（生物医学工程专业论文）红外光谱细胞水分检测系统设计与研究.pdf

西北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t w a t e re x i s ti ne v e r yb i o l o g i cs y s t e m i ti sb eo fg r e a ti m p o r t a n c et or e s e a r c ht h e r u l eo fw a t e ra c t ，w h i c hh e l pt or e v e a lt h ec h a r a c t e r so fc e l l u l a rs y s t e ma n di n t e r a c t b e t w e e nt h ec e l la n dt h ee n v i r o n m e n t ，a n dh o wa q u e o u sm o l e c u l e si n f l u e n c et h e s t r u c t u r eo fp r o t e i n p a p e ra p p l i e dt h ei n f r a r e ds p e c t r u mt e c h n o l o g yo nd e t e c t i o no f c e l l u l a rw a t e r , a n df o rt h ef i r s tt i m et h ed e s i g n a t i o no fc e l l u l a rp i p ef o ra r r a y i n gt h e c e l l ss i n g l eb ys i n g l ew a sp r o p o s e d m e a s u r i n gt h ea m o u n to fw a t e ri ns i n g l ec e l l n o n d e s t r u c t i v e l yi sr e a l i z e d t h r o u g hr e s e a r c ho f t h en o n d e s t r u c t i v ed e t e c t i o nm e t h o d o l o g yo f c e l l u l a rw a t e r , t h ei n f r a r e ds p e c t r o s c o p y e x p e r i m e n t a lp r o t o t y p ei sd e v e l o p e d t h ei n s t r u m e n t c o n s i s t so ft h r e ep a r t s ：t h es i g n a lc a p t u r es y s t e m , t h ec e l la r r a ys y s t e ma n dt h ed a t a p r o c e s s i n gs y s t e m t h es i g n a lc a p t u r es y s t e ma d o p t st h ed i o d el a s e r sa st h ei n f r a r e d s o u r c e ，a n dt h et r a n s m i t t e dp h o t o c u r r e n ti sd e t e c t e db ya nh g g r t ep h o t o d i o d e ；l o w n o i s ea m p l i f i e ra n dd a t aa c q u i s i t i o nc a r da r eu s e di no r d e rt oa n a l y z e do np c t h e t e s t i n gr e s u l t sf i tt h ed e m a n d 1 1 1 ec e l la r r a ys y s t e mm a k e su po ft h ec e l l u l a rp i p e t h e v a c u u mc h a m b e ra n dt h em i c r ov a c u u mp u m p m a l l a tp y r a m i d a la l g o r i t h mw a v e l e t a n a l y s i s w e r eu s e df o rr e s t r a i n i n gt h es i g n a ln o i s e ，w h i c hd e c o m p o s i t i o na n d r e c o n s t r u c t i o nc o e f f i c i e n t sa r ed a u b e c h i e s c o m p a c t l ys u p p o s e df i l t e rc o e f f i c i e n t s t h et r a c ew a t e ra n dt h em o r ew a t e rc o n t e n t ss i t u a t i o nw e r ed i s c u s s e dr e s p e e t t y ，t h e n t h em a t h e m a t i cm o d e l so ni n f r a r e ds p e c t r u mo fc e l l u l a rw a t e rb a s e do nl e a s t - s q u a r e a n db pn e u r a ln e t w o r k s w e r ed i s c u s s e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ec o r r e l a t i v e c o e f f i c i e n t sb e t w e e nt h ec h e m i c a la n a l y s i sv a l u ea n dt h ei rp r e d i c a t e dv a l u eo ft h e c o m p o n e n to f t h es a m p l ew a s o 9 5 2 p a p e ra l s op r e s e n t san e wm i c r oc o o l e rf o rt h eh g g r t ep h o t o d i o d ew h i c hh a s n o tp i s t o n t h ec l a s s i c a lk a m a u g ht h e r m o d y n a m i cc y c l e ，a n dan e wb e l l o w sa s c o m p r e s s o rr e p l a c et h et r a d i t i o np i s t o nw e r ea p p l i e da n dd e s i g n e d t h en e wm i c r o c o o l e rw ep r e s e n t sh a sa d v a n t a g e so fn ol e a k a g e ，a n dn on e e do fl u b r i c a t i n go i l o u r c o n c l u s i o ni st h a t t h i sn e wm i c r oc o o l e rh a ss t a b l e rp e r f o r m a n c e ，h i g h e re f f i c i e n c y a n di sa p tt om i c m m i n i a t u r i z e d k e y w o r d s ：i n f r a r e ds p e c t n m _ l ，c e l l u l a rw a t e rd e t e c t i o n ，w a v e l e ta n a l y s i s ，n e u r a l n e t w o r k s ，m i c r oc o o l e r i i 西北工业人学硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 生物学技术已发展到了分子基因时代，膜片钳技术促进了离子通道的电生 理学研究，并进而与分子生物学技术结合从分子水平对离子通道开展研究。分 子动力学模拟在复杂生物系统研究中也是一种相当有效的方法，但是在研究离 子通道时仍然面临着很大的困难，首先必须包括相互作用的非常准确的模型， 其次是离子通过通道的时间与可能模拟的时间数量级或许是同一时间分子通过 通道的量。 2 0 0 3 年1 0 月8 日瑞典皇家科学院宣布今年的诺贝尔化学奖颁给两位发现 盐和水是如何在细胞内进出的科学家，他们是p e t e r a g r e ，r o d e r i c km a c k i n n o n 他们的发现使我们对分子的活动有了基本得理解。可见从分子水平研究复杂生 物系统其意义的重要价值。 研究水分子在生物细胞体系中的运动规律除了揭示细胞体系特征和细胞环 境作用机制对水分子作用蛋白质结构的关系具有十分重要的意义，因为水分子 簇的弱作用普遍存在于超分子生物体系中，如蛋白质的二级结构主要靠氢键作 用形成稳定的构型。特别是分子簇间接环境的功能效应研究可望为深层次揭示 化学、生命科学等领域的本质问题提供有力工具。 1 1红外水分探测技术国内外研究现状 红外技术用于固、液体物水分检测应用领域相当广泛。现有的红外水分仪 有美国红外水分仪公司的q b 4 7 5 、q b 6 5 0 0 红外水分仪、英国n d c t m 5 5 、t m 7 1 0 系列红外水分仪、美国z e l t e x 公司z x 8 8 0 、美国z e l e r x 公司生产的z x 一5 0 近红外 水分检测仪、美国p s c 公司m t 系列近红外水分检测仪。 k j t 一1 0 0 近红外水分计是日本株式会社科特( k e t t ) 科学研究所推出的t 10 0 便携式的近红外水分仪系列。该水分计具有以下特点：测定时间短且精度高； 非接触式测定无破坏性；该水分计可测定粮食、食品、纤维等物料。红外水分 1 西北工业大学硕士学位论文 第一苹绪论 仪最常用的测量单元是测量波长和比较波长，可见，红外水分仪采用的滤光片 一般是比较波长如1 8 0 9 m 滤光片、测量波长如1 9 4 9 m 滤光片、补偿波长如 2 7 0 “m 滤光片及可见光滤光片。 上海精密科学仪器有限公司研发成功d h s l 6 - a 多功能红外水分仪，并通过 上海市质量技术监督局的鉴定。与传统的烘箱法分析水分相比，其效率和准确 度大大提高，分析时间缩短三分之二。该仪器在电子天平结构基础上，融合加 热单元，并采用微机控制，电磁力平衡和红外加热技术，产品的技术指标已达 到国内先进水平和国外2 0 世纪9 0 年代水平，但与目前市场上的同类进口仪器相 比，具有性价比的优势。d h s 1 6 a 多功能红外水分仪可广泛应用于化工、医药、 食品、烟草、粮食等行业的实验分析和日常进货控制及过程检测。 日本大阪集团开发的台式k m 1 0 0 型多渡红外线承分计，是种操作简单、 测定可靠的脱机专用高性能光学水分计。 1 2 红外技术在生物医学实验研究中的应用 光谱技术能够了解物质结构、物质成分和它们的含量，而且分析灵敏度和 精度都很高。光谱方法不仅可以测定多种参数，如吸收系数、散射系数等光学 特性参数，而且光谱本身含有组织分子的一些信息，如跃迁电子态、振动、转 动信息等。荧光的发光原理是物质分子吸收了照射光的光子，由基态能级跃迁 到激发态能级，处于激发态的分子通过无辐射驰豫降至第一电子激发态的最低 振动能级，然后再由这个能级以辐射驰豫的形式回到基态，发出分子荧光。分 子荧光光谱与激励光源的波长无关，只与物质本身的能级结构有关。 应用光谱学原理在生物医学领域开展了一系列实验研究，宋占军等多位学 者，采用红外光谱法微波辐照对心肌细胞的损伤进行了研究，结果发现心肌细 胞的损伤引起的心肌细胞改变，3 2 8 1 c m 4 和3 0 7 1 c m o 为n h 伸缩与酰胺i i 第一倍 频共振吸收；2 9 5 6 e m 一，2 8 7 1 c m “为膜脂质末端和膜蛋白中- - c h 3 的伸缩振动峰： 2 9 2 5 c m ，2 8 5 4 c m 。为脂质中c h 2 一的伸缩振动峰；1 7 3 6 c m 。为细胞膜中磷脂结 构中c = o 基团的伸缩振动峰；1 6 4 4 c m 4 和1 5 3 4 c m 。为蛋白质的酰胺i 带和酰胺1 1 带；1 4 5 1 e m “为膜脂质中- - c h 3 和- - c h 2 一非对称的弯曲振动峰：4 5 8 3 3 3 f l 。为 两北工业大学硕士学位沦文第一章绪论 - - c h l 对称弯曲振动峰；1 3 1 2 c m 。1 为酰胺i i i 谱带；1 2 3 8 c m 1 和1 1 6 9 c m 。为细胞膜 中磷脂磷酸二酯基团的对称伸缩振动；1 0 8 3 c m 。1 主要由糖类c o 基团伸缩振动 引起。上述吸收峰谱特征都在h z 0 的光谱吸收范围内，其生物分子的变化机制 有可能与微波引起热效应产生的水分变化有关。山东大学顾黎，谢利德等人采 用f t i r 检测，为实验测出的m e l 细胞的傅立叶变换红外光谱。不同波数对应的 峰高代表细胞内不同结构成分的红外吸收强度，3 & n 9 1 6 1 3 0 0 c m 。1 范围内的峰来自 d n a 和r n a 不同结构成分的振动，1 6 5 0 1 5 4 0 c m o 范围内代表蛋白质的酰胺i 带 和酰胺i 带，在此范围内的吸收来自蛋白质肽链中酰胺c 一0 伸展和酰胺n h 弯 曲振动，不同的峰位对应不同的蛋白质二级结构，1 4 5 2 c m 。1 和1 4 6 7 c m 。1 的峰来自 膜腊的酰基链中甲基和甲叉基的弯曲振动，在2 8 0 0 3 0 0 0 c m o 范围内的峰来自 膜磷脂中c h 伸展振动。得到所有样品的傅立叶变换去卷积谱后，测出特征性 波数对应的峰高( 吸收度) ，分别计算比值，发现在诱导细胞凋亡的过程中， t f a r l 9 基因的转染起着促进作用，并使细胞的流变学特性受到显著影响。该项 目的缺点是将细胞涂片方式，将实验细胞以重水( 含0 9 n a c l ) 漂洗2 次( 1 0 0 0 r p m ， 5 r a i n ) ，尽量除去上清液，用微量移液器将细胞移至c a f 2 窗片的中央，每次5 m l ， 涂成直径约3 m m 的扁平小滴，3 7 。c 放置数分钟，至小滴边缘刚刚干燥、中央扁 平时，加盖另- - c a f 2 窗片，上机( n e x u s - - 4 7 0 f t - - i r ) 检测，实验发现存在 残留n a c i 和水分的干扰。 黄继红等研究应用近红外分光仪( n i r o5 0 0 ，h a m a m a t s up h o t o n i e sk k ， h a m a m a t s u ，j a p a n ) ，每3 0 s 测量并记录1 次脑组织氧合血红蛋白( h b o ) 还原 血红蛋白( h b d ) 及总血红蛋白( h b t ) 变化值中发现，h b 0 2 一n t 与术后组织 学评分明显相关。研究结果表明，d h c a ( 低温循环) 中最低点持续时间( h b 0 2 n t ) 明显短；h b 0 2 一n t 和h b o 最小值与组织学评分有较好的相关性。赵军 等人通过红外光谱对氧合血红蛋白的吸收特征作为示踪物，探测大脑皮层的血 流量，采用红外技术可以替代现有的注射某些辐射性物质作为示踪诊断剂取得 了可靠的进展。 刘明杰，王钊等人利用傅里叶变换红外光谱法( f t i r ) 研究了人白血病细胞 h l 6 0 在全反式维甲酸( a t r a ) 作用下向粒细胞分化的过程。实验按下述方法进 两北t 业大学硕士学位论文 第一章绪论 行：f t i r 样品制备、光谱采集和数据处理大约l 1 0 个细胞离心收集后，经生理 盐水洗涤至少3 次，以除去培养基中的有机物，然后重悬在5 m l 中，滴在c a f 2 窗片上，真空干燥后，形成一直径为2 3 m m 的薄膜，供光谱测定用。同时取不 含细胞的培养基，同样处理，作空白试验。然后在s p e c t r u mg xf t l r 上采集样 品谱图，分辨率设定为4 c m ，扫描范围4 0 0 0 9 0 0 c m 一，每个样品扫描1 2 8 次。采 用软件进行谱图处理和计算，二阶导数采用9 点s a v “z k y g o l a y 平滑。 结果表明，分化后的h l 6 0 细胞f t i r 图谱发生了显著变化，体现在与蛋白 质、脂类、核酸和多糖等生物大分子相关的特征性谱带上。细胞内脂类物质烃 链增长，含量增加。指纹图谱区域( 9 0 0 1 3 0 0 e m 1 ) 的谱带随着分化进程呈现规律 性的变化。 韩伟等人采用利用高分辨傅里叶变换红外光谱( f t i r ) 初步得出该研究 能在分子水平上揭示出癌变细胞与正常细胞的明显差别，通过谱图解析，可直 接阐明引起谱图变化的主要原因、细胞癌变的可能机理，为肿瘤的早期诊断展 现了良好的前景。 高体玉，慈云祥采用v e c t o r2 2 型f t i r 谱仪( 德国b r u k e r 公司) ，分辨率设 定为4 c m l ，用空气冷却d t g s 检测器，每个样品扫描3 2 次，红细胞中的蛋白质 二级结构组成通过酰胺i 吸收带曲线拟台获得。具体方法按洛伦兹线型、噪音衰 减因子0 5 ，获得酰胺i 的去卷积谱，酰胺l 吸收带各子峰的吸收频率由其去卷积 谱和二阶导数谱获得，然后进行曲线拟合，拟合的r m s 误差均小于0 0 0 5 ，实验 发现，细胞谱学分析结果与细胞形态学观察结果具有一致性，另外，红细胞与粒 细胞和淋巴细胞的甲基和亚甲基吸收谱带完全不同，红细胞谱图中2 8 5 5 c m o 吸 收峰消失或变为肩峰，2 8 7 2 c m 1 , 吸收峰却增强。 王陆唐，黄肇明等人利用水分在1 9 4 u m 波长上对光能量收的特点，提出了 采用近远红外分光图像检测技术对人体汗水分布情况的观测方案，实验是使用 的红外摄像机是日本三菱公司t h e r m a l l m a g e r1 r m6 0 0 ，红外探测头采用 p l a t i n u m s i l i c i d e s c h o t t k y b a r r i e ri r c s d 方式，画面精度为3 5 万像素； s t r i d i n g - c y c l ec o o l e r 冷却方式，实验场所使用了2 盏5 0 0 w 卤灯，同时还使用了4 i 盏6 0 w 远红外辐射灯，用来提高周围可见光的照度以及增强远红外光线强度， 西北工业大学硕士学位论文 第一章绪 论 室内平均照度为2 0 0 0 1 x ，在摄像机镜头内插人中心波长为1 9 4 u r n 、带宽3 0 0 n m 带通滤波片，使其工作在1 9 4 u m 波段上。带通滤波片可以有效地消除来自人体 红外辐射对分光图像的影响。从获取的图片中可以看出，随着时间的变化，以 吸收水分试纸作参照，放在天平托盘中的试纸内的水分逐渐蒸发，图像的灰度 值也逐渐增大。 冯尚源，陈荣等人，利用n i c o l e t 7 5 0 型傅里叶变换红外光谱仪，分辨率设 定为4 c m ，通过人血红细胞傅里叶变换近红外拉曼光谱和红外光谱研究，基本 上确定了人血红细胞中特征官能团的归属，实验发现：不同拉曼频移的拉曼信 号强度随激发光功率呈非线性变化规律。实验方法是，血液样品装在直径为3 m m 的玻璃管内，采用9 0 0 方向散射，几何结构接收，在1 0 0 4 0 0 0 c m o 的范围内扫描 测试溶液，扫描1 0 0 次取平均值，绘制拉曼散射光谱图。 有应用红外光谱仪测定水分子结构的报道。r i g a s 等首先对结肠组织切片进 行了红外吸收谱检测发现正常组织与癌组织有截然不同的光谱特征，证明了这 种变化与癌细胞的相关性。 有研究表明癌细胞的生物大分了如蛋白质、核酸、脂质膜、碳水化合物及 糖蛋白功能基因的空间构像、构型、氯键结合力及糖蛋白数量的增减等改变与 其红外谱变化相关。 大肠癌筛检一直寻找一种简便、有效、无创的大肠癌筛检方法，由于红外 谱检测标准客观、易于掌握，每一张涂片扫描时间仅数十秒钟，l j 、时可阅片近 百张涂片，可大大提高检测效率。i r 技术除可检测分离纯化的细胞成分所产生 的特征性光谱外，还能分析复杂生物学标本如细胞悬液、体液、活检组织等在 不同病理生理情况下i r 光谱的变化，通过正常配位和同位素渗入等技术对结构 已知分子基团的i r 光谱分析，目前在6 0 0 4 0 0 0 c m d 频率范围内确定了5 0 7 0 个与 生物样本的化学基团、结构和空间构型有关的光谱。 b e n e d e t t i 等，通过一系列研究发现c l l 细胞i r 光谱的5 3 0 c m 。和9 6 6 c m 1 部位 有特征性改变。 傅立叶变换红外光谱分析技术作为一种快速非侵入性物理学方法，可在分 子水平上揭示肿瘤细胞与正常细胞的差别 西北工业大学硕士学位论文第一章绪论 盛剑秋，李世荣等人采用傅立叶变换红外光谱议分析胃肠脱落细胞实验发 现良恶性光谱的差异主要位于1 3 0 0 1 0 0 0 c m 1 频带上；正常细胞c 峰强度高于a 峰， 而癌细胞和中一重度异性增生细胞则相反。 生物学样本( 红外线) i r 光谱分析的主要优点在于： ( 1 ) 能发现出现病理改变之前的早期、细微的分子学结构和生化组成的变 化，敏感性很高； ( 2 ) 对样本的质和量无特殊要求的情况下，无需用试剂对标本进行染色或 其他处理，可以真实反映样本的本来结构面貌： ( 3 ) 实验过程自动化程度高，快速、简便，经济，重复性好； ( 4 ) 外周血淋巴细胞经分离、稀释、涂薄片干燥后不存在重叠和其他细胞 外成分的干扰，信噪比强。 缺点是i r 光谱是一项“平均化”的技术，只能反映样本中某一类物质的综 合信息。如能否通过示踪剂如特异性抗体、核酸探针等，使i r 光谱反映出某一 种具体成分的改变是值得探索的课题。 目前，通过i r 光谱技术与光学显微镜、荧光显微镜、核磁共振、x 线断层扫 描、正电子发射断层扫描和计算机数码技术等的联合应用，已能对细胞和组织 等标本进彳亍精确的显像和作图分析，由计算机重建出与该样本结构成分的含量 和分布相对应的三维i r 光谱图。 虽然，红外技术在生物医学领域的研究取得长足的进展，但是由于科学家 p e t e ra g r e ，r o d e r i c km a e k i n n o n 水分子通道的研究之后，针对水分子在生物细 胞体系中的运动规律的研究未见实质性进展的报道。 1 3 细胞学无创研究现状 一种新的昂贵的细胞实验仪器一流式细胞仪为无创法研究细胞学提供了全 新的手段，为研究细胞核酸、总蛋白量，分析或分选后的细胞可重复实验研究， 分选出多重染色的免疫细胞或同期细胞在无菌的情况下可继续培养实验。流式 细胞仪为细胞“活度”和药物敏感的筛选提供了新的技术平台。 曲北工业大学硕士学位论文第1 章绪论 1 3 1流式细胞仪工作原理 将制备的单细胞悬液( 或经特异荧光素染色后) 放入样品管中，在气体的压 力下进入充满鞘液( 磷酸盐缓冲液或生理盐水等) 的流动室。在鞘液和细胞悬 液存在一定压力差时，中心部位是排列有序的单列细胞，快速从喷嘴喷出，形成 细胞液柱。在喷嘴下方细胞液柱与入射的激光束垂直相交，其相交点即为测量 区。细胞通过测量区域时受激光照射而向空间3 6 0 。的所有方向发射散射光或荧 光。散射光主要有前向角散射光( 称o 。散射光) 和侧向散射光( 亦称9 0 。散射 光) ，其强弱与细胞的大小、形状、质膜和细胞内结构的折射率有关。荧光依据 荧光素的不同发出不同波长的荧光，显示不同染色。上述各种散射光或荧光信号 通过各种光学镜接收，并由检测器( 主要为光电倍增管) 转变为电泳冲信号，再 经整形、放大，由模数转换成数字信号，最后由计算机获取数据，贮存、处理和 分析，可得到多种信息参数，输出各种图形( 一维单参数直方图、二维点图和等 高图、假三维图等) 及统计结果。细胞分选器可使指定的细胞从细胞群体中分 离出来，细胞分选时，流动室在一定频率的超声振荡下，使喷嘴喷出的细胞液流变 成断续的液滴。根据需要使不同类细胞充以不同电荷，这些细胞经过正、负电场 时即可分选出带正、负电荷或不带电荷的三种细胞群。 1 3 2 流式细胞仪主要特点 ( 1 ) 简便快速 由喷嘴喷出的细胞液流速度可达7 m s ，每秒钟分析5 0 0 0 1 0 0 0 0 个细胞：细胞 样品处理简单，所有的人体或动物活细胞或经石蜡包埋的死细胞均可制备成单 细胞悬液用于流式细胞仪测定。 ( 2 ) 同时测量多参数 绝大多数流式细胞仪都可以同时收集两个方向散射光和两种以上波长的荧 光信号，获得物理和化学的多种参数。 ( 3 ) 灵敏度和分辨率高 前向角散射可分n 0 3 u m 的颗粒，荧光信号可分n 2 0 0 0 3 0 0 0 个异硫氰荧光 一 西北工业大学硕士学位论文 第一章绪论 素分子所产生的荧光；分辨率一般用变异系表示，前向角散射光和荧光分辨率。 般在2 o 以下。 分选细胞纯度和收获率高：一般分选纯度达9 9 ，收获率在9 0 以上。不 损伤细胞：分析或分选后的细胞可再用于实验研究，如分选出多重染色的免疫细 胞或同期细胞在无菌的情况下可继续培养。需要说明的是，多数流式细胞仪是 一种0 分辩率的仪器，只能测量一个细胞的总核酸、总蛋白量等，而不能测量细 胞中某一特定部位的核酸或蛋白量等，是这种仪器的不足之处。 流式细胞仪还是一类价格昂贵的仪器，美国产b e c t o nd i c k i ns o n c o p 需要 3 0 万美元；美国产e p i c s x lc o u r t e r 需要9 0 万人民币；德国p a r t e c 公司产需要 1 1 0 万人民币。 1 3 3 流式细胞仪存在的局限性 由于流式细胞仪采用将制备的单细胞悬液( 或经特异荧光素染色后) 放入 样品管中，在气体的压力下进入充满的流动室，而细胞液与入射的激光束垂直 相交，其相交点即为测量区，这种方法存在如下问题： ( 1 ) 细胞重叠，重叠的数量是随机的，由于重叠引起数据误差： ( 2 ) 需要荧光素染色，荧光素特性的自身差异和染色操作的误差。 本课题所提出的问题。采用流式细胞仪无法进行分析，因为流式细胞仪的 流动载体是采用磷酸盐缓冲液或生理盐水等，这些流动载体与水分子的红外光 谱的吸收谱带重叠。 1 4 本课题 1 4 1 本题 监测冷冻时细胞脱水的速率，植冰步骤，复苏步骤。在冷冻的过程中细胞 损伤的主要原因是胞内冰晶的形成，因此在冷冻保存过程中最重要的是减少细 西北工业大学硕士学位论文 第一章绪论 胞内水分含量，去除大量的水分。冻眠细胞复苏，是整个冷冻脱水操作过程的 逆转流程，这个过程的基本目的有两点：细胞再水合；移去渗透到细胞内的冷 冻保护剂。红外光谱水分探测为人类助孕技术提供一种监控细胞脱水的速率和 监控细胞再水合过程的技术平台，也为提高人类助孕成功提供了有效的辅助手 段。 本文的系统研究方案已获国家专利；专利号0 3 2 3 8 7 1 1 3 。 ( 1 ) 通过有效的观察技术观察细胞内水流到细胞外的量，细胞外水流到细 胞内的量，根据离子通道特性施加有效干预，控制在同一时间分子通过通道的 量，从而达到辅助调节自身容积的能力。将这种方法应用于临床研究大脑海马 组织对缺血、缺氧以及机械性损伤治疗方法和筛选有效药物是具有显著意义的。 ( 2 ) 针对脑细胞在高渗的环境中的反应作为研究对象，应用在非创伤性探 测技术有效的观察技术观察细胞内水分子量的探测。 ( 3 ) 还可用于研究氯离子通道与心律失常的心肌细胞作用机制。 ( 4 ) 研究肾小管细胞调节，观察分析细胞肿胀与水分子流动动力学规律。 ( 5 ) 本课题无创探测技术方案还可针对人类助孕技术其关键步骤。 1 4 2 本文主要工作 本课题无创探测技术和方法建立以分析细胞的功能或细胞受干预和抵抗干 预的特性，旨在该方法实用于以细胞为观察对象的从水分子入手的生理学研究 及药物设计与药物评价的系统。 提出一种以细胞为观察对象的细胞内水分子量化无刨探测方法；设计和制 造一套具有自主知识产权的红外光谱细胞水分探测仪；应用红外光谱细胞水分 探测仪完成针对生理细胞的水分探测并结合化学方法进行标定；建立细胞内水 分子量化无创探测方法的数学模型。 主要工作有如下： ( 1 ) 探讨红外光谱细胞水分探测原理，运用较为成熟的红外光谱探测技术， 提出一种新型细胞水分检测方法： 西北工业大学硕士学位论文 第一章绪论 ( 2 ) 研究红外光谱细胞水分探测仪系统构成，构建信号获取、信号处理系 统，设计并制造实验样机； ( 3 ) 提出无重合信号细胞流动排队方法，并跟据该方法设计了细胞排列的 细胞流道。排除环境因素干扰，优化整机构成； ( 4 ) 分别采用最小二乘法和b p 神经网络建立了细胞的红外光谱与其水分 含量之间关系的数学模型； ( 5 ) 介绍一种新型无活塞压缩微型制冷技术，为红外探测系统提出了一种 新型具有优势的微型制冷技术。 1 4 3 本文系统简介 红外光谱技术是依据某化学成分对红外光谱区的吸收特性而进行的定量测 定，若采用波长调制光谱法( w m s ) ，则有b e e r 定律的标度优点。在低水分状 况下，光强吸收很小，可以用b e e r 定律线性近似。微弱吸收信号和谱线线形之 间的线性关系允许运用线性最小二乘分析来决定w m s 线形的最佳解，这样得 到水分浓度的最优估计。在一般情况下，由于人工神经网络具有分布并行处理、 非线性映射、自适应学习和鲁棒容错等特性，对处理灰色、黑色体系与非线性 体系的信息有着突出的优点。 红外光谱细胞水分探测仪系统主要有：调制式红外光谱源、光探测器、窄 带光谱滤光、前置放大电路、信号变送电路、信号采集电路、信号处理与分析 计算模快、以及为了避免信号重叠影响单个细胞水分子含量的精确性计算采用 无重合信号细胞流动排队方法及其系统，同时还考虑到系统中光程环境流动空 气的水分子干扰的辅助抗干扰系统构成。该系统还必须满足细胞无创，使被探 测的细胞可以多次应用环境干涉和抗环境干涉的药品或其它条件的抗干涉方法 进行细胞实验的前后细胞特性数据分析。信号处理拟采用最小二乘和神经网络 两种方法进行。( 该方案已获国家专利；专利号0 3 2 3 8 7 1 l 3 ) 红外光谱细胞水分探铡仪原理框图，如图】1 所示： 红外光谱细胞水分探测仪系统构成结构视图，如图1 2 所示。 一 0 一 西北工业人学硕士学位论文第一章绪论 图1 1 探测仪原理框图 图】- 2 探测仪系统构成结构视图 l 一调调制电源；2 - 红外光源；3 真空室；4 一红外探测器；5 一细胞流道； 6 , 7 真空泵；8 - 试样管；9 - 信号线；1 0 计算机 西北工业大学硕士学位论文第一章绪论 1 5 本章小结 本章首先系统地介绍了红外技术在固、液体物水分检测中的应用，在生物 医学实验研究的应用以及细胞学无创探测研究现状。其次，说明了本课题红外 细胞水分探测仪研究的意义，即为细胞分子学离子通道动力学研究提供新的方 法，获得离子通过通道的时间，和同一时间离子通过通道的量数据。设计制造 一种红外光谱细胞水分探测仪系统，适合应用采用离子通道动力学理论设计药 物和药物实验的新平台。最后，本章提出了红外细胞水分探测仪的总体方案设 计，介绍了本文的主要研究内容。 西北工业大学硕士学位论文 第二章红外光谱细胞水分检测系统设计与研究 第二章红外光谱细胞水分检测系统设计与研究 1 9 7 6 年b e r ts a c km a n n 和e r w i nn e h e r 发表了应用膜片钳( p a t c hc l a m p ) 技 术论文，记录了单个离子通道开放之后的电信号，这一开创性的工作极大的促 进了离子通道的电生理学研究，并进而与分子生物学技术结合从分子水平对离 子通道开展研究。虽然离子通道理论与分子生物学技术结合从分子水平对离子 通道开展的研究取得长足的进展，但是真正应用到临床研究和药物设计离子通 过通道的时间探测或同一时间分子通过通道的量测量仍然存在困难。 本文提出一种以细胞为观察对象的细胞内水分子量化无创探测方法；设计和 制造一套具有自主知识产权的红外光谱细胞水分探测仪。 2 1红外光谱细胞水分检测技术原理 1 、红外光谱细胞水分探测仪的工作原理 从理论上讲所有温度高于绝对零度的物体都会产生红外辐射，它是由分子 运动能造成的，分子光谱分三种类型；仅由分子转动产生的光谱位于红外和微 波区，由分子振动和转动产生的光谱位于红外区，偶尔出现在可见光区，由分 子振动、转动和电子运动和共同产生的光谱在可见和紫外区和舒曼区，水分子 对上述光谱特定的频率都会出现选择性吸收。物质的分子通常处于稳定的低能 态、即基态。如果物质受到外来的激发、就会吸收外来的能量从基态跃进到较 高的能态、即激发态。两个状态之间的能量差决定了吸收光谱的特征。如果水 分子受到红外光辐射照射之后就会选择地吸收相应频率的辐射。使辐射发生能 量衰减，而水分子物质本身温度升高，因此物质的吸收光谱与其结构密切相关。 2 、水分子( 水分子) 的红外吸收机理分析 由于组成水分子的两个氢原子一个氧原子不在一条直线上，而是成1 5 0 度3 分的夹角结构，整个水分子不呈电中性、以电偶极子的形式存在，其最大的红 外吸收波长与偶极子极化程度有关，也就是说与水分子的积集状态有关，对水 西北工业大学硕士学位论文第二章红外光谱细胞水分检测系统设计与研究 分子来说，水与单分子形式存在，而固态或液态形式水则以( h 2 0 ) 2 、( h 2 0 ) 3 或数 目更多的形式出现，所于在选择吸收带时需要考虑聚集状态和所在物质介质的 情况聚合。水分子对红外辐射的吸收与分子跃迁到较高的振动能和转动能态有 关，h 和o 原子之间可能存在3 种相对振动、而整个水分子还有可能有各种旋 转运动、后者通过分子的质量中心的三条相互垂直的坐标来表证。 红外光谱技术是依据某一化学成分对红外光谱区的吸收特性而进行的定量 测定，如果采用波长调制光谱法( w m s ) ，则有b e e r 定律的标度优点。在低水分 的状况下，光强吸收很小，可以用b e e r 定律线性近似。微弱吸收信号和谱线线 形之间的线性关系允许运用线性最小二乘分析来决定w m s 线形的最佳解，这样得 到水分浓度的最优估计。在一般情况下，由于人工神经网络具有分布并行处理、 非线性映射、自适应学习和鲁棒容错等特性，对处理灰色、黑色体系与非线性体 系的信息有着突出的优点。 2 1 1 红外辐射及红外光谱 任何物( 质) 体，其内部的带电粒子都是处于不断运动状态的。当物体具 有一定的温度，即物体温度高于热力学温度o k 或摄氏一2 7 3 时，它就会不断 的向周围进行电磁辐射。物体的自发辐射，在常温下主要是红外辐射。红外辐 射俗称红外线或红外光，它是人眼看不见的光线。具有强烈的热作用，故又称 热辐射。 红外辐射和可见光、无线电磁波一样，也是以波的形式在空间( 同一介质) 进行直线传播的，并遵行逆二次方定律，也能反射折射散射干涉和偏振。它在 真空中的传播速度等于光在真空中传播速度，即有 c = 2 y , 盯= i 1 ( 2 1 ) 式中，z 为红外辐射的波长( c m ) ；，红外辐射的频率( h z ) ；盯红外辐射在真 空中1 c m 的长度内所包含的波的个数；f 光在真空中的传播速度。 热辐射的另一个特点是辐射光谱呈连续性，红外辐射和电磁波传播一样， 也有被传递介质吸收和散射等现象，使辐射能在传递过程中会逐渐衰减。 大气是红外辐射的主要传递介质。组成大气的主要气体是氨( n 2 ) ，氧( 0 2 ) ， 西北t 啦大学硕士学位论文 第二章红外光谱细胞水分检测系统设计与研究 氢( h 2 ) ，氩( a r ) ，而n 2 ，0 2 ，h 2 ，是空气中对称双原子分子，它们在红外 线传递过程中不会引起分子电荷的振荡( 或者说在振荡时不引起电偶极矩的变 化) ，因而不吸收1 5 u m 以下的红外线，即不会造成红外辐射在传输过程的衰减。 大气中除氮n 2 ，0 2 ，h 2 ，a t 外，还有其它气体分子、水蒸气及尘埃、固体 微粒、大气凝胶等，例如h 2 0 、c 0 2 、n 2 0 、c o 等多原子气体分子，在红外线 传输过程中会引起分子的电偶极矩变化，导致红外线的吸收和散射，使辐射能在 传输过程中逐渐衰减。 2 1 2 红外光谱传输介质的吸收特征 在非干燥大气中吸收红外线最厉害的也就是水蒸气( h 2 0 ) 和二氧化碳 ( c 0 2 ) ，h 2 0 在波谱1 3 8 u r n 、2 7 u m 、6 3 u m 附近有很强的吸收带。 红外光谱细胞水分探测就是根据红外线在传输过程中h 2 0 在波谱1 3 8 u r n 、 2 7 u m 、6 3 u m 、附近有很强的吸收带的性质设计的。 用吸收波谱法对物质浓度进行测定通常根据贝尔定律进行，其计算形式为 e = l n ( 争) = e c d ( 2 - 2 ) 式中，而为入射光强入射光的强度；，为出射光强；c 为物体密度； s 为吸收系 数；d 为样本吸收层厚度；e 为吸光度。 被测物体所吸收的光能量也可以按下列计算式 , 5 = j o j = l o 【1 一e x p ( 一6 c d ) 】 ( 2 3 ) 以上两式表明了光强，被测物体含水浓度的吸收指数规律。 红外光谱细胞水分探测仪是采用红外线透射式结构，根据红外光谱细区有 某些波长的红外辐射能量被水分子有选择的吸收，在1 3 8 0 n m 、1 9 4 0 n m 、2 9 5 0 n m 等均有吸收峰，来自膜脂的酰基链中甲基和甲叉基的弯曲振动产生1 4 5 2 c m 。和 1 4 6 7 c m 。峰，和来自膜磷脂中c h 伸展振动2 8 0 0 3 0 0 0 c m 1 范围内的峰干扰。 本系统选用了1 3 8 0 r i m 的波长作为检测波。 根据式( 2 2 ) 当一束光通过被检测的细胞之后，光强衰减，其入射光强与 西北工业大学硕士学位论文第二章红外光谱细胞水分检测系统设计与研究 出射光强符合l a m b e r t b e e r 定律，可将式( 2 2 ) 写成 ，= i o c x p 口 ( c l 一6 ) x ( 2 3 ) s = 1 式中，为射出光强；j 。为入射光强；g 为细胞f 的浓度：x 为光束透射细胞的长经 a 。为波长的光对成分的吸收系数；b 为与波长无关的散射系数。 根据式( 2 3 ) 可以测得透射光强相对于入射光强的变化，从而推出被测细 胞的含水量。 2 2 红外细胞水分探测流程步骤 本文设计的红外细胞水分探测器系统，如图2 1 所示。其主要有红外源、调 图2 - 1 红外细胞水分探测器结构框图 l - f 2 ，b n ；2 - 调制器；3 - 滤光片；4 - 真空泵；5 - 石英毛细管；6 - 红外探钡器 7 排空真空泵；8 试管；9 抽吸真空泵：1 0 收集器 制器、滤光片、真空腔、毛细管、红外探测器、真空泵和收集器等构成。红外细 胞水分探测器的流程如下： ( 1 ) 细胞制各( 红细胞分类、白细胞分类、淋巴细胞分类、心肌细胞分类 一1 6 一 西北工业大学硕士学位论文 第二章红外光谱细胞水分检测系统设计与研究 等等由医学专业完成) ； ( 2 ) 将分类细胞与流动载体混合( 流动载体采用不含水、不含与水分子吸 收相同的红外波谱的溶液、对细胞无损伤溶液) ； ( 3 ) 启动红外源； ( 4 ) 启动调制电机； ( 5 ) 启动信号放大器及前放电路； ( 6 ) 给红外探测器供电( 使红外探测器处接受状态) ： ( 7 ) 将红外探测器信号线与计算机连接，开启计算机，使其处读数据状态； ( 8 ) 将制备的细胞与流动载体混合液加入试管内； ( 9 ) 开启抽吸真空泵。 抽吸真空泵开启之后细胞与流动载体混合液从试管经石英毛细管流向收集 瓶，流动途径红外源透射光束，当细胞与红外源透射光束相交时，红外源透射光 经细胞的光信号被红外探测器获取，红外探测器获取的信号经前置放大器降噪和 信号放大输出至计算机的信号采集卡，由计算机读入数据储存器，经过数据处理 计算出细胞的水分含量。 在抽吸真空泵开启之后细胞与流动载体混合液从试管经石英毛细管流向收 集瓶，需要二次使用同一组细胞时可以从收集瓶中取出，经过适当的处理或再经 过药物对细胞进行实验之后可以再次探测水分实验，以两次数据的比较对药物作 用细胞膜的药效进行评价。 为了避免光路系统空气中的水分干扰，特别是防止石英毛细管管壁凝露将细 胞流道( 石英毛细管) 处于真空腔内，因此需要将石英毛细管穿过真空腔。 2 3 红外源器件的选型 红外辐射，俗称红外线，它的波长范围五= o 7 6 t 0 0 0 u m 。标准辐射源，它 包括绝对黑体模型、能脱斯灯和硅碳棒等：工程中的红外源，包括碳弧灯、钨 灯、氙灯、电发光辐射器、电加热的杆状或面状的辐射器、气体加热辐射器等。 能脱斯灯是一种用锆、钇、钍和其它混合物烧结成直径卜3 m m ，长2 0 一3 0 啪 的圆柱体，低温时不导电，当加热至4 0 0 。c 时变成导电体，如果在继续加热通电 西北工业大学硕士学位论文 第二章红外光谱细胞水分检测系统设计与研究 时，能脱斯灯的有效温度( 在特定波长上与该辐射具有相同光谱辐射亮度的黑 体温度) 约2 1 0 0 k 。能脱斯灯常用于2 1 4 u m 波长的分光光度学中进行相对测量。 绝对黑体模型是一个抽象的概念，这种理想的辐射体是无法制作的