（分析化学专业论文）低压离子色谱与化学发光联用新技术研究.pdf

低压离子色谱与化学发光联用新技术研究 学科专业：坌扭丝堂 指导教师：周光咽麴援 研究方向：丝堂筮造盆垄丘 研究生：塑塑丝 摘要 高灵敏度的化学发光( c l ) 检测手段与高分辨的高效液相色谱( h p l c ) 、离 子色谱( i c ) 、超l 临界流体色谱( s f c ) 、毛细管电泳( c e ) 、微流控芯片及微透析 等分离技术相结合，成为一种理想的分离分析方法，也是一种有效的微量和痕量 分析手段，已在环境科学、临床检验、药学、工业分析等领域锝到广泛的应用， 具有广阔的前景。 我们实验室刘玲率先尝试低压离子色谱与化学发光分析联用，并取得成功。 本工作是进行低压离子色谱与化学发光分析联用新技术的研究，进一步拓展低压 离子色谱的应用范围。本论文包括两个部分。 第一部分是综述。简述了低压离子色谱应用研究及其进展，还介绍了近年来 国内外有关化学发光分析作为h p l c 、i c 、s f c 、c e 和微流控芯片等柱后检测的 新进展。 第二部分是研究报告。具体内容如下： l 无机流动相低压离子色谱分离化学发光分析检测痕量锰 以o 0 9m o ll k c l 0 0 tt 0 0 1 l “h c i 作流动相，低压离子色谱( l p i c ) 分离， 鲁米诺化学发光( c l ) 检测m n 2 + 。研究了分离条件、化学发光条件及二者匹配 方式等因素对分离和检测的影响，以及干扰情况。测定m n 2 + 的线性范围 1 0 x 1 0 一4 o x l o g l - l ，检测限为1 o x l 0 1 9g l 。利用此法测定血清中的m n 2 + ， 平均回收率为1 0 8 。用无机流动相替代有机复合酸流动相，灵敏度提高2 3 个 数量级，流动相保质期从一周延长至半年。 2 低压离子色谱与化学发光分析联用检测痕量钙 当l u m i n o l - h 2 0 2 一n i ”混合溶液的发光降至基线值后，加入碱土金属离子， 其发光显著增强。基于此，结合低压离子色谱( l p i c ) 分离技术，本文建立起 c a 2 + 离子的l p i c c l 分离分析新方法。该方法的线性范围为8 0 x l o s - 6 4 x 1 0 巧 g m l ，相关系数r = 0 9 9 9 8 ，检出限为5 4 1 0 。8g m l ，相对标准偏差为1 3 3 ( n = 1 1 ) 。测定牛奶中的c a 2 + 离子，并与原子吸收光度法对照，结果令人满意。 拓展了l p i c 的应用范围，为丰富化学发光理论提供了新的科学证据。 3 鲁米诺铁氰化钾强发光后续化学发光分析汞、镉、锌的研究 实验发现，氢氧化钠介质条件下，鲁米诺与铁氰化钾混合，发生强化学发光 反应，流经一段距离后，发光降至基线值加入h 9 2 + 、z n 2 + 、c d 2 + 后，发光显著 增强，其相对化学发光强度增强值与浓度呈良好线性关系。基于此，建立化学发 光分析h g ”的新方法，该方法的相关系数r = 0 9 9 9 6 ，线性范围为1 0 x 1 0 - 9 7 0 x 1 0 。7g , m l ，检出限为5 6x 1 0 。1 0g ，m l ，相对标准偏差为2 , 3 3 ( n = 1 1 ) 。同样反应条件下，分析z n 2 + ，相关系数r = 0 9 9 9 2 ，线性范围为1 0 1 0 - s 5 0 n 1 0 g m l ；分析c d 2 + ，相关系数r = 0 9 9 9 4 ，线性范围为 5 0 x 1 0 - 8 4 2 5 x 1 0 - 6 9 m l ；进m d + 、c u 2 + 、f e 2 + 、c 0 2 + 、n i 2 + 、c r 3 + 、p b 2 + 、c d + 、 m g ”、b a ”，发光都有不同程度的增强，低压离子色谱适于分离上述离子，由此 可见，鲁米诺铁氰化钾强发光后续化学发光分析与低压离子色谱联用的应用前 景非常广阔。 关键词：低压离子色谱无机流动相化学发光后续化学发光联用技术碱土 金属离子 n o v e la p p l i c a t i o no fl o w p r e s s u r ei o nc h r o m a t o g r a p h y w i t hc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n s p e c i a l t y ：a n a l y ，t i c a lc h e m i s t r y r e s e a r c h ：l u m i n e s c e n c ea n a l ，y s i s m e n t o r ：p r o f z h o ug u a n g m i n ga u t h o r ：h us h u a n g x i u a b s t r a c t t h es t u d i e so fn o v e l a p p l i c a t i o n o f l o w p r e s s u r ei o nc h r o m a t o g r a p h y w i t h c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nw e r ec a r r i e do u ti nt h i sd i s s e r t a t i o n ，w h i c hc o n s i s t so ft w o p a r t s t h ef i r s t p a r t i sar e v i e wc o n c e r n i n gt h el o w - p r e s s u r ei o n c h r o m a t o g r a p h ya n d c h r o m a t o g r a p h yt e c h n o l o g yw i t hp o s t c o l u m nc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ，a n dt h e ns o m e r e s e a r c hr e p o r t sw e r eg i v e ni nt h eo t h e rp a r t s o m ek i n do fi o n sw e r es e p a r a t e da n d d e t e r m i n e db yl o w p r e s s u r ei o nc h r o m a t o g r a p h yw i t hc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ，a n d t h e r e f o r eg o o dr e s u l t sw e r eo b t a i n e d 1 - d e t e r m i n a t i o no ft r a c em a n g a n e s e ( n ) b yl o wp r e s s u r ei o nc h r o m a t o g r a p h y u s i n gi n o r g a n i cm o b i l ep h a s ew i t hc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n t h es e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fm n ( i i ) w e r ei n v e s t i g a t e d b yl o w p r e s s u r e c h r o m a t o g r a p h y c o m b i n e dw i t hc h e m i l u m i n n e s c e n c e t h e s e p a r a t i o na n dd e t e c t i o n c o n d i t i o n sw e r es t u d i e d p o t a s s i u mc h l o r i d ea n dh y d m c h l o r i ca c i dw e r eu s e da se l u e n t ，a n d l u m i u o l h 2 0 2s y s t e ma st h ec h e m i l u m i n n e s c e n c eo n e 0 0 9t o o l ，l 1p o t a s s i u mc h l o r i d e 。 0 0 1m 0 1 l h y d r o c h l o r i ca c i d ，4 0 x l o 4m 0 1 l l u m i n o l ，4 0 x 1 0 t o o l ，l h 2 0 2w e r ea s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n st h el i n e a r r a n g ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fm n ( i i ) i s 1 0 1 0 o x l o g l - f ：t h ed e t e c t i o nl i m i ti s1 0 1 0 一g l t h ep r e s e n tm e t h o di ss i m p l e ， r a p i d ，a c c u r a t ea n dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e c tm n ( i i ) i nb l o o ds e r u mt h e a v e r a g er e c o v e r yw a s10 8 2d e t e r m i n a t i o no ft r a c ec a l c i u m ( i i ) b yl o wp r e s s u r ei o nc h r o m a t o g r a p h yw i t h c h e m i l u m i n e s e e n c ed e t e e t i o n t h el u m i n o l h 2 0 2 n i 2 + c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) r e a c t i o na n di t sf o l l o w u pc lr e a c t i o n c a t a l y z e db ya l k a l i n e - e a r t hm e t a li o nw e r es t u d i e d b a s e do nt h ef o l l o w u pr e a c t i o n ，an o v e l m e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc a l c i u mw a sd e v e l o p e db yl o w p r e s s u r ei o n c h r o m a t o g r a p h yw i t hc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o r t h e d e t e r m i n a t i o na n ds e p a r a t i o nw e r ee v a l u a t e d t h el i n e a rr a n g ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no f c a l c i u m ( 1 i ) i s8 0 x 1 0 s 64 x 1 0 6g m l 一( f o 9 9 9 8 ) a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s5 4x 1 0 8 g m l 一t h ep r e s e n tm e t h o di ss i m p l e ，r a p i d ，a n da c c u r a t ea n d h a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e d t od e t e c tc a l c i u m ( i i ) i nc r e a m e r yw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s ，w h i c hw e r ei ng o o da g r e e m e n t w i t ht h o s ef r o ma t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y 3an o v e lf l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f m e r c u r y ( i i ) 、z i n c ( i i ) 、c a d m i u m ( i i ) b a s e d o n l u m i n o l k 3 f e ( c n ) 6s y s t e m f o l l o w e d - u pc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o n t h el u m i n o l k 3 f e ( c n ) 6s y s t e mc h e m i l u m i n e s c e n c e ( l ) r e a c t i o na n dl t sf o l l b w - u pc l r e a c t i o nc a t a l y z e db ym e r c u r y ( i i ) 、z i n c ( i i ) 、c a d m i u m ( 1 i ) w e r es t u d i e d t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fm e r c u r y ( i i ) w e r ee v a l u a t e d t h el i n e a rr a n g ef o rt h e d e t e r m i n a t i o no fm e r c u r y ( i i ) i s1 0 x10 - 9 7 o xlo 。7g m l ( f o 9 9 9 6 ) a n dt h ed e t e c t i o n l i m i ti s5 6 x 1 0 1 0g m l a st h es a m eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g ef o rt h e d e t e r m i n a t i o no fz i n c ( i i ) i st 0 x10 - 8 - 5 4 x10 6g m l 1 ( r = o 9 9 9 2 ) ；t h el i n e a rr a n g ef o rt h e d e t e r m i n a t i o no f c a d m i u m0 i ) i s5 0 x 1 0 8 2 5 x 1 0 6 9 m l ( r - - 0 9 9 9 4 ) k e y w o r dl o w p r e s s u r ei o nc h r o m a t o g r a p h y , i n o r g a n i cm o b i l ep h a s e ，c h e m i l u m i n e s c e n c e ， f o l l o w - u pc h e m i l u m i n e s c e n c e ，c o u p l e dt e c h n i q u e ，a l k a l i n ee a r t hm e t a l 4 第一部分综述 1 低压离子色谱及其进展 1 9 0 3 年，波兰植物学家m t s w e t t 在研究植物叶的色素成分时，将粒状的碳 酸钙填充到一根长的玻璃柱中，然后将植物叶的浸提液加到柱的顶端，此时，浸 提液中的色素便吸附在碳酸钙颗粒上，再用纯净的石油醚来冲洗，于是玻璃柱内 的植物叶色素便分离成几个颜色各异的谱带，m t s w e t t 把这种分离方法命名为 色谱法，色谱从此诞生。 1 9 4 1 年，m a r t i n 和s y n g e 发表了他们的著名论文“an e wf o r mo f c h m m a t o g r a me m p l o y i n gt o wl i q u i dp h a s e ”，提出了著名的平衡塔板理论，奠定 了色谱学的理论基础，为色谱学的发展作出了开创性的贡献，十年后，他们由此 获得了诺贝尔奖。 1 9 5 2 年，马丁和杰姆士发表了首篇关于气相色谱的论文，气相色谱得以产生 和发展。 1 9 6 9 年世界第五届色谱进展讨论会上，刚刚诞生的高压液相色谱技术引起了 色谱学家的广泛重视，高压技术的引入、固定相及检测器的不断改进使得高效液 相色谱技术得到迅猛发展，已成为项强有力的分离技术和微量分析方法i i 】。 离子色谱( 以下简称i c ) 是高效液相色谱( 简称h p l c ) 的一种。现代i c 的创始人是h s m a l l ，他们于1 9 7 5 年发表了第一篇论文，同年商品仪器问世【2 1 。 i c 的优点是：快速、方便、灵敏度高、选择性好、可同时分离多种离子化合物、 分离柱的稳定性好、容量高f 3 1 。近年来i c 发展很快，在环境、食品、医药卫生、 地质勘探、制革、石油化工、冶金等分析领域中都有十分广泛的应用4 1 1 。般 的i c 都是采用高压操作，不仅要求耐高压，而且要求耐酸碱腐蚀，因此仪器价 格昂贵。 1 1 低压离子色谱的诞生 1 9 8 5 年四川1 大学张新申教授首次提出了低压离子色谱( l o wp o w e ri o n c h r o m a t o g r a p h y ，简称l p i c ) 的构想 6 】，独创地用低压泵取代高压泵，使仪器结 构明显简单化、成本降低几十倍，并成功研制了一系列l p i c 色谱柱7 1 ，可在 1 9 6 2 9 4 1 0 5p a 的低压下进行快速分离分析，而且显著减少了高压操作容易出 现的泄漏、堵塞等问题。l p i c 操作简单，维修和使用都十分方便，其分析准确 度、精密度、灵敏度( 检测限达1 0 x 1 0 一g m l 。) 及速度( 1 0 - 2 0m i n ) 都可与高 压液相色谱( h p i c ) 相媲美。 1 2l p i c 的工作流程 7 w a s t e t 图2l p i c 的流程图 f i g2 t h ef l o wd i a g r a mo f l o w p r e s s u r ei o nc h r o m a t o g r a p h yf o ra n a l y s i so f c a t i o n s l 洗脱液( e l u e n t ) 2 6 压泵( i o ”p r e s s u r ep u m p ) 3 注射i 阔( i n j e c t i o nv a l v e ) 4 分离柱( s e p a r a t i o nc o l u m n ) 5 混台辨( m i x e r ) 7 反应试剂( r e a c t i o nr e a g e n t ) 8 反应盘管( r e a c t i o nc o i l ) 9 冼通池( f l o wc e l l ) 1 0 检测器 ( d e t e c t o r ) ii 计算机( c o m p u t e r ) 1 3l p i c 色谱柱的型号及适用分离离子 表1l p i c 色谱柱的型号及适用分离离子 1 4 l p i c 的洗脱体系 表2l p i c 的洗脱体系 洗脱体系 流速检测 抑制柱 ( m l m i n )器 c k a ) c k b ) a l a 1 0 7 2 1 0 一m 0 1 l h n o ) 1 4 4 10 m 0 1 l h n 0 3 1 2 x 1 0 一m 0 1 l n a 2 c 0 3 1 0 x 1 0 m 0 1 l 1 柠檬酸 o 6 1 0 o 6 1 o 1 2 吨o o 6 1 o c c c ( p 6 x 7 0 m m c 7 a 2 1 0 1 0 t 0 0 1 l n a 2 c 0 3 1 2 2 0 有机酸l p i c 1 4 4 1 0 4 m o ll h n 0 30 3 - - 0 6 有机酸l p i c7 2 x1 0 4 t 0 0 1 l h n 0 30 3 , - - 0 6 1 0 ) ( 1 0 3 m o 】l 酒石酸一0 5 x 1 0 - 3 m o i l 。1 乙二 c c c c 2o 6 1 0c 胺 i 0 x 1 0 一m o i l - 1 柠檬酸0 6 x 1 0 m 0 1 l 乙二 胺 c 21 1 1 0 4 t 0 0 1 l h n 0 3 o5 x 1 0 4 m 0 1 l 1 乙二胺 c 3 0 0 0 5 6 m 0 1 l 一1 柠檬酸0 0 0 7 5 m 0 1 l 。乙二胺 0 0 9 0 t 0 0 1 l k c i 00 6 3 m 0 1 l h 2 s 0 4 c 4 0 0 4 5 m o l l 酒石酸 06 1 0c 0 6 1 0 o 6 i o c o 0 6 1 oo q ，6 x 7 0 m m c ：电导检测器；o ：光学检测器 1 5l p i c 检测器的类型 表3 l p i c 检测器的类型 8 1 。6l p i c 的应用 1 6 1 l p i c 在环境样品分析中的应用 l p i c 和经典的i c 一样，可以同时、快速、灵敏、准确地检测自来水、雨水、 矿泉水中l i + 、n a + 、n h 4 + 、k + 、m 9 2 + 、c a 2 + 等阳离子阻1 】及f 、c i - 、n 0 3 、s 0 4 2 。 等阴离子 1 2 - 1 7 1 。张新申等【恤1 9 】采用l p i c ( c 3 柱分离、柱后铬天菁显色剂比色) 检测自来水及酸雨试样中的a l ”，其检测限明显低于经典i c ( 采用试钛灵作显 色剂) 。周光明、刘玲等【2 0 】首次将l p i c 与c l 联用，并获得成功。c 以草酸柠檬 酸混合溶液作为洗脱液，l u m i n o l - h 2 0 2 作为化学发光检测体系，能同时分离测 定c u 2 + 、c u 2 + 、c r 3 + 、f e 2 + 、m n 2 + 等5 种过渡金属离子。测定的线性范围分别为 ( m g l 1 ) ：c 0 2 + ：o 0 0 1 o 1 ：c u 2 + ：o 1 6 ；m n 2 + ：0 0 6 4 ：f e 2 + ：0 0 3 5 ：c r 3 十： 0 0 2 5 1 。检钡0 限( g ，l 分别为c o n ：o 8 5 ；c t r z + ：8 5 ；m n “：4 2 ：f e 2 + ：2 1 ； c r 3 + ：2 0 。利用此法测定了维生素b 1 2 中c 0 2 + 以及人发样中c t r h ，m n 2 + ，c r 3 + ， c 0 2 + 和f e 2 + 等离子的含量，其结果与原子吸收所测值吻合。 1 6 2l p i c 在石油化工工业分析中的应用 采用经典i c 分析油用水样中的l i + 、n a 十、n h 4 + 、k + 、m g 2 + 、c a 2 + 、s r 2 + 、 b a 2 + 、f 、c 1 、b r 、s 0 4 2 一等离子 2 屯引，由于油田水的矿化度很高，n a c l 的含量 在l o 一1 0 6 9 m l 一，干扰很大，但张新申等口3 j 用l p i c 取代i c ，结果令人满意。 1 6 3 l p i c 在皮革工业分析中的应用 l p i c 配置分光光度计，可快速测定制革鞣液中c r ”、a 1 3 十、z r 3 + 、c a “、c r o , 。2 。、 c i 、s 0 4 2 。等离子的含量j 2 4 2 9 ，此法快速、准确，并且采样少，检测限为：l f f 9 1 0 8 g m l l 。该方法还可测定皮革鞣液中甲酸、乙酸、丁二酸和柠檬酸等有机酸的含 量。丁克毅等采用凝胶过滤色谱( g f c ) 对柠檬酸盐( c i t ) 蒙固的铝( i i i ) 配合物溶 液的组分进行分离检测( 铬天青比色法) 各组分中c i t 和a 1 3 + 的含量。 1 6 4l p i c 在稀土样品分析中的应用 稀土元素由于相互性质十分接近且含量极少，无论采用化学方法还是仪器分 析方法，对稀土元素含量的分析历来都是一件十分棘手的事情。目前，对于稀土 元素的分析，多采用梯度洗脱，拄后反应生成有色物质，再用光度法检测。李勇 强 3 1 1 采用l p i c ，配电导检测器，不需要梯度洗脱，分析了镧、铈、镨、钕、铕 等十多种常见稀土元素，检测限可达i 5 l l o 6 m o i l 。赵仕林等吲采用l p i c 测 定了稀土硫酸介质中氟的含量。针对稀土溶液样品的复杂基体，提出了用k o h 沉淀( 掩蔽剂h yc 6 h 8 0 7 h 2 0 ) 的样品预处理方法，消除了许多阴、阳离子的干 扰，选择适宣的l p i c 分析条件，消除了s 0 4 2 等阴离子干扰。对稀土的硫酸浸提 液中的氟进行测定，氟的回收达9 5 以上。 1 6 5l p i c 在食品分析中的应用 吴永康等”1 利用l p i c 测定酱油中的谷氨酸( 配电导检测器) ，样品经适当 稀释后，以1 0m m o l 。l h n 0 3 溶液作流动相，流速1 0m l m i n ，进样量2 0g l ， 检出限为0 7 3g g ，m l ，方法精密度为9 5 。对不同品牌酱油进行了测定，结果 令人满意。 1 6 6l p i c 在生化样品分析中的应用 目前，氨基酸分析般都在高压下进行，常需梯度洗脱，配置紫外检测器。 杨眉口4 j 采用l p i c ，配电导检测器，不需梯度洗脱，能分离检测十三种常见氨基 酸，检测限可达1 0 g m l 。 华西医科大学药学院的伍朝筻教授等采用l p i c 分析了胰岛素，葡萄糖酸锌 口服剂及葡萄糖酸锌颗粒剂中的锌含量及富血康糖浆中的铁含量。分析结果与中 固药典( 1 9 9 0 所版) 标准方法相符。张新申i ”q 7 】等用l p i c 测定了施尔康片中的 辞和铁，还测定了人发中铁、铜、镍、锌、铅及人血中钠和钾。 2 化学发光与其它分离技术联用及其应用 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，简称c l ) 是基于化学反应所提供的能量， 使反应体系中的某种物质( 反应物、产物、中间体或其它共存物质) 的分子吸收 了化学反应所释放的能量而被激发，形成激发态分子当它们从激发态返回基态 时，同时将能量以光辐射的形式释放出来，发出一定波长的光。在一定条件下， 某一时刻的化学发光强度或某一时段化学发光总量与被测物质浓度成线性，基于 此进行定量分析，叫化学发光分析。 c l 具有灵敏度极高( 检测限常达1 0 m 1 0 mm o t l 1 ) 、线性范围宽( 3 6 个数量级) 、没有散射光及杂色光引起的背景值、分析速度快以及仪器设备相对 简单便宜等优点，而倍受广大分析工作者的关注( 粥“孙，是一种有效的微量和痕 量分析手段，已在环境科学、临床检验、药学、工业分析等领域得到广泛的应用 4 4 - 4 6 1 。 但是，c l 的不足之处是选择性差，从而制约了这一方法的实际应用。高灵 敏度的c l 检测手段与高分辨的高效液相色谱( h p l c ) 、离子色谱( i c ) 、超临界 流体色谱( s f c ) 、毛细管电泳( c e ) 、微流控芯片及微透析等分离技术相结合， 成为一种理想的痕量和微量分离分析方法。2 0 世纪8 0 年代的毛细管电泳和9 0 年代初微流控芯片的出现、分析仪器的微型化及微采样的要求向科研人员提出了 要解决高灵敏度检测的问题，c l 因不需要外加光源和灵敏度高的两大突出优点， 而成为微量和痕量检测研究的热点。 下面介绍国内外有关c l 与h p l c 、i c 、s f c 、c e 和芯片等分离技术联用 及其应用。 2 1 液相色谱柱后检测 自从h a r t k o p f 4 7 1 首创液相化学发光检测法，近3 0 年来，这种检测技术发展 迅猛，己广泛地应用于冶金、化工、环保、生物、医学、药学和临床等组分复杂、 含量低的样品分析4 8 锕】。与其它检测方法相比，c l 检测基础是氧化还原反应所 引起的能量转移原理，一般情况下需要两种或者两种以上物质混合反应，才可能 发生发光现象。所以，h p l c - c l 检测装置往往包括四大部分，即输液泵、色谱 柱、混合器和c l 检测器，其中c l 检测器由发光流通池和光电转换装置组成。 待测组分经色谱柱分离后与发光试剡混合发生c l 反应，流通池亦即发光池内的 光信号由光电倍增管或者其他光电转换器件转换并放大，最后由记录仪或者数据 采集装置记录。由于该检测法不需要光源和复杂的光学系统，直接检测发光强度， 消除了光源不稳定和杂散光的干扰，因此灵敏度很高。 章竹君等【5 列对该检测技术的原理、检测器的设计作过详细的论述，m cg o w n 等f 5 4 】介绍了h p l c 与c l 联用的进展。h p l c 与c l 联用引起广大分析工作者的 浓厚研究兴趣f 5 5 5 8 】 。 作为色谱柱后检测最常用的c l 体系有鲁米诺和过氧化草酸酯体系。 鲁米诺c l 体系一般要求在碱性水溶液条件下进行反应，而过氧化草酸酯往往在 有机溶剂中迸行反应，这两个体系互相补充，普遍地应用于有机、无机和生物样 品的分析。鲁米诺的衍生物，如异鲁米诺( a b e i ) n 7 以标记到羧酸和氨类化合物上 1 6 1 】，经过色谱分离后，再在碱性条件下与过氧化氢、铁氰化钾或者其他催化试 剂反应，c l 检测，可以应用于氨基酸、蛋白质、脂肪酸以及胺等化合物的分析 陋”。过氧化草酸酯c l 是在合适的荧光化合物( 增敏剂) 的存在下，由h 2 0 2 诱导 氧化芳香基草酸酯而发生发光“6 3 】。k o b a y a s h i - 等1 6 4 1 将此体系用于液相色谱检测， 成功地测定了4 种丹酰化氨基酸。随后这一技术得到广泛的研究和迅速发展。据 其发光原理，该方法可检测：1 ) 荧光物质及其衍生物：2 ) h 2 0 2 及经过处理能够 产生h 2 0 2 的物质；3 ) 能够熄灭或者增强该体系发光强度的物质。 下面按c l 体系分类，对h p l c 柱后c l 检测作简要介绍。 2 1 1 过氧化草酸酯c l 体系的柱后检测 6 0 年代开始报道了一类新的发光体系，即含草酸基团的衍生物，其典型化 合物有双【2 ，4 - 二硝基苯基 草酸酯( d n p o ) 、双【2 ，4 ，6 三氯苯基 草酸酯( t c p o ) 。 过氧化草酸酯c l 是目前发光效率最高的非酶催化化学发光反应，其光量子产率 达2 5 。过氧化草酸酯与h 2 0 2 反应生成类似于1 , 2 。二氧杂环丁烷酮的中间体， 由此把能量转移给荧光受体。k o b a y a s h i 等【6 4 】把这个反应发展为荧光物质的 h p l c 柱后检测，随后这种高灵敏度的检测法很快地被应用于多环芳烃的测定 6 5 1 w e b e r 和g r a v e s k i 【66 】把这种检测体系与毛细管液相色谱进行联用，测定了 2 氨基蒽和芘，检测限分别为4 5 0 和6 0 0f m o l 。但是，由于多环芳烃的种类较多， c l 检测的灵敏度往往与荧光物质的分子结构有密切的关系，兀兀共轭比较大或者 多环上具有供电子的氨基官能团的化合物，发光强度相对比较强 6 7 “引，柱后检 测的灵敏度也比较高，如芘和蒽的c l 检测灵敏度高于荧光检测法，硝基多环芳 烃几乎没有c l 现象，而氨基多环芳烃的c l 测定灵敏度相当高。h a y a k a w a 等【6 9 】 对h p l c c l 测定氨基多环芳烃的最佳条件进行了研究，从汽油和柴油排放的颗 粒物中萃取出来的1 ，3 、1 , 6 一、l ，8 ，硝基芘和1 一硝基芘经过亚硫酸钠还原后进行 色谱分离，柱后检测限达到f m o l 水平【加j ，比荧光检测高出3 0 7 0 倍。m a e d a 等 提出非会属h p l c 系统的设想，采用塑料色谱柱和聚四氟乙烯管，减少金属 离子对c l 的影响，从而提高了测定的灵敏度和精密度。 c e p a s 等 7 2 】对过氧化草酸酯( t c p o ) 一c l 体系柱后测定的条件，如流动相、 p h 、反应试剂的浓度、流速等进行了优化，测定了蒽、芘、苯并芘、二苯稠蒽、 9 ，1 0 一二苯蒽等，结果同样表明，荧光性有机化合物c l 测定的检测限与其分子结 构有很大的关系。最灵敏的二苯稠葸为o 0 0 2n g ，但是芘的测定检测限只有1 3 5 n 2 。对于多数待测物质，往往没有荧光或者荧光量子产率很低，需要经过柱前或 者柱后荧光标记衍生后才能有效地进行分析。由于多环芳烃是一类重要的环境污 染物，大多数化合物都是有效的c l 能量接受体，可充分利用c l 分析具有检测 灵敏度高的特点，所以这方面的研究和应用比较多。硝基化多环芳烃的荧光强度 相对较弱，对t c p o h 2 0 2 c l 体系的增敏作用比氨基化多环芳烃低，为了提高硝 基化多环芳烃的测定灵敏度，可通过样品柱前化学还原处理，将多环上的硝基还 原成氨基【73 1 。色谱分离条件不但影响样品测定的灵敏度，而且明显地影响化学发 光的选择性。通过控制分离条件，可以使这种作用有利于提高分析的选择性【7 4 】。 为了省去硝基在柱前进行化学还原处理步骤，h a y a k a w a 等改进了s i g v a r d s o n 提出的方法，在分离柱前安装了一根装有锌玻璃珠的微型柱，达到了在线还原 处理的目的，效果良好。经过改良的p t r h 包被颗粒填充柱可以较好地还原硝基 7 6 1 , 因而可较大程度地延长还原柱的寿命。这一系列的测定体系被很好地应用于 大气颗粒物中1 , 3 一、1 ，6 。和i ，8 - 二硝基芘以及1 硝基芘的测定，样品的需要量 只有数毫克。该法还可以应用于其他带有硝基的多环芳烃，如6 一硝基、2 一硝基荧 蒽、1 一、2 一和6 一硝基芘等的柱后检测【7 8 】。 除了具有荧光特性的多环芳烃【7 9 1 以外，其他一些易被c l 反应激化的荧光 化合物，如尸胺、组胺、腐胺、精胺、亚精胺及酪胺f 8 0 1 、生物碱【8 1 】、丹酰化化 合物1 8 2 1 等，同样可以采用过氧化草酸酯h 2 0 2 c l 柱后检测。一些不具有荧光特 性的物质，可以通过用荧光试剂衍生化，达到c l 测定的目的。在己知的荧光衍 生试剂中，丹磺酰氯是应用最广泛的荧光标记试剂之一。k w a k m a n 等【8 3 】报道了 色谱柱前丹酰化衍生烷基、硝基以及氯代苯酚的过氧化草酸酯c l 检测法，其灵 敏度比荧光法高出l 2 个数量级【8 4 1 ，用于标记仲胺类化合物、地下水中n 亚硝 基和相应的仲胺、尿液中的药物去氧麻黄碱及其代谢物，血浆中的m e x i l e t i n e 【8 ”， 以进行定量分析。o h k u r a 等 8 6 】将1 , 2 一二苯乙烯二胺作为柱前衍生试剂以异丙 基肾上腺素作为内标，通过l ，2 一二苯乙烯二胺在柱前将胺转化为相应的荧光衍生 物，测定人血浆及尿液中的儿茶酚胺( 降肾上腺素、l 肾上腺素和多巴胺) ，检测限 达1 5 0 4 5 0a m o l 。伯胺与邻苯二甲醛在还原剂2 一巯基乙醇存在下，生成具有较 强荧光特性的吲哚类似物，从理论上讲，这一反应可以应用于任何伯胺化合物， 可以作为伯胺类化合物的色谱柱前衍生化反应，产生的具有荧光性质的衍生物可 以在色谱柱后进行过氧化草酸酯的c l 检测，灵敏度高，选择性也得到提高，实 际应用前景比较好。i m a i l 等【8 7 j 建立t j l 茶酚胺的乙二胺荧光衍生法，用于血清 和尿中儿茶酚胺的测定，检测限为1 f m o l 。n o h t a 等8 8 1 提出了儿茶酚胺的另一种 柱前荧光衍生技术，方法简便，3 7 c 下衍生化反应所需时间只有2 5m i n 。该法己 应用于人血清中3 种重要的儿茶酚胺的c l 柱后分析【8 9 1 。 在酶或者光化学作用下，以测定生成物h 2 0 2 的间接方法，可以实现许许多 多物质的桩后检测。由于酶反应破坏待测物的结构，一般情况下，酶催化反应发 生在物质分离之后c l 反应之前。以常用的葡萄糖氧化酶为例： d g l u c o s e + h 2 0 + 2 _ g t u c o n i c a c i d + h 2 0 2 生成的h 2 0 2 与t c p o h 2 0 2 氨基荧葸体系发生发光反应【9 0 1 ，可以用于尿液中葡 萄糖的测定。 2 1 2 鲁米诺及其衍生物c l 体系的柱后检测 鲁米诺( 3 一氨基苯二甲酰肼) 发光现象早在1 9 2 8 年就已发现，它在碱性条 件下，被氧化剂氧化生成激发态的中间产物3 一氨基邻苯二甲酸，激发态回到基态 时发出4 2 5d i n 蓝光，通过测定光的强度，可以对参与反应的待测物质的含量进 行测定。对于鲁米诺化学发光体系，可以使用多种氧化剂，如k m n o 一，c 1 0 一， c e ( i v ) * n1 2 等，但最常用的氧化剂为过氧化氢。这一反应相对比较缓慢，催化剂 的存在可以大大加速反应速度。常用的催化剂有过氧化物酶、血红素、过渡金属 离子c u ( i i ) ，c 0 0 i ) ，n o ( i i ) ，f e ( i i ) 或者它们的配合物川。鲁米诺的光量子产率 介于0 0 1 和0 0 5 之间，远比过氧化草酸酯的光量子产率低，但是由于鲁米诺c l 体系简单，可以在水溶液中进行反应，部分金属离子和酶对c l 反应有催化作用， 表面活性剂、某些有机化合物等对发光具有增敏作用，有些有机物能够猝灭c l 或者通过产生h 2 0 2 而被间接测定。因此鲁米诺c l 体系往往被应用于过氧化氢、 催化剂( 金属或者酶) 或者体系中任何一种可以用于增强或者猝灭发光强度的物 质。如用固定化酶反应器将待测物质转化为h 2 0 2 ，然后进行c l 检测的方法， 已用来研究大脑及脊髓组织中组胺及n 甲基组胺的作用，其结果与h p l c 一荧光 法一致【9 2 i 。 鲁米诺h 2 0 2 体系在c o ( i i ) 存在下发生c l 反应，加入氨基酸时，c o ( i i ) 与氨 基酸配合，降低了c o ( i i ) 的催化能力，使得发光强度减小，从而达到间接测定氨 基酸的目的，该法已应用于氨基酸的柱后检测1 9 引。测定不同氨基酸的检测限有很 大的差异，组氨酸的最低检测限达0 0 0 4n m o l 。除了测定氨基酸外，抑制发光方 法也可以应用于其他有机物的分析。添加少量的多羟基化合物，如儿茶酚、原儿 茶酸、问苯二酚、维生素p 、对二羟基苯等可以引起鲁米诺玛f e ( c n ) 6c l 体系 的发光强度明显下降一。这一现象被用于多羟基化合物的色谱柱后检测，检测限 达1 0 4 9 l ；用于测定烟草中的芦丁和绿原酸，回收率达到9 0 以上，检测限在 o 5 p m o l l 。左右。崔华等 9 5 】建立了鲁米诺k 3 f e ( c n ) 6 测定苯二酚异构体的 h p l c c l 检测法，对苯二酚、邻苯二酚和间苯二酚的检出限分别为2 、3 2 和6 8 峙一，比紫外检测法低2 4 个数量级，比柱后显色衍生检测法低1 个数量级， 比电化学检测法低1 2 个数量级。鲁米诺h 2 0 2 c l 体系对于过渡金属离子具有 很高的检测灵敏度，结合低压离子色谱，可以同时测定c u ( i i ) ，c o ( i i ) ，f e ( i i ) 和 m n ( i i ) 等过渡金属离子；将其应用于维生素b 1 2 中的钴和人发中铜、钴、铬、铁 和锰的测定，结果与原子吸收法所测值致【9 6 】。除了催化c l 体系以外，还有其 他多种方式可以使鲁米诺类c l 体系应用于柱后检测，如：1 ) 可以将鲁米诺的衍 生物f 如a b e l ) 标记到羧酸和氨类化合物上，经过h p l c 分离后，在碱性条件下 与过氧化氢铁氰化钾反应进行化学发光检测：2 ) 利用某些物质对鲁米诺c