（化学工艺专业论文）蛋黄ace抑制肽分离纯化研究.pdf

蛋黄a c e 抑制肽分离纯化研究 摘要 蛋黄a c e 抑制肽是蛋黄蛋白质经碱性蛋白酶水解所得的短肽混合物， 具有明显的体外降压作用。本实验的研究旨在经系列的分离纯化程序，得 到具有活性的降压肽，为充分利用丰富的蛋黄蛋白质，提高鸡蛋利用价值 和促进农业资源有效利用提供参考。 酶解液脱色实验研究结果表明，加入1 5 活性炭、温度4 0 c 、p h 4 0 的条件下脱色4 0 m i n ，脱色率达到8 3 ，肽损失率5 6 。 用截留分子量为1 0 k d a 和3 5 k d a 超滤膜初步分离脱色酶解液，一级、 二级超滤溶液温度分别为4 0 和3 0 、水解液浓度6 和操作压力o 3 m p a 时2 种超滤膜具有较好的通量，可分别达到1 9 l m - 2 h - 1 和1 3 l n 1 2 h 一；分别 检测不同分子量段溶液a c e 活性抑制率，结果显示a c e 抑制肽主要集中 在分子量小于3 5 k d a 溶液中，a c e 活性抑制率达到5 1 3 。 分子量小于3 5 k d a 的超滤液用离子交换和凝胶层析分离。当乙酸钠缓 冲液p h 4 1 ，洗脱液离子强度为l m o l l 1n a c i 、进样量( 肽的质量树脂湿 体积) 为1 0 m g m l 1 ，洗脱温度3 5 c 、流速控制在0 5 m l m i n 4 时d 6 1 树脂 具有较好分离效果，洗脱峰对a c e 抑制活性提高到6 2 7 ，肽的总回收率 为8 2 4 。离子洗脱峰经s e p h a d e xg 一1 5 凝胶层析分离。当缓冲液乙酸铵 浓度为o 1t o o l l 一、洗脱液流出速度o 5m l r a i n 1 、进样浓度4 0n a g m l 1 的 条件下，肽的总回收率有9 0 * , ，洗脱组分5 4 峰具有最强的a c e 抑制活性。 洗脱组分5 4 峰经r p h p l c 反相制备色谱分离，可以得到1 2 种组分， 经活性检测，a c e 抑制活性最强组分位于5 # - a - a 2 ，i - - i p l c 纯度达9 6 。放 大实验表明，酶解工艺肽回收率8 l ；超滤放大肽回收率达7 6 8 ；凝胶 层析分离肽回收率达到6 8 8 。 抗油脂氧化实验表明，油脂浓度为2 5 ，a c e i 浓度为0 0 2 时，a c e 抑制肽与对照组具有相近的抗油脂氧化性。 关键词：蛋黄蛋白质a c e 抑制肽分离纯化 t h es t u d yo fi s o l a n o na n dp i7 r i c a t i o n a n g i o i e n s i nc o n 、，e r t 扑t ge n z y m 匣嘲b i t o r p e p t ：观f r o mh y d r o i j y s i sc h 【e ne g gy o l kp r o t e i n a b s t r a c t e g gy o l ka n t i h y p e r t e n s i np e p t i d ew a sp r e p a r e db yh y d r o l y z i n gc h i k e ne g g y o l kp r o t e i nw i t ha l k a l ip r o t e a s ew h i c hh a so b v i o u s l ya n t i h y p e r t e n s i nf u n c t i o n i nv i t r o as e r i e so fi s o l a t e dp r o c e d u r e sa r eu s e dt og e ta c t i v ep e p e t i d e si nt h e p u r i f y i n gp r o c e s s t h er e s e a r c hc a ng i v er e f e r r e n c et om a k et h em o s to ft h ee g g p r o t e i n ，r a i s i n gt h ee g gu s i n gv a l u e ，a c c e l a r a t e i n ga g r i c u l t u r er e s o u r c ee f f i c i e n c y u s e d s t u d i n gt h ed i s c o l o r a t i o no fh y d r o l y s i ss o l u t i o na n df i n d i n go u t w h e n1 5 a c t i v a t e dc a r b o nw a sp u tt oh y d r o l y s i ss o l u t i o na t4 0 。c w i t hp h 4 0a n dd e c o l o u - r a t e4 0 m i n n u t e s t h ed i s c o l o r a t i o nr a t i oc a ng e t8 3 a n d p e p e t i d el o s sr a t i oi s 5 6 t h em o l e c u l a rw e i g h t3 5 k d aa n d10 k d au l t r a f i c a t i o nm e m b r a n e sw a su s - e dt of i l t e rt h ed i s c o l o r a t i o nh y d r o l y s i ss o l u t i o n , t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p e - r a t i n gp r e s s u r ei sk e p ta t0 3 m p a , t h et e m p e r a t u r ei sk e p ta t4 0 0a n d3 0 c a n da t t h e6 h y d r o l y s a t ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n t h ej vo f t h et w ok i n d so f m e m b - r a n ec a na c h i e v e1 9l m - 2 h 1 a n d l 3l i n - 2 h _ 1 b ym e a s u r i n gt h ed i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d ei n h i b i t o r yt ot h ea c ea c t i v e ，i tw a s s h o w e dt h a tt h es t r o n - g e s ti n h i b i t o r ya c t i v ep e p f i d em o l e c u l a rw e i g h ta r el e s st h a n3 5 k d aa n di n h i b i t - t o r yr a t i oi s5 1 3 1 1 ”m o l e c u l a rl e s st h a n3 5 如af i l t e rs o l u t i o nw a si s o l a t a t e dw i t ht h ei o n - e x c h a n g ea n ds e p h a d e xg e l - 1 5 t h ed 6 1r e s i nc a nh a sb e t t e ri s o l a t i o ne f f e c t sa t t h et e m p e r a t u r e3 5 c ，i n i t i a lq u a l i t y ( p r o t e i n sq u a l i t y w e tr e s i nv o l u m e ) a t1 0 n a g m l 1 ，v e l o c i t ya t0 5m l m i l l 1 ，l i q u i dc o n c e n t r a t i o na t1m o l l - 1n a c la n d w i t hb u f f e rl i q u i da tp h 4 1a c e t i cs o d i u ms o l u t i o n t h ep e p t i d e st o t a ly e i l dr a t i o g e t8 2 4 a n dt h ei n h i b i t o r yr a t i og e t6 2 7 t h ep u l l i n go f fp e a kw a si s o l a t e d f i v ep e a k sw i t ht h eg e l 1 5a tt h e1 0m l m i n 1f o l l o wv e l o c i t y , t h ea c e t i cf l f f l l n l o - n i ab u f f e rl i q u i d sc o n c e n t r a t i o na to 1t o o l l 。1 a n di n i t i a lc o n c e n t r a t i o na t4 0 m g m l 1 t h ef i f t hp e a kh a v et h es t r o n g e ai n h i b i t o r yt oa c e t h et o t a ly i e l do v e r 9 0 c a nb er e a c h e d t h ef i f t hp e a k ss a m p l ew a si n j e c t e dt h er p h p l ce x p e r i m e r i te q u i p m e n t , i tc a nb es e p a r a t e di n t ot w e l v ec o m p o n e n t s 5 # - a - a 2h a st h e a c t i v ei n h i b i t o r yt oa c ea n di t sh p l cp u r i t yc a nr e a c h9 6 t h em a g i n i f y i n g e x p e r i m e n tr e s u l ts h o wt h a tt h ea i z y n l eh y d r o l y s a t ey i e l dr a t i o sc a nr e a c h81 ： t h eu l t r a f i c a t i o ny i e l do v e r7 6 8 c a nb eg o t ；p e p t i d e sy e i l dg e t6 8 8 w i t h g e l 1 5i s o l a t i o n t h ea n t i o x i d a t ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a ta c e ih a v et h es i m u l a t ee f f e c t sa s t h ec o n t r a s ta t 2 5 ( w v ) l i p i n c o n c e n t r a t i o na n da t o 0 2 ( w v ) a c e i c o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：e g gy o l kp r o t e i n ；a c ei n h i b i t o r y ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n i v 符号说明 色素的吸光度 对照组中马尿酸的峰面积 抗油脂氧化抑制率( ) 离子树脂静态吸附率( ) 加入a c e i 后马尿酸的峰面积 脱色前酶解液浓度( m g m l 1 ) 脱色后酶解液浓度( m g m l d ) 超滤前溶液浓度( m g m l d ) 回收组分i 的浓度( n a g m e 1 ) 酶解液的脱色率( ) 样品a c e i 对a c e 的抑制率( ) 超滤溶液通量( l m - 2 m i n - 1 ) 肽损失率( ) 脱色前肽的质量( m g ) 脱色后肽的质量( n a g ) a c e 抑制肽进样量( n a g ) 回收降压肽的质量( n a g ) a c e 抑制肽回收率( ) 超滤膜面积( m 2 ) 超滤时间( m i n ) 超滤透过液体积( l ) 超滤前溶液体积( n 1 l ) 回收组分i 的体积( m l ) v a缸尬缸凰啾岛a啦m h坤m地硒s t v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原刨性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第署名 草位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致 谢。 论文作者签名：万c 7 及闶j 2 ”7 年厂月? 。日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：巧霞刚导师签 、j ，7 1 f司年s rj 。b 董 c e 抑伽胜分暂总化爵竞 1 1 前言 第一章绪论 生物活性肽是多种氨基酸以不同排列方式构成简单的线型、复杂的线型、环型结构 的不同肽类总称，是源于蛋白质的多功能且最复杂的化合物。肽分子量介于氨基酸和蛋 白质之间，化学性质与氨基酸相似，由于组成肽的氨基酸残基种类、数量、排序甚至构 象不同，表现出不同的生物功能。当肽的组成氨基酸种类增加到一定数量时( 2 0 个以上1 ， 化学性质倾向于蛋白质，此时两者之间没有明显的界限。并且肽类化合物广泛存在于自 然界，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节都与活性肽有 一定的相关性。 以前人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径，近年来，科学家经研究发现， 蛋白质经消化道酶促水解后，主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被 机体吸收利用，这是傲研究理论和实践的重大突破【l 】，丰富了传统的蛋白质代谢模型 理论，即作为食品营养摄取的蛋白质和肽必须先由胃和小肠内的多种蛋白质分解酶水解 成为游离氨基酸，才能被人体吸收利用。现代研究表明，因为一些肽段的强烈电荷密度 和结构排序，在胃肠道内酶水解只能停留在肽的阶段，所以有部分营养成分是以多肽和 小肽的形式从肠道直接吸收。氨基酸和肽具有不同的吸收、转移机制，同氨基酸相比肽 的吸收效率更高、不易饱和。例如二肽和三肽在肠道的吸收速度就高于同组成的氨基酸。 许多易被肠道直接吸收的具有生物活性功能的小肽，不仅能提供机体生长、发育所需的 营养物质与能量，还同时在细胞生理及代谢调节上发挥重要作用，如抑制酶活性、抗菌、 降血压、免疫、调节神经和激素、抗氧化作用等【2 3 】。因此，生物活性肤已成为功能性 食品研究与开发的熟点之一，且大量的科研工作者对来源于食品蛋白质中的活性肽作为 一种潜在的功能性食品进行了广泛和多年的研究工作，并取得了一系列成果。 生物活性肽来源可以是内源性的，例如从内分泌腺组织、细胞分泌和体液中产生； 也可以是外源的，通过消化道吸收等方式进入血液后到达靶细胞发挥作用。一般认为多 肽的分子较大不能直接进入靶细胞，而是首先与分布在细胞表面的特异性受体相结合， 激活了与受体相连接的效应器，活化的效应器起作用后产生“第二信使”而传递信息，在 细胞内激活一些酶系，从而促进中间代谢或膜的通透性，或通过控制d n a 转录与翻译而 霄a c e 抑_ 脚。慵一哪爿哥完 影响特异的蛋白质合成，最终导致特定的生理效应或发挥药理作用p 研研究发现，自 然界存在大量具有调节生理和代谢功能的活性肽，例如a c e 抑制肽、胰岛素、脑活素 等，在医学临床应用方面表现出较大的优势。 通过各种方式所获的生物活性肽具有许多生理功能，具体体现在如下几个方面【9 一o l ： ( 1 ) 类吗啡活性肽( 神经活性肽) 可起到镇痛及调节人体情绪、脉搏、体温的作用； ( 2 ) 具有激素或调节激素的功能，这些肽通过自身作为激素或调节激素反应而产生多 种生理作用； ( 3 ) 具有免疫活性及作为酶的调节帮； ( 4 ) 促进矿物质的吸收利用。如酪蛋白磷酸肽作为无机离子的载体促进肠膜对钙、铁、 硒、锌等，尤其是钙的吸收和利用，提高动物受精能力，调节血压，还具有明显的抗蛀 牙、防止钙质流失等诸多生理功能i ( 5 ) 具有抗氧化作用。谷胱甘肽在体内与过氧化物酶共轭，使体内的过氧化氢和过氧 化脂质还原，防止体内生成过氧化脂质、具有保护生体膜、保护生物体的作用； ( 6 ) 具有降血压功能，目前已经在植物和动物蛋白中提取分离得到了具有降血压活性 的驮t u - t 3 l 。这些具有各种生理功能生物活性欣的发现引起了食品科学界和医药学界的高 度关注，特别是具有降血压活性的血管紧张素转换酶( a n g i o t c n s i n - i - c o n v e r t i n ge n z y m e , a c e ) 抑制肽成为生物活性肽研究领域最热门的方向之一 1 2a c e 抑制肽的研究进展 a c e 抑制肽通常称为降血压肽( a n g i o t e 试一i c o n v e r t i n g e a z y m e i n h i b i t o r ，a c e d ， 是指对a c e 酶活性具有抑制作用的活性物质。a c e 抑制肽的研究可以追溯到上个世纪7 0 年代，1 9 6 5 年f e 玎c h a 【1 4 】从巴西茅头蝮蛇( b o 衄o p s j 峨嗡嘞的蛇毒中分离出一种活性肽， 具有增强缓激肽的作用，故将其称为缓激肽增强因子( b r a d y k i n i np t e l l 矗a l i n gf a c t o r s , b f p s ) 。后来又发现这种肽类物质具有抑制血管紧张素转化酶( a c e ) 活性的作用，使 血管紧张素i 转变为血管紧张素的过程发生障碍，起到降压作用。1 9 7 1 0 n d c t t i 等i t s 从蝮 蛇中分离出一种九肽，壬肽抗压素( t i p r o f i d e ) 又称s q2 0 8 8 1 ，在降低原发性高血压症 方砸取得较好的疗效，静脉注射后作用时间长，但口服无效。在最近的二十年里，又先 后研发了以培哚普利( p e r i n d i p r i l ) 为代表的第二类前体药物，并因其口服吸收迅速、吸 收水解后成活性产物而起作用，同时其生物利用度高、体内半衰期时问适中、并且也容 易从体内排泄而广泛应用于临床治疗；第三类是以赖诺普利类似物为代表的药物，主要 2 - t 晓抑翻h 分离 化t 竞 为水溶性，吸收后不易与血浆蛋白结合，以药物原形从体内排出。但是长期服用化学合 成药物会产生药物不良反应，因此，开发安全、高效的天然降压药用于辅助治疗高血压 具有重要的意义。 1 2 1 国外研究进展 国外在a c e 抑制肽方面的研究开展的较早，取得了丰富的成果，目前国外研究成 果主要体现在以下几个方面。 ( 1 ) 在乳源蛋白方面 对乳源活性肽的研究最早始于1 9 7 9 年，由b r a n t i 等【1 6 】人第一次从牛b - 酪蛋白水解物 提取出了具有吗啡样活性的七肤，随后m 栅y a m 等【川从牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物 中获得具有a c e 抑制活性的1 2 肽，m u l l d l 婷t 1 羽人通过c 1 8 固相提取b 乳球蛋白胰蛋白酶 消化液，用2 0 - 2 5 乙腈洗脱得到肽物质，之后对固相提取物进行质谱分析，含有片 段p - l g f ( 1 4 2 1 4 5 ) ，采用截留分子量3 5 妨a 和1 k d a 的超滤膜可使a c e 抑制肽富集。y a m a m - o t o 等【1 9 1 用l c c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s c p 7 9 0 蛋白酶水解a 酪蛋白和b 酪蛋白，进行酶水解 物抑制a c e 活性研究，通过两步反相高效液相色谱( r v h p l c ) 分离水解物，再通过自发 性高血压大鼠( s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ，简称s 瑚u 实验检验其降血压活性，其中 序列为l y s v a l l e u - p r o - v a l - p r o - g l n 的肽链具有很强的活性。a b u b a b a r 等 2 0 1 人从蛋白酶k 的干酪乳涛蛋白的消化液中通过r p - h p l c 分离获得6 条具有抗高血压活性的肽，其中的 i p a ( i l e p r o - a l a ) 具有很强活性，对s h r 有明显降压作用。k o h m u r a 等1 2 1 1 人以b 酪蛋白的 某些片段为目标合成肽，每个肽段上都有一个脯氨酸，经体外实验证实活性区域集中在 f ( 3 9 5 2 ) 区段。 ( 2 ) 在发酵食品方面 n a k a 删嘲等嘲人利用c a l p i s 发酵剂中的l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i e u s 和s a c 圮h a r c m y o c so e 辑 - v i s i a e 发酵脱脂乳制备软饮料，发酵之后的脱脂乳a c e 抑制活性明显增加。通过4 步h g l c 分离纯化，从中提取出v 】) pf r a y - p r o - p r o ) 和i p p ( i l e - p r o - p r o ) 肽，随后的动物实验表明， s h r 口服一定剂量的酸奶或两种小肽均有明显的降压作用。s a i t o 等l 从清酒和酒糟中已 分离和鉴别出9 种a c e 抑制肽，在进行结构和活性的研究时发现这些抑制肽都是具有5 个 或更少氨基酸残基的短肽，c 端) b t r y 或1 弼曳基。m u g u e r z a 等刚人用e n t c r o c o c c u sf a c c a l i s 发酵牛乳也同样获得了a c e 抑制肽。 ( 3 ) 在动物蛋白方面 a s t a w a n 等t 2 5 】利用s e p h a d c ) 【g - 2 5 凝胶层析。再采用不同的离子交换树脂来处印度尼 黄 c e 抑_ 肚2 育砖化研竞 西亚干鱼和贝类的酶解产物，分离提取得到a c e 抑制肽，其分子量范围在1 0 0 0 - - 2 0 0 0 范 围内。m a t s u f u j i 凋利用碱性蛋白酶水解沙丁鱼获得1 1 种a c e 抑制肽，为2 4 肽，其q b a c e 活性抑制最强的肽为l y s - t y r 。经过肠道蛋白酶降解后，消化液的抑制活性没有改变，说 明此抑制肽不受消化道酶的改变。s u e t s t w i a 2 7 1 从沙丁鱼的肌肉组织中，利用酶解法获得 5 个六肽，并且其中五个小肽证实具有明显的降血压作用。由日本合成化学和京都大学 吉川正助共同研究的东方狐鲣鱼水解物项目开发成功，有关产品正在进行中试工作，可 望实现工业生产。该实验证实东方狐鲣鱼水解物中有1 0 余种二肽，这些二肽被认为具有 极强的a c e 抑制活性圆。a r i h a r a 等( 2 9 1 用8 种蛋白酶水解猪的骨骼肌蛋白，发现嗜热菌蛋 白酶的水解物a c e 抑制活性最高。同样从肌浆球蛋白的嗜热菌蛋白酶水解物中分离出 a c e 抑制肽，其序列分别为m e t - a s h 、p r o - p r o - l y s 和i i e - t h r - t h r - a s n p r o ，另外还有一些 三肽，同样具有降压作用。j a n g 【3 0 】用嗜热菌蛋白和p 坩t e i 瑚a 共同水解牛肉蛋白，经超 滤、凝胶层析和r p - h p l c 分离后，得到序列为v a l - l e u - a l a - g l n t y r _ l y s 的肽段，可以抑 制a c e 活性的3 0 1 。 ( 4 ) 在植物蛋白方面 植物类蛋白是一类非常具有提取a c e 抑制肽价值的资源。有文指出玉米醇溶蛋白和 玉米醇溶蛋白的酶解产物都具有降血压作用p “，m i y o s h i 等【3 2 1 研究发现，在玉米醇溶蛋 白的酶解产物中具有降压作用的主要是三肽，并且c 端只能是脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸。 利用嗜热菌蛋白酶水解玉米醇溶蛋白可获得一种具有明显降低血压作用的活性肽，其一 级结构为p r o - p r o - v a l h i s l e u ，并由此开发出具有明显降压作用的玉米多肽混合物“缩氨 酸”作为功能食品使用。目前日本昭利产业和日本食品化工等企业正研究开发具有降血 压作用的玉米肽p 3 1 。t 咖m a 等嗍利用蛋白酶在酸性条件下水解小麦麦谷蛋白，得到一 个具有抑制a c e 活性的三肽( 氨基酸序列为i i e - i i e t y r ) 并采用固相合成法合成了此肽，体 外实验结果证明合成的小肽同样具有抑制a c e 活性。 ( 5 ) 天然a c e 抑制肽 ， s u e t s u n a l 3 5 】采用离子交换和凝胶过滤色谱的方法分离大蒜中具有抑制a c e 活性的组 分，强抑制a c e 活性组分在r p h p l c 色谱中经进一步纯化可得到7 种具有抑制a c e 活性 的二肤，对其进行序列分析，通过化学合成后，饲喂s m t 具有降血压作用。 1 2 2 国内研究进展 国内目前关于a c e 抑制肽的研究不少，在分离过程和方法上，大部分还是吸取国外 的方法，因此真正在分离方面有所突破的报道不多。如倪莉等d 6 】采用凝胶色谱s e p 蛔d 懿 4 量黄a 旺坤制肚j 睛化研竞 g - 1 5 、离子交换层析和反相高效液相色谱法对水解度为2 0 的动物蛋白酶解产物进行 分离纯化，利用质谱测定其中一种a c e 抑制肽的组成为g l y - t y r 。1 9 9 7 年吴建平【3 7 】利用 米糠蛋白为原料，用胃蛋白酶在3 7 ，p h l 5 0 4 下水解米糠蛋白液，水解物再经凝胶过 滤和反相高压液相色谱分离得到l l e - a l a - p r o - a s n - t y r 、v a l a l a - p r o - a l a - g l y - t h r - i l e - a s n - t h r - t y r - p h e 、g l n - g l u - c y s - p r o - c y s - a l a - a s n - c y s - c y s - g l y - g l y e1 9 9 8 吴建平等p 研在p h 9 ， 反应温度为5 0 ( 2 ，酶量为4 ，底物浓度为7 5 的条件下水解大豆蛋白制备a c e 抑制肽， a c e 活性抑制率可以达到6 0 1 。李世敏等 3 9 1 从玉米淀粉的酶水解物中最终得到了五条 具有降血压活性的a c e 抑制肽单体。于江虹等【柚】从牛奶蛋白中分离出a c e 抑制肽，体外 实验表明对a c e 酶活性有很强的抑制作用，无论单次或连续给样，对s h r 均有显著降压 作用，对正常组无明显影响。张蓉真等【4 l 】将福建老酒样品经t o y o p e a r lh w 4 0 s 凝胶色谱 柱分离，得到5 种产物，其中第二组分具有较强的抑制a c e 活性。戴军等 4 2 1 从绍兴黄酒 中分离出具有降压活性的v a l g l u - a s p - g l y - g l y - v a l 、p r o - s e r - t h r ，a 泓，r 1 1 r 等小肽。2 0 0 3 年辛志宏等【4 3 悃碱性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白得到的水解物对血管紧张素转换酶有强 的抑制活性作用，小麦胚芽蛋白水解物s e p h a d e xg 1 5 纯化、制备r p h p l c 分离，得到 对a c e 活性有强烈抑制作用的组分，经氨基酸分析、电喷雾质谱确定序列为a l a - m c t - t y r 。赵骏等荆用酶解酪蛋白制各a c e 抑制肽等。由江苏大学开发的“紫菜a c e 抑制肽 制备技术研究”日前通过江苏省科技厅组织的鉴定。该成果建立了超声波与酶水解耦合 技术制备条斑紫菜a c e 抑制肽的方法，进行了条斑紫菜a c e 抑制肽的纯化与结构鉴定， 从条斑紫菜酶解液中获得y c y s - s e t - a m - a r g 和p r o - c y s - h i s t r p 两条新的高活性a c e 抑 制肽，其抑制a c e 活性的i c 5 0 ( 抑制a c e 活性5 0 时所需的a c e 抑制肽浓度) 值分别为 2 4 7 lt a g m l d 和5 3 8 腿m i 一，具有良好的耐高温性和酸稳定性，通过原发性高血压大鼠 的动物实验表明，条斑紫菜降压肽具有明显降低血压作用，呈量效关系【4 5 】。在国际科学 基金资助及国家海洋局的支持下，国家海洋局第二研究所研究开发出一种高活性a c e 抑 制肽。该所科研人员经研究发现，鲢鱼和贻贝酶解产物中的肽可用于高血压症的辅助治 疗。他们以鲢鱼和贻贝作原料，采用分步复合酶酶解及活性修饰等先进工艺，从中提取 出a c e 抑制肽，经冷冻干燥，制剂成型。经过对患有高血压症的老鼠进行实验，证明该 药降压效果显著。对病鼠给药6 h 后，老鼠的血压平均下降2 0 2 5m m l - i g ，最大降幅达3 0 m m h g ，经安全性检测，证明此药安全、无毒副作用。此种a c e 抑制肽不仅可以用作高 血压患者的治疗药物，而且可以作为健康者防止高血压症的预防用药。目前，该研究成 果已通过浙江省科技厅组织的成果鉴定【拈】。 嘴a c e 抑l 胜分育“垤，巴 1 3a c e 抑制肽的制备及分离纯化 1 3 1a c e 抑制肽的制备 随着现代科技的发展，近年来已在大量的动植物等食物蛋白中发现具有各种不同结 构的a c e 抑制肽，并且市场上也出现了一些食物蛋白来源活性降压肽商品。目前，人 们获得活性肽的方法有三种 5 4 1 ：首先是从自然界的生物体中提取本身固有的各种天然活 性肽类，如肽类抗生素、激素等；其次是消化过程中产生的或体外酶解蛋白质产生的具 有各种生理功能的活性肽类；再次通过化学法( 液相或固相) 、酶法或重组d n a 技术合 成的肽类。 ( 1 ) 直接提取法 直接提取法制备a c e 抑制肽，就是应用各种分离纯化技术，直接从各种自然界生物 体中把生物体或食品本身所含有的a c e 抑制肽提取出来。j e 等【5 0 1 从蓝色贻贝m ”i l 璐e d u - h s 发酵物中提取出序列为e 、1 m a q 儿y p g 的a c e 抑制肽，i c 5 0 值为1 9 3 4 p g m l ，一通 过直接口服可以有效地降低原发性高血压大白g ( s h r ) 的血压。a n d e r s 等刚发现，l a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s 发酵的酸乳中富含a c e 的抑制肽，对s h r 具有明显的降压作用；t o s h i a k i 等1 5 2 在鱼酱中也分离出a c e 抑制肽a l a - p m ，l y s p r o 和a r g - p r o 。a k i k o 等【5 3 1 综合比较 了多种不同发酵食品的降血压活性，发现大豆、干酪等食品经发酵后含有较高活性的 a c e 抑制肤，特别是以大豆为原料的发酵食品中含有较强的抑制a c e 活性组分。n o b y y a s um a t s u m u r a 等 5 4 1 从鲣鱼内脏的自溶产物中分离出6 种具有降血压活性的三肽和四肽， 其中4 种有很强的降血压活性。 ( 2 ) 合成法 合成法包括化学合成法、基因工程和酶法合成。化学合成法是游离的氨基进攻己连 接氨基的活化羧基，导致肽键的形成和活化剂的释放。m 删y 黝等嘲人通过液相法合 成了1 6 肽，证实从a c e i 的c 端起第3 个氨基酸残基显示了高度的立体专一性，并发现 a c e i 其c 端的三肽抑制a c e 活性很重要。化学合成法目前仅在实验规模中使用，还未 见其应用于工业生产的报道。基因工程即重组d n a 技术的实际应用，它是把在体外重 新组合的d n a 引入到适当的细胞中进行复制和表达。酶工程可用完整的微生物细胞或从 微生物细胞中提取的酶，作为生物催化剂进行蛋白质酶解。重组d n a 技术、酶法合成 a c e 抑制肽虽然可按人们的意愿合成任意活性肽，反应条件温和，能完成一般化学合成 难以进行的反应。但目前因为成本高、副反应多及残留有机化合物等问题制约着其发展。 6 - ，| ( 毫押_ 朋。隋“匕茸陵 ( 3 ) 体外降解法 体外降解蛋白质的主要方法有化学降解法与酶解法。化学降解法常采用加热和酸碱 处理的方法，虽简单价廉，但由于反应条件剧烈，在生产过程中氨基酸受损严重，酸水 解使l 氨基酸生成d 氨基酸，并能形成一些有毒物质；碱水解物有异味，并且难以按规 定的水解程度控制水解，故在食品工业很少采用i 铜。因此考虑到成本、技术的成熟度等 因素，酶解蛋白质法制备a c e 抑制肽必将成为一种主流，并且酶解蛋白生产a c e 抑制肽 具有安全性高、能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽、水解过程易控制、 不需要很高级的实验条件和昂贵的仪器设备、便于工业化生产的独特优势，引起人们的 极大兴趣，近几年报道的a c e 抑制肽的制备方法多采用酶解蛋白质法 5 6 1 。 a c e 抑制肽没有固定的氨基酸组成，因此酶解法制备a c e 抑制肽的原料来源选择十 分重要。大豆蛋白、鱼贝类蛋白、玉米蛋白、乳酩蛋白、鸡蛋等的年产量很高，并且价 格低廉，是生产a c e 抑制肽的良好原料。生产所用酶的选择是生产a c e 抑制肽的关键。 应根据酶的专一性从众多的蛋白酶中进行筛选。随着酶工程技术和生物技术的发展，己 有大量的蛋白酶闯世。目前已经应用在a c e 抑制肽生产的蛋白酶主要有碱性蛋白酶t 锕、 嗜热菌蛋白酶鲫、胰蛋白酶捆、a l c a l a s ed g l 、胶原蛋白酶6 0 1 、酸性蛋白酶【6 1 1 、胃蛋白 酶阍等，在酶法生产a c e 抑制肽的研究中，不同种类的酶、不同的水解条件都会使目的 产物有所差异，包括分子量分布、氨基酸组成、带电量、p n 值、极性等方面，因此会对 a c e 抑制肽的分离纯化产生重要影响。 1 3 2a c e 抑制肽的分离纯化 由于a c e 抑制肽的氨基酸组成和结构差别均较大，没有一个固定或较特殊的氨基 酸组成，并且食物蛋白质酶解产物成份相当复杂，这就增加了它的分离提取难度。a c e 抑制肽的分离提取甚至结构鉴定是一项最复杂，也是最有意义的工作。目前肽类分离纯 化常用的方法主要有以下几种。 ( 1 ) 根据分子大小差别的分离方法 主要有透析、超滤和凝胶层析等方法。透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白 质和肽分开。超滤( 简称u f ) 是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体进行物 理筛分的分离过程。其分子切割量( c w c o ) 一般为3 0 0 0 到5 0 万，孔径为1 0 0 r i m 。凝 胶过滤又叫分子筛层析，是本世纪六十年代发展起来的一种分离纯化方法。凝胶具有网 状结构，小分子物质由于分子体积相对较小能够进入其内部，而大分子物质由于分子体 积相对较大则被排阻在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按 7 - ，| c e 抑_ 肚分，r 懈竞 不同分子量筛分开了。凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛分功能 的一类化合物，这类化合物目前主要有葡聚糖凝胶、天然琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶及交 联不聚糖与双丙烯酰胺共聚的凝胶等州。 ( 2 ) 根据带电性质进行分离 肷类是两性物质，在每一个肽分子中都具有多个正电荷和负电荷，可利用肽分子的 这种性质将它们分离。目前主要有离子交换层析，聚焦层析等方法。离子交换层析是在 离子交换剂为固定相，洗脱液为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中带电荷 物质主要以离子交换方式进行反应，或以静电力进行吸附，这些过程都是可逆的。离子 交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择 性所决定。离子交换剂对呈两性离子的蛋白质、酶类、肽和核苷酸等物质的结合力主要 取决于这些物质的物理化学性质及它们在特定p h 值条件下呈现的离子状态。当p h 高于 等电点p i 时，它们能被阴离子交换剂吸附；反之，当p h d , 于p i 时，则被阳离子交换剂吸 附。离子交换层析主要是根据上述离子交换剂对各种离子或离子化合物的结合力的差异 把不同的物质分开。 ( 3 ) 高效液相色谱法 高效液相色谱法是在2 0 世纪6 0 年代末期，从气相色谱和经典液相色谱的基础上发 展起来的新型分离、分析技术。它采用了新型的高压输液泵、高灵敏度检测器及高效微 粒固定相，从而使经典的液相色谱获得了彻底的更新。高效液相色谱法兼有液相层析的 功能，可在常温下分离纯化物质以及具有气相色谱高压、高速、高分辨率和高灵敏度的 优点。将前面提到的凝胶排阻层析、离子交换层析及高效液相色谱相结合，可使蛋白质 水解物中的氨基酸、肽类及蛋白质通过成百上千次的层析分开。y a m a m o t o 等1 1 9 】通过两 步反相高效液相色谱( r p h p l c ) 分离水解物，获得序列为l y s - v a l l c u - p r o - v a l - p r o - g h 的肽链具有很强的抑制a c e 活性。n a k a m u r a 等固通过4 步唧l c 从中提取的v p p ( v a l - p r o - p r o ) 和i p p ( i l e - p r o - p r o ) 具有抑制a c e 活性的作用。鉴于食物蛋白质经酶解后产 生的a c e 抑制肽分子量一般在1 5 0 0 d a 以下，可以先用离心沉降、p h 等电点以及活性 炭吸附除去较高分子量、未水解的蛋白质，选择截留不同分子量的超滤膜，通过超滤除 去分子量较大的蛋白质和肽类以获得合理的氨基酸和短肽分布。可根据分子大小采用凝 胶过滤层析，将混合物通过多孔的凝胶床而达到分离目的，肽的回收率高，活力不受破 坏。使用过程中因其设备简单，重复性好，结果处理方便，因此应用非常广泛。许多 a c e 抑制肽的氨基酸结构非常接近，分子量的差别甚微，在这种情况下，如果凝胶层析 瞒 a 井出翻慵“研，巴 的分离效果不理想，往往需结合离子交换层析。但是，不同的离子交换树脂具有不同的 分离效果，因此对离子交换剂的选择就显得十分重要。 在进行a c e 抑制肽的分离纯化时，最好是将分离原理不同的2 种或多种手段结合 使用，从而使得到的耳的产物更纯。如a s t a w a n 等瞄谰s e p h a d e x - 2 5 凝胶层析和s p - s e p h - a d e xc 2 5 离子交换层析处理印度尼西亚干鱼酶解产物，获得了抑制a c e 活性的较高短 肽；s u e t s u n a l 6 6 1 用阳离子交换树脂d o w e x5 0w - x 4 和s ps e p h a d e xg - 2 5 凝胶从1 5 种鱼 贝类的胃蛋白酶水解产物中分离提取了a c e 抑制肽。k w o n 等1 6 7 采用凝胶过滤色谱法 和高效液相色谱法从红小豆中分离出氨基酸序列为v a l - g l y l e u - p r o - i l e - p h 的a c e 抑 制肽。s u e t s u n a 等【6 9 】人用阳离子交换树脂d o w e x5 0 w ( h + ) 、s e p h a d e xg - 2 5 凝胶和s p s e p h a d e xc - 2 5 从裙带菜( w a k a m e ) 酶解产物中分离出a c e 抑制肽并对其结构进行分析。 1 3 3a c e 抑制肽的评价 原料蛋白质经酶解反应后生成了众多的短肽和游离氨基酸，其中只有一部分肽具有 降血压活性。动物实验是评价a c e 抑制肽效应的有效方式，a c e 抑制肽生物学效应评价 的实验动物一般是原发性高血压大白鼠( s i - m ) 。a c e 抑制肽的动物实验一般采用口服或 静脉注射的方式，以不同剂量喂食或注射s h r ，同时做a c e i 药物对照组。比较不同剂量 对s h r 血压的影响，并与a c e i 药物的降压效果进行比较。由于动物实验费用昂贵，因此 建立一套体外测