（细胞生物学专业论文）增强型绿色荧光蛋白（egfp）基因真核表达载体的构建与表达.pdf

四川犬攀顿士学位论文檬浩杰 摘要 目的：为研究蠓强型绿色荧光蛋白( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ，e g f p ) 罄因在活纲溉中 搴为报告基因帮筛选标记酶可行稳， 特构建其真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) - e g f p ，并将它转染至h e l a 缨胞和大鼠骨髓闻充质于细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e ll ，m s c ) 中， 躐察箕在这两释细胞中酌表达情况。 方法：以b a m hi 和n o t1 双酶切分别从真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) _ 荦班e g f p 载体p e g f p 一1 中切敬线性化p c d n a 3 。l ( + ) 载体和晷鲍e g f p 基闲片段，然磁将两者连接起来，献两获得重组质糍p c d n a 3 1 ( + ) 一e g f p 。并分别以b a m hi 单酶切和b a m hi 、n o ti 双酶切进行鉴寇。 以腮质体转染试剂l i p o f e c ta m i n e 2 0 0 0 分别将构建姆约重组质靛转 染歪培养豹h e l a 细胞和大鬣雷髓闻充艨干细胞中，分别经g 4 1 8 筛 选两周和四周厝获得e g f p 阳性克隆，进行细胞爬片质放置在荧光晟 微镜下鼹察。 缝纂：成功构建了含e g f p 基困片段的凑核表运载体p c d n a 3 1 ( + ) 一e g f p ，并顺利转染至h e l a 细胞和大鼠骨髓间充质干细胞中，e g f p 疆性克隆在荧光照微镜下均嫩绿色。 绪论： e g f p 基因能以真核寝达载体p c d n a 3 1 ( + ) 一e g f p 的形式在 h e l a 细胞和大鼠骨髓间充质干细胞中成功表达，并发出绿色荧光， 霹鼠可以直接戮用荧光显徽镜辩活缨魁遴行捡溅，爨鼹e g f p 基蔽是 一种庭好豹活细胞报告基戮鞫筛选标避。 关键词；增强烈绿色荧光徵白( e g f p ) 蕊因：真核表达载体；转染； h e l a 缨戆；大簸鸯髓淘充屡于缎照 四川大学醐士学位论文撩浩杰 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t os t u d yt h ep o s s i b i l i t yo fe n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ( e g f p ) g e n ea si n f o r m a t i o n a lg e n ea n ds e l e c tm a r ki nl i v i n g c e l l 。c o n s t r u c tt h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp c d n a 3 ，1 ( + ) - e g f p f o re n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ng e n e ，a n dt r a n s f e rt h ee u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rt oh e l ae e l la n dr a tt n a l t o wm e s e n c h y m a ls t e m c e l l ，t h e no b s e r v et h ee x p r e s s i o no fe n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g e n ei nt h e s et w ot y p e so fc e l l s m e t h o d s ：d i g e s tt h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp c d n a 3 ，1 ( + ) - e g f pa n de n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i nv e c t o rp e g f p 一1w i t h t w ot y p e so fr e s t r i c t i v e l yn u c l e i ca c i di n s c r i b e de n z y m e ：b a m hta n d n o t ，o b t a i nl i n e a r i z a t i o np c d n a 3 1 ( + ) v e c t o ra n do b j e c t i v ee g f p g e n es e g m e n t ，a n dj o i nt h e mt o g e t h e lc o n s e q u e n t l yg a i nr e c o m b i n e d p l a s m ap c d n a 3 ，1 ( + ) 一e g f p , t h e ni d e n t i f yi tw i t hb a m h l s i n g l e e n z y m ed i g e s t i o na n db a m h ，i 、n o ti d o u b l ee n z y m ed i g e s t i o n ， t r a n s f e rr e c o m b i n e dp l a s m ap c d n a 3 1 ( + ) - e g f pt oc u l t i v a t e dh e l l c e l la n dr a tm a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l lb yl i p i dt r a n s f e r r i n gr e a g e n t l i p o f e c ta m i n e 2 0 0 0 ，a f t e rs e l e c t i n gt h e mf o rt w ow e e k s ( f o rh e l lc e l l ) a n df o u rw e e k s ( f o rr a tm a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l ) b yg 4 18 r e a g e n t ，o b t a i np o s i t i v ec l o n eo fe n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ， o b s e r v et h e mw i t hf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ea f t e rc e l lc r e e pp a r c e l r e s u l t s ：co n s t r u c tt h eeu k a r y o t i ce x p r e s s i o nve c t o rpc d n a 3 1 ( 十) 一e g f pf o re n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ng e n es u c c e s s f u l l y , a n d 2 璺纠盔兰鲤杰兰垡堡塞熊煎查 t r a n s f e ri tt oh e l ac e l la n dr a lm a r r o w m e s e n e h y m a ls t e mc e l l s u c c e s s f u l l y , o b s e r v eg r e e nf l u o r e s c e n c ef r o mp o s i t i v ec l o n ew i t h f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e c o n c l u s i o n ：i ti sd e m o n s t r a t e dt h a te g f pg e n ei s s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e di nh e l ac e l l sa n dr a tm a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l la s e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp c d n a 3 1 ( 十) 一e g f p , a n dp o s i t i v ec l o n e c a ne m i tg r e e nf l u o r e s c e n c e ，f u r t h e r m o r ei tc a nb ed e t e c t e dd i r e c t l yi n l i v i n g c e l l sw i t hf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e t h e r e f o re g f pg e n ei s i n f o r m a t i o n a lg e n ea n ds e l e c tm a r ki nl i v i n gc e l l k e y w o r d s ：e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n e g f p ) g e n e ； e u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o r ；t r a n s f e c t i o n ；h e l ac e l l ；r a tm a r r o w m e s e n c h y m a ls t e me e l l 3 四川i 大学硪士学位论文徐浩杰 k k j 一 勇毯蚕 最早从华盛顿星期五港水域发现的维多利亚水母( a e q u o r e a v i c t o r i a ) 是一摹中生耱发光懿承母，这释求母毙产生一秘其有特筑梭 的、看上去像圈光围着伞边缘的绿色荧光，这是幽于两种蛋白质 相嚣作用的原因，这两种蛋白质就是钙结合水母发光凝自( a e q u o r i n ) 帮绿色荧竞蛋自g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) o j 。 g f p 是s h i m o m u r a 等人于1 9 6 2 年发现的，它是有2 3 8 个氨基酸残澄 的荤链多肽，分子质量为2 68 8 8 。g f p 基因娥早于1 9 9 2 簪克隆成功，其 c d n a 。豹开放读弱橇架长麴7 4 0 b p ，莲l 跨越2 6 k b 缝多剽驻水母骜因缓麴 三个外显子编码。”。该蛋白在包括热、极端p h 和化学爽性剂等苛刻的 条传下都是稳定的“1 ，而且爆甲醛固定蘑会持续发如荧光 ：。但怒如 栗在逛覆环境下楚先会穰抉熄灭“3 。 g f p 发出的光是绿色的，发射光谱的峰值在5 0 8 r i m 发右，波长靠近 活维多剥亚农母的发射光谱，但是与纯钙缀台水母发光蛋白的纯学发 光鼷离较远，矮露发出的巍怒蓝色静，发射竞谱的蜂馕靠近4 7 0 n t o ”3 。 随着g f p 的纯化以及晶体的获得，发现当钙结合水母发光蛋白与 g f p 获同吸附在粥离子支撑物上时，钙活化的钙结合水母发光蛋自熊 够离效静穆其产生豹发光麓避转移给g f p 。当这释能擞经由f 6 s t e r t y p e 机制从活化的钙结合水母发光蛋白转移到g f p 时，g f p 便会产生 绿色光线”1 。 活纯韵钙结合水母发光骚自所产生麴藏光被开始予g f p 6 4 健瀚六 肽缴色基团所捕获，这个发色基团包含一个环状结构，并通过其环的 l 位秘2 位与肽的主链相连。 g f p 的结构鞠发射先谱酌这种稳定性是同它的发德基团的稳定襁 4 四川大学磁士学位论文橼浩杰 密不霹分懿。在g f p 熬氨基羧海残中，出s e r 一6 5 、t y r 一6 6 秘g l y 一8 7 遴过 共价键形成独特的、相当稳怒的环状三敝结构，构成g f p 发色基团的核 心。g f p 发色基团的结构在所有荧光蛋白中都相当保守，甚至包括那 些蘩鑫菲生物发巍生貔体黪焚毙蛋白也楚妇踅8 1 。 近年来，随着g f p 在各种异源细胞如：细菌、霉菌、线虫、酵 母、果蝇、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞中的成功表达。g f p 终麓一秘蘩型戆投告蛋皂蠢经弓l 起了玺甥学磷究者夔广泛关透。 由于g f p 络构和光谱功能的诸多联系，以及g f p 基因作为研究 从细菌到转基因小鼠基因表达和细胞内过程的标汜分子的独特优 点：霹鼓在异滚缀绞孛表达著产生荧炎，势显表达辩不霉获彝、疆 因予、酶底物等其它成分，不影响宿主绷胞，因而可以鉴定、跟踪、 分选表达g f p 的活细胞，g f p 基因近年 束成为细胞生物学和分子生 物学中广泛应瘸瓣诿缨庭掇褒蘩因彝蘩逡薮记”。1 。 增强型绿龟荧光蛋白( e g f p ) 基因怒在g f p 基因藏础上改造丽柬 的一种g f p 基因的突变体，包含6 4 位上幽苯丙氨酸( p h e ) 到亮氨酸 ( l e u ) 彝6 5 鬣上麴由丝氮酸( s e r ) 到懿蘸酸( t h r ) 魏嚣令突变， 另步b e g f p 序列中1 9 0 多个沉默碱基被改变成为高表达动物细胞蛋白偏 爱的碱基，因此舆有在动物细胞中表达较强荧光的特点。在发光特性 上，e g f p 霹鞋在波长为4 8 8 n m 敬蓝竞激发下产生波长为5 9 7 n m 熬绿夔发 射光“0 1 。 本研究旨在探讨以e g f p 为活细胞报告基因和筛选标记构建冀 孩袭这载薅p c d n a 3 ，l ( + ) - e g f p 翡爵孬熬及e g f p 基嚣在h e l a 缨溅秘 大鼠骨髓间充腠干细胞中的表达情况，从而为间充质干细胞活体移 植臌的细胞增赋、分化、迁移等研究奠定一定的基础。 鞲矧丈学龋士学靛论文徐洁熹 材料与方法 一实验材料 1 菌株和艨粒 密主萤大弱释蓬b l 2 i 蘩秣 真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) 质粒 含增强型绿色荧光蛋白( e g f p ) 基闲但不含启动子的p e g f p - l 质粒 疆主均滋本实验室绦存 2 缁胞系和动物 h e l a 细胞( 入子宫颈癌传代细胞)由本实验塞保存 大鬣嚣髓潺兖覆予缡髓取鑫健藏残年s 挎大鼠羧骨鞫腔簧 健康成颦s d 大鼠购彝四j | | 大学华西校隧实验动物中心 3 生化酶和相关试剂 陵螽l 洼辕酸肉甥酶b a m h 、n o t 疆及薯。d n a 连接懿、无d n a 酶豹 r n a s e a 、d n a 分子量m a r k e r 均购自t a k a r a 公司 d n a 凝胶回收试剂盒购自v i t a g e n e 公司 瑟质体转染试翔l i p o f e c ta m i n e 2 0 0 0 购舀i n v i t r o g e n 公司 d m e m 细腿培养基和h e p e s ( u l t r ap u r e ) 赡自g i b c o 公司 小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司 g 4 1 8s u t f a t e 、多聚赖氨酸和电泳缀琼脂糖购自m e r c k 公司 d m s o ( 二甲亚鞭，分析纯) 釉胰酶购鱼s i g m a 公司 4 主要仪器 编施培养箱( m c o1 s a c ) 为s a n y o 公司产品 荧光显微镜受重庆光学仪器厂产是 四川太举硬士学位论文撩洁杰 5 耄零遮剂麴聚耋方法 验氢笾殛虐醛配置方法：体积比例为2 5 ：2 4 ：1 z e 缓、冲邃浓度为：l o m mt r i s c 1p h 8 0 ，l o m me d t ap h 8 0 麓蓥鎏羔i 薹圣芏蠡l 鲞羔鋈邃 浓度为：5 0 m m 葡萄糖，2 5 m mt r i s c 1p h 8 ，0 ，1 0 m me d t ap h 8 0 n a o h s d s 毖波 浓度为：0 。2 mn a o h ，l 甏( w l v ，囊羹俸积分数) s d s ； 配置方法：用i o mn a o h 和1 0 ( w l v ) s d s 新鲜配赞 逖亟硷趁茧敝鲤渣邃 浓度舞：5 mk a c ，1 1 s 糍踩乙夔，p h 4 。8 ； 配置方法：2 9 5 m l 冰乙黻，用k o h 颗粒调校至p h 4 8 ( 几粒k o h 颗 粒即可) ，加水至l o o m l ，宣温保存，不可高温商愿灭菌 薹圣至塞遂鬟建遮 1 0 贮存液缀分为：1 0 8 9t r i s 碱，5 5 9 硼酸，4 0 m l0 5 me d t a p h 8 0 ，加水至1 l 1 x 工传滚浓度蠢：8 9 m mt r i s 碱，8 9 m m 臻酸，2 m me d t a ；镬溺藤 将贮存液稀释1 0 倍即可 遗丝丕筵f g l g 渲速 1 0 贮存滚浓疫为l o m g m l ，在2 0 m l 承孛溶瓣0 2 9e t b r ，溪匀 后4 c 避光保存，由于e t b r 是诱变剂，要小心操作 l 工作液浓度为lpg 乙，使用前将贮存液稀释1 0 倍即可 筮塞鎏差鬟题这熬配鬟方法： 一般市售脊释素8 0 万u 瓶，溶于4 m l ，每1 0 0 0 m l 培养液加0 5 m l ， 终浓度为1 0 0u m l ；一般市售链霉索i 0 0 万u 瓶，溶于5 m l ，每 1 0 0 0 m l 培养滚魏0 。5 m l ，终浓度菇1 0 0u m l 7 四川犬学硕士学位论文椽沽杰 二实验方法“。”4 ” 1 技术路线 1 1 质粒构建 西翊丈学疆士学莅论文徐蒎杰 1 ，2 细胞培养 阿磊赢丽葡习 1 3 转染、筛选、观察及冻存 纯他褥到的重缀质粒p c d n a 3 。l ( + ) 一e g f p 培养好的h e l a 细胞和大鼠骨髓间充质干细胞 9 西；一。一；一一。一一 四川大学硕士学位论文徐洁杰 2 方法步骤 2 1 重组质粒p c d n a 3 1 ( + ) 一e g f p 的构建 21 ，1 p c d n a 3 ，1 ( + ) 和p e g f p - 1 质粒d n a 的制备 1 ) 从有氨苄青霉素( 1 0 0 g m l ) 抗性的l b 固体平板上挑取一个有质 粒p c d n a 3 1 ( + ) 的单菌落，接种于3 m l 无菌且有氨苄青霉素 ( 1 0 0 p g m l ) 抗性的l b 液体培养基中，3 7 摇床振荡培养过夜至饱 和状态； 2 ) 从有卡那霉素( 5 0 p g m l ) 抗性的l b 固体平板上挑取一个有质粒 p e g f p 一1 的单菌落，接种于3 m l 无菌且有卡那霉素( 5 0 “g m l ) 抗性 的l b 液体培养基中，3 7 摇床振荡培养过夜至饱和状态； 3 ) 分别取2 m l 菌液于e p 管中，在室温下，以1 60 0 0 r p m 速度离心 2 0 s ，收集细菌菌体，其余菌液用2 0 甘油贮存于一2 0 w ； 4 ) 加入1 0 0 “l 葡萄糖t r is e d t a ( g t e ) 溶液重悬菌体沉淀，并 于室温静置5 m i n ； 5 ) 加入2 0 0 “ln a o h s d s 溶液，轻柔颠倒e p 管5 次，于冰上放鹭 5 m i n ； 6 ) 加入1 5 0 “l 冰预冷的乙酸钟溶液，振荡5 s ，置于冰上5 m i n ； 7 ) 在室温下，以1 60 0 0 r p m 速度离心5 m i n ，将上清移至另一干净 的e p 管中： 8 ) 加入等体积的酚氯仿异戊醇( 体积比例为2 5 ：2 4 ：1 ) ； 9 ) 在旋涡混合器上剧烈振荡l o s ，在室温下，以1 60 0 0 r p m 速度离 心1 5 s ： 1 0 ) 用2 0 0ul 的微量移液器将含有d n a 的上层( 水) 相小心地移入一 只新e p 管中，如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则重新抽 提有机相，合并水相； 四川大学硼士学位论文绦洁杰 1 1 ) 蹇鬟入等传拣戆舅羲醇沉淀，在室潺下，隘1 60 0 0 r p m 这瘦黉心 l o m i l l ： 1 2 ) 辫上清，沉淀用7 0 乙醇沈涤2 次，苒用3 0 虬含无d n a 酶的r n a s e a ( 2 0 p g m l ) 懿t e 缓滓滚溶瑟鞋去狳污染弱r n a ， 导到的凌糖 p c d n a 3 1 ( + ) 和质粒p e g f p l 用于纯化； 2 ，2p c d n a 3 ( + ) 羁p e f i f p - 1 曩较d n a 酌缝 乏 1 ) 往盛有待纯化d n a 溶液的e p 管加入等体积的酚氯仿异戊醇 ( 体积比例为2 5 ：2 4 ：1 ) ； 2 ) 稳藤漏渥合爨上尉囊振荡】o s ，在室潞下，爨1 6o o o r p m 速发离 心1 5 s ： 3 ) 用2 0 0ul 的微量移液器将食有d n a 的上层( 水) 相小心地移入一只 耨嚣p 管孛，懿祭在窳稷窝蠢疑耀交赛鲶嶷鑫色汉淀物，粥重豢獭疆 有机相，合并水相； 4 ) 往d n a 溶液中加入l l o 体积的3 mp h 5 。2 的乙酸钠，在旋涡混合 嚣上糖趣嚣荡或蹋手捂轻撵褒，0 管壁尼次缓之溪匀； 5 ) 加入2 倍2 5 倍体积( 加入盐之后计算的体积) 冰冷的无水乙醇， 在旒涡混合器上振荡混匀并鼹于碎干冰上5 m i n 或更长时问； 6 ) 簌室渥下，戳1 60 0 0 r p m 速度离心5 m i n ，弃去一 二潼； 7 ) 加l m l7 0 乙醇，颠倒离心管数次，并按步骤6j 藏行离心； 8 ) 弃上清，在室温下干燥沉淀； 将予溪貔沉淀甥溶予遴当薅疆豹双蒸拳，筑纯褥到瓣瑷粒 p c d n a 3 1 ( 十) 和质粒p e g f p 一1 用于双酶切消化； 四川大学硕士学位论文橡浩杰 2 。 3p c d n a 3 + 1 ( + ) 秘p e g f p - 1 矮粒d n a 戆双酶联漩 乏 1 ) 将上述纯化得到的质粒，分别采用b a m hi + n o ti 双酶切系统进 行双酶切消化，总反应体积均为2 0 “i 。，加有灭菌双蒸水6ul ，1 0 x 珏b u f f e r2 壮l ，b a m h 纛n o tl 番为l # l ，0 。i b s a2 # l ， 0 1 t r i t o n x 一1 0 02ul ，质粒d n a6ul ； 2 ) 3 0 消化2 h ，3 7 消化2 h ，6 5 、1 5 m i n 灭活限制性核酸内切 酶，一2 0 绦枣p c d n a 3 。l ( + ) 稻p e g f p i 缓粒d n a 瓣双酶切瀵化产 物用于电泳鉴怒和回收纯化； 2 。 4 双酶甥瀵健产戆懿亳濠鉴定 1 ) 制备凝胶，将2 0 m lt b e 魄泳缓冲液和0 2 9 电泳级琼脂糖在微波 炉中熔化、混匀、冷却至5 5 ，倒入已缀封好的凝胶灌制平台上， 捶上襻品枣蹇，霹鞋在其中糖入1 垫l 王 萋滚浓度数浚纯乙锭( e t b r ) 溶液； 2 ) 特凝胶固定餍，从制胶平台上除去封淞，拔取梳子，放入到加商 足够t b e 毫泳缓洚滚夔龟熬瀵中，t b e 魄泳缓磅渡毫滋凝菠表瑟l m m ； 3 ) 用适量的l o 加样缓冲液制备d n a 样品，然后阁移液器将样品 加入到样品孔中，在一个样品孔一定要包括合适的d n a 分子量 m a r k e r ； 4 ) 接通电极使d n a 向阳极移动，在8 0 v 的电压降下进行电泳： 5 ) 幽加样缓冲液中的溴酚蕊迁移到足够分离d n a 片段的距离时关闭 电源； 6 ) 凝胶可以直接在紫外灯下、观察并照相，初步估计酶切产物的浓度； 四川大举硕士学位论文棣洁杰 2 。 。5 凉骥辕凝黢枣双酶切滚耗产狻戆圈浚缝绽 1 ) 在紫外灯下切下含有线性化载体p c d n a 3 1 ( + ) 与目的基因e g f p 片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表蔺的液体； 2 ) 拣重凝黢耋爨，按照l m g = l # l 按或凝荻薅较； 3 ) 将凝胶放在1 5 m le p 管中，按每1 0 0ui 。凝胶：4 0 0 9 lb u f f e rd e a 的比例加入b u f f e rd e a ； 4 ) 滢匀嚣予? 5 热熬，簿瓣2 m i n 3 m i n 渥台一次，整至凝黢完全 融化，大约需簧6 m i n 8 m i n ； 5 ) 按照b u f f e rd e a 体积的5 0 加入b u f f e rd e b ，混合均匀； 6 ) 褥d n a p r e pt u b e 羧鬟在2 m lm i c r o f u g et u b e 审，涛上嚣割褥 的混合液移入d n a p r e pt u b e 中，以55 0 0 r p m 速魔离心l m i n ，弃 废液； 7 ) 游d n a p r e pt u b e 敖簧圈嚣2 m lm i c r o f u g et u b e 巾，魏入5 0 0 9 t 。 b u f f e rw 1 ，以55 0 0 r p m 速度离心l m in ，弃废液； 8 ) 将d n a p r e pt u b e 放置回原2 m lm i c r o f u g et u b e 中，再加入已 掇燹拳乙醇戆b u f f e rw 27 0 0 9 l ，瑷50 0 0 r p m 速度褒心l m i n ，隧司 样方法再用b u f f e rw 2 重炱洗涤一次； 9 ) 将d n a p r e pt u b e 放置入一干净1 5 m le p 管中，以1 60 0 0 r p m 速度离心l m i n ； 1 0 ) 蒋将d n a p r e pt u b e 放鬻入另一干净的1 5 m l e p 筲中，在s i l i c a 膜中央加入2 5 i _ t l 灭菌双蒸水与室温静簧l m i n ； l1 ) 夔1 60 0 0 r p m 速度离心l m i n ，洗瓣浚集藜鞠产物荠贮存予一2 0 用于连接反应； 四川太举硕士学位论文椽洁杰 2 。 。6 霉牧终纯麴双酶切浚 乏产壤豹遘攘 1 ) 将经过双酶切消化、电泳鉴定、阐收和纯化厢的线性化载体 p c d n a 3 1 ( + ) 与目的基因e g f p 片段按l ：3 比例的术端摩尔数进行 逡犊反应，憨蔽疲体穰2 0 # l ，热有必壤双蒸本8 黏l ，1 0 爱应缓 冲液2 儿，d n a8pl ( 其中线性化载体p c d n a 3 1 ( + ) 为2ul ，嗣的 基因e g f p 片段为6 ul ) ，t 。d n a 连接酶2 虬； 2 ) 1 6 反应1 2 h 过夜，6 s 1 5 m i n 叛灭活t 。d n a 滚攘酶，一2 0 僳 存用于转化。 2 2 重疆蒺羧p c d n a 3 。 ( + ) - e g f p 豹转能、裁善及缝稼 2 2 1 感受态榴主菌b l 2 1 的制备 1 ) 挑取冷冻保存的宿主菌b l 2 1 ，接种猩不含任何抗生素的l b 固体 培葵乎薮上，3 7 潺麓墙势过夜； 2 ) 从固体培养平板上挑取单个宿主菌b l 2 1 菌落。放置于2 m l 不合 抗生素的l b 液体培养基，3 74 c 摇床培养过夜； 3 ) 取l o o g l 逡凌培蓁蔻渡转入予l o m l 凝鲜强滚孛，3 7 狭速缀摇 3 h 至对数生长期； 4 ) 在室温下，以20 0 0 r p m 速度离心5 m i n 收集细菌麓体，尽量弃去 上漆： 5 ) 将细菌沉淀分装于8 支l _ 5 m l e p 管中，并用l m l0 1 m 冰冷的c a c l 。 溶液重悬，在激温下，以1 60 0 0 r p m 速度离心5 m i n ，弃上清； 6 ) 绥藜沉淀褥霜l m l0 1 m 猿冷c a c ：滚重悬，踩上敖嚣3 0 m i n ，予 窒温下，以1 60 0 0 r p m 速成离心5 m i n ，弃上清后； 7 ) 再加入l m l0 1 m 冰冷0 1 m lc a c l 。溅悬，按每管2 0 0 p l 分装予 1 5 m l 两管势撩存手- 2 0 备忍； 4 四川火学硕士学位论定徐洁杰 2 2 2 重组鹱粒p c d n a 3 1 ( + ) - e g f p 转他感受态雇擞藏b l 2 1 1 ) 取l o o g l 掰鲜制备的感受态菌滚予1 5 m l 离心警中，加连接反应 产物l o g l 混匀，冰上放鬣l o m i m 2 ) 迅速憋管敷入4 2 。c 水浍9 0 s 进霉亍热体克； 3 ) 再迅速冰浴2 m i n ，趣不禽抗生素的慵液体培养蒸8 0 0 9 。，3 74 c 低 速振摇1 h ； 4 ) 将菌渡稀释l o 倍后涂镌予含氨苄青霉素( 1 0 0 9 9 m l ) 虼l b 圈体 平板上，3 7 。c 温箱培养过夜培养； 2 ，2 。3 耋继黢粒p c d n a 3 。 ( + ) - e g f p 翡潮备 1 ) 在细菌转纯后3 7 c 过夜培养豹平檄上，挠取单个蔼落于3 m l 含氨 带青霉素( 1 0 0 9 9 m l ) 的l b 液体培养旗中，3 7 * 0 振荡培养过夜至饱 秘状态； 2 ) 取1 。5 m l 蘸液于e p 管中，班1 60 0 0 r p m 速度满心2 0 s 收集绷菌， 熟余菌液用2 0 甘油贮存于一2 0 * 0 ； 3 ) 奏上瀵，t 0 0 斗lg t e 波霪悬，势予嶷滠静鬟5 m i n ； 4 ) 加入2 0 0 9 ln a o h s d s 溶液，轻柔颠倒e p 管5 次，于冰上放置 5 m i n ； 5 ) 热入1 5 0 # l 冰颈冷鲍乙酸锤溶液，振荡5 s ，嚣予溶上5 m i m 6 ) 在室温下，以1 60 0 0 r p m 速度离，b5 m i n ，将上清移至另干净 的e p 管中； 7 ) 鸯霉入等体积的酸氯傍巽戊酵( 毒搴酸魄铡必2 5 ：2 4 ：1 ) ； 8 ) 在旋涡游念器上剧烈振荡1 0 s ，在窥温下，以1 60 0 0 r p m 速度离 心1 5 s ： 9 建2 0 0 垫l 瓣擞囊移渡爨涛古毒d n a 鳃上屡( 窳) 甥奎心逑移入一其 嚣粥大学磺士学位谂文撩港焘 薪e p 镑中，魏果程瘩籀帮有瓤辐交赛处有酝色沉淀耪，嗣重新接提 有机相，台势7 k 相； 1 0 ) 加入等体积的异丙醇沉淀，在室温下，以1 60 0 0 r p m 速魔离心 l o m i n ： 1 1 ) 弃上清沉淀用7 0 乙醇洗涤2 次，再用3 0 9 l 含无d n a 酶的r n a s e a ( 2 0 p g m l ) 的灭菌双蒸水溶解以去除污染的r n a ，保存于一2 0 。c 用 予酶甥签定和缝稔： 2 2 4 熏组质粒p c d n a 3 1 ( + ) - e g f p 的酶切、电泳鉴定 1 ) 将上述接提鑫豹葳粒，分剐采蠲b a m hi + n o tl 双酶窃系统透露 双酶切消化，总反应体积均为2 0 盹，加有灭菠双蒸水6 耻l ，1 0 h b u f f e r2ul ，b a m hi 和n o ti 备为lul 0 i b s a2ul ， 0 。1 t r i t o n x 1 0 02pl ，溪粒d n a6 pl ； 2 ) 3 0 消化2 h ，3 7 消化2 h ，6 5 、1 5 m i n 灭活限制性核羧内切 酶，- 2 0 c 保存用于电泳鉴定和回收纯化： 3 ) 与d n a 分子薰m a r k e r 对毙，在l 端浓度琼脂耱凝胶中进行窀泳以 梭测缝暴，凝胶可以直接在紫夕 灯下戏察菸照提，圣霹步 轰计瓣切产 物的浓度； 2 ，2 + s 重组璇较p o d n a 3 ，l ( + ) 一e f i f p 螅缝我 1 ) 往擞有待纯化d n a 溶液的e p 管加入等体积的酚氯仿异戊醇 ( 体积比例为2 5 ：2 4 ：1 ) ； 2 ) 在旋涡滋会器上威烈掇荡1 0 s ，耄塞遗下，娃1 60 0 0 r p m 速度离 心1 5 s ： 3 ) 用2 0 0hl 的微镦移液器将台有d n a 的上层( 水) 相小心地移入一只 6 四川大学顿士学位论文徐浩杰 薮秘营中，如鬃在本楣和露提樱交爨楚蠢鑫色沉淀携， 有机相，合并水相； 4 ) 经d n a 溶液中加入1 1 0 体积的3 mp h 5 2 的乙酸钠， 器上磺鸯鞋振荡或鼹手指轻弹离心管壁几次使之混匀； 则重瓤撼援 在旋涡混合 5 ) 加入2 倍2 5 倍体积( 热入盐之后计算的体积) 冰冷的无水乙醇， 在旋涡混合器上振荡混匀并溉于砖干冰上5 m i n 或更长时问； 6 ) 在室温下，以1 60 0 0 r p m 速度离心5 m i n ，嘉去上瀵； 7 ) 加l m l7 0 乙醇，颠倒离心管数次，并按步骤6 滋行离心； 8 ) 弈上清，在室温下干燥沉淀； 9 ) 将于爆的爨淀憋溶于遥囊俸积斡被蒸水，缝偬雩霉到重缝鹱粒 o c d n a 3 1 ( + ) 一e g f p 用于转染t l e t a 细胞和大鼠骨髓蒯巍质干细胞。 2 。3 缀照壤葵 2 ，3 1h e l a 缁胞韵复苏、堵养和传代 1 ) 从液氮罐中取出冻存t l e l a 细胞的冻存管，并直接投入3 7 。c 恒温 拳漆箱中，不融疆动使其尽妖融讫； 2 ) 从3 7 温水中取出冻存管，用酒糟消毒管口后，用吸管吸幽细 胞懋液约l m l ，注入离心管并滴加l o m l 以上培养液。混合后迅速以 】0 0 0 r p m 熬速爱离心l m i n ，狳去上滇滚，霉重复疆港棼滚浚涤一次 3 ) 用含有1 0 ( 体积分数) 小牛血清和双抗( 青霉黎和链霉素) 的 d m e m 培养液稀释两倍后接种到培养瓶，放在3 7 、5 c 0 。细胞培养 簇静嚣壤莠，次曩更换一次壤蓁滚，继续壤葬； 4 ) 当h e l a 细胞长满培养瓶底的7 0 8 0 满时，成及时传代，倒掉 用培养瓶中的培养液，用l m l p b s 缓冲液沈涤两次； 5 ) 翔入0 。2 5 ( w v ) 簇懿l m l 溃纯l m i n ，德蒸藏缀藏开始脱落辩 四川大学硕士学位论文棣沽杰 倒簿骧酶，鸯鞋入6 r n l 含毒1 0 d , 牛盘渍秘躜抗麴d m e m 培养液，躅吸 管妖打瓶底细胞健其脱落，墩取3 m l 至弼一培养瓶继续培养； 2 。3 。2 大鼹鸯髓阙宠震手缁臆的分离、臻葵翻传代 1 ) 选用健康成年s d 大鼠，麻醣后处死，墩股骨和胫骨，注意保留骨端 部分不受损伤： 2 ) 髑7 5 ( 体积分数) 溪精澄滤1 5 m i n 慧穆入超净工佟台中。放甏予 干净的培养皿内晾干，剪去骨头两端，露出骨髓腔； 3 ) 用含1 5 ( 体积分数) 小牛咖清和双抗( 青霉素和链褥素) 的d m e m 墙莽滚 申洗蚤熬腔，反复2 次，合毒营熬缨瞧豹培蓁波经打匀后援嵇 于6 孔培养板中的3 孔； 4 ) 于按种培养2 4 h 后换液，并将换取的培养液移入另外3 孔，于接种 甓4 8 h 蜃换滚，蚨i 嚣形成0 h 2 4 h 赡壁缁藏移2 4 h 4 8 h 菇壁缨熬嚣 3 孔； 5 ) 以后每天换液，连续3 d ，3 d 后改为每隔2 d 换液，每天观察细j 】6 l 形态爨蹩壁生长壤猿蒡终毽蒙： 6 ) 在细胞密度达到孔底7 0 9 0 满时，应该及时传代，先倒掉黝 中的培养液，用l m lp b s 缓冲液洗涤两次： 7 ) 热入0 。2 5 转染藤一天，将瘸戆蠲0 。2 5 ( w v ) 簇酶消纯、诗数著锚援 四川大学硕士学位论文榱洁杰 使焚在转染r 细胞融合度先9 0 ，细臌镳投在0 5 m l 不舍小牛斑漓 和淑抗的d m e m 臻养基中： 2 ) 对于每孔细胞，使用1 0 0 “l 不含小牛舡清和双抗的d m e m 培养撼 稀醛0 。8 婪g l 。0 # gd n a ，多i l 操作时可默批量制鍪； 3 ) 对于每孔细溅，使瑗1 0 0 “l 不含小牛j 缸清和双抗豹d m e m 培养鏊 稀释2ul 5pll i p o f e c ta m i n e 2 0 0 0 脂质体转染试剂，l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 稀释愿，在5 m i n 内同稀释靛d n a 混合，傺滠时闻过长会 洚低活性，可以批量制备； 4 ) 混合稀释的d n a ( 由第2 步) 和稀释的l i p o f e c ta m i n e 2 0 0 0 脂质 钵转染试裁( 由簿3 步) ，在嶷滠保温1 5 m i n 中。l 魄时溶液可能会混 浊，但不会影晌转染，因为凝合物可以程塞温保持6 h 稳定。 5 ) 使用0 8 m l $ l 的转染培养基在转染开始前洗涤细胞，转染培莽 基中舰入盘渍，傻英终浓度达至正誊生长壤养基的浓度； 6 ) 使用转染培棼基稀释复合物至总体积为l m l 管，将稀释的复合 物加入到细胞当中，在3 7 、5 的c o 。中保温5 h ； 7 ) 5 h 蜃，增加培养基懿钵积至l 正鬻锩黻，妇欲使缀腿的生长状态 达到最佳，最好使用新鲜韵完全培养基代替含有复合物的培养基， 最腐使h e l a 细胞生长在含1 0 ( 体积分数) 小牛血清和双抗( 青霉索、 镳霉素) 的d m e m 培养基，瑟大鼠骨燧闽炎餍于缨魄生妖在含1 5 ( 俸 积分数) 血清和双抗( 青霉索、链霉素) 的d m e m 培养基。 2 冁性克隆霉| l 遮、绥臆悲楚制冬及荧港曩徽镶薅察 1 ) 褥转染重组质粒p c d n a 3 i ( + ) 一e g f p 的细胞生长接近融合时按1 2 密度( 大鼠骨髓间充质干细胞) 或1 4 ( h e l a 细胞) 传代继续培养； 2 ) 至绥照密度达嚣5 0 7 0 熬会，铡搏原寒鼹培葵滚，捺蠲食鸯 9 四川大学硕士学位论文棣浩杰 g 4 1 8 ( 8 0 0d - g m l ) 、1 5 ( 体积分数) 小牛血渍( 大鼠肯髓闻充质予缎 斑) 或1 0 ( 体襁分数) 小牛斑清( h e l a 细胞) 但不含双抗( 青霉素 和链霉素) 的d m e m 培养液进行抗性细胞筛选培养，同时用未加转染 液鲶细飚 乍为对照： 3 ) 警对照细飚大部分死亡辩，再换一次筛选液，g 4 1 8 浓度蹲低至 2 0 0 “g m l ，每周换筛选液培养两次，以维持筛选作用； 4 ) 绣周后，显徽镜下可见蠢h e l a 细胞撬性克隆形成；四周后，照 檄镳下可觅有大鼠骨髓闻充溪干细胞抗慷克隆形成： 5 ) 将涂有多聚赖氨酸的盖城片高温高压消毒后，放鬣在6 孔板的孔 底，掩筛选褥剿蛉抗性细胞张檀在盏玻片上，待其，主长2 d ； 6 ) 待细胞密度达到7 0 左右时，取出长满细胞涂有多聚赖氨酸的箍 玻片，用甘油封片后放置在敞玻片上； 7 ) 将上面制鍪好的细胞照片放置于荧光曩徽镜下栽察。 2 6 转染细胞的冻存 l 扶遵壤期到澎成致密懿攀层细胞之瓣的壤蓁缎臌都霹臣震予冻 存，但最好为对数生长期的细胞，已经长满的细胞冻存的生存率比 较低，在冻存前一天最好更换一次培养熬； 2 ) 爆o 。2 5 ( w v ) 骧酶爨蓥屡生长故缎藏溃缘下袋，依据终代的 方法把消化好的细胞收集予离心管中并计数、离心； 3 ) 去除胰酶以及旧的培养然，加入配赞好的含有1 0 ( 体积分数) d m s o 凉夺培葵蒺，1 5 7 6 ( 体辍分数) 小孛瘫瀵( 臻予大聚餐蘧阉突矮 干细胞) 或1 0 ( 体积分数) 小牛血清( 用于h e l a 细胞) ，冻存液中 细胞的最终浓度为5 1 0 “1 x 1 0 7 ，用吸管轻轻吹扪，然后分凝入 缀溅骧存警孛黪封好，霹潋蹇接藏入滚懿孛冻存。 藉弼丈学矮士学柱论定椽穗杰 结果 1 质粒p c d n a 3 1 “) 和p e g f p 一1 的双酶切鉴定 p c d n a 3 1 ( + ) 质粒经过b a m i ti 、n o ti 双酶切后，电泳结聚( 见 阉l 一8 ) 显示有一条5 。4 k b 麓絷带，穰据p c d n a 3 。i ( + ) 瘊粒酶窃图谱 分析，该质救含有b a m hl 和n o ti 酶切位点各一个，经过双酶切后 得到线性化载体p c d n a 3 1 ( + ) 和另外一个很短的片段，电泳时这 令缀籁静冀蔽燕出了璩瓣糖凝黢，最蘑凝胶上褥剿的条带聿誊合线往 化载体p c d n a 3 1 ( + ) 的长度，故可以验证所获质粒确为p c d n a 3 1 ( 十) 质粒。 p e g f p - 1 蒺载经过8 a 硎i 、n o t 瑟酶切鑫，电濠结莱( 冕圈 l c ) 鼹示有瓶条分别为3 5 k b 卸0 。7 k b 的祭带，根据p e g f p l 质粮 酶切图谱分析，该质粒同样含商b a m hi 和n o ti 酶切位点各一个， 经过载酶切籁得嚣露静蘩茜e g f p 片段帮勇终一个鞍长豹的片段，电 泳时凝胶上的条带符合鼹个片段的长度，数可以验证雕获质粒确为 p e g