（植物学专业论文）拟南芥突变体atsuc3的鉴定及其生理特性的初步研究.pdf

独创性声明 本人声明所黑交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特嗣加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了磺确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 导师签名； 时间：汐石年 时间：肿 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产投为淀阳农、监大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保瞬送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存。汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅臼对外发表。 ( 保密的学位论文在解密厢应遵守此协议) 研究生签名：孬驾啦 黝躲乏给参军 珂，、厶z j 时闻：汐# 年 时间：沙萨 g 月厂日 6 甓哆鼹 曰 曰 哆 侈 月 月。 缓彳 良，2 勤狐 摘要 蔗耱是高等植物中碳永仡合物最主要的转运形式，对于植物的生长发育至关璧螫。 而檬物体内蔗糖的转运主要依赖蔗糖转运蛋白。因此对于蔗糖转运蛋自基因的研究具有 重要意义。本研究逶过p c r 法鉴定爨拟南芥蔗糖转运蛋白基鞭t d n a 插入纯合突交体 a f 刚c ? ，即一f 兜胜尹，并对其生理特性进行初步研究，探索拟南芥蔗糖转运赞白基因家 族成员爿 定3 生理功能的提示信息，为该家族蛋白功憨豹研究提供参考。 首先，利用“双引物”p c r 法鉴定出a s 了突变体，并对鉴定试验所使用的p c r 反 应体系进行了优化：然底筛选最佳激素浓度配比的培养基军日扑糗体进行野生激和a t 鲥。 愈伤组织的诱导；并比较了野生型和a t s ，卵突变体在槭株及愈伤组织水平上的形态学 差昴。此外，我们还利用高效液相色谱法( h p l c ) 检测了丑s 凇了植株及其簸伤组织对 蔗糖的吸收情况：并戳野生垄植株及其愈伤组织作为对照，测定了干旱胁迫 ( 4 0 p e g 一6 0 0 0 处理) j 苟低温( 4 恒温) 处理下a f s “甜植株及其愈伤组织部分生理特 性豹变化。试验结采及结论如下： 1 “双引物”p c r 法鉴定效果优于“三引物”p c r 法。优化后反成体系的主要参数 为3 。om m o l m 一+ ，o 2 0 矬n o l l “d n t p s ，o 。5hm o l t l 4 弓| 物，退火温度为5 8 ，3 0 个循环； 2 采用添加0 5m g l 2 ，4 0 ，o 0 5 m g + 0 1k t 的b 5 壤葵基，以具时柄的健康叶片 作为外植体诱导愈伤组织，可以在短时期内获得大量生长状况良好的a t s “田愈伤组织； 3 a 括脚檬株及其愈伤组织均可以吸收蔗糖，但吸收量低于同等培养条 牛下的野 生型植株及其愈伤组织。说明4 心啷基因的编码产物a t s u c 3 可能参与蔗糖的吸收、 转运或代谢过程； 4 在闷等培舞条馋下，a t 蒯甜植株及其愈伤组织的生长状况略好于野生型植株及 其愈伤组织，但差异不明显。野生型愈伤组织与矗r s “甜愈伤缎织之间的形态学差异较 檀株闻的形态学蓑具更为骧显。 5 干旱胁迫条件下，未发现a t s “印植株及其愈伤组织与野嫩型对照之间存在显著的 生理差异； 6 低温处理条件下，未发现a s ? 植株及其愈伤组织与野生型对照之问存在显著的 生理差异。 关键词：拟南芥，蔗糖转运蘸白，占s 簖0 高效液相彘谱( h p l c ) ，干旱胁追，低温 a b s t r a c t s u c m s e ，a s 1 1 eu p p c 肌o s tp a t t e mi nc a r b o h y d r a t et 舢s p o 撇t i o n ，i se s s e n t i a lf o rt h e g w 睡a n 畦如v e l o p m e n t0 f 撼窖h e rp l a n s 。a 蠡m i l yo fp r o t e i n sc a l l e ds u c r o s e 订随s p o 哟r s ( s u t s ) r c g u l a t e st 1 1 et r a l l s p o r 嫩i o no f s u c m s e t i l e 叫- o r e ，i ti so f g r c a ti m p o n a n c et os m d yt h e 矗m c t i o n so fs u c f o s et r a n s p o r t e i n 啦i ss 锄y 删船簖3 ( h o m o z y g o l l s | 瑚叽a _ 沧dl i n e sw i 重h 蚤d n a i n s e r t i o n si nb p mc h r o m o s o m e s ) w a si d e n t i 雠db yp c r m c a n w h i l e ，t l l er c s u l t so f i d e n t i f i c a t i o no fm u t a n t sb y t 、v op 出n e r sm 酬胁d a n d 弧艚ep r i m e r sm e t h o 掣r c s p e c i v 或y w e r ec o m p a r c da r 迸t l ef 沁t o r si nc o r r e s p o n d i n gp c rs y s t e mw e r eo p t i m i z e d i no r d e rt ou n c o v e rt h ep o s s i b l e 曲y s i o l o 西c a l 觚i o no fa 心u c 3t h a tb e l o n g st ot h e 4 瑚6 肋瑚括f 触，晒撇s u c f o s et r a 畦s p o n e rg e n ef h m i l y ，w es c r e e n e dd i f 凳r e n tc o m b i n a t i o no f h o l o n e si nt h em e d i u ma r dd i 饪b r e me x _ p l a n l sf o ri r 坩u c i n gd f s “c 3c a l l u b w ea l s o p r e l i m i n 韪纛l yi n v e s t i g a 托dp 缸s i o l o g - c a lc l a 携c 电e r si nb o mp l a n t sa n dc a l l u so fm u 纽n t 8 、i 也 稍l dt y p e sa sc o n t r o l s t h es u c r o s ea b s o r 州o nw a sd e t e r r n i n e db yh p l c ，a n dc h a n g e so f 曲v s i o l o g i c a l 咒s p o n s e so f 口括们3 露a n t so rc 醛l t l sw e f ed e 觚i n e d 雌d e rd r o u g 弧s t f e s s ( w i 也 4 0 p e g 6 0 0 0 仃e a n e m ) o r l o wt 锄p e r a t u r e ( 砸t l l4 t r e a 姗e n 幻 o 盯r e s u l t ss h o w ( 1 ) i ti sb e t t e r 地a d o 辞地e 1 、v op 五m e 塔m e 睡o d p c r 圭oi d e n t i 旬 口捃“订t h a i l t h r e ep r i m e r sm e t | l o d ，a 芏l dm eo p t i m i z e df a c t o r si np c ra r e ：3 0m m 0 1 l q m + ，0 1 2 0m m 0 1 l “d n t p s ，o + 5 l lm o l l 1 p d m e r s ，h y b r i d i z i n gt e m p e r 8 t u r e5 8 ，3 0c y c l e s ； ( 2 ) t h ea p p r o p r i a 把r a t i oo fc o n c e m r a t i o n so fh o r m o n e s ( 2 ，4 一d ：k t ) i nt h em e d i u mf o r i n d u c i n g 口船w jc a l l u si so 。5m r l - i ：o 0 5 m g l - i ，a 1 1 dm eb c s tk i n do f e x p l a l l t sa r cl e a v e s 埘t h p e t i o l e s ：f 3 ) t h e 辞括材c jp l a n t sa n di t sc a l l u sc a n 酌t ha b s o r bs u c r o s ea d d e d ，b u tt h ec o n t e n t so f s u c r o s ea b s o r b e db ym u t a n t sa r eai i “l el e s st h a nt h a ta b s o r b e db yc o r r e s p o n d i n gw i l dt y p e c o n t r o l s ，w h i e hi m p l i e sm 越4 媾敞om i 馥p l 料ar o l ei ns u c s ea b s o r p t i o f l ，t r a n s p o r t a t i o no r m e t a b o l i s m ：( 4 ) m eg r o w t ho fw i l dt y p ec o n t r o l sa r eb e n e rt h a n 口船“c 3p i a n t sa 1 1 di t sc a l l u s ， a n dt 沁m o h o l o g i e a ld 谨f e r e n o e sb e t w e e 珏斑ec a 圭l u so fm u 瞻n t sa n dw i l dt y p ec o n t f o l s 鑫r e m o r co b v i o u s1 1 1 a nt h o s eb e t w e e nt h ct w ok i n d so fp l a i l t s ：( 5 ) u n d c rd r o u g h ts t r e s s ，n o to n l y i np l a n t sb u la l s oi nc a l l u s ，n os i g n i 彝c 踟硅d 疆融r e n c e si nt h ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e 转黜 o b s c r v e db e t 、牝e nm u t a n t sa n dw n dt y p ec o n t r o l s ；( 6 ) u n d e r1 0 wt e m p e r a 【n l r e ，n o to n l yi r i p l a n t sb u ta l s oi nc a l l u s ，n os i g n i 6 c a n td i f r e r c i l c e si nt h ep h y s i o l o g i c a lc h a 豫c 把r s8 r e o b s e n ，e db e 哪e e nm u t a n t sa n dw i l dt y p ec o m o h k e y w o r d s 爿舶6 溉) p 5 括f 勉妇n d ，s u c r o s et r 髓s p o 鹏r ，n f s 纰3 ，h i 曲p e f f o n n 觚c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，d r o u g h ts t r e s s ，l o wt e m p e r a t u r e 2 垫里窒些查兰堡主堂堡笙壅 一 刖罱 蔗糖是植物光合作用同化产物最主要的转运形式其转运的方向和速率对于高等植 物的生长发育至关重要。研究表明，蔗糖跨膜转运及其在体内的分配过程与蔗糖转运蛋 白( s u t s 或s u c s ) 密切相关( t r u e r n i t 和s a u e r ，1 9 9 5 ；b a r k e re ta 1 ，2 0 0 0 ：d r e y e re t a l ，1 9 9 9 ) 。因此开展蔗糖转运蛋白的相关研究对明确植物营养运输和分配机制及指导 生产实践均具有重大意义。 目前已从不同植物中确定了3 0 多种编码蔗糖转运蛋白的编码序列，但对其功能的 研究尚处于初期。研究主要方法包括：( 1 ) 克隆相关基因，进行异体过表达研究( y e re t a l ，2 0 0 0 ：m e y e re ta l ，2 0 0 4 ：s c h u l z ee ta l ，2 0 0 3 ) ；( 2 ) 利用t d n a 插入突变技术， 获得目的基因敲出突变体( b o u c h ee ta 1 ，2 0 0 1 ；p a r i n o ve ta l ，2 0 0 0 ) 再通过筛选 出的纯合突变体，研究相应的功能( m e y e re ta 1 2 0 0 4 ) 。值得一提的是。利用该研究 策略，已在植物k 通道物质运输的研究中取得成果( 陈俊伟，2 0 0 1 ；d e e k e ne ta l ，t 2 0 0 2 ) 。与克隆的研究方法相比，突变体研究拥有更多优势( m e y e re ta 1 ，2 0 0 4 ) ，已逐 步成为反向遗传学研究的主要手段( b o u c h ee ta 1 ，2 0 0 l ；p a r i n o ve ta 1 ，2 0 0 ( ) ) 。 拟南芥( 月，a 6 f 咖s j s a j 妇) 因其独特的生物学、遗传学及分子生物学特性残 为当今植物分子遗传学、发育学、生理学及生物化学研究领域中理想的模式植物之一， 被誉为植物界中的“果蝇”( d v o r a k 和g o r h a m ，1 9 9 2 ) 。以拟南芥为试材所取得的研 究成果，可用以指导对其它植物的研究( 黄娼和李家洋，2 0 0 l a b ) 。因此利用拟南芥作 为模型进行蔗糖转运蛋自的研究具有很好的可行性和普适性。 迄今为止，已在拟南芥( ，矗6 幽肿拈f 舾，a 月a ) 的基因组中鉴定出9 个编码蔗糖 转运蛋白的基因( 一f 5 比。，省f 删( m e y e re ta 1 2 0 0 0 ) 。其中已取得结果最多的是 彳r 肜，和一f 毗2 ( g u e ne ta 1 ，1 9 9 2 ：i m l a ue ta l ，1 9 9 9 ：c h a n d r a ne ta l ，2 0 0 3 ； i v a s h i k i n ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ，而c 。弛。h 似p 的研究报道较少。近年来，该家族中基 因和蛋白质结构最为特殊，功能最具争议的成员 乳四r 益受到关注( b a r k e re t a l ，2 0 0 0 ：m e y e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。该基因的表达位于维管组织附近的细胞和心皮细胞中， b a r k e r 等( 2 0 0 0 ) 认为a t s u c 3 具有蔗糖转运的功能，而 i e y e r 等( 2 0 0 4 ) 则认为a t s u c 3 在植物体内发挥感知蔗糖的作用，同时可能还具有促剥t 荚开裂的作用( y e re ta ， 2 0 0 0 ) 。目前，关于d 鼬功能的信息多来自酵母突变体异体表达的研究结果( b a r k e re t a i ，2 0 0 0 ；m e y e re ta 1 ，2 0 0 0 ：m e y e re ta l ，2 0 0 4 ) ，而针对拟南芥植株本身的研究 则主要集中于对a f 蹴。表达规律的探索，尚未见生理功能的相关报道。 基于t d n a 插入突变技术的反向遗传学研究策略是研究“c 仍生理功能的一个系 统和直观的途径( b o u c h ee ta l ，2 0 叭；m e y e re ta l ，2 0 0 4 ：p a r i n o ve ta l ，2 0 0 0 ) 。 奉研究以模式植物拟南芥为试材，利用p c r 技术鉴定t 龇铘基因缺失纯合突变体， 即8 5 u o 盘依据反向遗传学研究策略，通过比较a 5 u o ? 植株与野生型植栋在生理特性 的差异，以期从基因表型出发研究h 蝴基因的缺失对植株生理代谢的所产生的影响， 为深入研究该基因的功能提供参考。 为深入研究该基因的功能提供参考。 文献综述 文献综述 1 。拟南芥蔗糖转运蛋蠢的研究进展 1 1 植物体中的蔗糖与蔗糖转运蛋白 高等梭物是由鑫养器官( 称作源，如成熟叶片) 和异养器官( 称为痒如根系、花、 果实等) 构成的自养生物。异养器官需要鑫算器官的光合产物来维持生长和发育( d r e y e r e ta l ，1 9 9 9 ) 。蔗糖在植物生长发育过程中发挥着举足轻霞韵作用( f a r r 8 re t8 l ，z o ) ， 它是光合阚化碳的最主要转运形式，是“库”代谢的主要基质，是许多果实中糖分积累 的主要形式，因此也是暴实品质形成的因予之一，此外蔗糖还是细魏代谢的调节因子， 可能通过影响基因表达发挥作用( j a n g 和s h e e n ，1 9 9 4 ；k o c h ，1 9 9 6 ；c h e n 鹳p p ae ta l ， 1 9 9 9 ) ；同时，蔗糖还具有信号功能，是协调植物源库关系的信号分子( k o c h ，1 9 9 6 ： s m e e k e n se ta l ， 1 9 9 7 ) 。 在植物体中，蔗糖从“源”转运到“库”，并在“库”中贮存、代谢。蔗糖在“源” 和“痒”之间的运输是通过韧皮部来宛成豹。蔗糖溶解在韧皮部豹汁液牛，以溶液形式 进行长距离运输至楗物体各部位，为非光合器官提供能量和碳源( c h i o u 和b u s h ，1 9 9 8 ； s m e e k e n se ta l ，2 0 0 0 ；t h o l l l a se t8 l ，1 9 9 4 ) 。源时片中的蔗糖一经合成便被装载入韧 皮部中的筛管伴脆复合体并通过长距离运输到库器官中进行贮存或代谢( l o r r a i n ee t a l ，2 0 0 0 ；s y l v i ee ta l ，1 9 9 9 ；赵智中，2 0 0 1 ) 。穗蔗糖的跨膜运输及其在植物中豹 分配过程中，蔗糖转运精臼( s u t s 或s u c s ) 发挥着极为重要的作用( l o r r 8 i n ee ta l ， 2 0 0 0 ) ( 闰1 ) ( w e b e re ta l ，2 0 0 3 ) 。 图1 ，蔗糖在植物体中的转运及蔗糖转速蛋白 f i g lt t 糊s p o 蛙o f $ u c | d 耋np l 黝t s 拍d 鞠c 辩t 聊体p o r e 牯 自从1 9 9 2 年r i e s m e i e r 等( r i e s m e i e re ta l ，1 9 9 3 ) 在菠菜中蓠次鉴定了编码蔗 糖转运蛋白的c d n a 痒捌以来，迄今为止，忍经程菠菜、芹菜、胡萝卜、葡萄和拟南芥 等十多种不同的植物中已确定3 0 多种编码蔗糖转运蛋自的c d n a 序列。研究发现，所有 4 沈阳农业大学硕士学位论文 植物蔗糖转运蛋白序列都有关联，该家族不同成员之间在氨基酸组成上具有极高的同源 性，它们郯属于阋一个基因家族( s a u e r 和s t 0 1 z ，1 9 9 4 ) 。 根据蛋白璇结构与特性分析，蔗糖转运摄自属于主要易化予超家族( m a j o r f a c i l i t a t o rs u p e r f 绷i l y ，m f s ) 中的一员( s c h u l z ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。是植物特有的 ( l o r r a i n ee ta 1 2 0 0 0 ) 。蔗糖转运蛋白的疏水氨基酸含量高，燕赢疏水性跨膜蛋白 ( 张雷，2 0 0 1 ) ，这有利于跨膜结构域的形成。它含有1 2 个跨膜结构域，分子中部有一 个大的露向髓震豹亲水臆浆环( 髯e b e re ta l ，2 3 ：l o r r & i n ee ta l ，2 0 0 0 ：s c h u l z e e ta l ，2 0 0 3 ：陈俊伟，2 0 0 1 ) ，将蛋融分为备含6 个跨膜结构域的两部分。这种6 一环一6 一 结镌在楗物中亮度保守( r 8 l l a 和弹a l s h ，2 0 0 4 ) 。运用攀尧隆抗体与大肠柽蘩x 曦蓥体 展涿技术分系证实蔗糖转运蛋白结构中c 、n 端均位于细胞质侧( n 0 i r a u de ta 1 ，2 0 0 0 ) ， 如图2 ( l o r r a i n ee ta l ，2 0 0 0 ) 。 围2 蔗糖转迳蛋白豹= 级结构( 鞋p l l i s 2 为学i ) f i 9 2s e c o n 妇r ys t r u c t u r eo fs u c r o s et m n s p o r t e r ( e 。g 弛s u c 2 ) 蔗糖转运蛋白的分予量大约为5 5k d ，慰于蔗糖的亲和力( 隐毽) 基本都在o 3 2 州范围内。其作用依赖于能量，并对疏质子剂敏感，说明它们是h + 蔗糖共转运蛋白 ( s l j c r o s e h + c o t r a n s p o r t e r ，s u c ) ，其转运作用依赖跨膜的质子动力势( r a f l l aeca l ， 2 0 0 4 ) 。多数蔗糖转运鬣白对p h 高度敏感，当p h 降低时，其对蔗糖的转运效率提高。 蔗糖转运蛋白基因在植物不同缎织中的表达也不同。从蔗糖转运蛋白家族不同成员 在植物体中不辩的定位可推断它们在植物生长发育过程中所发挥的作用也是多种多样 的。首先蔗糖转运蛋白可以介导蔗糖的跨膜运输，可以调节蔗糖的运输，还可能产生渗 透梯度。此外相应的蔗糖转运蛋自还在种子葫发尚花器富发育过程中发挥作用 ( l o r r a i n ee ta l ，2 0 0 0 ) 。基因表达研究发现蚕豆中的蔗糖转运蛋白v f s u t l 也在种子 发肖过程中发挥作用( w e b e re ta l ，1 9 9 7 ) 。还脊研究表明，有些蔗糖转运蛋自可殴在 植物中起到蔗糖感受器的作用( 陈俊伟，2 0 0 1 ) 。 蔗糖转运蛋自受到不同水平的调节。作为 + 蔗糖翔彝转运蛋皇，对手 l + a 罩p 酶活 性的调节可能迅速引起蔗糖转运动力学性质的改变( 陈俊伟，2 0 0 1 ) 。蔗糖转运蛋白的 转运活性还受到转移的蔗糖信号控制，这秘控制可能递过蛋囱磷酸化进褥( w e i s e se t a l ，2 0 0 0 ) 。蔗糖转运蛋白与发育事件相联系( w e b e re ta l ，1 9 9 7 ) 。s a k r 等( 1 9 9 7 ) 文献综述 发现切割和衰老均增加了蔗糖转运蛋白的m r n a 水平，蛋白质酶联免疫吸附测定表明衰 老增加了存在于质膜上的转运蛋白量。这些结果暗示蔗糖转运蛋白受转录和翻译后调 节。功能试验证实，韧皮部缺少k + 通道的甜纪争l 突变体植株对于蔗糖的分配效率远 不如野生型( d e e k e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。说明蔗糖转运蛋白的转运效率还受到其它蛋白家 族的影响。许多生物及非生物因子( 如光、温、水分胁迫及盐胁迫、植物激素以及病原 菌侵害等) 也可以影响蔗糖转运蛋白基因的表达( l o r r a i n e d ee t a l ，1 9 9 3 ；张雷，2 0 0 1 ) 。 此外蔗糖转运蛋白还受到m r n a 的翻译和翻译后调控，如蔗糖转运蛋白的日间调控，磷 酸化与脱磷酸化作用等( l o r r a i n e d ee ta l ，1 9 9 3 ) 。 1 2 模式植物拟南芥及拟南芥蔗糖转运蛋白基因家族 拟南芥是十字花科拟南芥属的一种小草本。近年来，植物科学中许多有价值的发现 几乎都是以拟南芥为实验材料取得的，拟南芥已成为一种典型的“模式”植物，被誉为 植物界的“果蝇”( 毛建民和李俐俐，2 0 0 1 ；袁月星和李巧丽，2 0 0 3 ：f r e d e t i c k ，2 0 0 2 ： b i o l o g ya n n u a lm a i nm e e t i n g ，2 0 0 5 ) 。它具有显花植物的全部特征和植物遗传研究的 模式物种的所有特点( 陈敏和白书农，1 9 9 5 ：陈璋，1 9 9 4 ；樊妙姬，1 9 9 2 ) ：( 1 ) 生活 周期短，利于突变体筛选；( 2 ) 种子体积微小，繁殖量大，植株矮小，便于在实验条件 下大规模种植；( 3 ) 基因组小，二倍体细胞中仅含有5 对很小的染色体，利于开展植物 遗传分析和基因定位等方面的研究工作。拟南芥基因组测序已经完成，而且有大量的 t d n a 插入突变体，从中可以获得所有的蔗糖转运蛋白基因及推测的转运蛋白基因敲出 的突变体，因而是反向遗传学方法研究植物转运蛋白基因的最理想的材料。 拟南芥基因组包含9 个蔗糖转运蛋白基因( 彳& 纠彳 & 仞) ( s t a d l e re ta 1 1 9 9 9 ： s c h u l z ee ta l ，2 0 0 0 ；m e y e re ta l ，2 0 0 0 ；j u e r g e n s e ne ta 1 ，2 0 0 3 ；m i c h e le ta 1 ， 1 9 9 8 h t t p ：p l a n t s t s d s c e d u c g 卜b i n s e a r c h c g i ? d b = p l a n t s t f a i i i i l y _ i d = 5 2 6 1 1 ： n o i r a u de ta l ，2 0 0 0 ) ，它们组成了拟南芥蔗糖转运蛋白基因家族( 5 劳砌j y ) 。这9 个基因分别位于三个不同的染色体上，有不同的外显子和内含子形式。除爿f 凹和 爿f 鼬田外，开放阅读框架的最终大小是非常相似的。目前为止，其中的5 个基因产物已 经被克隆( 爿f & 纠一f 5 z 仍) 。这5 个蛋白的结构基本都符合前述蔗糖转运蛋白的基本 结构( 图2 ) 。此外它们具有相似的生化特性，对蔗糖的亲和力在o 5 1 1 5f l l m 之间， 等电点均较低，都受巯基抑制剂p c m b s ( 对氯高汞苯磺酸) 的抑制( l u d w i ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 此外，拟南芥蔗糖转运蛋白家族各成员还具有其各自的特点。 编码a t s u c l 的基因月研定位于花组织中，与花粉管的生长和花药的开裂有关 ( l o r r a i n e d ee ta l ，1 9 9 3 ) 。 a t s u c 2 对于蔗糖吸收的k m 值在0 3 2 删之间( r a m ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。是一种高亲 和力蔗糖转运蛋白。a t s u c 2 位于主脉中负责蔗糖韧皮部的装载与卸出。研究表明爿t 熨 2 可能是该基因家族的主效基因。目前己通过基因敲除法( t d n a 插入突变) 获得a t s u c 2 功能缺失突变体，已有研究表明该纯合体在无糖培养基上生长受抑制，在有糖培养基上 可生长开花但不结实。分析被感染的根系表明蔗糖转运蛋白a t s u c 2 被病原物激活， 是第一个鉴定出的可被病原物激活的双糖转运蛋白。 爿蹴了基因与该家族其他成员显著的不同就在于：( 1 ) 含有1 3 个内含子，而此基 因家族的其他成员只含有2 4 个内含子。( 2 ) 彳t 5 z 仍编码的产物蛋白a t s u c 3 的分量高 于其他成员，这是由于彳 舭? 基因上第l 和第9 内含子之间插入了3 0 5 0 个氨基酸造 成的。( 3 ) a t s u c 3 含有较低的密码子偏好性，与k o z a k 序列的保守性较低。在酵母中的 表达试验表明它可能作为一种氨基酸感受器。b a r k e r 等( 2 0 0 0 ) 报道a t s u c 3 不能修复 酵母蔗糖吸收功能缺失突变体s u s y 7 “r a ，说明此蛋白在酵母中可能没有功能。因此， 6 沈阳农业太掌硕士学位论文 有人认为a t s u c 3 在植物中起到蔗糖感受的作用而非蔗糖转运的作用( w e i s e s 等，2 0 0 0 ) 。 然程露，y e r 等证明了a t s u c 3 可以调节蔗糖转运入酵母。推测a t s u c 3 可以续i 量蔗糖转 运效率( h t t p ：w w w p l a n t 曲y s i 0 1 o r g c g i d o i ) 。最近的报道显示a t s u c 3 实际上是 一个低亲和力蔗糖转运蛋白( s h u l z ee ta l ，2 0 0 0 ) 。用a t s u c 3 和高亲和力的s t s u t l 构建的嵌会蛋白证实是氨基酸末端丽非中心环在决定底物亲和力中起重要作用( s h u l z e e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。对在面包酵母中异源表达的a t s u c 3 进行功能研究，去掉胞浆环并来对 此装白的动力学性质有任何影响。说瞻既中夹魏浆环在运输上功能豹独立毪。它对藏糖 运输来说不是主要的。推测此中央环可能与其它功能相关，比如与为调节目的而产生的 蛋彝质与爨自质之闻的相互馋用相关( s c h u l z ee ta l ，2 3 ；r e i n d e r se t8 l ，2 0 0 2 ) 。 运用r n a s e 保护分析a t s u c 3 定位的器官特异性，发现其m r n a 在拟南芥所有器官中都 存在( s c h u l z ee ta 1 ，2 0 0 3 ；r e i n d e r se ta l ，2 2 ) 。一塔d 缈盔许多痒缨胞及组织如 保卫细胞、毛状体、萌发中的花粉、根尖、发育中的果实或拖叶中都有很强的表达。通 过a t s u c 3 特异抗血清进行的免疫定能发现，a t s u c 3 定位于拟南芥韧皮部中但不与俜胞特 异定位的a t s u c 2 共存( 骓e y e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在对于种荚开裂、种子数出十分重要的心 皮表皮下层细胞中及叶肉韧皮部细胞层中也鉴定出a t s u c 3 蛋白，说明a t s u c 3 与蔗糖由叶 肉寓韧皮部运输过程巾匿收灌漏豹蔗糖及与秘葵犴裂有关( m e y e re ta l ，2 0 0 4 ) 。 t s 沉3 还存在于雄蕊中( s c h u l z ee ta l ，2 0 0 3 ；r e i n d e r se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。对于a t s u c 3 一启动子： g u s 转基因接株的砑究发现在染色前切割制成的叶片或蒸的切片经染色后可在各部位褒 察到很强的g u s 染色。说明彳尉仞睹动子启幼的g u s 表达可能被伤害增强。i 司样，在拟南 芥愈伤缀织中也观察到缀强的彳f 妫唆达( 撼e y e re ta l ，2 0 0 4 ) 。此外，a t s u c 3 可熊负 责向受到伤害的细胞中更好的输送碳水化台物或者将胞外碳水化合物转移到受伤害的 细胞中来降低病原菌感染的机会。在未受到伤害的细胞中，a t s u c 3 可能有助于将由于扩 散造成的蔗糖损失降至最低井使快速生长的细胞的碳水化合物供应达到最佳( h t t 口： w w w p l a n t p h y s i 0 1 o r g c g i d o i ) 。对于a t s u c 3 报告基因在伤害后表达增强的研究， 第一次找到了一种参与胁遮响应的獠物蔗糖转运馨自( 醚e y e re ta l ，2 0 0 4 ) 。 目前关于月熨枕f ，4 f 树l 的研究报道较少。已知月t & 览耳的表达在源叶的小叶脉中 活跃，同时一f 僻也在痒组织，妇幼畸、花和果实中表达( 并e i s ee ta l ，2 0 ；b 8 r k e r e ta l ，2 0 0 0 ) ；初步证明爿f 比伤。在拟南芥所有器官中均有表达( l u d w i ge ta l ，2 0 0 0 ) ： 名挝踊。只在莲座时中有微弱的表达( 珏a r r i n g t o n 和g r e g o r y ，2 0 0 5 ) 。但对于4 蹴9 基因表达的特异位点还未见报道。关于这几个鏊因及其所编码的蛋白的功能也少有报 道。 2 基因功能的研究策略 蟊薪，了解菜未知基因可能具有的功熊，通鬻首先使用生物信息学方法对该蒸因的 d n a 序列及蛋白质序列进行分析。但生物信息学分析方法只能提供该基因功能的间接证 据，最终还需借助突交体，逶过实验数据来鉴定其其体功能。 借助突变体研究基因功能的方法主要分为两个方面，即正向遗传学( f o r w a r d g e n e t i c s ) 和反向遗传学( r e v e r s eg e n e t i c s ) 。歪向遗传学建指，通过生物令体或细 胞的基因组的自发突变或人正诱变，寻找相关的袭型或性状改变，然后从这些特定性状 变化的个体或细胞中找至4 对绒的突变基因，并揭幂其功能。例如遗传瘸基因的克隆。其 策略是“从功能到表型突变体到基因”，最后得到具有相关功能( 如对盐敏感和耐盐) 的基因。正向遗传学途径常见的方法如传统的功能克隆( f u n c t i o n a lc l o n i n g ) 、表型 竞瀣( p h o n e t y p i c a lc l o n i n g ) ，包括递减杂交( s u b s t r a c t i v e hy b r i d i z a t i o n ) 、差异 7 显示p c r ( 叩一r t p c r ) 、差异显示分析( r d a ) 、抑制性扣除杂交( s s h ) 等。反向遗传学 的原理与上述正向遗传学正好相反，人们蓠先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再 去寻找有关的表黧交亿。例如基因敲除技术或转基因研究。其策略楚“从纂因至n 袭塑突 变体到功能”，最后得到未知基因的功能。较为常见的反向遗传学途径为图位克隆 ( i l l a p - b a s e dc l o n i n g ) 与转座子瓜一d 盼标签( t r a n s p o s o n 月一d n at a g g i n g ) 技术。目 前，已获得了t d n a 插入诱变的拟南芥突变体群体( f e l d m a n n ，1 9 9 1 ) 。从这些突变体 群傣中筛选出特晃基因拔突变了的接株，并对突变株进行表型分析将有助予揭示瞬的基 因的生物学功能( 许锗宏和卫志明，1 9 9 7 ) 。 正向遗传方法存在基嚣定位克隆的河题。如，在线虫一号染笆体上已囊3 个基因 已由突变体经豫向遗传学途径被证实，但却没得到克隆，因为定位克隆通常费时费力。 而反向遗传方法的优点就是突变的基因序列已知，观察到的任何突交表型都与已知的序 列相关，从而能为穿列数据与生物学功能乏闻提供一个更迅速的连接。 综上所述，突变体的获得是进行功能基因组研究的前提，筛选和分析植物突变体是 研究植物基因功能的一个有力手段。如果某些突变体的变异像点豹基因参与了缀熏要的 植物生理生化及发育过程，那么克隆这些基因，并研究这些基因变异的分子基础和它们 控剿植物生长发育豹楗理，这对于德物体的遗传学研究、发育与代谢调控、稠用有益往 状进行突变育种等方面具有麓要指导意义。 3 ，植物对干旱胁迫的生理反应 干旱是一种典型的多发性灾害逆境，对植物艇产影响巨大，长久以来一壹是攘物磺 究所关注的热点问题。千旱胁追对植物生理特性的影响较为复杂。不仅包括干旱所造成 的直接水分胁迫，还包括由此所产生的次生伤害。胁迫过程中各个事件之间相互交错， 迸一步增加了研究的复杂性。 另一方面，植物经过长期的进化也逐渐形成了许多特异的适应和抗性机制。通常可 撅括为三类：( 1 ) 避旱，帮作物的整个生育麓或是对水分敏感的时期与干旱发生时闻锗 开，从而避免干旱胁迫：( 2 ) 高水势耐早，即植物在干旱条件下通过减少失水和维持吸 水，使体内仍能保持一定豹水分，缓胞处予正常垂鼋微环境当中，从丽抵镥予幂；( 3 ) 低 水势耐早，即植物能通过产生保护性物质降低对千旱的敏感性，或通过一系列的生理生 化变化使二f 旱解除后，植物的各种生理功能迅速恢复正常( t u r n e r ，1 9 7 9 ；l e v i t t ，1 9 8 0 ) 。 这两个方面互为作用共同构成了干旱胁迫和植物生理特性的特殊关系，其中荚键性 的问题可概括为以下几个方露： 3 1 干旱胁迫对渗透调节物质的影响 渗透调节( o s t i e 蕊j u s t 狮n t ) 是植物榔旱的一晕中重要方式( u r n e r ，1 9 7 9 ；l e v i t t ， 1 9 8 0 ) 。干旱发生后，植物细胞除因失水造成内容物被动浓缩外，还可通过主动代谢活 动来增加其内部的溶质浓度，降低其渗透势，进藤促进缀胞从腿终介质吸水，进延保持 一定的膨压，以维持正常的代谢活动( h e l l e b u s t ，1 9 7 6 ) 。 不同植物参与渗透调节的物质种类也不同。主要包括臆氮酸和可溶性糖类。研究发 现游离脯氨酸广泛存在予高等植物体内，随环境的改交，植物体内的游离脯氨酸禽量也 出现相威的变化。相荧研究证实，在逆境条件下许多植物会发生脯氨酸的积累( 钮福祥 等，1 9 9 6 ；l e v ye ta l ，1 9 8 0 ；a s p i n e l l 帮p a l e g ，1 9 8 0 ) 。干早胁迫可以降低脯氨酸的 氧化，同时抑制蛋白质的合成，姒而增加了脯氨酸的累积。另外，还有证据表明，在萎 蔫叶冀中滕氨教含量的增船主要是谷氨酸会成虢氨酸途径受到刺激的结暴。丽脯氨酸豹 积累主要是通过合成途径实现而不是增加蛋白质水解所致( b a r n e t t 和n a y l o r ，1 9 6 6 ) 。 沈阳农业大学硕士学位论文 脯氨酸的积累对植物抗性具有积极的意义，是植物对高温和干旱胁迫的保护性反应之 一，在细胞水分调节中发挥重要作用。张明生等( 1 9 9 9 ) 的研究表明，脯氨酸在抗性反 应中发挥多重作用，包括参与降低细胞渗透势，维持膨压，提高生物大分子稳定性，增 强细胞抵御盐胁迫伤害的能力等。但也有人提出相反的观点，认为脯氨酸积累主要是作 为植物缺水的指示剂而发挥作用( h a n s o n ，1 9 8 0 ) 。 参与渗透调节的可溶性糖类主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等( 张宪政和陈 凤玉，1 9 9 6 ) 。干旱胁迫条件下，植物出现可溶性糖的积累。研究表明，在土壤出现缓 慢干旱时，柽柳植株主动积累可溶性糖，调节渗透势，帮助植物在干旱逆境下维持正常 生长所需水分。同样，在发生干旱胁迫时，不同品种水稻叶片的可溶性糖含量均呈现上 升趋势，可上升至2 o 左右。这种主动积累有利于降低植株内渗透势，帮助其在干旱逆 境下维持正常生长所需水分，进而提高植物的抗逆性( 朱维琴等，2 0 0 3 ) 。 3 2 干旱胁迫引起的活性氧伤害及植物保护酶活性的变化 3 2 1 活性氯伤害 活性氧是化学性质活泼，氧化能力强的含氧物质的总称。由于具有很强的氧化能力， 所以对对大多数生物功能分子均具有破坏作用。如出现活性氧的过度积累必然导致细胞 发生伤害。正常条件下，植物体内活性氧的产生是受到严密的控制，活性氧的产生与清 除之间保持动态平衡。发生干旱胁迫时，这种动态平衡遭到破坏，进而引起活性氧的积 累，造成植物细胞的损伤和破坏。 膜系统常被认为是干旱伤害的原初和关键部位。一般认为，植物细胞质膜磷脂中的 脂肪酸不饱和性越高，越容易受到活性氧的攻击，产生有机自由基中间产物( 陈少裕， 1 9 9 1 ) 。不饱和脂肪酸和三烯酸中的亚麻酸3 个不饱和键被氧化，产物之一就是m d a ( 蒋 明义，1 9 9 1 ) 。李文卿等( 2 0 0 0 ) 认为，干旱胁迫引起植物叶片质膜透性的增加主要是 由于质膜受到活性氧的攻击，膜饱和度增加，流动性减小，膜脂分子构象发生改变，从 而导致膜的选择透性丧失，电解质和小分子有机物质大量外渗。另外，据报道，活性氧 可以直接引发叶绿素的破坏，导致叶绿素含量下降( 林植芳等，1 9 8 4 ) 。 3 2 2 保护酶活性的变化 干旱胁迫下，植物保护酶的活性也发生相应的变化。保护酶活性的变化往往随着植 物材料不嗣、胁迫方式不同以及胁迫强度不同而不同( 李台生。2 0 0 0 ) 。 超氧化物歧化酶( s o d ) 是膜脂过氧化防御系统的主要保护酶，能够催化活性氧的歧 化反应，使其转化为无毒分子氧和过氧化氢，从而降低植物所遭受的伤害。此外，膜脂 过氧化防御系统还包括过氧化氢酶( c a t ) 和过氧化物酶( p o d ) 等，它们帮助最终消除生理 系统中所产生的h ：0 。 总之，植物对干旱胁迫的反应是多方面的