（生物化学与分子生物学专业论文）文昌鱼gmnn基因的克隆、序列分析、表征及表达.pdf

摘要 g e m i n i n 基因( g m n n ) 在抑制再复制的进程中是主要的调控者，在细胞周期中 的s ，g 2 和早中期时，它负向调节c d t l p ，阻止m c m 2 7 p 复合物在复制起点的装 配，因此g m n n 通过阻止d n a 非正常地再复制来维持基因组的忠实性，确保同 一个复制起点在一个细胞周期中不会活化两次。在后生动物后期生长中，g m n n 在控制细胞分化的同时也控制着细胞的增殖。 g m n n 分别抑制青鲻鱼视网膜中s i x 3 和小鼠胚胎中h o x 的转录因子，同时在 非洲爪蟾中通过抑制b r g 1 的活性来维持神经祖细胞处于未分化状态。我们从文昌 鱼及j a p a n i c u m 中克隆得到g m n n 的e d n a 克隆。运用5 r a c e 和3 r a c e 克隆 得到g m n n 的全长e d n a 为7 2 1b p ，经进一步测序验证，然后运用r e a lt i m e p c r 研究其在胚胎和组织中的表达情况。 文昌鱼g m n n 序列编码一个2 4 1 个氨基酸的蛋白质，它与人g m n n 基因的同 源性接近4 8 0 2 ，与小鼠g m n n 基因的同源性达到5 3 7 3 ，与大鼠g m n n 基因 的同源性达到6 2 2 2 ，与原鸡g m n n 基因的同源性达到5 2 4 ，与倭黑猩猩 g m n n 基因的同源性达到6 2 5 0 。通过对文昌鱼的g m n n 基因的研究我们发现 它是由8 个外显子和7 个内含子组成，此外，运用实时定量p c r 研究g m n n 基因 的表达情况显示它在卵巢中高表达，而在精巢没有得到高表达。文昌鱼g m n n 基 因的克隆和表达结果显示文昌鱼该基因是一个编码相对短的蛋白的小基因，而与其 他脊椎动物不同的是该基因并不在增生组织表达。 关键词：文昌鱼；g m n n 基因；c d t l p ；m c m 2 7 p 复合物 a b s t r a c t g e m i n i ng e n e ( g m n n ) i sac e n t r a lr e g u l a t o ro ft h ep r o c e s st h a ti n h i b i t sr e - r e p l i c a t i o n d u r i n gs ，g 2 ，a n de a r l ymp h a s e so f t h ec e l lc y c l e ，i tn e g a t i v e l yr e g u l a t e st h ec d t l pa n d p r e v e n t st h e mf r o ml o a d i n gt h em c m 2 - 7 pc o m p l e xt ot h eo r i g i n so fr e p l i c a t i o n g m n n t h u sm a i n t a i n st h ei n t e g r i t yo ft h eg e n o m eb yp r e v e n t i n ga b n o r m a lr e - r e p l i c a t i o no fd n a i te n s u r e st h a t t h es a m eo r i g i no f r e p l i c a t i o ni sn o ta c t i v a t e dt w i c ew i t h i nt h es a m ec e l l c y c l e g m n ng e n ec o n t r o l sd i f f e r e n t i a t i o na sw e l la sc e l lp r o l i f e r a t i o nd u r i n gl a t e m e t a z o a nd e v e l o p m e n t i ti n h i b i t sb o t hs i x 3a n dh o xt r a n s c r i p t i o nf a c t o r si nm e d a k ar e t i n aa n dt h em o u s e e m b r y o ，r e s p e c t i v e l y , a n dm a i n t a i n s a nu n d i f f e r e n t i a t e ds t a t ei nn e u r a lp r o g e n i t o rc e l l so f x e n o p u sl a e v i sb ya n t a g o n i z i n gb r g - 1a c t i v i t y w eh a v ec l o n e dae d n ac l o n ee n c o d i n gg m n nf r o mt h ea m p h i o x u s 丑j a p a n i c u m t h e 7 2 1b pf u l l l e n g t hg m n ng e n ec d n aw a sc l o n e du s i n g5 r a c ea n d3 r a c ea n d f u r t h e rc o n f i r m e db yn u c l e o t i d es e q u e n c i n ga n dt h e ne x p r e s s e du s i n gr e a lt i m er t - p c r t h ea m p h i o x u sg m n ng e n es e q u e n c ee n c o d e sap r o t e i no f2 41a m i n oa c i d sw h i c h d i s p l a y sa p p r o x i m a t e l y4 8 0 2 h o m o l o g yw i t hh u m a ng m n ng e n e ，5 3 7 3 w i t ht h e m o u s eg m n n g e n e ，6 2 2 2 w i t hr a t t u sn o r v e g i c u sg m n n g e n e ，5 2 4 w i t ht h eg a l l u s g a l l u sg m n ng e n ea n d6 2 5 0 w i t hp a nt r o g l o d y t e s b ys t u d y i n gg m n ng e n es e q u e n c eo r g a n i z a t i o nw ef o u n dt h a ti ti sm a d eo f8e x o n sa n d 7i n t r o n s f u r t h e r m o r e , t h ee x p r e s s i o np a t t e r no fg m n n g e n ew i t hr e a lt i m er t - p c r r e v e l e dt h a tg m n n g e n ei sh i g h l ye x p r e s s e di nt h eo v a r yb u t n o ti nt h et e s t i s o u rr e s u l t s o nc l o n i n ga n de x p r e s s i o nt h eg m n ng e n ei na m p h i o x u sr e v e a l e dt h a tt h ea m p h i o x u s g m n ng e n ei sas h o r tg e n ee n c o d i n gar e l a t i v e l ys h o r tp r o t e i nb u tu n l i k ei no t h e r v e r t e b r a t e s i sn o te x p r e s s e di np r o l i f e r a t i v et i s s u e s k e y w o r d s ：a m p h i o x u s ；g m n ng e n e ；c d t lp ；m c m 2 - 7 pc o m p l e x l i s to fa b b r e v i a t i o n sa n ds y m b o l s u i ：m i c r ol i t e r ：i n f i n i t e a ：a d e n i n e a p c c ：a n a p h a s e p r o m o t i n gc o m p l e x c y c l o s o m e a p c ：a n a p h a s e p r o - c y c l er e g u l a t e d a t r g e n e ：a t a x i at e l a n g i e c t a s i aa n d r a d 3r e l a t e dg e n e b eb r a n c h i o s t o m af l o r i d a e b f l o r i d a e ：b r a n c h i o s t o m af l o r i d a e b i ：b r a n c h m s t o m aj a p a n i c u m b j a p a n i c u m ：b r a n c h i o s t o m a j a p a n i c u m b t ：b o st a u r u s ：c o w b t o r o s ：b o st a u r u s ：c o w b h l h ：b a s i ch e l i x - l o o p h e l i x b p ：b a s ep a i r b r a c al ：b r e a s tc a n c e r1 e a r l yo n s e t ) c 1 f c a n i sl u p u sf a m i l i a l i s ：d o g c ：c y t o s i n e c d cl8 ：c e l ld i v i s i o nc y c l er e l m e dl8 c d e4 5 ：c e l ld i v i s i o nc y i c l er e l a t e d4 5 c d c ：c e l ld i v i s i o nc y c l er e l a t e d c d c 6 ：c e l ld i v i s i o nc y c l er e l a t e d c d k ：c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e c d n a ：c o m p l e m e n t a r yd n a c d t l ：c h r o m a t i nl i c e n s i n ga n dd n ar e p l i c a t i o nf a c t o rl c d tlp ：c d cd e p e n d e n tt r a n s c r i p tlp c d x 2g e n e ：c a u d a lt y p eh o m e ob o x2 c d x 2 ：c a u d a lt y p eh o m e ob o x2 c e h 3 2 ：ce l e g a n sh o m e o b o x - 3 2 d r ? d a n i or e r i o ： d r e r t o ：d a n i or e r i o d n t p ：d e o x v n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e e c o l i ：e s c h e r 耙h i nc o l i e sc e l l ：e m b r y o n i cs t e mc e l l f a n c d 2 ：f a n c o n ia n e m i ac o m p l e m e n t a t i o ng r o u pd 2 gp h a s e ：g a pp h a s e gg ：g a l l u sg a l l u s ：h o u s ec h i c k g ：g u a n i n e g 1 ：g a pp h a s el g 2 m ：at r a n s i t i o np e r i o db e t w e e ng 2a n dm i t o s i sw h e r e t h e g 2c h e c k p o i n tc o n t r o l m e c h a n i s me n s u r e st h a te v e r y t h i n gi sr e a d ys ot h a tc e l le n t e rt h em ( m i t o s i s ) p h a s ea n d d i v i d e g 2 ：g a pp h a s e2o rg r o w t hp h a s e2 g a t a 6 ：g a t ab i n d i n gp r o t e i n6 g e m h 3 7 ：h u m a ng e m i n i n 3 7 g i 、仆小ig e n e ：g e m i n i ng e n e hs a p i e n s ：h o m os a p i e n s h s ：h o m os a p i e n s , h 2 0 ：h y d r o g e no x i d e ：w a t e r h c m v ：h u m a nc y t o m e g a l o v i r u s h d a c ：h i s t o n ed e a c e t y l a s e h o xg e n e ：h o m e o b o xg e n e s h sc d t1 ：h o m os a p i e n sc d cd e p e n d e n tt r a n s c r i p tl ： h s g f 、，f n n ：h o m os a p i e n sg e m i n i ng e n e i c m ：i n n e rc e l lm a s s k d a ：k il o d a l t o n mm u s c u l u $ ：m u sm u s c u l u s m m ：m u sm u s c u l u s m c m 4 ：m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c ec o m p l e x4 m c mc o m p l e xg e n e ：m i n i - c h r o m o s o m em a i n t e n a n c ec o m p l e xg e n e s m c m 2 7 p ：m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c ec o m p l e x2 7 p m i n ：m i n u t e s n a n o gg e n e ：n a n o gh o m e o b o x n c b i ：n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n n o b 1g e n e ：n e wz e a l a n do b e s elg e n e o c t 4 ：o c t a m e r - b i n d i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r3 o r c ：o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x p t ? p a nt r o g l o d y t e s pt r o g l o d y t e s ：p a nt r o g l o d y t e s p 5 3 ：p r o t e i n5 3o rt u m o rp r o t e i n5 3 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r e r c ：p r e r e p l i c a t i v ec o m p l e x ) 兄n o r v e g i c u s ：r a t t u sn o r v e g i c u s ：n o r w a yr a t r n ：r a h u sn o r v e g i c u s ：n o r w a yr a t r a c e ：r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s r a c e 3 ：r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n a 3 e n d s r a c e 5 r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n a 5 e n d s r n a s e ：r i b o n u c l e a s e r p a ：r e p l i c a t i o nf a c t o r r - p c r ：r e a lt i m ep o l y m e r a s er e a c t i o n sp h a s e ：s y n t h e s i sp h a s e ：a ni n t e r p h a s ep e r i o dw h e r ed n ar e p l i c a t i o no c c u r s s e c ：s e c o n d s i x 3 ：s i n eo c u l i s r e l a t e dh o m e o b o x3h o m o l o g s o x l ：s r y ( s e xd e t e r m i n i n gr e g i o ny ) - b o xc o n t a i n i n gg e n e2 s sd n a ：s i n g l e s t r a n d e dd n a sw i s n fc o m p l e x ：c h r o m a t i nr e m o d e l i n gc o m p l e x t ：t y r o s i n e t g c s ：t r o p h o b l a s tg i a n tc e l l s x t ：x e n o p u st r o p 耙a l i s x t r o p i c a l i s ：x e n o p u st r o p i c a l i s l i s to ff i g u r e s f i g 1d i a g r a m m a t i cr e p r e s e n t a t i o na m p h i o x u s 2 f i g 2g m n ng e n es t r u c t u r e 5 f i g 。3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h ed e v e l o p m e n to fg e m i n i n + + g e m i n i n 七| 一。a n d g e m i n i n 一一e m b r y o s 7 f i g 4m o d e lf o rc e l ll i n e a g ed e t e r m i n a t i o nd u r i n ge a r l ym a m m a l i a ne m b r y o g e n e s i s10 f i g 5m o d e lf o rl i c e n s i n gc o n t r o ld u r i n gm i t o s i s 1l f i g 6 ：f a b r c ap a t h w a ya c t i v a t e db yr e r e p l i c a t i o n 。1 2 f i g 7m o d e lf o rg m n na c t i v i t i e si ne m b r y o n i cd e v e l o p m e n t 1 4 f i g 8m o d e lf o rc e l ll i n e a g ed e t e r m i n a t i o nd u r i n ge a r l ym a m m a l i a ne m b r y o g e n e s i s1 6 f i g 。9a g a r o s eg e le i e c t r o p h o r e s i so fp c rg m n nd n af r a g m e n t 3 0 f i g 1 0 a g a r o s eg e ie i e c t r o p h o r e s i so f3 r a c eg m n ng e n e 3 l f i g 1 1 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so f5 r a c eg m n ng e 3 2 f i g 。1 2a l i g n e dg m n np r o t e i n ss e q u e n c e s 4 2 f i g 1 3t h ep h y l o g e n e t i ct r e eo fg m n ng e n e 4 4 f i g 1 4 ：g m n ng e n es e q u e n c e 4 7 f i g 15 ：g m n ng e n eo r g a n i z a t i o n 5 l f i g 16 ：r e a lt i m er t p c re x p r e s s i o no fg m n nmr n ai nd i f f e r e n t t i s s u e s ：；：! c e r t i f i c a t i o n i ，p r o f e s s o rw a n gy i q u a n ，h e r e b yc e r t i f yt h a tih a v er e a dt h i sm a n u s c r i p ta n d r e c o m m e n df o ra c c e p t a n c eb yt h ex i a m e nu n i v e r s i t yad i s s e r t a t i o ne n t i t l e d “c l o n i n g ， s e q u e n c i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o na n de x p r e s s i o no fg m n ng e n ef r o ma m p h i o x u s i n f u l f i l l m e n to fd e g r e eo fm a s t e ro fs c i e n c eo fx i a m e nu n i v e r s i t y s i g n e d d a t e 易么 仃7 e l s c h o o lo fl i f es c i e n c e s x i a m e nu n i v e r s i t y x i a m e n ，f u j i a n p r c h i n a s u p e r v i s o r d e c l a ra t i o n ih e r ed e c l a r et h a ta p a r tf r o mt h es o u r c e sc i t e d ，t h i sd i s s e r t a t i o ni sm yo w nw o r ku n d e r t h es u p e r v i s i o no fm ys u p e r v i s o rp r o f e s s o rw a n gy i q u a n t h em a t e r i a l so ft h e d i s s e r t a t i o nh a v en o tb e e np r e s e n t e da n di tw i l ln o tb ep r e s e n t e dt oa n yo t h e ru n i v e r s i t y o t h e rt h a nt h i su n i v e r s i t yf o rs i m i l a ro ra n yo t h e rd e g r e e s i g n a t u r e ，1 叫纵舯氏 c a n d i d a t e ：e m m a n u e lm u k 、7 i 么辆f ：a 竺! 竺垫璺：璺! 竖竺垫墨：竺皇竺竺堕生苎垫璺! 坐曼兰里堡竺垫璺旦! 鱼坚垒型生竺墅里垒璺旦坐型! c h a p t e rlg e n e r a li n t r o d u c t i o n 1 1a r n p h i o x u s a m p h i o x u s ，a r ea l s oc a u e dl a n c e l e t s t h en a m ea m p h i o x u sc a m ef r o mt h e i rm o r p h o l o g y a n dm e a n sp o i n t e do rs h a r p e na tb o t he n d s a c t u a l l yb a s e do ne t y m o l o g y ，t h ew o r d a m p h i o x u si sm a d eo ft w ow o r d s ：t h el a t i na m p h y ：b o t ha n dt h eg r e e kw o r do x y s ：s h a r p t h e s y s t e m a t i ct a x o n o m yp u ta m p h i o x u si nt h ek i n g d o ma n i m a l i a ，p h y l u mc h o r d a t a ， s u b p h y l u mc e p h l o c h o r d a t a ，i t i sa l s ok n o w na sa c r a n i a t a t h e s u b p h y l u m c e p h a l o c h o r d a t ac o m p r i s e so n ec l a s sl e p t o c a r d i i t h ec l a s sl e p t o c a r d i ii si ni t st o u r s u b d i v i d e di n t ot w of a m i l i e s ：a s y m m e t r o n i d a ea n db r a n c h i o s t o m i d a e t h em e m b e r so f t h i ss u b p h y l u ma r ec a l l e da m p h i o x io rl a n c e l e t s t h el a n c e l e t sa leg r o u p e di n t o3 0 s p e c i e s a l lo ft h e s es p e c i e sa r ek n o w na ss m a l l ，5t o10c e n t i m e t e r sl o n g ，b u tf a s c i n a t i n g a n i m a l s a c t u a l l yl a n c e l e t sl o o kl i k es i m p l i f i e df i s h e s ，a n da r eq u i t ec a p a b l eo fs w i m m i n g s h o r td i s t a n c e s n o r m a l l yh o w e v e rt h e yp r e f e rt os p e n dt h e i rt i m ei nt h es a n do fm a r i n e s h o r e s a l la m p h i o x u ss p e c i e sr i v ei nm a l i n ew a t e r t h e ya l ef o u n da l la r o u n dt h ew o r l d i nb o t ht e m p e r a t ea n dt r o p i c a lw a t e r s a l lt h em e m b e r so ft h ec e p h a l o c h o r d a t aa r es i m i l a rt ov e r t e b r a t e sb u tu n l i k et h e mt h e y h a v ean o t o c h o r di n s t e a do fat r u eb a c k b o n e u n l i k eo t h e rp r i m i t i v ec h o r d a t e s ，t h e yh a v e ab o d yd i v i d e di n t os e r i a l l yr e p e a t e dm u s c u l a rs e g m e n t s t h e ya r et h ec l o s e s tr i v i n g i n v e r t e b r a t er e l a t i v eo ft h ev e r t e b r a t e s a n dc o n s i d e r e da st h eb e s ta v a i l a b l es t a n d i nf o r t h ep r o x i m a t ea n c e s t o ro ft h ev e r t e b r a t e sa n dt h e yr e t a i nb a s i cc h o r d a t em o r p h o l o g i c a l s t r u c t u r e sa n dd e v e m p m e n t mp a t t e r n s ，a n dg e n o m e su n c o m p l i c a t e db ye x t e n s i v eg e n e d u p l i c a t i o n ss oa m p h i o x u sm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei ns t u d y i n gt h eo r i g i n a n d e v o l u t i o no fv e r t e b r a t e s 【1 2 ，3 4 ，5 1 f i g 1d i a g r a m m a t i cr e p r e s e n t a t i o na m p h i o x u s 图1 文昌鱼图示 t h ea m p h i o x u sb o d yc o n t a i n st h r e eo p e n i n g s ；am o u t h tg u a r d e d b yt e n t a d e sc a l l e d b u c c a lc i r r ia n dt h r o u g hw h i c hw a t e re n t e r s ，a na t r i o p o r e t o w a r d st h ep m t e r i o r e n d ：t h et a i lo ft h ea n i m a lt h r o t t g hw h i c hw a t e re a l t sa n db e h i n dt h i sa r ta n u s t h r o u g hw h i c hw a mp r n d u e be x l t s al a r g ep h a r y n xl i e sw i t h i nt h ea t r i a lt a r i f f w a t e r , d r a w ni nt h r o u g ht h em o u t hb yt h ea c t i o no fo u m e r o l l 5b e a t i n gc h i a ，p a s s e s t h r o u g hm a n ys m a l ls l i t si nt h ep h a r y n x b e f o r ee x i t i n gv i at h ea t r i o p o r e t h en e r v e c o r d ( i nr e d ) i sp r o t e c t e d b y t h e n o t o c h o r d ( i n b h u ) a m p h i o x u sa n d e v o l u t i o no f v e r t e b r a t a a m p h i o x u si sb e s e v e dt op l a ya l li m p o r t a n tr o l ei ns m d m n gt h eo r i g i na n de v o l u t i o no f v e r e b r a t o sb e c a u s et h e yr e t a i nt h eb a s i cc h o r d a t e m o r p h o l o g i c a l s t r u c t u r e sa n d d e v e l o p m e n t a lp a t t e r n sm i dg e n o m e su n c o m p l i c a t e db ye x t e n s i v eg e n ed u 叫c a d o n s a m o n g a l lt h em e m b e r so ft h es u b p h y l u m ，a m p h i o x u s e sa r em em o s tc l o s e l yr e l a t o dt o v e r t e b r a t ec c p h m o c h o r d a t oi nt e r m so ft h e i rg e n o m eo r g a n i z a t i o n ，t h e yr e s e m b l e v e r t e b r a t e ss ot h a to l l ew o u me x p e c tf o rt h ev e r t e b r a ma n c e s t o rp r i o rt ot h eg e n o m e - w i d e d u p l i c a t i o n s w h i c ha r eh y p o t h e s i z e d t oh a v e o c c u r r e de a r l y d u r i n gv e r t e b r a t ee v o l u t i o n l 2 , s 7 1 i nf a c t a m p h i o x u s e sr e f l e c tt h ep r i m i t i v ep r e v e r t e b r a t ec o n d a i o n ，a n dy e tt h e ya l s o e x h i b ru n i q u e l ys p e c i a l i z e df e a t u r e st h a ta r o s ei nt h eh a l fab i l l i o ny e a r sa f t e ri t s d i v e r g e n c e f r o m t h er e s t o f t h ec h o r d a t o5 n e a g eh o w e v e r , t h e y , a l t h o u g hv e r yv e r t e b r a t e - l i k e 1 a c k ss e v e r a lk e yv e r t e b r a t ei n n o v a t i o n sl i k en e u r a lc r e s t b o n e a n da ne n d o s k e i c t o n i s ，9 ，i o i l 】 1 2d n a r e p l i c a t i o n d n a r e p l i c a t i o ni si n i t i a t e da t d i s c r e t es i t e so nc h r o m o s o m e st h r o u g ht h ec o o r d i n a t e a c t i o no fan u m b e ro fr e p l i c a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r s b a s e do na n a l o g yw i t hy e a s t , w h e r e t h i sp r o c e s si sb e s tu n d e r s t o o d ，ac o m p l e xo fp r o t e i n sc a l l e dt h eo r i g i nr e c o g n i t i o n c o m p l e x ( o r c ) a s s o c i a t e sw i t hs p e c i f i cd n a s e q u e n c e sn e a ro r i g i n so fr e p l i c a t i o nt o r e c r u i to t h e rr e p l i c a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r sd u r i n gt h eg 1p h a s eo ft h ec e l lc y c l e t h eo t h e r r e p l i c a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r ss u c ha sc d c 6 p ，c d t lp ，a n dt h em c m 2 - 7 p c o m p l e x ，a s s o c i a t e w i t ht h eo r i g i ns e q u e n c ei na no r c d e p e n d e n tr e a c t i o nt of o r map r e - r e p l i c a t i v ec o m p l e x ( p r e r c ) a t 恤g1 st r a n s i t i o n ，t h ea c t i v a t i o no fc y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e sl e a d st ot h er e c r u i t m e n t o fe l o n g a t i o nf a c t o r s ，c d c 4 5 ，d n ap o l y m e r a s e s ，a n dr p a t ot h ep r e - r c sa to r i g i n s t h e a c t i o no ft h e s er e p l i c a t i o ne l o n g a t i o np r o t e i n sl e a d st ot h ei n i t i a t i o no fd n as y n t h e s i s ， t h eh a