（病理学与病理生理学专业论文）derl1在非小细胞肺癌增殖侵袭中的作用研究.pdf

l 掣燃嬲 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地 方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处 本人承担一切相关责任 论文作者签名 日期 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定 即 研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学 本人保 证毕业离校后 发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学 且导师为通讯作者 通讯作者单位亦署名为中国医科大学 学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许 论文被查阅和借阅 学校可以公布学位论文的全部或部分内容 保密 内容除外 以采用影印 缩印或其他手段保存论文 论文作者签名 指导教师签名 日 期 目录 一 摘要 中文论著摘要 1 英文论著摘要 8 二 英文缩略语 1 6 三 论文 论文一 前言 1 7刖吾 l 实验材料与方法 1 7 实验结果 1 9 讨论 2 9 结论 3 1 参考文献 3 2 论文二 前言 3 4 刖吾 j 耳 实验材料与方法 3 4 实验结果 3 7 讨论 4 1 结论 4 3 参考文献 4 4 论文三 前言 4 6 翮吞 o 实验材料与方法 4 6 实验结果 4 8 讨论 5 4 结论 5 5 参考文献 5 6 四 本研究创新性的自我评价 5 9 五 附录 综j 苤 6 0 在学期间科研成绩 6 7 致谢 6 8 个人简介 6 9 中文论著摘要 d e r l l 在非小细胞肺癌中过表达并与肺癌 增殖侵袭能力相关 刖吾 近年来肺癌发病率持续升高 已成为恶性肿瘤死因的第一位 而大部分肺癌患 者死于肿瘤的复发和转移 因此发现肺癌侵袭 转移的关键靶点具有重要意义 d e r l l 是一种内质网相关蛋白 它参与错误折叠的蛋白质从内质网释放如细 胞浆的过程之中 在内质网应激 e rs t r e s s 的过程中 d e r l l 的表达水平发生 上调 并且能够抑制内质网应激所导致的细胞凋亡 有研究证实d e r l l 在肿瘤中 可以从内质网中渗透到细胞膜上表达 在胰腺癌 肝癌 乳腺癌 结肠癌 食管 癌等多种肿瘤中存在d e r l l 高表达 乳腺癌细胞中研究发现 d e r l l 在乳腺癌 组织中过表达并与肿瘤的淋巴结转移有关 d e r l l 能减弱药物诱导的细胞凋亡 这些研究提示d e r l l 可能是促进肿瘤增殖转移的一个重要癌基因 但是d e r l l 在非小细胞肺癌中的表达情况及其与临床病理因素的关系未见 文献报道 其对肺癌细胞的作用及其作用机制还不清楚 我们检测非小细胞肺癌 中d e r l l 的表达情况 分析了d e r l l 表达与临床病理因素的关系 通过干扰肺 癌细胞系a 5 4 9 中d e r l l 的基因表达 探讨了d e r l l 对肺癌细胞增殖 侵袭能 力的影响及其相关机制 材料和方法 l 组织来源 具有完整随访资料的9 0 例原发性非小细胞肺癌及相应正常肺组织标本均来 自2 0 0 2 年到2 0 0 5 年在中国医科大学附属第一医院实行手术的病人 组织经1 0 中性福尔马林固定 石蜡包埋 患者术前均未接受放化疗 组织学分类和分化程 度根据2 0 0 4 w h o 分类标准进行判定 按国际抗癌联盟的肺癌p t n m 分期标准 i 期3 8 例 i i 期2 2 例 i i i a 例2 0 i i i b5 例 期5 例 鳞癌4 4 例 腺癌4 6 以p b s 代替一抗作为阴性对照 结果判定 d e r l l 免疫组化阳性信号定位于细 胞浆 我们将1 2 5 的细胞核或细胞浆 核着色记为1 分 2 6 5 0 记为2 分 5 1 7 5 记为3 分 7 6 1 0 0 记为4 分 同时根据染色强度 无染色记为0 分 淡染记为1 分 黄色颗粒记为2 分 棕褐色颗粒记为3 分 着色细胞数得分乘以着色强度得 分为d e r l i 得分 我们将得分0 4 分记做d e r l l 阴性 得分5 1 2 分记做d e r l l 阳性 3 细胞培养与s i r n a 干扰 肺癌细胞系a 5 4 9 h 1 2 9 9 购自a t c c 均用含1 0 热灭活新鲜小牛血清的 r p m l l 6 4 0 g i b c o u s a 1 0 0 u m l 的青霉素 1 0 0 u m l 的链霉素的培养基 在3 7 c 5 c 0 2 的条件下培养 o n t a r g e t p l u ss m a r t p o o ls i r n af o rd e r l l 与 o n t a r g e t p l u ss i c o n t r o l 购自d h a r m a c o n 转染前2 4 小时将细胞按5 0 密度接种 于2 4 孔板 采用d h a r m a f e c t1 转染试剂进行转染 转染后4 8 小时使用p c r 和 w e s t e r nb l o t 检测干扰效率 4 i m p c r 对于培养细胞或新鲜肺癌组织采用r n e a s yp l u sm i n ik i tf r o m q i a g e n 提取 总r n a 采用a b ih i g hc a p a c i t yc d n ar tk i t a p p l i e db i o s y s t e m s 进行反转录 使 用a b l 7 9 0 0 实时定量p c r 仪 并使用d e r l l 特异性探针检测其在组织与细胞中 的含量 内参采用b e t aa c t i n 5 w e s t e r nb l o t 法检测蛋白表达 收集细胞及剪碎的新鲜肺癌组织加入裂解液充分裂解 低温高速离心 4 1 2 0 0 0 转 m i n 3 0 m i n 提取上清为总蛋白 上样蛋白量为6 0 u g 电泳 1 2 s d s p a g e 凝胶 转印 5 0 v 1 2 0 m i n 5 正常小牛血清封闭 抗d e r l l 1 1 0 0 0s i g m a 和抗1 3 a c t i n 1 1 0 0 0 4 c 孵育过夜 分别与对应的二抗 1 2 5 0 0 2 s a n t ac r u z u s a 室温孵育2 h e c l 显色 结果经自动电泳凝胶成像分析仪 c h e m i i m a g e r5 5 0 0 a l p h ai n n o t e c h u s a 采集 进行灰度值测定 6 m t t 法检测细胞增殖及集落形成实验 将单个细胞悬液接种于9 6 孔培养板中 每孔体积2 0 0 u l 含1 0 3 个细胞 培养 2 4 h r 每孔加入m t t 3 4 5 2 y l 2 5 d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e 溶液 5 m g m l s i g m a u s a 继续培养4 h r 吸去上清液 加入15 0 u l d m s o s i g m a u s a 振荡1 0 m i n 4 9 0 n m 波长下测定各孔光吸收值 以不含细胞的等体积培 养基作对照 绘制细胞生长曲线 集落形成实验在干扰4 8 小时后接种1 0 0 0 个细 胞于6 e m 培养皿中2 周后用g i e m s a 染色 7 细胞迁移和侵袭能力检测 用无血清r p m l l 6 4 0 培养基重悬细胞 调至2 5 x 1 0 5 个 m l 细胞 取1 0 0 u l 加 入上室中 孔径s u m c o s t a r u s a 下室加入6 0 0 u l 含l o d 牛血清r p m l l 6 4 0 培养基 3 7 5 c 0 2 孵箱中培养6 h r 后吸尽培养基 p b s 清洗后 甲醇室温固 定1 5 m i n 用棉签轻擦掉上表面的细胞 苏木素染色 室温干燥过夜 取下聚碳 酸酯微孔膜 置载玻片上 镜下观察 细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清 r p m l l 6 4 0 培养基以1 3 稀释m a t r i g e l b db i o s c i e n c e s u s a 力n 入上室1 0 0 u l 在 室温下放置3 h r 使用前用培养基重新水化并吸净 其他与迁移实验相同 培养1 8 h r 后观察结果 8 数据分析 采用s p s s l 0 0 统计分析软件 对d e r l l 表达和临床病理因素的关系用卡方 检验 生存分析采用k a p l a n m e i e r 法 用l o g r a n k 检验判断差异性 其它实验结 果采用t 检验进行数据分析 用均值4 标准差表示 p 0 0 5 为差异有意义 结果 1 d e r l l 蛋白过表达与非小细胞肺癌分期和淋巴结转移有关 我们采用免疫组化方法检测了d e r l l 蛋白在9 0 例肺癌及其癌旁正常肺组织 中的表达情况 d e r l l 在正常支气管上皮及肺泡上皮均弱着色 为阴性表达 在 9 0 例非小细胞肺癌中d e r l l 阳性表达为3 4 例 阳性率为3 7 阳性信号主要表 3 2 在两种肺癌细胞系中转染d e r l l 特异性s i r n a 抑制肺癌细胞 增殖和侵袭 我们采用d e i u l 特异性s i r n a 干扰其在肺癌细胞系a 5 4 9 和h 1 2 9 9 中的表 达 通过实时定量p c r 检测转染效率 我们发现转染4 8 小时后 与转染乱序 s i r n a 的细胞相比 转染特异性干扰的细胞d e r l l 的表达明显下降 其中a 5 4 9 干扰效率8 7 h 1 2 9 9 干扰效率8 3 m t t 法测定结果显示 d e r l l 特异性 s i r n a 干扰的细胞增殖能力明显低于对照组 p o 0 5 与m t t 结果相似 干扰 d e r l l 后a 5 4 9 与h 1 2 9 9 细胞的集落数目明显下降 同时 t r a n s w e l l 侵袭实验 证明下调d e r l l 基因表达后 a 5 4 9 及h 1 2 9 9 细胞的侵袭能力被明显抑制 3 干扰d e r l l 下调肺癌细胞中m m p 2 和m m p 9 的表达 为了研究干扰d e r l l 后肺癌细胞侵袭能力下调的机制 我们检测了粘附相关 蛋白和侵袭相关蛋白的表达变化 我们检测了m m p 2 和m m p 9 蛋白表达量和活性 的变化 我们发现 干扰d e r l l 后m m p 2 和m m p 9 的总蛋白和活性蛋白含量均 有明显下调 然后我们使用实时定量p c r 检测了m m p 2 和m m p 9 的m r n a 水平 变化 我们发现干扰d e r l l 后m m p 2 和9 在转录水平上出现明显下调 因此 d e r l l 干扰所致的侵袭能力下调可能是由m m p 下调所导致的 4 干扰d e r l l 通过e r k 通路下调m m p 2 和m m p 9 转录 m m p 2 和m m p 9 的转录调节通常是由e r k 通路 p 3 8 通路和j n k 通路来调 节的 我们猜测干扰d e r l l 可能通过这三者来调控m m p 2 和m a 佃9 的转录 干 扰d e r l l 后 我们发现p p 3 8 和p j n k 的水平没有发生变化 但是p e r k 的水平 出现明显下调 因此d e i u l 导致的m m p 2 和9 的上调可能是由e r k 通路介导的 我们使用e r k 通路抑制u 0 1 2 6 和p d 9 8 0 5 9 剂处理a 5 4 9 和h 1 2 9 9 细胞后发现 m m p 2 和m m p 9 的m r n a 水平出现明显下调 与干扰d e r l l 后的趋势一致 此 外 我们检测了e r k 上游蛋白p m e k p r a f 的磷酸化水平 发现干扰d e r l l 下调了p m e k 和p r a f p m s k 因此d e r l l 可通过m e k e r k 通路介导m m p 2 4 和m a 压p 9 的转录 5 干扰d e r l l 能够抑制s t a t 通路 此外 我们还检测了干扰d e r l 后j a k s t a t 通路激活状况的变化 干扰 d e r l i 能够抑制j a k s t a t 通路关键蛋白s t a t 3 磷酸化水平 我们发现干扰 d e r l l 之后s t a t 3 的磷酸化水平明显下调 以上结果说明d e r l l 能够同时调节 m e k e r k 通路水平和s t a t 3 通路活性水平 6 干扰d e r l l 下调p e g f r 水平和总e g f r 蛋白水平 由于d e r l 1 能够同时调控m e 幻 e i 通路和s t a t 3 通路 并且其定位于细 胞膜和浆 我们猜测d e r l l 对这两个通路的调控可能是通过调节e g f r 通路活性 来实现的 我们检测了干扰d e r l l 后p e g f r 的水平和总e g f r 的蛋白水平 我 们发现下调d e r l l 能够显著下调p e g f r 的磷酸化水平并且下调e g f r 的总蛋白 水平 干扰d e r l 降低e g f 激活p e g f r 的能力 提示d e r l l 通过与e g f r 相 互作用来调节下游通路活性 7 d e r l l 与e g f r 结合 由于干扰d e r l l 能够下调e g f r 总蛋白水平 我们猜测d e r l l 可能通过增 强e g f r 的稳定性来实现对其蛋白水平的调控 我们使用免疫共沉淀发现d e r l l 蛋白与e g f r 蛋白能够直接结合 讨论 d e r l l 在内质网应激反应中起到了重要作用 d e r l l 参与了将错误折叠蛋 白质从内质网运送到胞浆的过程 d e r l l 含有4 个跨膜结构域 但其氮端和碳端 都处于细胞浆中 9 1 有研究证实d e r l l 在肿瘤中可以从内质网中渗透到细胞膜 上表达 因此d e r l l 抗体可以作为肿瘤治疗的新靶点 最近研究发现 d e r l l 在胰腺癌 肝癌 乳腺癌 结肠癌 食管癌等多种肿瘤中存在着高表达 可能是 一个潜在的癌基因 在乳腺癌组织中用w e s t e r nb l o t 和免疫组化的方法检测了 d e r l l 的含量 发现其在肿瘤组织中过表达 并且与肿瘤的分级和淋巴结转移相 关 然而 d e r l l 在肺癌中的表达情况及其与临床病理因素的关系还不清楚 本研究证实了在非小细胞肺癌中d e r l l 在蛋白水平存在显著上调 d e r l l 5 的过表达与肺癌的淋巴结转移和p t n m 分期显著相关 干扰d e r l l 在肺癌细胞 中的表达明显抑制了肺癌细胞的增殖能力和侵袭能力 此外 d e r l l 通过与e g f r 结合 提高e g f r 稳定性从而提高p e g f r 通路以及下游s t a t 通路和e r k 通路 活性来增强肿瘤细胞的侵袭转移能力 为了验证d e r l i 在肺癌中的表达情况 我们通过免疫组化证实其蛋白在非小 细胞肺癌组织中过表达 而且d e r l l 在肺癌中的染色强度明显强于正常支气管上 皮并且与肿瘤的转移相关 此外d e r l l 在肺癌细胞系中的表达高于正常支气管细 胞系h b e 中的表达 这些结果证实了 d e r l l 在非小细胞肺癌中存在过表达且 d e r l l 过表达与临床病理因素关系密切 先前的研究发现 诱导内质网应激能够上调d e r l l 的表达 d e r l l 基因敲 除可以诱导内质网应激反应 在乳腺癌中d e i 也1 能够保护细胞减少内质网应激所 导致的凋亡 提示d e r l l 与肿瘤的生长能力密切相关 不仅如此 转染d e r l l 还增强了乳腺癌细胞在裸鼠体内的转移能力 但是在肺癌细胞中d e r l l 是也否存 在着这种功能还未证实 我们通过m t t 集落形成和t r a n s w e l l 实验验证了干扰 d e r l l 基因表达后a 5 4 9 与h 1 2 9 9 细胞的增殖速度与集落形成能力明显下降 细 胞的侵袭能力也明显下调 这些结果进一步解释了d e r l l 在肺癌组织中与淋巴结 转移和p t n m 分期存在显著相关性 d e r l l 是如何促进肺癌细胞的侵袭转移能力的呢 本研究显示干扰d e r l l 能够在一定程度上下调m m p 2 和m m p 9 的表达 m m p 2 与m m p 9 对细胞外基 质的降解和细胞的侵袭能力有重要作用 1 2 6 因此d e r l l 可通过对m m p 的调节 来促进肺癌细胞的侵袭能力 我们知道 m a p k 通路对m m p 2 和m m p 9 的转录 具有重要调节作用 因此在干扰d e r l l 后我们检测了m a p k 通路活性 发现 p e r k 的水平出现明显下调 因此d e r l l 可能通过e r k 通路来调节m m p 进 一步应用e r k 通路抑制u 0 12 6 和p d 9 8 0 5 9 剂处理a 5 4 9 和h 1 2 9 9 细胞后发现 m m p 2 和m m p 9 的m r n a 水平出现明显下调 与干扰d e r l l 后的趋势 致 此 外 我们检测了e r k 上游蛋白p m e k p r a f 的磷酸化水平 发现干扰d e r l l 下调了p m e k 和p r a f p m s k 因此d e r l l 可通过m e k e r k 通路介导m m p 2 和m m p 9 的转录 6 另外 我们还发现d e r l l 可以调控j a k s t a t 通路 而j a k j s t a t 通路和 m e 舳r k 通路都与e g f r 通路相关 而e g f r 突变和通路信号增强在肺癌中具 有重要作用1 1 7 1 因此我们推测d e r l l 是通过e g f r 调节下游e r k 通路 调节 m m p 2 和m m p 9 的表达进而增强肿瘤细胞的侵袭转移能力 而迸一步实验验证了 这一推测 我们发现d e r l l 可通过与e g f r 结合 增强e g f r 稳定性从而提高 p e g f r 通路活性 综上所述本研究证实了癌基因d e r l l 在肺癌中呈过表达 并且其过表达与 p t n m 分期与肺癌的淋巴结转移正相关 下调d e r l l 表达能够抑制肺癌细胞的 增殖与侵袭能力 d e r l l 通过e g f r 调节m e k e r k 通路和s 卫虹3 通路 进而 调节m m p 2 和m m p 9 表达 影响细胞侵袭 因此 d e r l l 在肺癌发展中具有重 要作用 可能成为治疗肺癌的候选靶点之一 结论 1 d e r l l 在肺癌中过表达 并且其过表达与肺癌的淋巴结转移 p t n m 分 期呈正相关 2 下调d e r l l 表达能够抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力 3 d e r l l 通过e g f r 调节m e k e r k 通路和s t a t 3 通路 进而调节m m p 2 和m m p 9 影响细胞侵袭 关键词 d e r l l 肺癌 增殖 侵袭 7 英文论著摘要 i n v o l v e m e n to fd e r l l i np r o l i f e r a t i o na n d i n v a s i o no f n o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r i n t r o d u c t i o n l u n gc a n c e ri st h el e a d i n gc a u s e o fd e a t ha m o n gt h em a l i g n a n tt u m o r sw o r l d w i d e a n dt h ei n c i d e n c eo fl u n gc a n c e ri si n c r e a s i n g n o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r n s c l c i s t h ep r i m a r yh i s t o l o g i c a lc l a s s i f i c a t i o no fl u n gc a n c e r a n dt h ep r o g n o s i so fp a t i e n t sw i t h n s c l cp r i n c i p a l l yc o r r e l a t e sw i t ht u m o rm e t a s t a s i s w h i c hi sam u l t i s t e pp r o c e s s i n v o l v i n gt h ei n v a s i o no fp r i m a r yt u m o rc e i l s i n t ot h es u r r o u n d i n gt i s s u ea n dt h e i r p r o p a g a t i o n a td i s t a ls i t e s av a r i e t yo fc o m p l e xg e n e t i c e p i g e n e t i c a n d m i c r o e n v i r o n m e n t a lf a c t o r sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h e s u r v i v a la n dc o l o n i z a t i o no f t u m o rc e l l sa tn e wl o c a t i o n s h o w e v e r am a j o r i t yo ft h e s eb i o m a r k e r sm a ys e r v ea s f i n g e r p r i n t so rs u r r o g a t ee n dp o i n t so fd i s e a s es t a t u sa n dt r e a t m e n to u t c o m e t h e i d e n t i f i c a t i o no f b i o m o l e c u l e sp l a y i n gad i r e c tr o l ei nt u m o rm e t a s t a s i sa n dc e l ls u r v i v a l i sa ni m p o r t a n ts t e pt o w a r dr a t i o n a ld e s i g no fd r u g sf o rt r e a t m e n to fa d v a n c e d m a l i g n a n c i e s d e r l li sr e p o r t e dt op a r t i c i p a t ei nt h ed i s l o c a t i o no fm i s f o l d e dp r o t e i n sf r o m e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m e r a n dm e d i a t e st h er e t r o t r a n s l o c a t i o no fp r o t e i n sf r o me r l u m e ni n t oc y t o s 0 1 d e r l le x p r e s s i o ni su p r e g u l a t e db yi n d u c e r so fe rs t r e s si ny e a s t a n dc a e n o r h a b d i t i se l e g a n sa n ds u p p r e s s e se rs t r e s s i n d u c e da p o p t o s i si nt u m o r c e l l s a l m o s ta l ls o l i dt u m o r se n c o u n t e re rs t r e s s s u c ha sh y p o x i a a n dt u m o rg r o w t h d e p e n d so na ni n t a c tu n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e b l o c k i n g t h eu n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e a l s os e n s i t i z e sc a n c e r st oc h e m o t h e r a p i e s h o w e v e r d e s p i t et h ei n c r e a s i n ge m p h a s i so nd e r l l i nh u m a nt u m o r s w h e t h e ri t p o s i t i v e l yp a r t i c i p a t e si np r i m a r yh u m a nn o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e rh a sn o ty e tb e e n d e t e r m i n e d m o r e o v e r t h ed o w n s t r e a mt a r g e t sw h i c hd e r l lr e g u l a t e sn e e df u r t h e r i n v e s t i g a t i o n t oa d d r e s st h i sq u e s t i o n w ei n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o na n dc l i n i c a l s i g n i f i c a n c e o fd e r l 1i n9 0 s u r g i c a l l y r e s e c t e dn s c l c sw i t hd i f f e r e n t c l i n i c o p a t h o l o g i c a lf e a t u r e s i na d d i t i o n w ea l s oe x a m i n e dt h ea s s o c i a t i o no fd e r l l 8 e x p r e s s i o na n dt h ep r o l i f e r a t i o na n dm e t a s t a t i cp o t e n t i a lo f n s c l cc e l ll i n e s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 p a t i e n t sa n ds p e c i m e n s t h i ss t u d yw a sc o n d u c t e dw i t ht h ea p p r o v a lo ft h el o c a li n s t i t u t i o n a lr e v i e wb o a r d a tc h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y p r i m a r yt u l t i o rs p e c i m e n sw e r eo b t a i n e df r o m9 0p a t i e n t s 6 6m a l e sa n d2 4f e m a l e s d i a g n o s e dw i t hl u n gs q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a s c c a n d a d e n o c a r c i n o m aw h ou n d e r w e n tc o m p l e t er e s e c t i o ni nt h ef i r s ta f f i l i a t e dh o s p i t a lo f c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t yb e t w e e n2 0 0 1a n d2 0 0 5 f o l l o w u pi n f o r m a t i o nw a s o b t a i n e df r o mr e v i e wo ft h ep a t i e n t s m e d i c a lr e c o r d n o n eo ft h ep a t i e n t sh a dr e c e i v e d r a d i o t h e m p yo rc h e m o t h e r a p yb e f o r es u r g i c a lr e s e c t i o n a n da l l t h ep a t i e n t sw e r e t r e a t e dw i t hr o u t i n ec h e m o t h e r a p ya f t e rt h eo p e r a t i o n t h em e a na g eo ft h ep a t i e n t sw a s 6 0y e a r s r a n g e 3 6 8 7y e a r s t h eh i s t o l o g i c a ld i a g n o s i sa n dg r a d eo fd i f f e r e n t i a t i o n w e r ee v a l u a t e du s i n gh a e m a t o x y l i na n de o s i n s t a i n e ds e c t i o n sa c c o r d i n gt ot h ew o r l d h e a l t ho r g a n i z a t i o n w h o g u i d e l i n e so fc l a s s i f i c a t i o n a l l 9 0s p e c i m e n sw e r e r e e v a l u a t e dw i t hr e s p e c tt oh i s t o l o g i c a ls u b t y p e d i f f e r e n t i a t i o n a n dt u m o rs t a g e s c c w a si d e n t i f i e di n4 4o ft h ec a s e s a n da d e n o c a r c i n o m ai n4 6o ft h es a m p l e s l y m p h n o d em e t a s t a s e sw e r ei d e n t i f i e di n4 8o ft h e9 0p a t i e n t s t h ep t n ms t a g i n gs y s t e mo f t h ei n t e r n a t i o n a lu n i o na g a i n s tc a n c e r 7 t he d i t i o n w a su s e dt oc l a s s i f ys p e c i m e n sa s s t a g e si n 3 8 i i n 2 2 i i i n 2 5 a n di v n 25 2 c e l ll i n e s a 5 4 9 h 12 9 9c e l ll i n e sw e r ef r o ma m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n m a n a s s a s v a u s a t h ec e l l sw e r ec u l t u r e di nr p m i16 4 0 i n v i t r o g e n c a r l s b a d c a u s a c o n t a i n i n g10 f e t a lc a l fs e r u l t l i n v i t r o g e n 10 0i u m lp e n i c i l l i n s i g m a s t l o u i s m o u s a a n d l0 0 t g m ls t r e p t o m y c i n s i g m a c e l l sw e r eg r o w no ns t e r i l i z e d c u l t u r ed i s h e sa n dw e r ep a s s a g e de v e r yt w od a y sw i t h0 2 5 t r y p s i n i n v i t r o g e n 3 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y s u r g i c a l l ye x c i s e dt l z l t i o rs p e c i m e n sw e r ef i x e dw i t h 10 n e u t r a lf o r m a l i n e m b e d d e di np a r a f f i n a n d4 l t m t h i c ks e c t i o n sw e r ep r e p a r e d n o r m a lb r o n c h i a l e p i t h e l i u mp r e s e n ti n t h et u m o rs l i d e s w a su s e da sc o n t r 0 1 i m m u n o s t a i n i n gw a s p e r f o r m e du s i n gt h ee l i v i s i o nm e t h o d u l t r a s e n s i t i v e t m m a i x i n f u z h o u c h i n a t h e s e c t i o n sw e r ed e p a r a f f i n i z e di nx y l e n e r e h y d r a t e d 谢t l lg r a d e da l c o h o 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