（分析化学专业论文）新型生物自由基检测技术.pdf

硕士学位论文 摘要 近年来，由于活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 引起的d n a 、蛋白质 等生物大分子的氧化损伤在基因突变、癌症和衰老等生物过程中起到重要作用， 受到了广泛的关注。因此，对r o s 引起的d n a 和蛋白质等生物大分子氧化损伤 的检测就显得尤为重要。目前的检测方法虽然灵敏，但耗时、费力并且耗费大。 在本研究中，我们开发了一种简单，快速，无标记的金纳米粒子比色法研究单链 d n a ( s i n g l e s t r a n d e dd n a 。s s d n a ) 损伤的过程。此外，合成具有高效自由基捕获 能力的自旋捕捉探针，以期用于检测r o s 引起的生物大分子自由基生成。本论文 的主要研究工作如下： 1 采用无标记金纳米颗粒做为指示剂，开发了一种可以肉眼可视的s s d n a 损伤的 比色检测新方法。该方法基于不同长度的s s d n a 在纳米金颗粒上的吸附速率不 同的原理，通过控制s s d n a 对a u n p s 的吸附时间来考察s s d n a 断裂时d n a 链长的变化。当a u n p s 与不同长度的s s d n a 在限定的时间内进行孵育，短的 s s d n a 和长的s s d n a 在a u n p s 上的吸附量会存在差异，从而导致不同长度 s s d n a 与a u n p s 的复合物在盐溶液中的稳定性差异。这种稳定性差异将引起金 纳米颗粒溶液颜色的改变，最终可用于直观的表明s s d n a 的损伤效应。这种比 色法能够快速检测s s d n a 的酶切反应及由自由基引起s s d n a 的氧化损伤，并可 用于核酸酶抑制效应以及抗氧化效应的检测，证明了该体系在新型核酸酶抑制 剂的鉴定以及天然产物或药物的抗氧化性筛选上具有潜在的应用价值。 2 合成了两种高效环状硝酮类自由基捕获剂，并用质谱，核磁，红外等进行了表 征。这两种自由基捕获探针上分别含有羟基和羧基官能团，增加了其水溶性， 并可以直接用于生物体系中的自由基捕获实验；而且也可以通过它们的羟基和 羧基官能团修饰上具有功能性的小分子( 例如荧光素、生物素) 或电活性分子 ( 例如二茂铁、亚甲基蓝) 。这样就可以利用功能化的自由基捕获剂实现对生物 大分子自由基的检测手段多样化。 关键词：自由基；纳米金；比色检测；捕获剂；抗氧化剂；核酸酶；抑制剂 i l 新型生物自由幕柃测技术 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，o x i d a t i v ed a m a g eo fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，e s p e c i a l l yd n a a n dp r o t e i n ，b yr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) h a v ea t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o nd u et o t h e i ri m p l i c a t i o ni nm u t a g e n e s i s ，c a r c i n o g e n e s i s ，a n da g i n g t h u s ，i ti si m p o r t a n tt o d e v e l o pb i o s e n s o r sf o rm o n i t o r i n gt h er o s i n d u c e db i o m a c r o m o l e c u l a rd a m a g e t h e g e n e r a l m e t h o d sf o rb i o m a c r o m o l e c u l a ro x i d a t i v e d a m a g e a r es e n s i t i v eb u t t i m e c o n s u m i n g ，l a b o r - i n t e n s i v ea n dc o s t l y h e r e i n ，w er e p o r tas i m p l e ，r a p i d ，a n d l a b e l - f r e ec o l o r i m e t r i em e t h o df o ra s s a y i n gt h ec l e a v a g eo fs s d n ab yo x i d a t i v e d a m a g eo rs s d n as p e c i f i cn u c l e a s e m o r e o v e r ，w es y n t h e s i so fh i g hs e n s i t i v i t ys p i n t r a p sf o r t h ed e t e c t i o no fb i o m a c r o m o l e c u l e sd a m g e db yr o s t h em a i nw o r ko ft h i s t h e s i si ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 ad i r e c tv i s u a l i z a t i o nm e t h o df o rt h ec l e a v a g eo fs i n g l e - s t r a n d e dd n ad e t e c t i o nw a s d e v e l o p e db yu s i n gu n m o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e ( a u n p ) a si n d i c a t o r b a s e do nt h e f a c tt h a ts s d n aa b s o r b so na u n p sw i t har a t et h a td e p e n d so ns e q u e n c el e n g t h ，w e e x p l o r e das t r a i g h t f o r w a r ds t r a t e g yo fc o n t r o l l i n gt h ea d s o r p t i o nt i m eo fs s d n a o n a u n p sf o r i d e n t i f y i n gt h ed n al e n g t hc h a n g eu p o nt h ec l e a v a g eo fs s d n a i n c u b a t i o no fs s d n aw i t ha u n p si nac o n t r o l l e dt i m ew o u l dc a u s et h ed i f f e r e n t i a l a d s o r p t i o na m o u n to fs h o r ts s d n aa n dl o n gs s d n ao na u n p sa n dc o n s e q u e n t l y l e a dt ol e n g t h d e p e n d e n ts t a b i l i t yo fs s d n a a u n p sc o m p l e xa g a i n s ts a l t - i n d u c e d a g g r e g a t i o n ，t h e r e b yc a u s i n gt h ec o r r e s p o n d i n gc o l o r - c h a n g eo fg o l dn a n o p a r t i c l e s s o l u t i o ni nt h ep r e s e n c eo fs a l t t h em e t h o dd e v e l o p e dh e r ep r e s e n t sap r o m i s i n g t e c h n i q u et om o n i t o rs s d n ac l e a v a g ep r o c e s sb ys s d n a - s p e c i f i cn u c l e a s e so rf r e e r a d i c a l s i ta l s os h o w sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nn a t u r a lp r o d u c to rd r u gs c r e e n i n g b a s e do ni n h i b i t i o no fo x i d a t i v ed a m a g eo fd n a 2 i nt h i ss t u d y , t w ok i n d so fc y c l i c n i t r o n es p i nt r a p sh a v e b e e n s u c c e s s f u l l y s y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db ye s i m s ，1h - n m r ，i r a n ds oo n t h e s et w os p i n t r a p sc o n t a i nh y d r o x y lg r o u po re a r b o x y lg r o u p ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hi m p r o v e st h e w a t e rs o l u b i l i t yo ft h es p i nt r a p sa n dw a sb e n e f i c i a lf o rt h ea p p l i c a t i o ni nl i v i n g o r g a n i s m ；a d d i t i o n a l l y , t h e s es p i nt r a p sw i l l b ef u r t h e rm o d i f i e db yf u n c t i o n a l m o l e c u l e s ( s u c h a sf l u o r e s c e n ta n db i o t i n )o re l e c t r o a c t i v em o l e c u l e s ( s u c ha s f e r r o c e n ea n dm e t h y l e n eb l u e ) ，w h i c hw i l lb e u s e da st h en o v e lp r o b e sf o rt h e d e t e c t i o no fb i o m a r o m o l e c u l e c e n t e r e dr a d i c a l s k e yw o r d s ：f r e er a d i c a l s ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) ；c o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n ； s p i nt r a p s ；a n t i o x i d a n t ；n u c l e a s e ；i n h i b i t o r i i i 硕，i ：学位论文 第1 章绪论 1 1 生物体内自由基与抗氧化系统 2 0 世纪初，人们开始认识了一类化学性质极不稳定的新物质自由基( f r e e r a d i c a l s ) 。而生物体系中自由基的存在，直至2 0 世纪5 0 年代才被确认。因为当时 对自由基反应在生命过程中的重要意义的认识非常有限，随着科学技术的不断发 展，新的分析方法开始出现，特别是近代生物物理检测技术的不断发展，许多生 命现象的自由基机制先后一一被揭示，推动了生物学的迅速发展，形成了一个以 化学、物理学和生物医学相结合的极具有生命力和广阔前景的新领域即自由基生 物学、医学领域。 1 1 1 生物体内自由基 1 1 1 1 自由基的定义、性质和氧自由基的分类 自由基( f r e er a d i c a l s ) ，化学上也称为“游离基”，是指最外层电子轨道上含有 未配对电子的分子、原子或离子【l 】。所有化合物或单质都含有两个或两个以上的电 子，电子的排列方式决定了分子的稳定性。一般说来，稳定的化合物通常电子都 是以成对的形式存在的。分子可因化学或物理的原因而破坏了其电子的成对性， 或发生共价键的均裂，所生成的含有未成对电子的物质即我们所说的自由基。由 于生成的自由基具有成单电子，因此通常情况下是不稳定的、具有较活泼的化学 活性，易于自行结合成稳定的分子，或与其它稳定分子反应生成另一种自由基。 随着自由基生物学的不断向前发展，人们对生物体内自由基的认识也越来越多， 在生物体内相继发现了各种类型的自由基，生物体系主要遇到的是氧自由基，例 如0 2 、h 0 2 、o h 、l o 、l o o 等氧自由基，以及n o 、- n 0 2 两种氮中心自由基。 表1 1 中列出了一系列具有生物损伤作用的活性氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， r o s ) 。在生理或病理条件下，生物体还会产生活性氧、活性氮( r e a c t i v e n i t r o g e n s p e c i e s ，r n s ) 和活性氯( r e a c t i v ec h l o r i n es p e c i e s ，r c l s ) 1 2 j 。严格来讲r o s 包 括活性氧自由基和非自由基的含氧化物。 表1 1r o s 的特点、生成途径与种类 1 1 1 2 自由基的生物学作用 自由基对于生物体的生理过程和病理过程都起到了重要的作用 3 1 。氧自由基对 于细胞的信号传导、基因调控以及对可溶性鸟苷酸环化酶活力调节起到了关键作 用1 4 5 j 。由于自由基的化学活性较高，能够引起生物大分子的氧化氧化，例如使脂 质过氧化而破坏细胞膜和细胞器膜；与蛋白质巯基或色氨酸残基作用而使蛋白质 功能或酶活性丧失，从而引起蛋白质分子聚合和交联；破坏核酸的结构、攻击嘌 呤与嘧啶碱基，导致变异的出现与蓄积，最终导致细胞损伤甚至死亡【3 】。有文献报 道表明超氧化物岐化酶( s o d ) 被活性氧损伤后，其物理、化学和免疫特性都发 生了明显改变【6 】，最终使其不仅不能够保护细胞，反而还会促进细胞的氧化损伤。 另外，自由基参与了许多疾病的病理过程，例如唐氏症、心脏病、癌症、弗里德 赖希运动失调症、类风湿性关节炎和自身免疫性疾病等。现有大量资料已经证明， 炎症，肿瘤、衰老、血液病、以及心、肝、肺、皮肤等许多方面疾病的发生都与 体内自由基产生过多有着十分密切的关系。另外，氧化损伤也是引起突变、肿瘤 生成、衰老和与衰老相关疾病的非常重要的因素之一。但同时自由基的这种高活 性也能被生物体用来抵御病原微生物的入侵，激活的巨噬细胞和免疫系统中的其 它吞噬细胞能够产生r o s 来杀伤病原微生物等【3 】。综上所述，生物体中的自由基 是一把“双刃剑”：当处于生理水平时它是信号和调控分子；而当处于病理水平时 它又变成了损伤细胞的“冷酷杀手”。氧自由基生物学的普遍规律在图1 1 给出了精 硕上学位论文 彩的描绘【7 1 。 e n d o g e n o u s s o u r c e s m i t o c h o n d r i a n a d ho x i d a s e c y t o c h r o m ep 4 5 0 a n t k ) x 瑾i a n t d e f e n c e s c a t s o d ，g p x g l u t a t h i o n e ，v i t a m j mc ，e e x o g e n o i u s s o u r c e s u zi o n i z i n gr a d i a t i o l t c h e m o t h e m o e u t i c s i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e s e n v i r o n m e n t a lt o x i m 翟志她r o m 弘曲e dp h y s i o l o g i c a l t t m c t i o n l l l 驴凼dp h y s i o l o g i c a l f i m c t i o n a g i n gd i s e a s ec e l ld e a t h 图1 1 疾病、衰老与生物体内r o s 代谢平衡 1 1 1 3 常见的自由基生成途径 一、生物体外的自由基生成 可应用物理或化学方法使具有成对电子的分子或离子变成含不成对电子的自 由基。这些方法通常包括下列途径： 1 、裂解法【8 ，9 】 共价键化合物的解离有两种方式：异裂与均裂 异裂+一 a ：b a+b 均襄 a ：b _ a + b 均裂的产物都带有不成对电子，因此均属于自由基。利用此法产生自由基需 要从外界提供足够大的能量。常见的供能方法有热解、光解与辐射分解等。 2 、电子转移法 ( 1 ) 金属离子介导的氧化还原反应 凡是能够单电子氧化还原的金属离子都可以与h 2 0 2 作用而使其发生均裂，产 生自由基。 m + 1 + h 2 0 2 一m + 2 + o h + o h 新型生物自由基检测技术 实验室常用的著名f e n t o n 反应就是典型的例子【10 1 。当f e 2 + 与h 2 0 2 发生反应 后可产生一个十分复杂的自由基化学过程，并且随着f e 2 + 和h 2 0 2 的浓度变化时， 所生成的自由基种类也不尽相同。 ( z ) 电子俘获 非自由基物质也可以从外界俘获一个电子，从而使之变成自由基。例如： c c l 4 + e c c l 3 + c i 0 2 + e o q o a 二、生物体内的自由基生成 图1 2 哺乳动物细胞内氧自由基、氮自由基以及其它活性物质的生成途径 缩写：a a ，氨基酸；a r g ，l 精氨酸；b h 4 ，( 6 r ) - 5 ，6 ，7 ，8 - 四氢- l 一生物喋呤；c h 2 0 ， 甲醛； c i t ，l 瓜氨酸；d q ，敌草快；e t s ，电子传递系统；f a d ，黄素腺嘌呤二核苷酸( 氧化型) ： f a d h 2 ，黄素腺嘌呤二核苷酸( 还原型) ；g l y ，甘氨酸；h 2 0 2 ，过氧化氧；h o c i ，次氯酸； h l o h ，氢化脂质自由基；i r ，电离辐射：l ，脂质自由基：l h ，脂质( 不饱和脂肪酸) ； l o ，脂质烷氧自由基；l o o ，脂质过氧自由基；l o o h ，脂质过氧酸；m p o ，髓过氧化物 酶；n a d + ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( 氧化型) ；n a d h ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( 还原型) ； n a d p + ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( 氧化型) ；n a d p h ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( 还 原型) ；n o ，一氧化氮；0 2 ，超氧阴离子自由基；o h ，羟基自由基：o n o o 一，过氧亚硝 基；p 4 5 0 ，细胞色素p 4 5 0 ；p d g ，磷酸依赖的谷氨酰胺酶；s a r ，肌氨酸；s o d ，超氧化物 岐化酶；v i tc ，维生素c ( 抗坏血酸) ：v i te ，维生素e ( a 生育酚) 。 氧气对于所有r o s 、r n s 以及活性氯的生成都是必需的。图1 2 中展示的是 生物体中主要氧自由基和氮自由基的主要生成反应。n o 合酶( n i t r i co x i d e s y n t h a s e ，n o s ) 的酶促反应是动物体内n o 生物合成的唯一途径。如图1 3 所示， 硕十学位论文 超氧自由基是由氧气分子直接生成的第一个活性氧，而超氧自由基在酶或非酶反 应的转化中又可以生成其它其它活性氧或活性氮。超氧自由基的生成途径如下： n a d p h 氧化酶氧化n a d p h ；黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤或次黄嘌呤；线粒体电子 传递链中还原力( 例如n a d h 、n a d p h 或f a d h 2 ) 的氧化；一元胺( 例如多巴 胺、肾上腺素和去甲肾上腺素) 、黄素、血红蛋白在金属离子存在下的自身氧化； 0 2 在细胞色素p 4 5 0 作用下引起的单电子还原；当l 精氨酸和四氢喋呤缺乏时， 0 2 在n n o s 和e n o s 催化下发生的单电子还原【1 ，2 ，1 1 ，1 2 1 。 h 2 0 2 的形成包括三种途径，例如s o d 将2 - 转化成h 2 0 2 ；细胞色素p 一4 5 0 、 d 氨基酸氧化酶、乙酰辅酶a 氧化酶、或尿酸氧化酶催化的氧气分子的双电子还 原生成h 2 0 2 【2 】；甘氨酸代谢过程中的肌氨酸氧化也会产生h 2 0 2 ( 如图1 2 所示) 。 羟基自由基( o h ) 是化学性质最为活泼的活性氧，然而寿命极短。其生成主要通 过铁等金属离子与h 2 0 2 发生f e n t o n 反应。 1 1 2 生物体内抗氧化系统 自由基是人体正常的生理代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于一个不 断生成与清除的动态平衡中，人体内存在少量的自由基，不会对人体健康构成威 胁，相反还可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌、病毒，消除炎 症，分解毒物。但是如果由于某些原因，使得人体内活性氧自由基生成的数量过 多，动态平衡就会打破，过多的自由基就会对生物膜和其他组织造成损伤，破坏 细胞结构，干扰人体的正常生理代谢活动，进而引起各种疾病，加速人体衰老等 进程。 在长期的生物进化过程中，为了防止自由基给生物体造成损伤损害，生物体 内必然会形成一个完整的抗氧化系统，进而产生一些物质能清除这些自由基，这 些物质一般统称为自由基清除剂( s c a v e n g e r ) 。一般来说，自由基清除剂是指能清 除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的一类物质。自由基清除剂的种类繁多， 通常可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。一类为酶类清除剂，一般为抗氧 化酶，例如超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( g p x ) 等几种。另一类为非酶类自由基清除剂，例如黄酮类、多糖类、维生素c 、 维生素e 、b 胡萝卜素和还原型谷胱甘肽( g s h ) 等活性肽类。 目前研究得最深入、应用得最为广泛的一种酶类自由基基清除剂超氧化 物歧化酶( s o d ) ，几乎存在于细菌、真菌等需氧呼吸的所有生物体内。s o d 是一 类含金属的酶，按照其所含金属辅基不同可分为含铜锌s o d ( c u z n s o d ) 、含锰 s o d ( m n s o d ) 和含铁s o d ( f e s o d ) 3 种s o d 。s o d 是生物体内抗氧化系统 中十分重要的抗氧化损伤的一种金属酶，对氧自由基具有强烈的清除作用，尤其 对于超氧阴离子( 0 2 一) ，s o d 可将其催化，使其发生歧化反应而生成h 2 0 2 和 新型生物自由基检测技术 0 2 ，故s o d 又可称为清除0 2 一的特异性酶。s o d 的主要生理功能有：清除体内 产生的过量的0 2 ，保护蛋白质、d n a 和细胞膜免受0 2 一的破坏作用，减轻或 延缓甚至达到治愈某些疾病，延缓因自由基损害生命有机体而引起的衰老现象； 提高人体的抵抗力，增强人体对烟雾、辐射、有毒化学品及医药品的适应性；增 强人体自身的免疫力，提高人体对自由基引发的疾病的抵抗力，如炎症、肿瘤、 白内障、肺气肿等；清除因放疗所诱发的大量自由基，从而减少放射对人体其他 正常组织的损伤；消除疲劳，增强对剧烈运动的适应力。 过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 也是一种酶类清除剂，又可称为触酶，是一种 以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使h 2 0 2 分解为0 2 和h 2 0 ，清除体内的h 2 0 2 ， 是生物体防御体系的关键酶之一。c a t 作用于h 2 0 2 的机理实质上是使h 2 0 2 发生 歧化反应，但必须有两个h 2 0 2 先后与c a t 相遇并与活性中心上作用，才能发生 歧化反应。氧化氢酶普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、 线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为有机体提供了抗氧化防御 机理。 谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它于 1 9 5 7 年被m i l l s 首先发现，但直到1 9 7 3 年才由f l o h e 和r o t r u c k 两个研究小组确 立了g p x 与硒之间的联系。硒是谷胱甘肽过氧化酶( s e g p x ) 的活性成分，s e g p x 存在于胞浆和线粒体基质中，它以谷胱甘肽( g s h ) 为还原剂分解体内的过氧化 物，能使有毒的过氧化物还原成无毒的化合物，并使h 2 0 2 分解成0 2 和水，因而 可保护细胞膜和其它生物组织不被过氧化损伤。它同s o d 和c a t 一起构成了生 物体内抗氧化防御体系，因而在机体抗氧化中发挥着重要作用。谷胱甘肽是细胞 内最丰富的低分子量含巯基物质，谷胱甘肽具有以下特点：既可以作为食物的 组成部分被小肠吸收，又可以从生物体内合成，因而它既是外源又是内源的抗氧 化剂；尽管g s h 直接氧化产物g s 是一种促氧化的物质，但g s 很容易形成 g s s g 二聚体，当n a d p h 依赖的谷胱甘肽还原酶存在时，g s s g 又可以被再还 原成g s h ；能在谷胱甘肽s 转运酶的催化下与异生亲电物质反应；能够通过 直接或间接的酶反应有效清除r o s ；能够与n o 结合生成s 亚硝基谷胱甘肽， 后者能在硫氧还蛋白的作用下重新释放g s h 和n o ；能与谷胱甘肽二硫键氧化 还原酶以及硫氧还蛋白相互作用，共同在调节细胞氧化还原内部平衡过程中起到 重要作甩【1 3 】。正是由于以上特点，谷胱甘肽在生物体内抗氧化体系中的地位非常 重要。 维生素不仅是人类维持生命和健康所必需的营养素，还是人体内重要的自由 基清除剂。维生素e 经过一个自由基的中间体氧化生成生育醌，从而将r o o 转化 为化学性质不活泼的r o o h ，中断了脂类过氧化的连锁反应，有效地抑制了脂类 的过氧化作用。维生素c 通过逐级供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏 硕t 学位论文 血酸，在转化的过程中达到清除0 2 、o h 、r o o 等自由基的作用。维生素c 能 够通过与维生素e 自由基反应来循环生成维生素e ，自身变为维生素c 自由基。 维生素c 自由基由于其未成对电子能量相对稳定，因此不是一种活性较高的自由 基【14 1 。维生素c 自由基最终被g s h 循环回维生素c ( 图1 3 ) 。p - 胡萝i - 素能通过 提供电子，抑制活性氧的生成，从而达到防止自由基产生的目的。 d p h l l l a d p g s h - c a a j u 硎t ) - ) - b 捌t m c 嘲t r o 。鹏瞳b 吼h 2 0 + 0 2 图1 3 哺乳动物细胞内氧自由基、氮自由基以及其它活性物质的清除途径 缩写：a d p ，二磷酸腺苷；a r g ，l 精氨酸；b h 4 ，( 6 r ) - 5 ，6 ，7 ，8 - 四氢- l - 生物喋呤；c a m ，肌 肽；c a t ，过氧化氢酶：c i t ，l 瓜氨酸；c y tc ，细胞色素c ；e t s ，电子传递系统；g s s g ， 氧化型谷胱甘肽；g s h ，还原型谷胱甘肽；g s h p x ，谷胱甘肽过氧化物酶；g s h r ，谷胱甘 肽还原酶；g s h t ，谷胱甘肽s 转运酶；g s n o ，亚硝基谷胱甘肽；h b 0 2 ，氧合血红蛋白； h e m e n o ，n o 合血红素：h i s ，组氨酸；l o h ，脂质醇；l o o h ，脂质过氧化氢；n o ，一氧 化氮：n 0 3 一，硝酸根；0 2 ，超氧阴离子自由基；o n o o - ，过氧亚硝基：p c ，戊糖循环；r ， 自由基；r ，非自由基；r 5 p ，5 磷酸核糖；s o d ，超氧化物岐化酶；t a u ，牛磺酸：v i tc ， 维生素c ( 抗坏血酸) ；v i tc ，维生素c 自由基；v i te ，维生素e ( 生育酚) ；v i te ，维 生素e 自由基。 黄酮类化合物是具有酚羟基的一类还原性化合物。在复杂反应体系中，由于 其自身被氧化而具有清除自由基和抗氧化作用。其作用机理是与0 2 一反应阻止自 由基的引发，与金属离子螯合阻止o h 的生成，与脂质过氧化基r o o 反应阻断脂 新型生物自由基检测技术 质过氧化。 总之，当生物体处于在正常生理条件下，其体内自由基生成与清除处于一种 动态平衡状态，从而使得自由基维持在正常水平即生理水平范围内。一旦自由基 水平低于生理水平就会扰乱自由基在细胞增殖和免疫主体防御中的正常生理功 能。同样，当自由基水平高于生理水平，则这种动态平衡被打破，进而促使氧化 应激的产生，引起蛋白质、脂质和d n a 等生物大分子的损伤，进而引起细胞死亡， 最终导致一系列生理疾病的发生。 1 2 自由基检测 自1 9 0 0 年，m g o m b e r g 首次证实三苯甲基自由基以来，自由基参与生命中 许多重要的过程逐渐为人们所认识，特别是随着现代分析技术的迅猛发展，因而 寻求简便、快速、准确、高效的自由基检测技术成为研究自由基生物学作用的关 键【15 1 。 1 2 1 活性自由基检测方法 1 2 1 1 光度法 通过捕获剂捕获自由基，所形成的自旋加合物的颜色变化对自由基进行定量 分析是光度法的基本原理。它也是最传统的自由基分析方法。它是计量吸光度的 变化值而间接测得自由基的含量。常用的自由基捕获探针有茜素1 1 6 】、溴邻苯三酚 红【17 1 、m t t 、甲基紫【1 引、邻菲萝啉。对于氧自由基，传统的方法是用羟胺与氧自 由基后作用后产生亚硝基化合物，亚硝基与甲萘胺和对羟基苯磺酸形成一种红色 的络合物，然后用分光光度计检测其吸光度，从而检测氧自由基的含量。但是该 体系有许多缺点，比如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。t a n g 等【1 9 】采用了更好 的体系，即以n ，n 二甲基苯胺( d m a ) 和4 氨基安替吡啉反应体系来检测氧自由基。 该方法还可用于血液中s o d 的检测。 光度法操作简单，耗费较少，仪器设备价格低廉，但是也有许多不足之处， 例如检测的灵敏度较低，检测限较高，专一性也不够强等。 1 2 1 2 高效液相色谱法 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 作为一种间 接检测自由基的一种技术己经被人们所熟识并得到了广泛的应用。h p l c 具有较高 分离效率，而且它还可以和各种检测手段如紫外检测( u v ) 、电化学检测( e d ) 、 质谱检测( m d ) 等实现联用，因而可实现在各种复杂体系中的痕量自由基检测。 因此，它比光度法具有更高的灵敏度和更低的检测限。h p l c 目前研究较多的是羟 基自由基，般使用的分析探针为水杨酸，这是因为水杨酸与羟自由基反应速率 硕士学位论文 快、灵敏度高、毒性很小，尤其适合于体内( i nv i v o ) 羟基自由基的检测【2 0 1 。水 杨酸与羟基作用后，自身被氧化成2 ，3 一二羟基苯甲酸和2 ，5 一二羟基苯甲酸，通 过电化学检测器定量分析这两种氧化产物，便可间接测量羟基自由基的含量。t s a i 等【2 1 】结合在线微透析技术，采用5p m 的微管h p l c 检测了老鼠血管中的两种水杨 酸氧化物的浓度，其检测限可达1 3p m o l m l ( 或0 2n g m l ) 。如果采用双电极 检测模式，使各条件最优化，能够使灵敏度更高，检测限甚至可以达到lp g 【2 2 1 。 h p l c m s 联用方法也能实现羟基自由基的检测，b e r g h 等1 2 3 j 成功的采用该技术确 认a 旅烯和羟自由基作用产物矮松醛和龙脑烯醛，他们对h p l c m s 系统加以改 进，配备了一个特殊设计的微波共振腔( m i c r o w a v ec a v i t y ) ，能够在高气压下使用， 该装置允许操作气压高达1 3 3k p a ，从而能够顺利检测半挥发性样品。 1 2 1 3 化学发光法 化学发光现象是一种常见的自然现象，利用化学发光测定化学发光反应反应 物、催化剂、增敏剂、抑制剂，偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂的技术叫 做化学发光技术( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 。化学发光技术可以作为一种非常灵敏 的生物体代谢物、自由基以及抗氧化剂检测技术。其优势是利用了发光试剂与自 由基反应后能直接发光的原理，根据发光强度就能确定自由基的含量。常用的化 学发光试剂有l u m i n o l 和l u c i g e n i n ，其中l u m i n o l 被自由基氧化后会发出蓝光，因 此检测光的强度就可以确定自由基含量。z h a o 等【2 4 l 以l u m i n o l 为发光试剂，研究 了茶叶中的茶色素清除2 * - - 与o h 的能力，并比较了其与茶多酚的自由基清除能 力。结果表明，其清除能力以及动力学过程与茶多酚相似。 l u c i g e n i n 的检测原理与l u m i n o l 相似。t a u b e r t 等【2 5 j 以l u c i g e n i n 为发光试剂， 使用k 0 2 作为非酶超氧自由基产生源，考查了植物酚与超氧化物的反应动力学， 并计算了多种酚的反应速率常数。结果表明，植物酚具有较强的自由基清除能力 是因为酚结构中含有的焦酚和儿茶酚结构部分的化合物，而没食子酸部分则是由 于达到了最大反应数率常数所需的最基本的结构单元。 1 2 1 4 电化学方法 电化学法方便、快速，灵敏度较高，而且易于进行自由基变化的动态追踪检 测。例如，电化学法检测o h 灵敏度高，检出限低，而且测定快速、简便、实用， 可以用于低剂量o h 的测定。但它常受其它干扰试剂影响，选择性较差，不适合 于复杂体系中的自由基检测，应用范围有限。电化学法通常也与其他方法联用， 例如e c e s r 、h p l c e c d 等。随着光电检测技术的发展日新月异，这类电化学联 用技术，很有可能成为未来分析检测氧自由基的一种可信度高而准确的现代测试 工具。 新型生物自由基检测技术 1 2 1 5 荧光光谱法 荧光法研究r o s 的最大特色之处在于荧光探针可以在细胞内直接进行自由基 成像研究，从而在三维空间上定量分析活体细胞内氧自由基的产生。2 ，7 - d c f d a ( 2 ，7 d i c h l o r o f l u o r e s c i nd i a c e t a t e ) 就是一种常用于细胞内r o s 水平的荧光分析 探针，在细胞内r o s 作用下，它可脱掉酯基变成可发射荧光的d c f ( 4 8 5n m 激 发，5 3 5m 发射) ；d a f s ( d i a m i n o f l u o r e s c e i n s ) 是另一种检测n o 的常用荧光探 针。此外，分析灵敏度高，对自由基浓度变化的显示方式比较直观也是荧光分析 法的特点。 1 2 1 6 毛细管电泳法 与h p l c 相比较，毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 检测自由基的 特点在于仪器较简单，分析费用少。特别是将c e 与电化学检测相结合后，灵敏度 可以大幅提高。例如，捕获氧自由基后所形成的产物的检测限可以达到2 1 0 q m o l l 2 6 1 。另外，在脂类、蛋白质、核酸、肽类等大分子的分离检测中c e 也具有 独特的优势，例如s a l v i t 2 7 】使用毛细管区带电泳测定了溶解酵素、人血清白蛋白 ( h a s ) 、p 乳球蛋白a 等蛋白质被自由基氧化损伤后的产物，并考察了四种抗氧 化剂阻止蛋白质被损伤的抗氧化能力以及与蛋白质结合的能力。与h p l c 相比较， c e 的另一个优点是没有固定相，因为固定相的存在可能会导致自由基猝灭反应的 发生。因此，这为c e 法实现自由基的直接检测提供了可能性。c e 在实现自由基 活性物质的直接分离检测时可能具备以下优点【2 8 】：( 1 ) 可以选取合适的分离介质， 使得该分离介质与待检测对象具有较低的反应活性。( 2 ) 分离效率较高，同时分 析速度也很快。( 3 ) 色谱柱中不需要固定相，减少或避免了活性物质分解。( 4 ) 毛细管内部是一个封闭的体系，排除了外部的自由基猝灭剂的干扰，因而自由基 能稳定存在。 1 2 1 7 电子自旋共振( e l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e ，e s r ) 技术 2 0 世纪6 0 年代发展的电子顺磁共振( e l e c t r o np a r a n a a g n e t i cr e s o n a n c e ，e p r ) ， 又称电子自旋共振技术，e s r 方法是论证生物体内存在自由基的最原始实验证据。 其根本原因在于e s r 波谱在实验原理上对自由基的分析最为直接和可靠，是凝聚 相体系中最具专一性的自由基分析检测方法。但是自由基的高活泼性和不稳定性， 使其能快速与溶液中绝大部分的分子进行反应，这也就使得自由基在溶液中的浓 度非常低，因此在室温下直接利用e s r 检测寿命极短的高活泼性自由基难度较大。 尽管人们通过连续流动【2 9 】或低温冷冻【3 0 。3 3 】等方法也曾顺利直接检测到某些瞬态自 由基，但是这些方法需要消耗大量样品，并且操作也比较复杂繁琐，故对生物体 系内自由基研究的实用性不高。随着科技的发展于进步，在2 0 世纪6 0 年代末期 硕士学位论文 开始出现了一种短寿命自由基分析技术自由基捕获( s p i nt r a p p i n g ) 3 4 - 3 6 l 。该 技术是利用某一反磁性化合物自由基自旋捕捉探针( s p i nt r a p ，常用硝酮化合物 和亚硝基化合物) 与不稳定的自由基反应生成一种相对稳定的顺磁性自旋加合物， 然后通过自旋加合物的e p r 常数( 超精细结构) 来研究自由基的电子结构，从而实 现检测短寿命自由基的目的。自由基捕获的基本原理如图1 4 所示： r 啼闻+ r 二一r 忡 殴 ( a 闺! 硝基类 州一r r 脚， 图1 4 自由基自旋捕获技术的原理 1 2 1 8 免疫自旋捕捉技术( i m m u n o s p i nt r a p p i n g ) 2 0 0 2 年，m a s o n 小组提出了一种新的检测自由基的技术免疫自旋捕捉技 术3 7 1 ，他们通过将辛酸修饰的d m p o ( 一种常用的硝酮自由基捕捉剂) 与卵白蛋 白反应形成复合物，然后注射到兔子体内，以此来得到抗d m p o 的抗体，并成功 的在生物体内检测蛋白质、d n a 等生物分子所形成的自由基【3 7 4 2 1 ，原理图见图1 5 。 图1 5 对以生物分子为中心的自由基的研究 1 2 2 自由基自旋捕获探针 如前所述，自由基捕获技术始于2 0 世纪6 0 年代末，1 9 6 5 年，e gj a n z e n 研 究了取代硝基苯热解反应后，发现e s r 谱仪能够检测到稳定的自由基信号，并预 测这些稳定自由基来源于硝基苯的还原产物【4 3 1 。2 年后，m 1 w a m u r a 等报道了硝 酮化合物( n i t r o n e ) 与自由基的1 ，3 加成反应，并用e s r 波谱证明上述反应过 程中能产生很稳定的自由基【4 4 1 。同时还报道了环状硝酮5 ，5 - d i m e t h y l 1 p y r r o l i n e 新型生物自由基枪测技术 性自由基的短篇报告，并首次将该技术称为“s p i nt r a p p i n g ” 4 5 1 。与此同时，c 星r 亚硝基化合物 雪霎燃 番jr 开环硝酮化含物 冀酮类化合物t 磊二二笼磊获i l 环状硝酮化合物 针l 其它，- - 苯i ! l 、硫代羧基化合物 硕士学位论文 i e t o h o i o p b n i e t o ) 2 。姆刚5 0 。姆 o io i e m p o d e p d m p o d e p p e p od e p b d p o p o ( o e t ) 2 图1 6 几种自由基捕获探针的代表化合物 1 2 2 2 线性硝酮类自由基捕获探针 p b n ( p h e n y l n t e r t b u t y ln i t r o n e ，苯基n 叔丁基硝酮) 是线性硝酮自旋捕捉剂 的代表化合物。它已广泛应用于各个自由基研究领域，优点如下： p b n 是固体， 对光、热、空气等都不敏感，易保存，也易于合成，纯化简单；能溶