（农药学专业论文）新化合物HIA1除草生物活性及作用特性研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 捅姜 为适应我国农业可持续发展需求 尽快发展除草剂 提高除草剂自主 创新能力 新型除草剂 丙酮酸脱氢酶系抑制剂的设计和研究成为十分 活跃的研究领域 本文以o o 一二甲基一1 2 4 一二氯苯氧基乙酰氧基 呋 喃甲基膦酸酯 h 认 1 为研究对象 进行了除草生物活性 杀草谱 吸 收部位 作物安全性等试验 探讨了其作用机理及其对植物部分生化指标 的影响 为其开发应用提供理论和实践依据 也为新型除草剂的研究与创 新提供一定的参考 研究结果如下 1 培养皿生物活性测定 h 认一l 具有双重活性 低浓度下促进根 芽生长 高浓度下有较强的抑制作用 且对6 种试材的活性有很大差异 其中双子叶植物较敏感 分别为黄瓜 萝卜 苘麻 油菜 1 0 m g l 处理 下 根 芽抑制率分别在8 6 2 和8 8 2 以上 2 芽前 芽后活性比较结果表明 芽后茎叶处理效果明显高于芽前 土壤处理 其中马齿苋 反枝苋 苘麻芽后茎叶处理的e c 9 0 分别为4 9 6 5 4 3 9 9 2 5 3 1 8 5 0 9a i h m 2 芽前土壤处理的e c g o 分别为3 8 0 7 4 1 3 9 1 2 6 9 3 4 3 7 2 9 9a i h m 2 3 杀草谱试验结果表明 h i a 1 对阔叶杂草具有良好的防除效果 而对禾本科杂草的防效一般 阔叶类杂草茎叶处理2 d 后植株扭曲畸形 生长矮小 1 0 d 后茎部开始出现瘤状膨大物 从膨大处开始干枯 逐渐死 亡 禾本科杂草施药后表现为生长矮小 1 0 d 后根基部开始变黑褐色 逐 渐腐烂 4 安全性试验表明 h i a 1 对玉米较安全 且对不同品种的玉米敏 感程度基本相同 泰玉1 4 号除外 农大1 0 8 先行2 号 金海6 0 4 鲁紫 糯1 号的选择性指数均在2 6 以上 而对棉花 花生 大豆 油菜较敏感 4 0 0 9a i h m 2 剂量下均开始有药害 药害症状同杂草受害症状 5 施药适期研究发现 不同叶龄的试材对药剂的反应敏感性有很大 差异 2 3 叶期时施药防效最高 6 0 0 9a i h m 2 处理剂量下达到9 0 以上 的防效 6 活性炭隔离和茎叶喷雾 灌根研究发现 新化合物h i a 1 可通过 根 茎叶 芽吸收进入植物体内 新化合物h i a 1 除草生物活性及作用特性研究 7 作用机理研究结果表明 h i a 1 为丙酮酸脱氢酶系抑制剂 1 0 0 0 m g l 时 对丙酮酸脱氢酶系活性的抑制率在6 0 左右 8 经不同浓度的h i a 1 处理后 苘麻幼苗及幼根的细胞相对存活率 p o d s o d 活性和根系活力也发生相应的变化 高浓度时有较强的抑制 作用 低浓度则对其抑制较弱或有一定的激活作用 浓度为0 1 m g l h i a 1 处理后苘麻幼根细胞存活率超过1 0 0 表现出激活作用 当浓度为 1 0 0 0 m g l 时 细胞存活率均低于4 0 p o d 和s o d 活性表现趋势相同 呈现出先升高后降低的变化 1 0 0 0 m g l 时 苘麻幼苗及幼根s o d 活性分 别为对照的5 0 和3 0 左右 当浓度分别降为0 1 和l m g l 时 均约为 对照的1 1 3 1 0 1 0 0 0 m g l 时幼苗和幼根p o d 活性低于对照 1 0 0 0 m g l 时为对照的5 8 和4 0 左右 1 m l 时幼苗及幼根p o d 活性均约为对照 p o d 活性的1 3 0 根系活力则较对照差异显著 并明显低于对照 9 田间药效试验结果表明 3 0 h i a 1 乳油在4 5 0 7 2 0 9a i h l t l 2 对 反枝苋 马齿苋 小藜表现出较好的防治效果 但相同剂量下的总体防效 略低于7 2 2 4 d 丁酯乳油 作用速度较慢 对玉米相对安全 最好应 用于阔叶类杂草较多的地块 关键词 丙酮酸脱氢酶系 0 o 一二甲基 1 2 4 二氯苯氧基乙酰氧基 呋喃甲基膦酸酯 生物活性 作用特性 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t i no r d e rt od e v e l o ph e r b i c i d e i m p r o v ei n d e p e n d e n ti n n o v a t i o na b i l i t y a n da d a p tt os u s t a i n a b l e d e v e l o p m e n t o f a g r i c u l t u r e d e s i g n i n g a n d r e s e a r c h i n gn e w s t y l e h e r b i c i d ew h i c hi n h i b i t e d p y r u r a t ed e h y d r o g e n a s e c o m p l e xb e c a m eas t i r r i n gf i e l d i nt h i sp a p e r t h en o v e lc o m p o u n dn a m e d o o d i m e t h y l 一1 一 2 4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t y l o x y 一m e t h y l f u r a np h o s p h o n a t e w a ss e l e c t e da sr e s e a r c ho b j e c t i no r d e rt oa s c e r t a i ni t sa p p l i c a t i o np o t e n t i a l t oc o n t r o lw e e d si nc o r nf i e l d p r o v i d et h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a lb a s i sf o ri t s d e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o n a n da l s op r o v i d er e f e r e n c e db a s i sf o rn e w s t y l e h e r b i c i d e ss t u d ya n di n n o v a t i o n w et e s t e dh e r b i c i d a lb i o a c t i v i t y s p e c t r u mo f w e e dc o n t r o l l i n g a b s o r p t i o ns i t e s a l t yt oc r o p s f i e l de f f i c a c yt r i a la n ds oo n r e s e a r c h e di t sm e c h a n i s ma n de f f e c to np a r t i a lb i o c h e m i c a li n d e x e so fp l a n t t h er e s u l t sc o u l db es u m m a r i z e da sf o l l o w s 1 r e s u l t so fb i o a s s a ys h o w e dt h a th i a 1h a dd u a la c t i v i t y r a d i c l ea n db u d w e r ep r o m o t e da tl o wc o n c e n t r a t i o n b u ti n h i b i t e da th i g hc o n c e n 仃a t i o nw i t h d i f f e r e n ts e n s i t i v i t yt os i x m a t e r i a l s t h e r e i n t o t h ed i c o t y l e d o n s u c ha s c u c u m 西s a t i v u s r a p h a n u ss a t i v u s a b u t i l o nt h e o p h r a s t i a n db r a s s i c a c a m p e s t r i sw e r em o r es e n s i t i v et oh i a 1 t h ei n h i b i t o r yr a t e so fr a d i c l ea n d b u dl e n g t hw e r em o r et h a n8 6 2 a n d8 8 2 a t10 m g l 2 t h er e s e a r c ho fa c t i v i t i e sw h i c hw e r ec o m p a r e db e t w e e np r e e m e r g e n c e a n dp o s t e m e r g e n c es h o w e dt h a ta l lt h ee f f e c to fp o s t e m e r g e n c et r e a t m e n t s w e r es i g n i f i c a n t l yb e t t e rt h a np r e e m e r g e n c et r e a t m e n t s t h e r e i n t o t h ee c 9 0 o fp o r t u l a c ao l e r a c e a a m a r a n t h u sr e t r o f l e x u sa n da b u t i l o nt h e o p h r a s t ia f t e r p o s t e m e r g e n c e t r e a t m e n tw e r e4 9 6 5 4 3 9 9 2 5 318 5 0 9 a i h r n 2 a n d 3 8 0 7 4 1 3 912 6 9 3 4 3 7 2 9 9a i h m 2a f t e rp r e e m e r g e n c et r e a t m e n t 3 s p e c t r u mo fw e e dc o n t r o l l i n gw a s c a r r i e db yp o t b i o a s s a yi ng r e e n h o u s e r e s u l ts h o w e dt h a th i a 一1h a dg o o dc o n t r o le f f e c tt om o s t l yf a m i l i a rl a t i f o l i a t e w e e d s a n dg e n e t i cc o n t r o le f f e c tt og r a m i n e o u sw e e d s l t i f o l i a t ew e e d s b e c a m et w i s t e d m a l f o r m e da n ds t u n t e da f t e rt w od a y sw i t hf o l i a g et r e a t m e n t s o m et u m o r sw e r ea p p e a r e da f t e rt e nd a y s a n dt h ep l a n tb e c a m ed r yr o ta n d 3 新化合物h i a 1 除草生物活性及作用特性研究 d e a df r o mt u m o r s g r a m i n e o u sw e e d sb e h a v e ds t u n t e d t h e nb e c a m ep i t c h y a n dp e r i s h e d 4 s a f i ye x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a th i a 1 w a ss a f et od i f f e r e n tv 撕e t a lc o r n s w i t ha l m o s ts a m es e n s i t i v ed e g r e e s e l e c t i v i t yi n d e x e sw e r ea l la b o v e2 6 s u c ha sn o n g d a1 0 8 x i a n x i n g2 f j i n h a i6 0 4 e t a l e x c e p tt a i y u1 4 c o t t o n p e a n u t s o y b c a na n dc o l ew e r em o r es e n s i t i v ew i t ho b v i o u si n j u r ya ss a m ea s w e e d s l 5 b yp o tb i o a s s a ym e t h o di ng r e e n h o u s e i tw a sf o u n dt h a tt h es e n s i t i v i t y o fm a t e r i a lh a dd i f f e r e n c ea td i f f e r e n tl e a f s t a g e t h ea p p l i c a t i o nt i m i n gw a s f r o m2t o3 l e a fs t a g eo f w e e d s a n dt h ec o n t r o le f f e c tw a sm o r et h a n9 0 a t 6 0 0 9a i h m 2 6 b ym e t h o do fa c t i v ec a r b o ni s o l a t i o n f o l i a g et r e a t m e n ta n dp o u r i n gr o o t s i tw a sf o u n dt h a tt h i sn o v e lc o m p o u n dc o u l db ea b s o r b e di n t op l a n tb yb u d s r a d i c l e s l e a v e s r o o ta n ds t e m s 7 t h es t u d yo fe f f e c tm e c h a n i s ms h o w e dt h a th i a 一1w a sp y r u r a t e d e h y d r o g e n a s ec o m p l e x i n h i b i t o r t h ei n h i b i t o r yr a t ew a sa b o u t6 0 a t o o o m e 拉 8 b ya b u t i l o nt h e o p h r a s t it ob em a t e r i a l s o m eb i o c h e m i c a li n d e x e so f s e e d l i n ga n dr a d i c l es u c ha sc o m p a r a t i v es u r v i v a lr a t eo fc e l l s p o da c t i v i t y s o da c t i v i t ya n dr o o ta c t i v i t yh a ds o m ec o r r e s p o n d i n gc h a n g e s a f t e r t r e a t m e n tw i t hh i a 一1 t h e s eb i o c h e m i c a li n d e x e sw e r ei n h i b i t e de v i d e n t l ya t h i 曲c o n c e n t r a t i o n s a n di n h i b i t e d u n e v i d e n t l y o ra c t i v a t e da tl o w c o n c e n t r a t i o n s t h ec e l l sc o m p a r a t i v es u r v i v a lr a t eo fr a d i c l ew a sa b o v e10 0 a to 1m g l r e p r e s e n t i n gs t i m u l a t i v ee f f e c t a n dl o w e rt h a n4 0 a t10 0 0m e c l s o da n dp o da c t i v i t i e ss h o w e ds a m ec h a n g et e n d e n c y w h i c hw e r ei n c r e a s e d f i r s ta n dr e d u c e dl a t e r s o da c t i v i t i e so fs e e d l i n ga n dr a d i c l ew e r ea b o u t5 0 a n d3 0 o fc o n t r o la t10 0 0 m g l r e s p e c t i v e l y w i t hb o t h a b o u t113 o ft h o s e o ft h ec o n t r o la to 1a n dlm g l p o da c t i v i t i e so fs e e d l i n ga n dr a d i c l ew e r e l o w e rt h a nt h ec o n t r o la c t i v i t i e sf r o m10t o10 0 0 m g l w i t h58 a n d4 0 o f t h o s eo ft h ec o n t r o la t10 0 0 mg l a n dt h ep o da c t i v i t i e sw e r eb o t ha b o u t 4 山东农业大学硕士学位论文 1 3 0 o ft h o s eo ft h ec o n t r o la tl m g l t h er o o ta c t i v i t yw a sl o w e rt h a nt h a t o ft h ec o n t r o lw i t hs i g n i f i c a n td e f f e r e n c e s 9 t h ef i e l de f f i c a c yt r i a li n d i c a t e dt h a t3 0 h i a 一1e ch a dh i g he f f i c a c yt o c o n t r o la m a r a n t h u sr e t r o f l e x u s p o r t u l a c ao l e r a c e aa n dc h e n o p o d i u ma l b u m b u tt h eg e n e r a lc o n t r o le f f e c tw a sl o w e rt h a nt h a to f7 2 2 4 一db u t y l a t e i tw a s s a f et oc o i t lw i t hs l o ws p e e do fe f f e c tr e l m i v e l y a n db e t t e rt ob eu s e di nt o m f i e l dw h i c hh a dm o r el a t i f o l i a t ew e e d s k e yw o r d s p y r u r a t ed e h y d r o g e n a s ec o m p l e xi n h i b i t o r o o d i m e t h y l 一1 一 2 4 一d i c h l o r o p h e n o x y a c e t y l o x y m e t h y l f u r a np h o s p h o n a t e b i o a c t i v i t y c h a r a c t 一 甜s t i e s 5 缩略词表 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文 是在导师指导下 独立进行科学 研究所取得的成果 对在论文研究期间给予指导 帮助和做出 重要贡献的个人或集体 均在文中明确说明 本声明的法律责 任由本人承担 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定 同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸 质本和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权山东农业大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文 同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收 录到 中国学位论文全文数据库 并向社会公众提供信息服 务 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名 堡煞 引雅名澎 j j e p e t 期 切口9 石 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 人口与粮食是人类在2 1 世纪面临的五大挑战之一 世界农业面临每 年增加7 0 0 0 万人口的巨大压力 而危害粮食生产 除病虫害外 杂草危 害也是一个重要的方面 陈万义 1 9 9 7 涂鹤龄 1 9 9 9 杂草即农田中 非目标栽培植物 其主要危害是与农作物争水 肥 光 空间 同时也是 作物病虫害的中间寄主 从而恶化农作物生长环境 造成作物减产和品质 下降 它既有野生植物的特性 也受人类生产活动的影响 是农业生态系 统中的一个重要组成部分 世界农田杂草共有1 0 0 0 多种 危害性较大的 杂草有9 0 多种 农作物受杂草危害平均减产9 7 粮食作物受害减产 1 0 4 张泽溥 1 9 9 7 防除杂草的方法很多 有农业除草法如精选种 子 人工拔草 水旱轮作 合理翻耙等 机械除草法如机械中耕除草 生 物除草法如利用食草昆虫 病原微生物和植物敏感物质防除杂草和化学除 草等 上述各种除草方法在杂草的综合治理中发挥一定的作用 但化学除 草却具有独特的优点 在杂草治理中占有更重要的位置 2 0 世纪四十年代以来 除草剂已开始应用于农田杂草防除 农田化 学除草已成为全球性现代化农业生产的重要组成部分 尽管转基因作物的 诞生 如批耐除草剂的转基因作物 对化学除草剂有一定的冲击 但由于化 学除草剂具有高效 快速 经济等优点 成为农业高产 稳产的重要保障 在我国 除草剂在三大农药 除草剂 杀虫剂 杀菌剂 中所占的比例远 低于世界水平 张一宾 1 9 9 8 国产除草剂的品种主要是国外开发的专 利期己过的品种 自主创制的品种数量非常有限 因此 在当前我们应该 尽快发展除草剂 增加除草剂品种 提高作物的产量 以适应我国现代农 业可持续发展的需要 1 1 除草剂研究进展 自1 9 4 2 年美国z i m e r m a n p w 和h i t c h c o c k a e 发现2 4 一d 除草活性 以来 除草剂的应用开发得到快速发展 2 0 世纪5 0 6 0 年代主要开发了 苯氧羧酸 氨基甲酸酯 2 6 二硝基苯胺 脲 均三嗪 酰胺等类除草剂 2 0 世纪8 0 年代最受人注目的是杜邦公司最先开发的磺酰脲类除草剂 代 表品种 卞嘧磺隆 在稻田防除杂草取得了显著的经济效益 世界除草剂 7 新化合物h i a 1 除草生物活性及作用特性研究 工业便进入了超高效时代 李斌 1 9 9 8 给除草剂新品种开发及化学除 草带来了新的革命性变化 2 0 世纪9 0 年代开发的1 2 4 5 一四取代苯 类原卧啉原氧化酶抑制剂 既高效又安全 薛思佳等 2 0 0 0 在除草剂 中 磺酰脲类 磺酰胺类 嘧啶醚类等乙酰乳酸合成酶 a l s 抑制剂类 除草剂 柏再苏等 1 9 9 8 范志金等 2 0 0 3 谭效松等 2 0 0 5 被广泛应 用 而一些用量高 毒性大的除草剂品种逐渐退出市场 新除草剂在保持 原有高活性 对环境友好的前提下 不仅具有新颖的作用机理 选择性高 对作物安全 而且对后茬作物无影响 由于大多数除草剂都是通过对特殊的酶的抑制而产生杀草作用的 寻 找新的高效作用靶标酶和揭示新的作用机制成为生物化学家不懈努力的 目标 近年来在除草剂研究领域 人们从作用机理上将除草剂划分为光合 作用抑制型 氨基酸合成抑制型 植物激素干扰型 细胞分裂抑制型等 通过研究除草剂作用机理来选择靶标酶 目前已确定的除草剂靶标共有 1 7 种 其中主要存在两种靶标 乙酰乳酸合成酶和原卟啉原氧化酶 靳 莉等 2 0 0 2 彭浩等 2 0 0 3 苏少泉 2 0 0 0 石小清等 2 0 0 0 周宇涵等 2 0 0 2 例如 环状亚胺类除草剂是一类需光性除草剂 它主要抑制叶绿 素的形成 而类胡萝卜素生物合成受阻碍仅是一种次生效应 其作用靶标 是原卟啉原氧化酶 环状亚胺除草剂被植物幼芽或叶片吸收后 在体内进 行非共质体传导 在光照条件下通过抑制叶绿素生物合成中需光的5 氨 基酮戊酸而造成光合色素严重减少和已形成的植物色素的光氧化破坏 最 终使植物产生白化现象 因此以酶作为靶标进行分子设计 鉴定化合物分 子结构中的活性团 开发能有效杀死杂草 而不伤害作物并对动物及环境 安全的除草剂 以特定酶作为靶标设计新的有机分子 筛选高活性化合物 是开发除草剂的有效途径 即逐步从传统的随机合成筛选法寻求先导化合 物发展为生物合理设计和对靶标的合成与筛选 王涛等 2 0 0 2 高爽等 2 0 0 5 如 叶绿素与类胡萝b 素含量下降及光诱导的乙烯形成是过氧化 除草剂活性指标 根据这些指标发现 4 芳基 1 2 聚甲烯 1 2 4 一三唑 烷与5 芳亚氨基一3 4 一聚甲烯 1 3 4 噻二唑烷 特别是n 一芳基 1 2 一 四甲烯衍生物具有很强的过氧化活性 可开发出有效的新品种 张一宾 1 9 9 7 苏少泉 1 9 9 8 近年来 在新型除草剂创制中 杂环化合物占据 山东农业大学硕士学位论文 了主要地位 尤其是具有超高除草活性 高选择性的稠杂环新型除草剂 刘 长令 1 9 9 9 2 0 0 2 2 0 0 8 刘远雄等 2 0 0 7 李正名 1 9 9 4 1 9 9 8 范志 金等 2 0 0 4 1 2 丙酮酸脱氢酶系抑制剂研究概况 1 2 1 丙酮酸脱氢酶系概况 1 2 1 1 丙酮酸脱氢酶系催化机理 在糖代谢过程中 葡萄糖经糖酵解成为丙酮酸 然后在丙酮酸脱氢酶 系的催化下将丙酮酸转化成为三羧酸循环所需要的乙酰 c o a 同时将 n a d 还原为n a d h 生成的乙酰 c o a 贝j j 进入三羧酸循环被彻底氧化分解 从而为生物体提供大量的能量 丙酮酸氧化脱羧转化为乙酰 c o a 是连接 糖酵解和三羧酸循环的纽带 是有氧代谢的关键环节 必须在丙酮酸脱氢 酶系 也称为丙酮酸脱氢酶复合体 p y r u r a t ed e h y d r o g e n a s ec o m p l e x 简 称p d c 的催化下才能进行 王忠 2 0 0 0 沈同 2 0 0 0 丙酮酸脱氢酶 系属于q 酮酸脱氢酶复合体家族中的一种 存在于微生物 哺乳动物及 高等植物中 是一个定位在线粒体中的多酶复合体 其核心结构由丙酮酸 脱氢酶 p d h 简称e 1 二氢硫辛酸乙酰转移酶 e 2 和二氢硫辛酸脱 氢酶 e 3 组成 这3 种酶在p d c 的催化反应中以首尾相接的形式发挥作 用 这种结构上的有序结合使丙酮酸脱氢酶系催化形成乙酰 c o a 的复杂 反应得以顺利进行 而且可以避免不必要的副反应 s t e u s s ycn 2 0 0 1 吴永革等 2 0 0 2 谭才邓 2 0 0 7 此外 还有6 种重要的辅助因子参与 焦磷酸硫胺素 t p p 硫辛酸 黄素腺嘌呤二核苷酸 f a d 烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸 n a d 辅酶a c o a s h f f f l m 9 2 其催化反应过程可表 示为 c h 3 c o c o o h c o a s h n a d a c e t y l c o a c 0 2 n a d h h d a i l s o nm j 1 9 7 8 c a r er l 1 9 8 0 和b e r g a 1 9 9 8 等研究表 明 在丙酮酸脱氢酶复合体总的催化反应中 首先是e 1 与其辅助因子t p p 结合 在m 9 2 存在的情况下催化丙酮酸脱羧 形成羟乙基 t p p 羟乙基 被移到e 2 并氧化成乙酰基 乙酰基再与结合上e 2 的硫辛酸结合形成乙 酰硫辛酰胺 接着e 2 催化乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给c o a s h 形成 9 新化合物h i a 1 除草生物活性及作用特性研究 乙酰 c o a e 3 则负责把还原型的硫辛酸氧化形成氧化型的硫辛酸 并把 氢传递给f a d f a d h 再使n a d 还原 并形成循环 见图1 1 0 h r c c o o c q 占0 县一c o a s h j o a 之 n a d n a d h 图1 1 丙酮酸 盐或酯 氧化脱羧反应 f i g 1 1p y r u v a t eo x i d a t i v ed e c a r b o x y l a t i o nr e a c t i o n l l i p o i c a c e t y l e n z y m e p y r u v a t ed e c a r b o x y l a s e e 1 d i h y d r o l i p o i ca c i da c c t y l a s e e 2 d i h y d r o l i p o i ca c i dd e h y d r o g e n a s e e 3 c o f a c t o r t p p c o a s h f a d n a d l i p o i ca c i d m 9 2 1 2 1 2 丙酮酸脱氢酶系的调控 s c h w a r t z e r 1 9 6 8 r a n d l e p j 1 9 7 8 和r o c h e t e 1 9 8 9 等研 究报道 丙酮酸脱氢酶复合体在丙酮酸转变成乙酰 c o a 的过程中起着重 要的催化作用 它的活性受到多因素的调控 其中最主要的是两个方面 即产物反馈抑制控制和磷酸化及去磷酸化的控制 产物控制即由n a d h 和乙酰 c o a 控制 这两种产物表现的抑制作 用是和酶的作用底物n a d 和c o a s h 竞争酶的活性部位 是竞争性抑 制e 2 n a d h 抑制e 3 如果m h n a d 和 乙酰 c o a c o a s h 的比 值高 e 2 则处于与乙酰基结合的形式 这时不可能接受在e l 酶上与t p p 结合着的羟乙基 使e 1 酶上的t p p 停留在与羟乙基结合的状态 从而抑 制了丙酮酸脱羧作用的进行 磷酸化和去磷酸化的调控即e 1 的磷酸化和 去磷酸化是使丙酮酸脱氢酶复合体失活和激活的重要方式 在处于丙酮酸 脱氢酶复合体核心位置的e 2 分子上结合着两种特殊的酶 一种称为激酶 另一种称为磷酸酶 激酶使丙酮酸脱氢酶组分磷酸化 磷酸酶则是脱去丙 酮酸脱氢酶的磷酸基团从而使丙酮酸复合体活化 c 2 通过激活磷酸酶的 作用 也使丙酮酸脱氢酶活化 l o x 肿 一 i伽 a p 一 聊 卜 山东农业大学硕士学位论文 1 2 2 丙酮酸脱氢酶系研究方法 人们早在2 0 世纪四十年代 就开始了对丙酮酸脱氢酶系的研究 l i p m a n nfj 1 9 4 4 和s t u m p f pk 1 9 4 7 等人对乳酸菌 大肠杆菌和鸽 子胸肌中丙酮酸脱氢酶系进行了初步初步研究后 k o f k em 1 9 6 3 和 u t en e v e l i n g 1 9 9 8 等人对大肠杆菌丙酮酸脱氢酶系进行了进一步的分 离纯化 并对其酶的催化特性进行了详细的研究 随着科技的进步 人们 对丙酮酸脱氢酶复合体的结构和特性都有了更深一步的了解 近几年来 用于研究基因的手段也日新月异 对于基因的研究也取得了很大的进步 随着一些模式生物全基因序列的测定 如 大肠杆菌 拟南芥 果蝇等 对于一些功能基因的研究更是取得惊人的成果 人们对于丙酮酸脱氢酶的 基因也有了较清楚的认识 模式生物的丙酮酸脱氢酶的基因序列也逐渐的 得到证实 现己知大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶是由两个相同的仪亚基组成 并且大肠杆菌的全基因组序列己经测定并公布在g e n e b a n k 上 许多生物 体的丙酮酸脱氢酶的基因己经在不同的宿主中得到表达 其中以在大肠杆 菌中表达的丙酮酸脱氢酶和构建表达以q2 仍异四聚体构成的丙酮酸脱氢 酶居多 到目前为止 有关丙酮酸脱氢酶复合体的结构 组成 分布 生 化特性 催化机理 调节机理等都有了较深入的认识 随着对丙酮酸脱氢 酶研究的普遍深入和对相关研究的发展 对丙酮酸脱氢酶活性测定方法也 提出了更高的要求 c i s z a ke 2 0 0 1 a r j u n a np 2 0 0 2 s c h w a bma 2 0 0 5 j a n a e ta 1 2 0 0 5 丙酮酸脱氢酶系缺乏或发生变异致使其不能将丙酮酸转化为乙酰 c o a 而还原为乳酸 因此 依靠三羧酸循环作为乙酰 c o a 的来源受阻 同时a t p 的产量亦减少 从而导致代谓 障碍 组织受损 对于人类来说 临床表现以脑组织受损的症状为典型 造成丙酮酸脱氢酶缺乏的原因以丙 酮酸脱氢酶突变后的机能障碍较普通 正因为丙酮酸脱氢酶复合物在生命 体中占据着如此一个关键的代谢位置 所以它也一直是生物学 医学及农 学等领域的研究热点 目前己有报道的丙酮酸脱氢酶系活性测定方法几乎都是二十世纪五 六十年代就发展起来的 根据采用的手段主要可分为两大类 放射性同位 素法和分光光度法 同位素标记法主要用于粗酶液 是基于1 4 c 丙酮酸经 新化合物h i a 1 除草生物活性及作用特性研究 过e l 的催化作用转化为c 0 2 通过测定1 4 c 标记的c 0 2 生成量来决定e 1 酶的活性 s t e rjp 2 0 0 3 同位素标记法是采用动态的测量 没有分光 光度的方法便利 同时它还用到一种相对不稳定的放射性物质 易造成环 境污染 分光光度法测丙酮酸脱氢酶复合体活性的方法既可通过测定产物的 增加 也可以通过测定底物减少来反映丙酮酸脱氢酶复合体的活性 常用 测定丙酮酸脱氢酶系活性的分光光度法各有优缺点 如 常用的测定还原 型辅酶i n a d h 形成速率的辅酶a 法 但该方法则易受到丙酮酸脱氢 酶复合体反应产物的副反馈抑制而受到限制 2 6 二氯吲哚酚法 k h a i l o v a ls 1 9 7 7 n e m e r i an 2 0 0 1 主要是测定e l 的活性 但2 6 一d c p i p 本身为氧化剂 可以与伊巯基乙醇和二硫苏糖醇等巯基保护剂发生氧化 还原反应 如果全酶的e l 活性低 这种氧化还原反应能掩蔽酶的活性 另一个原因是e 1 催化反应的结果是电子传给了酶复合体中e 2 而不是2 6 d c p i p 即全酶中电子优先传给e 2 所以使用2 6 d c p i p 时必须注意 伊巯基乙醇和二硫苏糖醇对测活的影响 如果酶为自己提取 必须保证提 取过程中使用到的酶的巯基保护剂 p 巯基乙醇和二硫苏糖醇等 不被带 人终产物 以免影响酶的测定 否则需进行必要的校正 何亚辉等 2 0 0 6 h i n m a n 等人 1 9 8 1 报道了一种在粗的均质液中测定丙酮酸脱氢酶复合 体活性的分光光度计法方法 碘硝基四哇紫法 何亚辉 2 0 0 7 研究发 现该方法在测定粗酶液活性时有高的背景吸收 这可能是由于酶液中的物 质与反应体系中的干扰物质 如 巯基保护剂等发生了反应 所测酶活性 太低 而干扰又太大 导致测定失败 1 2 3 丙酮酸脱氢酶系抑制剂研究进展 由于丙酮酸脱氢酶系在植物有氧代谢中的作用及其不可逆性 丙酮酸 脱氢酶系成为一个具有开发农药新产品意义的作用靶标 目前尚无以它为 靶标的商品化除草剂 贺红武 1 9 9 9 1 2 3 1 国外研究进展 r e i s s 19 5 8 发现在丙酮酸和辅酶a 存在下 亚砷酸盐会使丙酮酸脱 氢酶系失活 c o r b e t t 等 1 9 8 4 报道二烷基二硫代氨基甲酸铜盐对丙酮酸 脱氢酶系也具有抑制作用 s c h w a r t a 等 1 9 7 0 和m a l d o n a d o 等 1 9 7 2 1 2 山东农业大学硕士学位论文 先后发现银化合物和溴代丙酮酸酯能使丙酮酸脱氢酶系失活 但这些含砷 和含铜类农药 如二烷基二硫代氨基甲酸铜盐 等并不是理想的抑制剂 因 为这几类农药对丙酮酸脱氢酶系的抑制活性不高 对其它相关的酶活性也 有较大影响 并且有的毒性较大 因而未商品化或推广应用 w e s t e r i k 等 19 7 4 和t h o m p s o n 19 7 3 通过肽底物醛的类似物对木 瓜蛋白酶和胰肽酶e 具有强抑制性的研究 发展了一种形成特殊共价中间 体方法 并得到确证 k l u g e r 等 1 9 7 7 用这种方法首先对从大肠杆菌中 提取的丙酮酸脱氢酶系进行了研究 证实了反应式中的反应中间体t 的 存在 f 一 m 瑚 一 p 斗q r 2 c h 3 c h 3 n h e t p p h 2 c i i r 1 天 l 响鼢醇 在这一过程中丙酮酸与丙酮酸脱氢酶系e 1 上的t p p 连接 t p p 的关 键结构是噻唑环中n 和s 原子之间的c 原子上的h 比大多数c h 基的h 更容易解离 使该c 原子形成反应性很强的负碳离子 因而可亲核攻击 丙酮酸的羰基碳原子 6 形成加成物m a t p p 噻唑环上的n 带正电 可作为电子穴 使脱羧作用容易进行 脱羧后产生羟乙基 t p p 见反应 式a k l u g e r 等据此设计合成了丙酮酸脱氢酶系底物的类似物 甲基 乙酰基膦酸钠盐 m 1 并研究了m l 对p d c 的抑制作用 其研究结果表 明 m 1 为丙酮酸脱氢酶系强有力的竞争性抑制剂 t p p 与m l 慢慢结合 因酶的活性存在 这种抑制作用是可逆的 一般条件下不易发生脱磷酸作 用 在这一抑制过程中 m l 与丙酮酸的竞争 首先占有丙酮酸的位置与 t p p 结合 然后再与t p p 辅酶反应 给出一个与m a 类似的中间体m b 但m b 不能发生进一步的脱羧反应 从而抑制了在丙酮酸脱氢酶系催化下 新化合物h i a 1 除草生物活性及作用特性研究 脱羧反应 破坏了正常的有氧代谢过程 这一过程可用反应式 b 描述 k l u g e r 等的研究工作使丙酮酸脱氢酶系抑制剂的研究达到一个新的水平 为获得丙酮酸脱氢酶系抑制剂提供了一个新的设计思路 焖 一文x i 毫毒h t 遗 h y d m x y e u y t 霉p p 图1 2 在丙酮酸脱氢酶系作用下 丙酮酸和化合物m 1 与t p p 反应过程 f i g 1 2t h er e a c t i o n so f p y r u v a t ea n dc o m p o u n d m o w i t ht h i a m i n ep y r o p h o s p h a t e c a t a l y z e db yp d c 为了探索和开发以丙酮酸脱氢酶系为靶标的新型除草剂 b a i l l i e 等 1 9 8 8 在k l u g e r t i 开究的基础上 设计合成了约5 0 种丙酮酸含磷类似物 并研究了这类化合物的除草活性及对丙酮酸脱氢酶系抑制活性 获得了许 多有意义的研究结论 并报道某些q 羰基 次 膦酸盐对植物体内的丙 酮酸脱氢酶系有很强的抑制作用 它进入植物体内极易与脱质子化硫胺素 焦磷酸酯 t p p 加成 生成牢固的不能进行正常脱羧的中间产物 从而 使植物细胞中丙酮酸氧化脱羧形成乙酰 c o a 的过程受阻 破坏了植物生 长的正常运转 从而导致植物的死亡 显示出引人注目的除草活性 选择 除草活性较高的此类化合物进行了广泛的田间药效评价 其结果表明 这 类化合物还不具备充分的商品化潜力 但这种设计方法的学术价值和良好 前景在农药界得到了高度的肯定和评价 1 9 9 2 年e v a n sda 报道 通过植物生物化学研究也发现某些 氧代膦 次膦 酸及其衍生物对植物体内的丙酮酸脱氢酶系具有很强的抑制作 用 2 0 0 1 年 b u t l i nrj 等研制出一类新型丙酮酸脱氢酶系抑 j 齐l j n 一乙酰基 杂环化合物 为含氟的具有光学活性的化合物 专利号 p c tl m a p plw o 0 1 1 7 9 4 2 c l c 0 7c 2 1 1 3 2 1 5 m a r2 0 0 1 同时 还合成了两类促进丙酮酸 脱氢酶活性的化合物 主要用于治疗人类糖尿病 脉管炎 心肌萎缩 高 1 4 山东农业大学硕士学位论文 血脂和动脉硬化症等疾病 能通过促进或抑制热血动物 如人类 体内的 丙酮酸脱氢酶而改善体内代谢 缓解病症 为寻找不含磷的丙酮酸脱氢酶 抑制剂 或促进剂 提供了非常有意义的先导化合物 1 2 3 2 国内研究进展 为了设计新型高效的丙酮酸脱氢酶系抑制剂 获得具有更高除草活性 的新型化合物 华中师范大学农药所尝试将生物化学融入农药分子设计 和采用生化推理的方法 设计合成了一类新型的芳 杂环 氧基乙酰氧基 烃基膦酸衍生物 见图1 3 其结构特点在于既含有潜在的具有农药活性 的结构单元芳 杂 氧羧酸 同时又含有潜在的抑制丙酮酸脱氢酶系的羰 基膦酸酯结构单元 当该类化合物进入植物体后 在羧酸酯酶和氧化酶的 作用下降解氧化 代谢分解产生可能具有农药活性的芳 杂 氧羧酸类结 构单元a 和可能对丙酮酸脱氢酶系具有抑制作用的q 一羰基膦酸酯类结构 单元b 由于某些q