ) 合成各种维生素，如双歧杆菌能合成维生素b l 、b 2 、b 6 、b 1 2 和叶酸等，乳酸杆菌能合成维生素c 等。( 2 ) 参与食物的消化作用，将各种蛋白质分解成多肽或氨基酸，促进人体的吸收；分解乳糖、降解胆固醇等脂类物质。( 3 ) 产生乳酸、醋酸，降低肠道内的p h 值，加快肠道蠕动，消除便秘。( 4 ) 抑制致病菌群的生长，如双歧杆菌生长在大肠粘膜上，起着占位保护作用，使进入肠道内的致病菌群无安身之地，同时有益细菌产生的有机酸和其他抑菌物质，能抑制或杀死病菌的生长。( 5 ) 分解有害、有毒物质，双歧杆菌、乳酸杆菌分泌的各种酶，能分解有害菌产生的亚硝胺、硫化氢及其他有毒或致癌物质，有利于延缓衰老和预防癌变。( 2 ) 中间类型如大肠杆菌、肠球菌等，正常情况下它们益多害少，但在一定条件下也可能对人体造成危害。( 3 ) 致病菌如产气荚膜梭菌、假单孢菌等，它们害多利少，但数量较少，在正常情况下，一般不会致病，如果后两类细菌的数量超过正常范围，才会导致疾病。1 1 3 2 肠道微生物区系人体肠道内有如此多的细菌但并未引起不正常或致病现象，这一微生物层构成了肠道正常菌群。肠道菌群间互相保持着共生或拮抗的关系，它们以宿主摄取的食物以及分泌于消化道内的各种成分作为营养，从而不断地增殖和被排泄，肠道菌群与宿主的健康、疾病有着极其密切的联系【1 7 】。在正常状态下，肠道菌群的组成、种类都是较为稳定的，肠道菌群不仅和肠粘膜共同构成一道保护屏障，阻止细菌、病毒和食物抗原的入侵，还可以刺激肠道的免疫器官发挥更强的免疫功能。益生菌是肠道正常菌群的优势菌群，与肠粘膜紧密结合构成肠道的生物屏障，能通过占位效应、营养竞争及其分泌的各种代谢产物及细菌素等抑制条件致病菌的过度生长及外来致病菌的入侵，维持肠道微生态平衡【1 8 】。一个成人肠道内的微生物数量比其所有体细胞和生殖细胞的总数要高一个数量级。与大多数自然的生态系统一样，肠道中的微生物多样性是不确定的，但是现行的观点认为肠道的微生物区系由5 0 0 多种微生物构成，其总的生物量约为1 5 k g 19 1 ，并且细菌占大多数。肠道菌群主要的种类是：类菌体、真菌类、双歧杆菌属、梭菌属、消化链球菌属及其它的种类，而这些微生物在动物的消化道内又具有定位、定性、定量和定宿主等特点。正常肠道内定植有双歧杆菌、肠杆菌、乳酸杆菌和肠球菌等厌氧菌和革兰氏阴性菌为主的菌群。1 1 3 3 肠道茵群和免疫功能的关系第一章前言肠道菌群不仅和肠黏膜共同构成一道保护屏障，阻止细菌、病毒和食物抗原的入侵，还可以刺激肠道的免疫器官，发挥更强的免疫功能。肠道菌群在肠道免疫中起着非常重要的作用，当肠黏膜屏障不能有效地阻抑病原微生物入侵，造成黏膜的炎症损伤时，肠黏膜对大分子物质的通透性明显提高，引起大量的抗原物质入侵，又可以进一步加重肠黏膜的损伤和肠道菌群的紊乱，而且损伤的黏膜组织还会对自身的菌群发生免疫反应，是诱发内源性感染和自身免疫性疾病的危险因素。1 1 4 益生菌对小鼠肠道粘膜免疫影响的相关研究在粘膜表面的粘液中存在着大量的分泌型i g a 成分，这种免疫球蛋白是粘膜表面主要的免疫成分。自上个世纪七十年代以来，诸多学者和科学家对小鼠小肠道内的微生物菌群和肠道表面的免疫球蛋白成分等相关内容作了相当深入的研究。1 9 6 3 年，t h o m a s 提出i g a是位于粘膜表面的主要免疫成分；此后两年，s c h a e d l e r r w 证实了微生物菌群对胃肠道的重要作用。从八十年代起，有关益生菌和相关的生物活性多肽对胃肠道粘膜系统的影响得到了学者们的重视，研究内容也逐步深入。1 9 8 6 年p e r d i g o n , n a d e r d em a c i a s 等人就发现，口服某些乳酸菌能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞的活性增加，同时肠道内i g a 的含量也明显增加。1 9 9 9 年p e r d i g o n 等人将乳酸菌发酵的牛奶喂食小鼠，发现产s i g h 细胞、吞噬细胞活性和在感染过程中产生的特异性抗体反应等免疫应答效果均有增强作用。2 0 0 0 年p e r d i g o n ，v a l d e z 等人的研究也证实了肠道内生态系统和益生菌的组成成分之间有着复杂的相互作用，这种作用在肠道相关免疫系统( g a l t ) 的活化发育和维持过程有着重要作用。2 0 0 2 年j l e b l a n c 等人对乳酸菌的发酵产物进行了柱层析处理，将获得的三个组份喂食小鼠，结果显示小鼠的粘膜免疫效果均有增加，特别是中等分子量的组分效果尤为显著。2 0 0 4年m m e d i c i 等人利用含益生菌的鲜奶研究了对小鼠肠道粘膜免疫的调控作用。这些研究显示，益生菌和乳源的一系列多肽对机体能够产生明显的免疫调节作用，这对于解决抗生素滥用的现状，维持并增强人体肠道正常功能，增强人体体质有十分重要的意义。1 1 5 益生菌和肠道粘膜免疫1 1 5 1 益生菌的黏附益生菌粘附在宿主肠道上皮细胞后，可发挥占位定植的作用，以阻止病原菌与肠道粘膜受体结合产生粘附；益生菌的粘附还可以防止条件致病菌的易位，防止条件致病菌向周围不断扩散，引发有关部位感染，此外益生菌的定植还使宿主具有调整菌群平衡、控制内毒素血症、抗肿瘤、抗衰老、免疫和营养等生理作用【2 0 】。因此，益生菌进入肠道后能否粘r第一章前言附在肠道粘膜上皮细胞表面，形成稳定的菌群，与其是否能发挥生态效应关系密切。( 1 ) 粘附素粘附素是一种具有多种结构和功能的多样化分子，可能是蛋白质、多肽、糖蛋白、糖脂和多糖或单糖，是存在于微生物的菌毛、细胞壁、外膜蛋白、鞭毛、荚膜及小丝状体的一类与微生物的粘附密切相关的特殊物质。( 2 ) 粘附素受体粘附素受体也是微生物的粘附所必须的物质之一，一般位于宿主上皮细胞粘膜上，其中大部分是具有脂肪酸结合位点的蛋白质或糖类，各类细菌具有不同粘附结构的配体、受体以及不同的粘附部位。1 1 5 2 益生菌对肠道粘膜的作用细胞因子能够调节免疫应答的各个方面，并影响着其他细胞的功能。细胞因子产生于天然免疫和特异免疫的效应阶段，介导免疫应答、炎症反应并实施有效地调节，它决定着t 、b 细胞分化的方向。经过抗原刺激后的t 细胞被活化从而开始向t h 0 分化，t h 0 就会分泌出一些细胞因子，如果分泌的是i l 一4 、i l 1 0 、t g f 一1 3 等细胞因子，就会向t h 2 分化，从而激活b 细胞分泌i g e ；如果分泌的是i l 2 、i l 1 2 、i l 1 8 、i f n 吖等细胞因子，就会向t h l 分化，一方面可以激活b 细胞分泌s i g a ，另一方面t h l 分泌的i l - 2 、i f n - a 、i f n p 、t n f o 【等细胞因子可以发挥抗癌抗病毒的功能。除此之外，t 细胞还会分泌一些其它的细胞因子如干细胞生长因子( s t e mc e l lf a c t o r , s c f ) 、i l 5 、i l 6 、i l 7 等，s c f 主要是通过跨膜的形式来抵抗外来细菌的入侵；i l 5 是促进嗜酸粒细胞前体的分化和增殖，协同其它细胞因子( 如i l 2 、i l 4 等) 刺激b 细胞的增殖与分化，促进活化的b 细胞分化成i g a + b 细胞；i l 6 对肠粘膜中的体液免疫、尤其是i g a 反应十分重要；i l 7 是一种多向性细胞因子，可以促进前b 细胞的生长、分化，是成熟b 细胞的增殖因子，同时i l 7 对于t 细胞的分化、生长及功能也有重要影响。益生菌有诱导细胞核因子r b ( n u c l e a rf a c t o rr d 3 , n f 1 c b ) 介导反应的能力，n f r d 3 可以活化肠腔内的t o l l 1 i k e 受体，t o l l 1 i k e 受体是肠道免疫的重要启动者【2 1 盈1 。这些细胞因子通过合成和分泌的相互调节、受体表达的相互调控、生物学效应的相互影响而组成共同组成了一个奇妙的因子网络。2 0 0 5 年朱于敏等用储存不同时期的酸奶进行小白鼠试验，结果发现乳酸菌作为有效成分刺激小鼠肠道淋巴细胞使几2 的水平增高1 2 3 1 。2 0 0 4 年芬兰m a i j as a x e l i n 等【2 4 】报道了一种含双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u mi n f a n t i s 和b i f i d o b a c t e r i u mb r e v e ) 的益生菌产品，证明了在免疫效应中起了最主要的作用是来源于戤i n f a n t i s 和b i b r e v e 的d n a 可以很明显的促进i l 1 0 和i l 1 的产生。另外，双歧杆菌的o第一章前言d n a 中g c 含量相对于比较高，未甲基化的c p g 可以更好的和t o l l 1 i k e r e c e p t o r9 结合，从而引起免疫反应，产生抗炎因子，提高n 1 反应。2 0 0 7 年p a t u r i 等瞄佣l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a f t il 1 0 和l a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e il a f t il 2 6 灌喂b a l b c 小鼠，利用荧光免疫检测法检测到在小肠中s i g a 分泌增多，用酶联免疫方法检测到i l 1 0 和i f n 吖的量也是增多的，他们提出这两种菌都能够提高小鼠免疫系统的功能。益生菌进入消化道后被肠内特有的m 细胞摄取，传递给p e y e r sp a t c h e s 内的抗原递呈细胞，从而促进t h 0 细胞分泌细胞因子同时向t h l 细胞分化，t h l 细胞在细胞因子的作用下也能够分泌其特异的细胞因子，从而促进b 细胞分泌i g a ，抑制i g e 的分泌，同时t h l细胞产生的一些细胞因子0 l 。2 、i f n 0 【、i f n 一1 3 和t n f a ) 可抑制肿瘤和病毒的生长【2 6 j 。鼹邋简辨h l 爨魏图1 1 益生菌的作用1 1 6 瑞士乳杆菌的国内外研究现状瑞士乳杆菌，近年来发酵酸乳制品的医疗保健作用日益受到注目，研究发现多种发酵制品具有降血压、抑制肿瘤等生理功能，特别是对某些发酵乳中免疫活性因子( 如活性多糖、活性多肽等) 生物学功能的研究更为活跃。活性肽具有增进人体新陈代谢的生理功能，易消化吸收，有促进免疫、激素、酶抑制剂、抗菌、抗病毒、降血脂的作用，食用安全性高，是当今国际食品最热门的研究课题和极具发展的功能因子。在众多的乳酸菌中，瑞士乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ) 不仅是人体肠道的益生菌，可分离自酸乳，制干酪的引时装嚼：啼夕一b巍声竺一，殴第一章前言子和干酪，同型发酵产生d l 乳酸食用安全，而且瑞士乳杆菌还有较强的蛋白水解活性，能水解乳蛋白产生多种生物活性肽。同时，l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u sc p 7 9 0 其胞外蛋白酶能优先水解魄1 c n 和1 3 - c n ，其发酵的乳具有抗高血压、抑制肿瘤、降低胆固醇等作用，另外日本生产的c a l p i s 发酵乳对s h r ( 患原发性高血压的小鼠) 有一定的降压作用，发酵剂中主要含有l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ，从l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s c p n 4 发酵乳产品中分离得到具有抑制血管紧张素转化酶i ( a n g i o t e n s i n - i - c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 活性有抑制作用的片段【2 7 1 。在发酵过程中，乳酸菌所分泌的蛋白酶将这些活性片段切割下来释放到发