（食品科学专业论文）松仁多糖的理化性质及免疫功能研究.pdf

摘要 摘要 红松( p m u sk o r a i e n s ss i e b e tz u c c ) ，是主产于中国小兴安岭的珍贵树种。其种仁具 有软化血管、降低血脂、胆固醇、甘油三脂及防止衰老的功能，具有广阔的应用开发潜 力。 本文以红松松仁为原料，利用现代分离分析手段，对松仁多糖的提取工艺、纯化分 级、理化性质、结构特征以及免疫活性进行了研究，主要结果如下： 1 、分别采用水提法、超声波和微波辅助提取法提取多糖，并对这三种提取方法的 最佳工艺进行了优化研究，多糖得率分别为6 2 6 ，1 0 7 4 和6 0 1 。超声波和微波辅 助提取均明显缩短了提取时间，具有高效、节能的优点。 2 、松仁多糖粗品( p n p c ) 除去蛋白质和小分子杂质，得到多糖精品( p n p p ) ，经 d e a e - 5 2 离子交换层析和s e p h a d e xg - 1 0 0 凝胶过滤层析分离纯化，得到了四个主要级 分，分别为p n p i - a ，p n p i - b ，p n p 2 - a 和p n p 3 a ，经纸色谱和高效液相色谱鉴定均为均 一组分。 3 、松仁多糖四个级分的分予量分别为1 0 2 x 1 0 5 d a l ，1 4 3 x 1 0 4 d a l ，1 1 0 x 1 0 5 d a l 和 1 6 3 x 1 0 5 d a l 。p n p l a 由鼠李糖和葡萄糖组成，摩尔比为1 0 0 ：2 5 7 ：p n i 1 - b 由阿拉伯 糖和葡萄糖组成，摩尔比为1 0 0 ：4 0 3 ；p n p 2 - a 和p n p 3 - a 均由葡萄糖一种单糖组成。 经红外光谱( 兀陬) 、紫外光谱和核磁共振光谱( n m r ) 对各组分进行结构分析，确定 p n p i a 、p n p i - b 、p n 】p 2 - a 和p n p 3 - a 的组成单耱均为b 吡喃糖。 4 、松仁多糖各剂量组均能显著增加小鼠免疫器官的重量，对小鼠的细胞免疫功能 和单核巨噬细胞吞噬功能也均有促进作用，其中，中剂量组2 5 0 m g k g d 均达到了显著 差异水平。此外，松仁多糖各剂量均能促进小鼠两种细胞因子i l - 2 和1 i - 6 的分泌，这 表明多糖可以增强机体的特异性体液免疫应答。 关键词松仁多穗：纯化；结构；免疫功能 东北林业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p i n u sk o r a i e n s i ss i e b c lz u c ci sar a r et r e es p e c i 瞄o fx m ox n ga n n gi nc h i n a 1 1 l e k e r n e lh a sv a r i o u sf u n c t i o n ss u c ha ss o f t e n i n gv n s , r e d u c i n gb l o o d - f a t , c h o l e s t e r o la n d t r i g l y c e r i d e s oi tc a nb ew i d e l ye x p l o i t e d t h i sp a p e ru s et h ep i n en u ta sr o u g hm a t e r i a l , s t u d i e dt h ee x t r a c t i o np r o c e s s ，p u r i f i c a t i o n , p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，s t r u c t u r a lf e a t u r e sa n di m m u n o l o g i cf u n c t i o n so ft h ep i n en u t p o l y s a c c h a r i d eo n p ) b ym o d e r na n a l y s i st e c h n i q u e t h cm a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 t h ep o l y s a c c h a r i d ew a se x t r a c t e db yh o tw a t e re x t r a c t i o n , u l t r a s o u n da n dm i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o nr e s p e c t i v e l y , a n dt h eo p t i m a lt e c h n o l o g yo ft h e s ee x t r a c t i o n sw a sm a j u r i z e d 1 1 罅y i e l d sa r e6 2 6 。1 0 7 4 a n d6 0 1 ，r e s p e c t i v e l y t h eu l t r a s o u n da n dm i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o ns h o r t e nt h ee x t r a c t i o nt i m eo b v i o u s l y , h a v i n gt h ea d v a n t a g eo fe f f i c i e n ta n d e n e r g y - s a v i n g 2 t h cp u r i f i e dp i n en u tp o l y s a c c h a r i d e ( p n p p ) w a sg a i n e dt h r o u g hd e t a c h i n gt h ep r o t e i n a n dm i c r o m o l e c u l a ri m p u r i t yf r o mt h ec r u d ep i n en u tp o l y s a c c h a r i d e ( p n p c ) ，a n df o u r f r a c t i o n s , p n p l - a ，n q p l _ b ，p n p 2 - aa n dp n p 3 - aw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e db yd e a e - 5 2 i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , a n ds e p h a d e x g - 1 0 0g e l - f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y f o u r f i a c t i o n sw e r es h o w nt ob eh o m o g e n e o u sb yp a p e rc h r o m a t o g r a p h y ( p qa n dh i g h p e r f o r m a n c ef i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( 磁l 日 3 t h cm o l e c u l a rw e i g h t so ft h ef o u rf r a c t i o n sw e r e1 0 2 x 1 0 s d a l , 1 4 3 x 1 0 4 d a l 1 1 0 x 1 0 5 d a la n d1 6 3 x l 矿d a l t h eu n i tm o n o s a c c h a r i d eo fp n p l aw a si d e n t i f i e da s r h a m n n s ea n dg l u c o s ew i t ht h er a t eo f1 0 0 ：2 5 7 ；a n dt h eu n i tm o n o s a c c h a r i d eo fp n p i - b w a si d e n t i f i e da sa r a b i n o s ca n dg l u c o s ew 铂1t h er a t eo f1 0 0 ：4 0 3 ；p n p 2 一aa n dp n p 3 - aw a s b o t hc o n s i s t e do fg l u c o s e t h es t r u c t u r e so ft h ef r a c t i o n sw e r ea n a l y s e dt h r o u g hf f i r , u l t r a v i o l e ts p e c t r aa n dn m rs p e c t r a , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm o n o s a c c h a r i d eo fp n p i - a , p n p i - b ，p n p 2 - aa n dp n p 3 - aw e r ea l l1 3 一p y r a n o s c 4 p n p pd o s a g eg r o u p sh a v ea p p a r e n te f f e c t st oi n c r e a s et h ew e i g h to fn o r m a lr a t s i m m u n eo r g a n , e a c hd o s a g ec a na c c e l e r a t et h ec e l l u l a ri m m u n ef u n c t i o na n dm o n o n n s l e a r p h a g o c y t ef u n c t i o n , a n d2 5 0 m g k g dh a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e f u r t h e r m o r e ，p n p pd o s a g e g r o u p sh a v ea p p a r e n tp r o m o t e re f f e c t st ot h es e c r e t i o no fn o r m a lr a t s i l - 2a n di l - 6 ，i ts h o w s t h a tp n p pc a l le n h a n c es p e c i f i ch n m o r a li m m u n er e s p o n s e k e y w o r d s p i n en u tp o l y s a e c h a r i d e ；p u r i f i c a t i o n ；s t r u c t u r e ；i m m u n o l o g i cf u n c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘韭盎些盘鲎或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 ，1 ，。 学位论文作者签名：制乃签字日期：珈7 年g 月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盎韭挂些盘茔有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权壅i 垦签些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：别荡 签字日期：弘噼加仍日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 剔磁辄动吁 签字日期：弘吵年占月w 日 电话： 邮编： _ 单= i 日= _ _ _ j _ l l _ _ _ l _ 一_ _ _ o _ l o 一 1 绪论 蛋白质、核酸和多糖是最重要的三种生物大分子，蛋白质和核酸在生命现象中的重 要性已为世人所知。以基因重组为代表的生物工程已经并将大大地造福于人类社会。多 塘类物质的研究水平远远落后于蛋白质和核酸，多糖作为药物始于1 9 4 3 年i l j ，但是在 较长时间内没有得到足够的重视。近三十多年来，随着生物和化学科学的快速发展，多 塘的诸多功能得以揭示。随着免疫物质的化学研究与发展以及新药物资源的寻找与研 究，人们发现糖类在生物体中的作用不仅是作为能量资源或结构材料，更重要的参与7 生命现象中细胞的各种活动，特别近年来人们发现，多糖对很多危害人类健康的疾病， 如免疫紊乱、糖尿病、血栓及肺炎等都有显著的疗效，因此糖的研究开始逐步活跃起来 i 粥】。其中，一些分子量在几千以上，具有很强生物活性的活性多糖的研究受到日益重 视。到目前为止，已有近3 0 0 种的多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来，其中从 植物中，尤其从中药中提取的水溶性多糖最为重要。它们的生理活性、化学结构以及构 效关系成为多糖研究的前沿阵地，取得了很大的进展i ”j 。 1 1 多糖的研究概况 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) ，又称多聚糖，通常是由d 葡萄糖、d 半乳糖、l 阿拉伯 塘、l 鼠李糖、d 半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等单糖分子脱水缩合并借糖苷键彼此连接而 成的高分子物质阎，在植物、动物和微生物细胞及细胞壁中广泛存在，主要的存在形式 有淀粉、纤维素和半纤维素、某些果胶、树胶、黏液质和黏胶质、糖原、肝素、硫酸软 骨素和透明质酸等。多糖按在生物体内的功能可以分为两类，一类是作为组织细胞的支 架结构分子，如甲壳类动物中的几丁质、植物中的纤维素等；另一类是生物体贮存养料 的单位和主要的能量来源，如淀粉、糖原等。天然植物中常见的多糖为菊糖、淀粉、树 胶和黏液质、果胶等，以前认为这些多糖大多无生物活性，通常把它们作为杂质除去。 从2 0 世纪6 0 年代以来逐渐发现多糖在抗肿瘤、抗病毒、抗心血管疾病及抗衰老等方面 有着独特的生物活性，其作用多数是通过免疫系统来实现的1 7 j 。 1 1 1 多糖的提取分离 1 1 1 1 多糖的提取 多糖是极性大分子化合物，提取前先用低极性溶剂( 如甲醇一氯仿、石油醚和丙酮 等) 除去亲脂性成分，再用不同温度的水、稀碱溶液提取，尽量避免在酸性条件下提 取，以防引起糖苷键的断裂 s - 9 1 。由于水提时间长且效率低，碱提易破坏多糖的立体结 构及活性，现在有研究采用酶法提取多糖，即采用复合酶一热水浸提相结合的方法，复 合酶多采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶，此法具有条件温和、杂质易除 和提高得率等优点，已较好的应用于大枣多糖i 、黄芪多糖【1 1 1 及百合多糖【1 2 】等的提 取。此外，有研究表明，利用超声波i 廿1 、微波l m l 6 l 等技术辅助提取可有效地提高多糖的 东北林业人学硕上学位论文 得率和产品质量，并能缩短反应时间。 1 1 1 2 多耱的分离 多糖提取之后，其中还含有许多杂质要除去，如色素、低聚糖及高分子量的蛋白质 等。小分子杂质可选用不同孔径的透析膜，用透析法去除。多糖中游离蛋白质的去除方 法有s c r a g 法，三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法。前两种方法常用于微生物多糖的分离， 后者多用于植物多糖。而上述三法皆不适用于由祷和欣共价结合而成的糖肽类i 怫。因为 糖肽在处理中也被沉淀出来，因此结合蛋白质的去除常先用蛋白酶破坏蛋白质与糖的结 合再去除蛋白，应用此法的有螺旋藻多糖【堋、百合多糖【1 9 】等。此外，李知敏等研究发 现，可用2 m o l l 的盐酸调节多糖提取液的p h 值，放置过夜，离心去沉淀，得无蛋白的 糖溶液。盐酸法的除蛋白率高于三氯醋酸法和s e v a g 法，但对所得多糖的活性的影响未 见报道【刎。 1 1 2 多糖的纯化 采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，是多分散性的。其不均一性表现在 化学组成、聚合度及分子形状等的不同。纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖的过 程。 1 1 2 1 分级沉淀法 利用不同多糖的分子大小和溶解度不同而分离，常用的有季铵盐沉淀法和有机溶剂 沉淀法。 1 1 。2 2 凝胶柱层析法 凝胶柱层析是根据多糖分子的大小和形状不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶 ( s e p h a d e x ) 、琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 及d e a e s e p h a d e x ，以不同浓度的盐溶液和缓 冲溶液作为展开剂( 离子强度最好不低于0 0 2 ) ，从而使不同大小的多糖分子得到分离 纯化。这种方法不适用于粘多糖的分离【2 1 t 。 1 1 2 3 纤维素阴离子交换柱层析法 常用的交换剂有d e a e 一纤维素( - - 乙基氨基乙基纤维素) 、d e a e - 葡聚糖和d e a e - 琼脂糖，可处理为酸型、碱型和硼砂型三种。洗脱剂可采用不同浓度碱溶液、硼砂溶液 以及盐溶液。此法优点是可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和 粘多糖。多糖在交换柱上的吸附力与多糖结构有关，一般随酸性基团的增加而增加。对 于线状分予，分子量较大的多糖吸附力强，直链多糖较分支多糖易吸附i 翻。 1 。1 。2 4 膜分离法 膜分离不仅节约能源，无污染且保留生物活性成分的高效价，因而得到广泛的应 用。不同的超滤膜具有允许不同相对分子质量和形状的物质通过的性质，多糖溶液通过 各种己知的超滤膜就能达到分离。近年来使用外场强化使超滤效果得以提高【2 3 1 。膜分离 法已经应用于米糠脂多糖 钏和香菇多祷闭等的分离提取中。 多糖的分离纯化方法除上述几种方法外，还有金属络合物法、盐析法及制备性区域 1 绪论 电泳法等。国外采用l k b 柱层析系统，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。 多糖的检测可用比旋度、示差折射及紫外检测等方法，也可以用苯酚- 硫酸法及蒽酮硫 酸法测定多糖。纯度的鉴定可以用超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法、高效液相法、 示差折射法和紫外检测法等陋硎 1 1 3 多糖的结构分析 1 1 3 1 多耱的结构层次 多糖是生物大分子，具有十分复杂的结构。它的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分 析方法，分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构【2 8 l 。 多糖的一级结构是指糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构 型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。糖的一级结构非常复杂，糖残基上还可以 连接硫酸基团、甲基化基团、磷酸基团和乙酯基团，这就使得多糖一级结构更加复杂。 多糖的二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体，只关系到多糖分 子中主链的构象，不涉及侧链的空间排布，它的结构形式主要依赖一级结构的排布。在 多糖链中，糖环的几何形状几乎是硬性的，各个单糖残基绕糖苷键旋转而相对定位，由 此决定多糖的整体构象【嚣j 。 多糖链一级结构的重复顺序，由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非 共价相互作用，导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象，即多糖的三级结构i 刊。 多糖的四级结构是指多聚链间非共价键结合形成的聚集体。多糖链的聚集作用可在 相同的分子问进行，也可在不同的多糖链间进行p ”。 由上可知，多糖的结构形态是各个单糖残基在空间相对定位的综合。解析这些定 位，对于理解多糖的生物学功能有极深刻的意义。 1 1 3 2 多糖的结构描述 多糖的结构描述包括分子量范围、单糖的组成、连接点类型、单糖和糖苷键的构型 及重复单元等。要获得以上信息需借助于元素分析仪、气相色谱、质谱、红外光谱、核 磁共振和圆二色谱等仪器检测，以及通过酸水解等化学方法，还可采用酶降解、免疫化 学等生物学方法 3 2 - 3 3 1 。但目前还没有一种方法可以单独完成其结构分析，必须综合使 用。表1 1 列出了多糖的一级结构测定常用的技术方法。 表1 - 1 多糖结构鉴定的常用方法 解决的问题常用的方法 分子量测定 单糖组成和分子比例 毗喃环或呋哺环形式 连接次序 羟基被取代情况 糖链肽链连结方式 a ，b ，异头异构体 凝胶过滤法、质谱法、蒸气压法、粘度法 部分酸水解、完全酸水解、纸色谱、气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱 红外光谱 选择性酸水解、糖苷键顺序水解、核磁共振 甲基化反应一气相色谱、过碘酸氧化、核磁共振、质谱法 单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应 糖苷酶水解、核磁共振、红外光谱、拉曼光谱 确认提取物为单一多糖后便可进行结构分析。其分析手段分述如下： 东北林业大学硕士学位论文 ( 1 ) 气相色谱( g c ) 和气质联用( g c - m s ) 法它们可快速准确地测出多糖的组 成及各单糖之间的摩尔比。但这2 种方法要求所测样品具一定的挥发性，因此待测样品 多需制备成硅烷化衍生物、乙酰化衍生物等； ( 2 ) 核磁共振光谱( n m r ) 法主要用于确定多糖结构糖苷键的构型以及重复结构 中单糖的数目。一般1 h n m r 用于测定简单的多糖，因它的化学位移范围比较小， 1 3 a q m r 图的化学位移较宽，用于测定复杂的多糖； ( 3 ) 紫外光谱法常用来检测多糖中是否含有蛋白质、核酸及多肽类，因它们的 紫外吸收峰在2 6 0 2 8 0 n m ； ( 4 ) 红外光谱法常用来确定吡喃糖的糖苷键构型及常规观察其它官能副3 4 1 ； ( 5 ) 快原子攻击质谱( f a b - - m s ) 法用于测定多糖结构，用反应质谱法( r e a c t i o n m a s sp e c t i o m e t r y ) 成功地解决了糖的差向异构体的区别。在f a b 离子源中，一种芳基硼 酸如2 ，4 二甲基苯基硼酸( d m p b ) 或1 - 萘基硼酸( n b ) ，可以立体选择性地与糖反应生成 离子特征 m s + m r - h 2 h 2 0 和 m s + m r - h - 4 h 2 0 1 。对于不同的糖，二者的强度比值不同， 因而可以区别各种糖的差向异构体，特征离子的结构可以由碰撞活化谱推知1 3 5 - 3 6 1 ： ( 6 ) 化学方法酸水解是目前应用较多的一种化学方法，它分为完全酸水解和部 分酸水解。用完全酸水解方法，可鉴定多糖中的单糖组分；用部分酸水解来解析多糖中 的低聚糖，也可用酶解法来替代。其它的化学方法包括：过碘酸氧化、s m i t h 降解、碱 降解、甲基化反应、乙酰解等化学降解法以及酶解法、免疫化学和放射化学法，用于多 糖结构中糖苷键的构型、单糖之间的连接部位确定等，但使用时一般需物理方法和化学 方法结合起来才可完成多糖的结构测定； ( 7 ) 酶学方法糖苷酶是研究糖苷链结构必不可少的一种工具。这是由于它们具 有高度的底物专一性，尤其对糖苷连接的异头体的构型( a b ) 和糖残基的绝对构型 ( d ，l ) ；至于对糖残基成环的方式( 吡喃环还是呋喃环) 、连接方式( 1 2 、1 3 、1 4 或 1 6 ) 是否存在分支以及配糖体的性质等方面的要求，就不是非常严格，可以有些变 动，它在糖链结构研究中的应用，主要是：确定糖链的残基的顺序，阐明糖链的一级结 构；以及确定每个组成单糖残基的异头体构型。在完成上述的目标时，所用的酶都是外 切糖苷水解酶，而内切糖苷水解酶主要是用于从糖复合物中释放出糖链，以及了解糖链 和非糖部分的连接情况。有时也可将长的糖链切断为较短的寡糖片段，以利于结构分析 1 3 7 - 3 s l 。 多糖是大分子化合物，故要鉴定多糖的结构首先要了解它是由哪些单糖组成以及各 种单糖之间的比例，一般是将糖苷键用酸、酶、甲醇水解或选择性降解，将大分子裂解 成各种片段，各自分析后拼凑成一个化合物。可用纸层析、薄层层析、气相色谱法及高 效液相色谱法等方法测定。然后需判断糖苷键位置、糖环结构、组成单糖残基顺序、糖 类o 、b 异构体类型等。目前核磁共振法应用较为广泛，可以在不破坏多糖结构的基础 上同时测定q 、b 异构体类型、糖苷键位置、单糖残基顺序等。另外可用甲基化分析结 合气相色谱法及质谱仪测定糖苷键位置；用甲基化分析高碘酸盐氧化作用，乙酰解、 1 绪论 甲醇解、酸水解、酶水解、降解等各种方法结合色谱法测定单糖残基顺序；用甲基化、 部分酸水解、乙基化等步骤处理多糖，再用高效液相色谱法分离鉴定糖环结构类型，也 可以电离方法用质谱仪法直接分析烷基化寡聚糖来决定糖环结构类型；此外，还可用异 构酶水解及红外光谱法确定a 、b 异构体类型p 9 l 。 1 1 4 多糖的免疫活性 多糖的药用研究始于4 0 年代，6 0 多年来，人们从动物、植物及微生物中提取分离 了大量的多糖及多糖类物质用作治疗或辅助治疗药物【枷。做为生命活动中起核心作用的 基本物质，多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降 血脂及保肝等多种功能1 4 1 删。而且多糖是通过宿主中介起作用，所以多糖没有细胞毒 性，不影响正常细胞。目前多糖的活性研究主要集中在它们的结构和免疫调节活性的关 系、分子水平的作用机制及如何通过化学修饰增强其生物活性上【4 “卯。其免疫调节作用 主要通过以下几个途径实现： 1 1 4 1 对皂噬细胞功能的影响 巨噬细胞是一种多潜能细胞，不仅参与机体的特异性免疫反应和非特异性免疫反 应，而且是两种免疫反应联系的。桥梁细胞”巨噬细胞通过以下方式来实现免疫调 节：( 1 ) 通过调理机体加强吞噬作用，即经抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用发挥作用； ( 2 ) 通过非特异性膜受体，直接与肿瘤细胞结合，发生溶细胞作用；( 3 ) 通过巨噬细胞分 泌的一些细胞因子抑制肿瘤组织的生长。银耳多糖对小鼠单核吞噬细胞系统有明显的激 活作用，并随剂量增大而增强，其吞噬指数( k 值) 和吞噬系数( a 值) 均显著升高i 硐增 强巨噬细胞功能的多糖还有牛膝多糖i 舯一辖l 、甘草多糖 删、人参多糖例和黄芪多糖【5 l 】。 1 1 4 2 对t 细胞免疫功畿的增强作用 t 细胞既是免疫应答的效应细胞，也参与免疫应答的调节，抗原刺激在体内发生的 体液免疫或细胞免疫都是由抗原递呈细胞和t 辅助细胞f 1 1 l 细胞) 的相互作用开始的【5 2 1 中药枸杞多糖( l b p ) 对t 淋巴细胞介导的免疫反应有明显的选择促进作用，对胸腺 t 淋巴细胞的增殖效应最强，对脾t 淋巴细胞亦有促进作用，是一种t 淋巴细胞免疫佐 剂【5 3 】。 香菇多糖是一种典型的t 细胞激活剂，具有调节细胞免疫功能的作用。另外，有人 报道香菇多糖对肿瘤及慢性肝炎有免疫调节作用，主要是促进t 细胞活性，对辅助性t 细胞及杀伤性t 细胞的促进作用尤为显著，具有抗病毒及诱生干扰素保护肝脏的作用 p 4 - - 5 5 l 。此外，灵芝多糖可通过间接激活淋巴细胞中d n a 多聚酶而促进d n a 合成及t 细胞增殖，促进i l - 2 产生，从而影响t 细胞亚群的数量和功能闭。 1 1 4 。3 对b 细胞及其产生抗体的增强作用 b 细胞是抗体产生细胞，b 细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞产生抗体，发生 抗体依赖或抗体介导的免疫应答。近年证明b 细胞本身也是一种抗原递呈细胞，将捕捉 的抗原信息递呈给弧细胞，使抗原聚集，利于免疫应答的发生吲。 东北林业大学硕士学位论文 江振友等【5 8 1 报道，灵芝多糖能提高小鼠的b 细胞产生特异性抗体，并显示高、 中、低3 个剂量组中，低剂量组小鼠抗体生成细胞增加，作用比较明显，并在2 周内喂 养和对照组比较有显著性差异。j o n g - i lp a r k 等从一种药用植物黄柏的皮层中提取纯化 得到一种杂多糖，该多糖作用于小鼠的多克隆抗体组成的细胞系统，表现出有效的b 淋 巴细胞刺激活性瞵9 l 。此外，蚕蛹多糖【6 0 l 和灵芝多糖【6 1 1 均可增强小鼠b 细胞增殖。 1 1 4 4 激活n k 细胞和l a k 细胞 n k 细胞是生物体内天然存在的非特异免疫杀伤细胞，它在宿主的免疫监视功能中 有着重要的作用。l a k 细胞是淋巴因子诱导的杀伤细胞，经i b 2 激活可杀伤肿瘤细 胞，而对正常细胞无损伤。香菇多糖与化疗药物合用可提高化疗患者n k 细胞的活性， 使n k 细胞对t 淋巴细胞的应答性增强1 6 2 】。邵树军等【叫试验证明，每天在腹腔注射牛 膝多糖6 0 m g , x g ，连续1 0 天不仅能对抗环磷酰胺( c o 所致的小鼠外周血中n k 细胞活 性降低，还能提高正常小鼠外周血中n k 细胞活性。杨海贤等【叫证明，黄芪多糖具有不 同程度的提高存活l a k 细胞的体密度，减少坏死及凋亡细胞的体密度的作甩。 1 1 4 5 对d c 细胞的影响 d c 细胞是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞( a p c ) ，它能摄取各类抗原，在机体 细胞免疫和体液免疫调控中均起着重要作用。何彦丽等【6 5 】分析得出，枸杞多糖、香菇多 糖及云芝多糖等多种中药多糖( 主要由1 ，3 糖苷键为主链的葡聚糖或杂聚糖组成) 可增 加淋巴细胞培养上清液中的i ) c 前体细胞数量，诱导体内产生的多种细胞因子，均有促 进d c 分化和成熟的作用已有多数试验结果表明，多糖可提高小鼠脾脏t 细胞的增殖 功能和血清抗体水平，增强杀伤性t 淋巴细胞( c t l ) 、n k 细胞的杀伤功能，多糖的这 些作用有可能部分就是通过促进d c 细胞的功能成熟来实现的。 1 1 4 6 激活网状内皮系统( 砌璐) 生物体中的网状内皮系统具有吞噬、排除老化细胞和异物及病原体的作用，常用碳 廓清法测定其活性。从三七根中提取的多糖可显著增强网状内皮系统在碳廓清试验中的 活性，并增强小鼠绵羊红细胞抗体的生成，恢复由环磷酰胺延迟的过敏反应。此外，甘 草多糖、杜仲多糖、雷丸多糖、刺五加多糖及虫草多糖也都能激活网状内皮系统i 的j 。 1 1 4 7 对补体系统的作甩 补体是血液中一组具有酶源活性的蛋白质系列，是机体非特异性免疫系统的重要组 成部分，在宿主防御机制中起重要作用。不同多糖对补体有不同的作用，大部分多糖能 活化补体系统的经典途径及变更途径。如酵母多糖、当归多糖和茯苓多糖是通过替代途 径激活补体的，圆锥绣球多糖是通过经典途径，而酸枣仁多糖和车前子多糖可由替代、 经典2 条途径激活补体1 6 7 稍j 1 1 4 8 对细胞因子的影响 植物多糖能促进白细胞介索( 0 、干扰素( 硬n ) 和胂瘤坏死因子( 响等细胞因子的 生成。 黄芪多糖可以升高以大黄建立的脾虚模型小鼠i l - 2 水平，枸杞多糖能显著增加老 1 绪论 龄或成年小鼠细胞i l - 2 的分泌，低浓度时还可以促进i l - 3 的分泌【叭嘲 灰树花多糖具有较明显的抗流行性感冒病毒和单纯疱疹病毒的作用，其抗病毒作用 与其促进i f n 的产生有关【7 n 。此外，黄芪多糖、人参多糖、柴胡多糖、刺五加多糖、银 耳多糖及当归多糖等均能诱生i f n 。 奚瑾磊等发现当归多糖( a s p ) 及其中性组分( a s p l ) 在体内外均可增强小鼠腹腔细胞 分泌n 旺d 的功能盼俐。 1 1 5 多糖研究的发展趋势 多糖作为一类重要的生物活性物质，到目前为止，虽然只有云芝多糖、猪苓多糖、 香菇多糖、裂褶多糖和茯苓多糖等少数应用于临床，但它们在抗肿瘤、抗凝血、抗突 变、降血脂、抗衰老及抗病毒等疑难病症的治疗方面已显示了诱人的前景。国内多糖的 研究一般仅限于分离纯化、化学组成、生物活性和免疫药理研究糖结构的分析和多糖 构效关系的研究没有很大突破。国外有研究认为多糖像蛋白和酶一样可能在分予中存在 一个或几个寡糖片断的活性中心，因此，研究多糖的结构及活性片断与药理活性的关系 将成为多糖研究工作中的一个热点。 1 2 红松的研究概况 红松( 尸跏淞k o r a i e n s i ss i e b e tz u 嘲，别名海松( 草本纲目) 、果松( 东北) 、朝鲜松( 中国 裸子植物志1 ，是主产于中国小兴安蛉的珍贵树种。红松坚果主要利用器官为种子。目 前对松仁的研究主要集中在不饱和脂肪酸、磷脂及甾醇等脂溶性成分上，对其他天然成 分则几乎没有进行深入研究。 1 2 1 红松松仁的主要化学成分 松仁具有很高的营养价值，据北京食品协会测定，红松种仁的含油率达 6 5 - 7 8 ，每百克松仁含蛋白质1 3 1 5 9 ，脂肪6 9 3 0 9 ，碳水化合物8 1 7 9 ，粗纤维 9 0 2 9 ，维生素c 1 8 8 m g ，维生素1 3 0 4 r a g 。种仁内还含有锌、硒等一系列微量元素和人 体必须的1 8 种不饱和氨基酸，其中精氨酸、天门冬酸、谷氨酸、亮氨酸占 1 3 8 1 6 9 7 4 1 。 1 2 2 红松松仁的功能 红松种仁具有软化血管、降低血脂、胆固醇、甘油三脂及防止衰老的功能，入药能 够熄风，润肺，治风痹、头眩、燥咳、吐血、便秘，对动脉粥样硬化、高血压有明显的 预防和治疗作用。 1 2 _ 2 1 对细胞因子的影响 松仁所含的脂肪，主要为亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸，可消除胆固酵沉积、 调整和降低血脂、软化血管和防治动脉粥样硬化。多不饱和脂肪酸还能减少血小板的凝 集和增加抗凝作用，放能降低血脂和血液黏稠度，预防血栓形成，对心血管系统有保护 作用。因此，老年人常食松仁，能防止因胆固醇增高而引起的心血管疾病。 东北林业大学硕士学位论文 1 2 2 2 增强机体免疫力 松仁中的磷脂能显著提高机体免疫功能，激活巨噬细胞的活力，增强吞噬能力，提 高机体抵抗疾病的能力；多糖和维生素e 在一定程度上都具有调节血脂代谢及抗氧化作 用，能够增强机体的免疫力。 1 2 2 3 延缓衰老 磷脂在人体神经系统生长发育、生殖激素的分泌调节等方面起着重要的作用，可以 补脑健脑，预防神经衰弱、老年痴呆症等。a 一亚麻酸是维持大脑和神经系统所必需的 因子，具有延缓衰老的作用。 1 2 2 。4 排毒养颜 亚油酸是皮肤表皮脂质屏障形成的要素，磷脂能够促进皮肤对氧气、养分的吸收， 它们对细胞增殖、代谢性调节和表皮细胞的角化将产生重要的影响。 1 2 2 5 其它功能 松仁中的二十八烷醇是世界上公认的抗疲劳物质，维生素e 具有抗肿瘤、防止 d n a 的辐射损伤等方面的作用。另有文献表明，二十八烷醇混合物还具有消炎和防治 皮肤病的作用，对胃、十二指肠溃疡以及脱发等疾病具有显著疗效【。 1 3 研究内容和意义 本课题的目的在于探索红松松仁中的水溶性多糖的提取分离工艺，并对它的理化性 质和免疫活性进行测定。 在我国红松松仁年产量较大，黑龙江省是红松的主要分布省区，全省年产红松松仁 约7 4 8 万吨，但大部分经过简单的加工后，均以千果、饮料等的形式被人们食用，对松 仁这一具有显著生理功效的宝贵资源的研究利用相对不足。 天然产物一直是国内外研究的热点，而运用现代科学技术对天然产物的活性成分进 行研究，包括分离、纯化、结构测定、功能的研究是新世纪天然产物研究的趋势，具有 生物活性的多糖的研究是其重要组成部分。 本项研究将为红松松仁的深入开发提供理论基础，这对于开发红松松仁的精深产品 和现代生物制品具有重要意义。 2 松仁多糖的提取工艺研究 2 松仁多糖的提取工艺研究 植物多糖的常规提取方法为水提法，其影响因素包括浸提温度、时间及料液比超 声波和微波是近年兴起的可有效提高多糖得率的辅助提取方法，这两种方法均会受到作 用功率和时间的影响。本文以松仁多耱的得率和总糖含量为考察指标，通过单因素试验 和正交试验对水提法、超声波及微波辅助提取法的提取工艺进行了优选，由此为下一步 的研究工作及松仁多糖的高值化综合利用打下了基础。 2 1 试验材料 2 1 1 材料 松仁，松科植物红松( p i n g sk o r a i e n s i ss i e b e t z u 嘲的果实，购于哈尔滨市南极批发 市场。 2 1 2 试剂 乙醇、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、硫酸、丙酮、乙醚及三氯乙酸等均为国产分析纯 试剂。 2 1 3 仪器 超临界萃取装置h a l 2 1 5 0 - 0 2 紫外可见分光光度计 7 5 6 p c 旋转蒸发仪r l - 5 2 a 循环水多用真空泵 s h b - 3 高剪切力分散乳化机 f a 2 5 超声波细胞粉碎杌y 9 9 2 d l g 微波炉w d 7 0 0 真空冷冻干燥机a 】口h a i ，2 高速万能粉碎机f w l 0 0 恒温水浴锅t d a - 8 0 0 2 离心机tdl-5 恒速电动搅拌器等j j - 5 2 2 试验方法 江苏南通华安超i | 缶界萃取有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 郑州杜甫仪器厂 上海弗鲁克流体机械制造有限公司 宁波新芝 天津乐津电子有限公司 g e r m a n y 天津市泰斯特仪器有限公司 天滓市泰斯特仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 常州国华电器有限公司 2 2 1 原料预处理 松仁粉碎后，用超临界萃取装置除去大部分油脂，以丙酮为溶剂再次回流除脂，低 温烘干，粉碎备用。 东北林业大学硕上学位论文 2 2 2 工艺流程 热水浸提 原料一预处理一均质乳化一超声波提取一除蛋白( 1 5 三氯乙酸) 一定容( 测定糖含 微波提取 量) - - 9 5 乙醇沉淀一粗多糖 2 2 3 多糖含量测定方法 本试验采用苯酚一硫酸法【7 6 l 测定多糖得率。 称取0 0 2 5 9 干燥至恒重的葡萄糖，定容至2 5 m l ，再取l m l 定容至2 5 m l 。分别吸 取0 、0 4 、0 6 、0 8 、1 0 、1 2 、1 4 、1 6 、1 8 m l ，稀释至2 m l ，各加入l m l 的6 重蒸 酚溶液和5 m l 的浓硫酸，室温放置l o m i n ，混匀。静置2 0 r a i n ，4 9 0 h m 处测定吸光度。 样品测定：吸取除蛋白的多糖提取液l m l ，定容至l o o m l 。取定容液l m l ，按上 述步骤操作测定吸光度，以标准曲线回归方程计算多糖含量，校正因子取0 9 。 多糖的得率( ) = 测量浓度稀释倍数x 提取液体积x o 9 原料干重 2 2 4 热水浸提法 2 。2 4 1 单因素试验 现有的多耱研究结果表明，浸提温度、时间和料液比是影响多糖得率的主要因素。 本试验选取这三个因素做为考察因素，按照2 2 2 所示的工艺流程进行单因素试验。 ( 1 ) 浸提温度对多糖得率的影响在浸提时间为3 h ，料液比为1 ：3 0 的条件下， 选取浸提温度的五个水平为6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 进行单因素试验，研究浸 提温度对多糖得率的影响。 ( 2 ) 浸提时间对多糖得率的影响在浸提温度为8 0 ，料液比为1 ：3 0 的条件 下，选取浸提时间的五个水平为1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 进行单因素试验，研究浸提时间 对多糖得率的影响。 ( 3 ) 料液比对多糖得率的影响在浸提温度为8 0 ，浸提时间为3 h 的条件下，选 取料液比的五个水平为1 ：1 0 、1 ：2 0 、1 ：3 0 、1 ：4 0 、1 ：5 0 进行单因素试验，研究料 液比对多糖得率的影响。 2 2 4 - 2 正交试验 在上述单因素试验的基础上，按l “3 3 ) 进行正交试验，因素水平安排见表2 1 ，试 验设计、结果及数据分析见表2 - 4 和表2 5 。 表2 - 1 水提法正交试验水平表 2 松仁多糖的提取工艺研究 2 2 5 超声波辅助提取法 2 2 5 1 单因素试验 采用超声破碎方法破碎细胞，可以提高多糖得率。超声破碎有3 个条件需要设定，即 超声功率、超声时间和超声作用方式( 脉冲) 。本试验固定脉冲时间l o s ，间隔3 s ，改变 超声功率和超声时间，并针对多糖易溶于热水的性质，结合不同水浴温度及料液比研究 它们对松仁中多糖得率的影响m 。 ( 1 ) 超声波处理时间对松仁多糖得率的影响在料液比为1 ：3 0 、超声波的保护温 度为7 0 、功率为5 0 0 w 的条件下，选取超声时间的八个水平为1 5 r a i n 、2 0 r a i n 、 2 5 r a i n 、3 0 m i n 、3 5 m i n 、4 0 m i n 、4 5 m i n 、5 0 m i n 进行单因素试验，研究超声波处理时间 对松仁多糖的得率的影响。 ( 2 ) 料液比对松仁多糖得率的影响在超声时间为2 5 r a i n ，超声波的保护温度为 7 0 ，功率为5 0 0 w 的条件下，选取料液比的八个水平为1 ：1 0 、1 ：2 0 、l ：3 0 、 1 ：4 0 、1 ：5 0 、1 ：6 0 、1 ：7 0 、1 ：8 0 进行单因素试验，研究科液比对松仁多糖的得率 的影响。 ( 3 ) 超声功率对松仁多祷得率的影响在超声时间为2 5 r a i n ，超声波的保护温度 为7 0 ，科液比为l ：3 0 的条件下，选取超声功率的八个水平为4 0 0 w 、5 0 0 w 、 6 0 0 w 、7 0 0 w 、8 0 0 w 、9 0 0 w 、1 0 0 0 w 、l l o o w 进行单因素试验，研究超声功率对松仁 多糖的得率的影响。 ( 4 ) 水浴温度对松仁多糖得率的影响在超声时间为2 5 m i n ，料液比为1 ：3 0 ，超 声波的保护温度为7 0 ，功率为5 0 0 w 的条件下，选取水浴温度的八个水平为6 5 、 7 0 、7 5 、8 5 、9 0 、9 5 、1 0 0 进行单因素试验