（细胞生物学专业论文）小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探.pdf

摘要 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选 及其抗衰老作用初探 细胞生物学专业 研究生陈施羽指导导师宗浩 动物微生态学是研究正常微生物与其宿主间相互关系的生命科学，主要 研究在环境因素的影响下动物与微生物之间的互生、共生等相互关系益生 菌( p r o b i o t i c s ) 指被应用于动物及人体内，通过改善宿主体内的微生态平 衡进而促进宿主健康的单一或混合的活的微生物制剂，其源于宿主并对宿主 健康有一定的促进作用，由于对其宿主无害，将其制成活菌制剂再应用于人 或动物体内，具有调整菌群平衡，增强机体生理功能的作用，被广泛应用到 各种微生态制剂中。本研究结合乳酸菌的抗氧化活性，以及应用谷胱苷肽过 氧化物酶( g s h p x ) 活性，超氧化物岐化酶( s 0 d ) 活性，还原型胱甘肽( g s h ) 含量这三项广泛应用的抗衰老评价指标进行试验，希望在现阶段，能分离得 到安全、廉价的益生菌应用于抗衰老这一领域。 本文首先使用m r s 培养基，从健康小鼠肠道内溶物中分离出乳酸菌，经 菌株分离和纯化，得到5 株乳酸菌。根据菌落特征，经革兰氏染色法对乳酸 菌菌株进行鉴定，得知分离到的5 株乳酸菌分别为，l l 菌株为多粘芽孢杆菌 ( 最p o l y m y x a ) ，l 2 菌株为于酪乳杆菌( 厶c a s e i ) ，l 3 菌株为乳球菌属 ( l a c t o c o c c u ss p ) 中的一个新种或菌株表型特征的变异种，l 4 菌株则初步 判定为乳糖芽孢杆菌( a c t o s u s ) 或纳卡氏芽孢乳杆菌( n a k a y a m a ) ， l 5 菌株为德氏乳杆菌( d e l b r u e c k i d 然后根据菌株培养后各分离菌株 的耐酸性、耐胆盐及对致病菌抑制性选择用于动物试验的最佳菌株l 4 和l 5 。 选用自然衰老小鼠为实验动物，将分离、筛选后得到的乳酸菌发酵液及 其不同组合的乳酸菌发酵液连续3 0 天灌胃，灌胃结束后将小白鼠处死，取其 血液和肝、脑组织，并将肝、脑组织制成组织匀浆。使用可见光分光光度剂 测量小鼠血清、肝脏及脑组织的超氧化物岐化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物 酶( g s h - p x ) 活性和丙二醛( 岫a ) 的含量，统计检验不同组合菌株对上述指 标的影响。实验结果表明，空白对照组自然衰老小鼠的肝、脑组织和血清中 g s h - p x 和s o d 的活性较低，l 4 或l 5 菌株发酵液单独灌胃，l 5 菌株仅对小鼠 脑组织s o d 和g s h - p x 的活性有显著性提高，l 4 菌株仅对小鼠肝组织g s h - p x 的活性有显著性提高，l 4 、l 5 菌株混合发酵液后对三组抗衰老指标都有显著 ( p o 0 5 ) 或极显著( p o 0 1 ) 提高。 关键词：微生态学；益生菌：乳酸菌；分离；鉴定：抗衰老 2 i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i af r o mt h eg u to f m i c ea n d p r i m a r yr e s e a r c ho f i t sa n t i a g i n g m a j o r ：c e l lb i o l o g y g r a d u a t e ：c h e ns h i y u s u p e r v i s o r ：z o n gh a o t h ea n i m a lm i c r o - e c o l o g yi so n es u b j e c tt ot h er e s e a r c ho ft h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h en o r m a lm i c r o o r g a n i s ma n di t sh o s t i ti s m a i n l yo nt h es t u d yo ft h ei n t e r g r o w t ha n dt h ep a r a g e n e s i sa n ds oo n u n d e rd i f f e r e n te n v i r o n m e n tf a c t o r s p r o b i o t i c s ，w h i c hi sa p p l i e dt ot h e a n i m a l a n dt h eh u m a nb o d y , r e f e r st ot h e s i n g l e o rm i x e dl i v e m i c r o o r g a n i s mp r e p a r a t i o n ，w h i c h c a n p r o m o t e t h eh o s t h e a l t h y t h r o u g hi m p r o v i n g t h eh o s t b o d ym i c r o e c o l o g i c a l b a l a n c e i t o r i g i n a t e sf r o mt h eh o s ta n di sg o o df o rt h eh o s th e a l t h y s i n c ei ti s h a r m l e s st ot h eh o s t ，i ti sm a d et ot h ep r e p a r a t i o na n dt h e na p p l i e dt o t h ep e r s o na n dt h ea n i m a l i tc a nh e l pt oa d j u s tt h eb a c t e r i u mg r o u pa n d s t r e n g t h e nt h ep h y s i o l o g yf u n c t i o ns oi ti sw i d e l yu s e dt om a k ev a r i o u s m i c r o e c o l o g i c a lp r e p a r a t i o n s t h i s r e s e a r c hi st o t h r o u g h t h e e x p e r i m e n to ft e s t i n gt h ea c t i v i t yo ft h eg s h - p xa n dt h es o d ，t h e c o n t e n to ft h eg s hc o m b i n gw i t ht h ea n t i o x i d a t i o nc h a r a c t e ro ft h e l a c t o b a c i l l u si no r d e rt oi n t r o d u c eo n em e t h o do nt h es e a r c ha n d s e p a r a t i o no ft h es a f ea n dl o w p r i c e dp r o b i o t i c ss oa st oa p p l yt ot h e a n t i a g i n gr e s e a r c hf i e l d i nt h i st h e s i st h el a c t o b a c i l l u sw a ss e p a r a t e df r o mt h eh e a l t h yr a t i n t e s t i n e si n n e rd i s s o l v e su s i n gt h em r sc u l t u r em e d i u mf i r s t l ya n d t h e nb yt h es e p a r a t i o na n dt h ep u r i f i c a t i o n ，5b a c t e r i a ls t r a i n sw e r e 3 摘要 o b t a i n e d b yi d e n t i f y i n gt h e5b a c t e r i u mt h r o u g hg r a m sm e t h o da n d a c c o r d i n gt ot h e i rc h a r a c t e r i s t i c s t h e5l a e t o b a c i l l u s ei n c l u d i n gl 1o f t h eb p o 咖m y x a ，l 2o ft h el e a s e l ，l 3i st h a to n en e wo ra b e r r a n c e s p e c i e so fl a c t o c o c c u ss p ，l 4s 1 a c t o s u so r $ n a k a y a r a a ，a n dl 5w a s l d e l b r u e c k i i t h et w ob e s tb a c t e r i a ls t r a i n sl 4a n dl 5w e r es e l e c t e dt o t h ea n i m a le x p e r i m e n ta c c o r d i n gt ot h e i ra b i l i t yt ob e a rg a l l b l a d d e rs a l t a n dr e s t r a i nt op a t h o g e n i cb a c t e r i a t h em i c ep r e s c r e e n e db e f o r ee n v i r o n m e n th a v eb e e nd i v i d e di n t o g r o u p sa tr a n d o ma n dt h e nc o n s e c u t i v e l yl a v a g e d3 0d a y sw i t hd i f f e r e n t c o m b i n a t i o no fs e p a r a t e da n df i l t r a t e db a c t e r i a ls t r a i n s a f t e rb e i n g l a v a g e d ，t h em i c ew e r ep u tt od e a t ha n dd i s t i l lt h e i rb l o o ds e r u m ，l i v e r , a n db r a i nt i s s u e ，a n dt h e nm i xt h e mi n t op l a s m a f t e rt h a tt h ec h a n g e s o ft h eo r g a n sm a d ，s o da n dg s h - p xw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo ft h eg s h p xa n dt h es o di nt h em i c eb r a i n t i s s u e ，l i v e ra n db l o o ds e r u mo ft h ee m p t yc o m p a r i s o ng r o u pw e r e c o m p a r a t i v e l yl o w t h eb r a i nt i s s u eg s h - p xa n dt h es o da c t i v i t yi n t h el 5g r o u pa n dt h el 4g r o u pg s h - p xa c t i v i t yi nt h el i v e ri s p r o m i n e n te n h a n c e d ( p 0 0 5 ) ，w h i l ea l lt h eo r g a na c t i v i t yi n d e xa b o v e w e r es i g n i f i c a n t l ye n h a n c e d ( p 0 0 5 ) o rm o s ts i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) e n h a n c e di nt h em i x e db a c t e r i a ls t r a i n s k e yw o r d s ：i v f i c r oe c o l o g y ；p r o b i o t i c s ；l a c t i ca c i db a c t e r a ( l a b ) ；i s o l a t i o n ； i d e n t i f i c a t i o n ；a n t i - a g i n g 4 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师塞浩指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的 个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承诺；己提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印 刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索：2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位 论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。 论文作者签名：陈施羽 2 0 0 7 年4 月5 日 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 文献综述 随着人们对健康食品的认识加深，食物的作用不再仅仅是为机体生长和维 持提供基本原料。如何通过食物对机体生理或其他方面的影响而促进健康， 日益引起人们的关注，功能食品( 保健食品) 应运而生，此类食品( 或食物 成分) 除自身营养价值以外，还对健康有一定贡献。益生菌对机体肠道菌系 具有很好的调节作用，而肠道菌系平衡则是关系到人体营养和健康的至关重 要的因素，因此使得益生菌的研究成为功能食品研究中的焦点。 1 益生菌概述 1 1 益生菌的产生 很长时间以来，人们就知道人体中栖息着大量的微生物，总数可达1 0 1 4 个，分别定居于人的肠道、皮肤、阴道、口腔、鼻腔等部位( 陈朝东，2 0 0 0 ) ， 其中数百种微生物已被确定为与人体共生，这些微生物与宿主之间的关系可 能简单，也可能很复杂。通过对无菌动物的研究证实，体内微生物的共栖并 不是动物生存所必需的，但与普通动物相比，无菌动物又表现出许多生理生 化方面的差异。并且无菌动物对感染更加敏感，部分原因是由于免疫系统低 下和缺乏所谓的“竞争性定植( c o m p e t i t i v ec o l o n i z a t i o n ，是用来描述共栖微 生物对外来侵入的病毒产生干扰作用的一个名词) ”。正是这些普通动物与无 菌动物之间的差异使人们认识到微生物在人体内定居对人的健康有重要的意 义( s a n d e r s 。2 0 0 0 ) 。 人体内共生的微生物对宿主的影响有利有弊。一方面，微生物的某些代 谢产物如短链脂肪酸( s a f c ) ，包括乙酸、丙酸、丁酸，可为人体提供一定 能量，并能影响肠粘膜细胞的再生和分化，调节肠腔p h ，促进矿物质的吸收 和代谢途径；同时人体内复杂且相当稳定的微生物区系可通过竞争性定植而 使外来有机体( 包括病原体) 难在体内定居，从而形成一道抵抗病原体的重 要防线( z i e m c r ，1 9 9 8 ；陈朝东，2 0 0 0 ) 另一方面，在少数情况下微生物与 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 宿主之间可能发展成一种病原关系，并可能引起宿主的疾病或死亡微生物 的某些代谢产物可能具有基因毒性，诱变性或致癌的活性，经过一个长期的 释放阶段后可能导致癌症的发生( s a n d a s 。2 0 0 0 ) ；而且当有某些因素( 如宿 主生理、食物、用药等) 破坏了体内微生物菌相之间的平衡时，会使某些有 害茵或条件致病菌由受抑制状态转为优势菌，引起自体感染( f o o k s ，1 9 9 9 ； 孟昭赫，1 9 9 3 ) 。正是出于对人体微生物区系作用的认识和要发挥微生物区系 的有利作用而避免其有害作用的想法，促使了益生菌理论的产生 1 2 益生菌的定义 1 9 6 5 年，l i l l e y 和s t i l l w e l l 首次提出益生菌( p r o b i o t i c s ) 一词，他们 将其定义为“由一种微生物分泌，刺激另一种微生物生长的物质”。 “p r o b i o t i c s ”一词来源于希腊文，是“共生”的意思，与。a n t i b i o t i c ” ( 抗生素) 相对立，意味着“在动物之间，于生命活动的维持上起到相互补 益的作用”1 9 7 4 年，美国学者p a r k e r 认为。益生菌是维持宿主肠道内微生 物平衡的微生物或物质”( f u l l e r ，1 9 9 2 ) 。由于这一定义范围过大，易引起 混乱，于是美国食品与药品管理局( f d a ) 把这类产品定义为可以“直接饲用 的微生物制品( d i r e c tf e e dm i c r o b i a lp r o d u c t s ) ”。显然，随着人们对益 生菌作用认识的不断深入，有关益生菌的定义也处在发展变化之中。目前， 大家普遍接受的益生菌定义是1 9 8 9 年英国学者f u l l e r 提出的f u l l e r 将益 生茵概括为“某种或某一类通过改善宿主肠道菌群平衡，对宿主发挥有益作 用的活的微生物饲料添加剂”( f u l l e r ，1 9 8 9 ) 随后，h s o s a a r d ( 1 9 9 0 ) 又 将益生菌定义为：“摄入动物体内参与肠内微生物群落的阻碍作用，或者通过 非特异性免疫功能来预防疾病而间接的起促进生长作用和提高饲料效率的活 的微生物培养物”( f u l l e r ，1 9 9 2 ) ，是取代或平衡肠道微生态系统中由一种 或多种菌系生长的微生物添加剂( 包括活的微生物或其活菌制剂) 近年来， 随着人们对人体及动物体内正常微生物菌群与健康关系的深入研究，益生菌 的定义也日益完善。最近，益生菌被定义为应用于动物及人体内，通过改善 宿主体内的微生态平衡进而促进宿主健康的单一或混合的活的微生物制剂 ( r o b e r t 。1 9 9 4 ) 。该定义不仅强调了益生菌是一种活的微生物，而且指出，益 2 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 生菌不只是应用于动物，也可以应用于人体，拓宽了益生菌的应用领域，是 目前广为接受的说法。 1 3 益生菌研究的理论基础 1 3 i 动物微生态理论概述 微生态学即微观生态学，是。研究正常微生物与其宿主间相互关系的生 命科学分支”( 康白，1 9 9 8 ) 。而动物微生态则是。研究动物体内微观环境中 的正常微生物及其宿主相互关系的微生态学分支”( 刘国华，2 0 0 0 ) 。一般认 为，动物微生态学包括4 个方面的内容，即动物微生态平衡理论、动物微生 态失调理论、动物微生态营养和动物微生态防治理论。动物微生态理论认为， 动物及体内寄生的微生物相互作用，相互影响；在环境因素自4 影响下动物与 微生物保持动态的平衡；在动物与环境的关系中，正常微生物群中的原籍菌 对动物有益，外籍菌则有害，两者又可以转化：正常微生物群的组成存在种 属和个体的特异性；特定的环境条件可照成动物微生态失调，使生态系统丧 失功能；动物与微生物群之间存在共生关系，互相提供营养等生存条件( 刘 国华，2 0 0 0 ) ，这些理论是当前益生菌研究的理论基础。 1 3 2 益生菌基本理论概述 益生菌被摄入动物体肠道后，在复杂的微生态环境中与近4 0 0 种正常菌 群汇合。显现出栖生、偏生、竞争或吞噬等复杂的关系，改变生物体内的微 生物群落，促进宿主动物的健康( 杜震宇，2 0 0 2 ) 。但是益生菌的作用机理在 理论上进展还不够成熟，目前主要有3 种学说：优势种群学说；菌群屏 障学说；微生物夺氧学说。 1 4 益生菌的特征 益生菌有一些共同的特性，也是在研究实践中鉴定益生菌很好的标准 ( f u l l e r ，1 9 8 9 ；l e e k s a l m i n e n ，1 9 9 5 ：s a l m i n e n ，1 9 9 8 ；c h a n d a n ，1 9 9 9 ) ，其特性 归纳如下： 源于宿主并对宿主健康有一定的促进作用； 3 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 对胃酸、胃肠内或胰的酶及胆汁消化作用表现出一定抵抗力，从而 能在胃肠道内存在并正常生活： 能有效的定植于胃肠道中，从而抑制肠内病原体的粘附、定植、复 制或有活性； 通过产生抗菌的代谢产物或细菌素，选择性调节微生物区系的组成， 并能对食物中的病原体起一定抑制作用； 是公认安全的微生物； 准确识别菌( 基因、种属、菌株) 及其特性，保证具有已证明的安 全性； 在其产品制备及储存期间能保持活性及稳定性，能用于大量生产并 具有经济价值； 并非每一种益生菌都必须具备所有这些特点，但用于益生菌制剂时应选 择尽可能更多地满足以上特点的菌株。 1 5 益生菌种类 已确认的适合用于生产的益生菌菌种较少( 见表1 ) 。目前研究最多的是 乳酸菌( 主要是乳酸杆菌属( l a c t o b a c i l l i ) ) 和双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i a ) ， 这两类菌都可在健康成年人正常肠道菌群中出现。其它用作益生菌的还有链 球菌( s t r e p t o c o c c u s s p ) 、肠球菌( e n t e r o c o c c u s s p ) ，拟杆菌( b a c t e r o i d e s s p ) 、芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 、丙酸菌( p r o p i o n b a c t e r i u ms p ) 及真菌 ( f u n g i ) 等。 4 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 表i - 1 商业制品中的益生菌及商业用益生菌株 t a b l e l lt h ep r o b i o t i c sa n dt h eb a c t e r i a ls t r a i ni nt h ec o m e r c i a lp r o d u c t s 2 乳酸菌的益生作用及国内外研究动态 2 1 乳酸菌粘附和定植机理 粘附是定植的第一步，它能使乳酸菌扩大菌群，避免被肠道分泌的流体 和肠道的蠕动所清除，1 9 8 2 年k l e e m a n 和k l a e n h a m m e r 发现乳酸菌有两种不 同的粘附机理；一种是需要钙的非特异系统，用实验证实了二价钙可提高益 生菌对肠道细胞的粘附性。另一种是钙独立系统，钙独立系统中有两种乳酸 菌成分参与了乳酸菌的粘附，一种成分是抗蛋白酶( 与菌体表面有关) ：另一 种是热稳定的胞外蛋白且对蛋白酶敏感，而双歧杆菌又有所不同，它的粘附 借助于细胞表面或双歧杆菌培养物上清液中的类蛋白促粘附因子，这种粘附 似乎是特异性的，通过细丝状的成分粘附于肠道粘膜表面上( r y h a n e n ，1 9 9 6 ) 。 c h a u v i e r e ( 1 9 9 2 ) 研究了2 5 株乳杆菌对c a c o - 2 细胞的粘附时，发现受试的 具有粘附的菌株中有3 株具有不依赖与c a + 的性质。c o c o n n i e r ( 1 9 9 2 ) 研究 l a c i d o p h i u sb g 2 f 0 4 ( 人体来源) 对c a c o 一2 细胞的粘附性也表明b g 2 f 0 4 的粘附性与c a + 无关，而是涉及到一个促粘附因子和一个胞壁因子 5 小白鼠肠道菌群中乳酸苗的筛选及其抗衰老作用初撩 b v e r n e t ( 1 9 9 3 ) 研究了1 3 株双歧杆菌对体外培养的c a c o - 2 细胞的粘附，发现 各菌株粘附力有明显差异，即双歧杆菌的粘附具有种属特异性，其中有5 株 双歧杆菌的粘附性在很大程度上不依赖于c a ：+ ，而是由细胞表面的不稳定蛋 白样促粘附因子来调节的。这就说明了益生菌的粘附具有种属特异性。其实 益生菌的粘附也具有宿主特异性，o u w e h a n d ( 1 9 9 9 ) 观察了4 株双歧杆菌对 不同年龄人的肠黏液的粘附能力，发现双歧杆菌对老年人和婴儿的肠黏液的 粘附力明显低于成年人。 2 2 乳酸菌对消化道紊乱的调节作用 众多的研究提示益生菌治疗腹泻具有良好的效果。r o l f e ( 2 0 0 0 ) 报道了 双歧杆菌和乳酸菌制剂对各种胃肠道疾病的治疗作用，如抗生素相关性腹泻、 细菌性腹泻、病毒性腹泻、食物相关性腹泻等，腹泻是一种常见的临床症状， 引起腹泻的原因虽多，但整体可分为感染型和非感染型两大类，而其中感染 型腹泻占大多数，约为8 0 。到目前为止有证据证明的益生菌的调节作用的结 果如下： ( 1 ) 感染型腹泻 感染型腹泻，主要由志贺菌、沙门菌、艰难梭菌、轮状病毒、致病性大 肠杆菌等致病菌所致现已知双歧杆菌、乳杆菌对这类疾病的防治疗效可靠 吸附于人体的嗜酸乳杆菌具有抗菌活性( s a l m i n e n s ，d e i g h t o n ，1 9 9 8 ) ， 该菌株能吸附于分化的肠道细胞上，还可在体外抵抗幽门螺杆菌，杀灭入侵 菌( c o c o n n i e r ，1 9 9 8 ) k a i l a ( 1 9 9 2 ) 等用干酪乳酸菌发酵奶治疗3 9 例急 性轮状病毒感染的婴幼儿胃肠炎，发现血液中l g a 、l g g 、i g m 分泌细胞增加， 病程明显缩短。i s o l a u r i 等( 1 9 9 5 ) 用干酪乳酸菌给5 4 名婴儿服用。以给轮 状病毒疫苗的婴儿组作阳性对照，发现血液中i g a 、i g m 分泌细胞均增加 i s o l a u r i ( 1 9 9 1 ) 对7 4 个4 4 5 个月的孩子分别用乳杆菌g g 和安慰剂治疗腹 泻，发酵乳杆菌g g 治疗组疗程仅为1 4 天，而对照组为2 4 天，当患儿仅由轮 状病毒引起的腹泻时疗效更为明显。a n a n d 等证明，双歧杆菌对沙门氏菌、志 贺氏菌、梭状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、伤 寒杆菌、变形杆菌、埃希氏大肠杆菌、弯曲杆菌有拮抗作用。g i b s o n ( 1 9 9 4 ) 6 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 等报道，双歧杆菌能产生一种未知的广普抗菌物质，具有抑制沙门氏菌、志 贺氏菌、霍乱弧菌等病原菌的活性。m i c h e l u t t i ( 1 9 9 6 ) 等将6 3 例4 a 内的 急性腹泻病儿随机分成3 组。第l 组口服l b 菌株死菌制剂；第2 组给予非微 生态制剂；第3 组为l b 菌株死菌制剂+ 抗菌药物。结果显示：第1 组与第2 组相比，临床症状改善迅速，疗效有显著性差异。s a a v e d r a 等用加有双歧杆 菌的酸奶喂养5 5 例5 2 4 月龄的婴幼儿，与标准配餐组作对照，结果急性腹 泻的发病率由8 9 6 降为2 9 6 。 ( 2 ) 乳酸菌与胃健康 幽门螺杆菌是慢性胃炎，胃溃疡和十二指肠溃疡的重要病因学因素。根 据m a r s h l l ( 1 9 9 4 ) 的研究，乳酸菌对引起慢性胃炎、胃癌的幽门螺杆菌具有 抑制作用。它能抑制幽门螺杆菌的定植及其活性。动物试验和人体试验都表 明：乳酸菌或其代谢产物具有抑制幽门螺杆菌的感染。m i d o l e 等研究发现包 括两歧双歧杆菌的产酸菌，在乳酸浓度为5 0 - - 1 5 0 衄o i 几时能对幽门螺杆菌 n c j c l l 6 3 7 产生抑制。k a b i r ( 1 9 9 7 ) 将研究l a c t o b a i l l u s s a l i v a r i u s w b l 0 0 4 对幽门螺杆菌的定植抑制从体外试验推向了动物试验。c o c o n n i e ( 1 9 9 8 ) 在 研究中发现，l b - s c s ( 嗜酸乳杆菌代谢产物) 能抑制幽门螺杆菌尿素酶的活 性，无论是离体或在体内试验中均显示出良好的抗幽门螺杆菌活性 2 3 乳酸菌的益菌机制 弓盗生乳酸菌用于调整胃肠道紊乱上，发挥了很大的作用，研究者也正致 力于探讨其机理，特定益生乳酸菌作用于特定病原菌的机制还需要更多研究， 另外不同的益生乳酸菌的抑菌机理也不同，而且同一益生乳酸菌对不同的致 病菌的抑制程度也不同，现将益生菌可能的抑菌机制归纳如下： ( i ) 屏障： 益生乳酸菌通过磷脂附着在肠粘膜上，与致病菌竞争附着点，与其他厌 氧菌一起共同占据肠粘膜表厩，形成生物学屏障，阻止致病微生物定植和侵 入，改变肠道菌相构成并保持动态平衡，保护肠粘膜。此外，双歧杆菌还产 生细胞外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的复杂多糖，由于这是潜在致病菌 及其毒素的受体，所以通过这种酶的作用可阻止潜在致病菌及其毒素对肠粘 7 小白鼠肠道籀群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 膜上皮细胞的粘附。 ( 2 ) 抑菌及杀菌作用： 益生乳酸菌还发酵食物中糖类，产生大量乳酸及醋酸和过氧化氢，降低 肠道的p h 值和氧化还原电位，抑制致病微生物的生长。乳杆菌和链球菌产生 的两种抗菌素l a c t o c o c i n s 和n i s i n 具有广泛的抑菌谱，而且对于引起食物 中毒l i m t e r i a , c l o s t r i d i 埘和b a c i l l u s 具有抑制性。目前报道的双歧杆菌 产生的细菌素有两种，一个是从两歧双歧杆菌中( 且b f i d u m ) 代谢物中分离 出的称为“b i f i d i n ”的抗菌物质它可以抑制金色微球菌和金黄色葡萄球菌的 生长繁殖( 罗珍兰，1 9 9 8 ) 另一种是从长双歧杆菌( 昱1 0 n g u m ) 中分离纯化 出来的称为“b i f i l o n g ”的抗菌物质，它对大肠杆菌、沙门氏菌、粪链球菌 和金黄色葡萄球菌的生长繁殖有抑制作用( k a n d ，1 9 8 9 ) 。 ( 3 ) 与有害菌竞争营养物质 通过体外连续培养的方法可以发现肠道固有菌群与外来菌之间对营养物 质的竞争现象。但在肠道内是否有这种竞争营养的作用并没有直接的实验证 据。有人认为，这种竞争并不起多大作用，但是在某种物质如生物素成为有 害菌的限制因素时，这种益菌作用就会表现出来。 ( 4 ) 生物夺氧学说 在肠道微生态系统中，厌氧菌是优势种群。利用非致病的好氧微生物暂 时在肠道定植，使局部环境的氧分子浓度降低，氧化还原电势下降，促进厌 氧微生物的生长，达到提高定植抗力，恢复生态平衡的目的。这是好氧和兼 性厌氧芽胞杆菌的作用机理之一但在动物体内是否存在。生物夺氧”作用， 还有待进一步研究。 2 4 乳酸菌与胃肠道免疫的关系 益生乳酸菌穿过胃酸屏障后，通过粘附，竞争排斥，占位和产生抑制物， 在肠道中保持着菌群优势，并对肠道局部免疫产生重要的影响。肠道局部免 疫系统，又称肠道相关淋巴组织( g u t 一8 s s o c i a t e d t i s s u e ，g a l t ) 包括肠道 上皮细胞之间及位于板层的淋巴细胞、淋巴滤泡、p e p e s 小体及肠系膜淋巴 结复合物。根据t a n g a n 和s h a n a h a n 的研究，每米小肠内约有1 0 ”个产免疫 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 球蛋白细胞存在，约占人体内产免疫球蛋白细胞的8 0 。因此，肠道内能引起 各种来自不同限制性免疫细胞的免疫学应答。人们已经了解到定植在哺乳动 物肠道的共生菌能够提高循环中的特异的和天然的抗微生物抗体的浓度。 目前所报道的乳酸菌的主要免疫调节作用基本类似，包括激活巨噬细胞、 b 淋巴细胞和n k 细胞，增加肠道中i g a 的产生，增加i l - 1 、i l - 2 、i l _ 6 、i l - 5 、 t n f - a 等细胞因子的产生量 ( 1 ) 乳酸菌与细胞免疫 乳酸菌的某些菌株：鼠李糖乳杆菌( 彳7 磁5 3 1 0 3 ) ，植物乳杆菌( 盱乃， 乳酸球菌( 朋孵霉) ，双歧杆菌动物亚种是肿瘤坏死因子q ( t n f - a ) 和i l - 6 的强有力的诱导剂( h a l l e r ，1 9 9 9 ) ，有些能刺激i l - i o 、i l - 1 、i l _ 4 、i l _ 5 的产生，以增强免疫。其中i l - 6 和t n f _ d 是被激活的巨噬细胞分泌的两种 重要的细胞因子，在参与集体的炎症反应和防御感染、介导抗肿瘤和调节机 体免疫机能中发挥重要的作用( t h o m a s ，1 9 8 9 ) 许多研究结果显示：乳酸菌 能干预细胞免疫，乳酸菌、双歧杆菌能阻断许多微生物的入侵和粘附 ( o u w e h a n d ，1 9 9 8 ) 干酪乳酸菌和保加利亚乳杆菌可激活巨噬细胞功能，刺激人体产生免疫 应答。还通过巨噬细胞和t 细胞、n k 细胞活性的增强来增强人体的免疫：巨 噬细胞、。n i ( 细胞、t 细胞的活化，有益于增强周围血管和局部淋巴结中淋巴 细胞的免疫，t 辅助细胞、n k 细胞的增加，可使抑制性t 细胞减少。双歧杆 菌通过刺激小鼠的巨噬细胞产生一些免疫活性因子而间接发挥抑瘤作用，在 体内外对i l 忡6 和t n f a 的生成有明显的促进作用，对s l m 荷瘤小鼠均有明显 的抑瘤作用( 张宝元，2 0 0 1 ) 。酸奶生产中广泛应用的st h e r m o p h i l u s 和 厶b u l g a r i c u s 被证明具有显著的系统免疫调节活性和肠道调节活性 ( m a r i n ，1 9 9 8 ) 用1 矿嗜酸乳杆菌给小鼠灌胃8 h 后取其腹膜巨噬细胞培养， 所产生的i n f _ y 数量明显上升( t e j a d a - s i = o n ，1 9 9 9 ) 一些研究表明，热杀 死的b i h d o b a c r e i u m 厶b u l g a r i c i s 和5 ：t h e r m o p h o u s 的各菌株均表现出激 活巨噬细胞因子的能力。m a r i n ( 1 9 9 8 ) 用一个巨噬细胞系和一个t 辅助细胞 系研究4 株酸奶中用的嗜热链球菌( & t h e r m o p h o u s ) 对细胞素的产生的效果， 并与保加利亚菌( 厶b u l g a r l c u s ) 、青春双歧杆菌( 且a d o l e s c e n t i s ) 和两歧 9 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 双歧杆菌( 且b i f i d u m ) 相比较，结果发现热灭活的st h e r m o p h o u s 对肿瘤坏 死因子t n f a ，白细胞介素i l - 2 、i 卜6 、i l 一5 都有影响，所有菌都诱导巨噬 细胞中i 卜6 产生量显著增加，尤以st h e z 讶o p h o u s l 3 3 活性最强。4 株 t h e 吻o p h o u s 对t n f 口的诱导作用也很强。当用三组乳酸菌细胞和脂多糖 共同刺激巨噬细胞时也能在一定程度上增加t n f - a 和i l - 6 的产量。至今为 止的理论倾向于认为，细胞壁是乳酸菌免疫激活作用的主要活性成分 ( s e k i n e 。1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) 乳酸菌与体液免疫 口服乳酸菌能刺激人体产生非特异性免疫。乳酸菌能刺激机体产s i g a 的 细胞增殖，从而使得s i g a 水平上升，可促使系统对轮状病毒产生免疫应答， 中和毒素，缓解轮状病毒引起的腹泻、急性肠胃炎、厌食、遗传性过敏皮肤 炎、c r o h n s 等病的症状y a s u i 等发现口服短双歧杆菌可激活小鼠体液免 疫系统，提高抗轮状病毒i g a 或抗流感病毒l g g 产生，乳酸双歧杆菌能增强 小鼠对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌0 1 5 7 ：h 7 感染的抵抗力，特异性i g a 抗 体升高( 蓝景刚，2 0 0 2 ) 。用长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌饲喂b a l b c 小自鼠， 每隔1 - - 2 周采血测定血清中的特异性抗体，结果表明，空腹乳酸菌6 7 周 后血清中的抗体效价显著上升，说明乳酸菌具有刺激机体产生特异性抗体的 作用( 高桥毅1 9 9 2 ) 。总之，乳酸菌及其产物的作用与佐剂相似，具体地说 就是诱导干扰素产生，促进细胞分裂、体液及细胞免疫，对肠粘膜有非特异 的免疫刺激作用，能促进肠粘膜细胞分泌i g a ，i g a 的主要作用是抑制细菌对 肠粘膜的粘附，并通过它对细菌的凝集作用有利于促进病原菌从体内排出。 将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵的乳酸添加导饲料中，饲喂小白鼠，然 后给小自鼠口服鼠伤寒沙门氏菌使其感染，在不同时期分别计数各脏器中的 伤寒杆菌活菌数。结果发现，饲喂乳酸菌发酵酸奶的小鼠，在感染后第4 天， 肝和脾细胞的免疫应答作用明显增强。让小白鼠连续2 天摄取干酪乳杆菌， 然后经口感染鼠伤寒杆菌和产毒性大肠杆菌，结果发现，在小白鼠肠道内容 物中有抗上述病原菌的i g a 抗体。这些事实说明，口服乳酸菌具有激活宿主 的免疫系统，防止病原菌侵入等作用( 范志红2 0 0 0 ) 。 从目前的实验证据可以确信，与普通食物的经口免疫耐受作用不同，乳 i o 小白鼠肠道菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 酸菌具有免疫活性，这种活性不仅限于增加黏膜免疫功能，对系统免疫功能 也有调节作用。而且这种作用因人而异，其详尽的作用机理和作用条件有待 于迸一步研究这些研究进展对于迸一步认识和利用传统的乳酸菌发酵食品、 开发新的功能更强的乳酸菌发酵食品具有重要的指导意义。 2 5 乳酸菌降胆固醇作用研究现状 m a n n 和s p o e r r y 报道，非洲m a s a i 人大量引用由乳杆菌发酵的乳制品， 其体内血清胆固醇含量普遍较低。1 9 7 7 年，他们调查发现饮用酸奶和相关制 品的美国人，其体内血清胆固醇含量也较低。这些结果引起了国内外营养学、 医学、微生物学等各界人士的关注，从而引起学者对乳酸菌降胆固醇作用的 研究热潮。迄今，有大量实验证实不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇的效果 表1 - 2 国外对乳酸菌降低胆固醇作用机制的研究起步较早1 9 7 7 年g i l l i l a n d 对肠道乳杆菌的降低胆固醇作用进行了研究，提出了乳酸菌在生长过程中通 过降解胆盐促进胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点1 9 8 5 年 g 订l i l a n d 报道在厌氧条件和有胆汁酸的条件下厶a c i d o p h i l u s 能够吸收介 质中的胆固醇，实验证明如果在体外l a c i d o p h i l u s 不能降解胆固醇，那么 在体内也不会有作用( 动物实验) 。以猪源分离出几株乳酸菌进行实验发现， 在体外降解胆固醇能力强的菌株p 3 2 和p 4 7 ，定量饲喂给高胆固醇的猪，观察 1 0 天发现p 3 2 能使猪血清中的胆固醇水平明显下降( p 自由基与心血管疾病 随着自由基及其介导的脂质过氧化反应在疾病中的作用研究的日趋深 入，自由基与冠心病、心肌缺血、心律失常、充血性心律衰竭、动脉粥样硬 化发生、殳展相关的事实正在不断增加，对其损伤机制的认识亦更趋深化( 张 润峰2 0 0 3 ) 研究表明，高血脂时体内自由基产生和清除平衡被破坏，许多自由基清 除剂活性降低，如超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 。s o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t a l a s e ，c a t ) 等，产生大量的脂质过氧化物( 1 i p i dp e r o x i d e ，l p o ) ，这些 l p o 与动脉粥样硬化的形成密切相关。其机制表现为l p 0 直接损伤内皮细胞， 导致内皮细胞的退行性变化和通透性改变，l p o 的产物丙二醛 ( m a l o n d i a l d e h y d e , m d a ) 极易修饰低密度脂蛋白( 1 0 w - d e n s i t yl i p o p r o t e i n , l d l ) ，成为m d a - l d l 后，能为单核巨噬细胞受体所辨认、内饮，而形成泡 沫细胞；炎性细胞浸润并释放各种生长因子，刺激中膜平滑肌细胞移于内膜 1 7 小白鼠肠遭菌群中乳酸菌的筛选及其抗衰老作用初探 增生，吞噬及分泌大量阅质成分。形成动脉粥样硬化。现有资料提示，提高 如s o d 等清除自由基酶类的水平，应用药物阻滞l d l 的氧化可抑制动脉粥 样硬化的发生并改变病损的进展。膳食中的抗氧化剂如v e 和v c 具有潜在的 辅助治疗作用，能保护体内l d l 免遭氧化修饰，从而阻止或延缓动脉粥样硬 化的发生发展( 于冬雁2 0 0 0 ) 。 ( 5 ) 自由基与其他疾病 自由基除了能引发上述几种疾病外，还和其他的一些疾病也