（机械设计及理论专业论文）微波辅助蛋白酶水解反应工艺和反应器的研究.pdf

摘要 摘要 由于常规的酶解反应所需时间比较长，本课题主要研究了微波辐射辅助蛋白酶水解 蛋白质的反应。研究发现采用微波辐射可以加快蛋白酶水解反应，提高反应速率。 设计制造了实验室规模的微波辐射蛋白酶催化反应器，该装置中由夹套反应器、 螺旋形管道微波辐射器，流体循环系统和水浴循环控制恒温系统等部分组成。螺旋形管 道反应器置于微波炉内，采用循环式的方法解决了蛋白酶在微波辐射过热时使酶失活的 问题。并且该反应器实现了微波辐射功率可调，物料反应温度可调。设计计算了夹套式 传热反应器，利用循环水浴加热使物料始终保持在一定温度下反应。 本文以木瓜蛋白酶水解大豆蛋白为研究对象，验证反应器系统的优越性。首先研究 了在常规实验下木瓜蛋白酶的最佳水解条件，水解的效果用甲醛滴定法测氨基氮含量的 高低来确定，通过单因素实验和正交试验得到木瓜蛋白酶对大豆蛋白水解的最佳工艺条 件为：固液比是1 ：8 、酶用量5 ( 酶与大豆蛋白比) 、酶解温度5 0 、酶解时间5 h 、 酶解p h 值6 7 。 由于反应系统中物料是循环式的，固液比是1 ：8 时循环不顺畅，所以取固液比l ： 1 0 。反应器内循环反应条件为固液比是l ：l o 、酶用量5 、酶解温度5 0 、酶解p h 值 6 7 ，在不加微波辐射条件下酶解时间5h 与用4 8 0 w 微波辐射反应1 2 0m i n 试验对比， 结果表明用微波辐射6 0m i i l 氨基氮含量就达到了不用微波辐射下反应5h 的氨基氮含 量，反应速率提高了5 倍以上。研究了微波功率对水解的影响，功率越高水解速率越快。 用液相色谱分析比较了用微波辐射水解1h 和不用微波辐射水解5h 水解液游离氨 基酸的含量，结果表明各种游离氨基酸含量和总氨基酸含量基本相同。 最后对反应器的通用性和放大性进行了研究。 本课题研究表明，微波辐射能辅助蛋白酶水解，设计的反应器有优越性，能提高反 应速率。 关键词：微波辐射蛋白酶催化反应器，木瓜蛋白酶，大豆蛋白，氨基氮，氨 基酸，液相色谱 a b s 姗c t a b s t r a c t t h ec o n v t i o n a lh y 函0 l y z 撕雠r e a c t i o nt a k e sl o n g 缸e t l l i sp a p e rh 弱m a i n l y r e s e 鲫c i 湖m ep r o t e 鹤争h y d r o l i s i sr c t i o ni i l 1 e 鸽s i s t 锄c co fm em i c m w a v er a d i a t i o n t h e s t u d ys h o w s 也a tt h i sm e m o do f m i c r o w a v er a d i a t i o nc 锄s p e c du pm er e a c t i o nr a t e a l a b o r a t o r ys c a l em i c r o w a v er a 击a t i o nr e a c t o rf o rp r o t e 硒争b ，d r o l i s i sw 嬲d e s i 弘e d 锄d c o n s t m c t e d ，锄dn l er 鼯c t o rc o n s i s t so fs t i 玎i n gt a | ：l l 【0 r 础r h e l i x i i l gp i p e l i n er c a c t o r m d i a t o db ym i c r o w a v ei nc a v i 劬i i q u i dc i r c l es y s t e m ，w a t e rc i r c l et 砌【硒rt l l ec o n 旬巾l l i n g 廿l e r e a c t 觚ti i q u i d 觚d 0 n 1 1 1 eo 懈h e a le 腩c to f i i l i 啪w a v er a d i a ：t i o nc 锄b ea v o i d e di i lm i s c i r c u l a t i o nt ) ，p er e c a t o m o r e o v t 禹p o w e ro fm i c r o w a v er 础a t i o na r l dm et 唧e r a t l l r eo f 根l c t 锄tl i q u i dc 孤b e 删u s t c di nt l l i sr 咖r t h es t i r r i n gt a i l l 【w 弱d e s i 弘e d 觚dc o m p u t a t e d 1 1 1 ew a t e rc 曲c u l a t i o nt a | l l 【e na ：b l 懿t l l er e a c t a n t1 i q u i di nc e r t a i nd e s i r e a b l et 伽n p e r a t u r c t h ep a r a m e t e 瑙s o yp r o t e i i lh y d r 0 1 ) z o db yp a p a y i l lw e r e0 p t i m i z e di n 衄sp a p e rp d o rt o m i c r o w a v ef a d i a t i o nr e a 瓶o ns y s t e m 删y ，也eb e s tb ，出0 l y s i sc c i n d i t i so fp a p 妁缸w e 他 s t u d i e di nr e g u l a re x p e r i i n e n t s ，t l l ec o n t to fi l i 缸d g m e 嬲m c db yf 0 衄a l de _ h y d et i 眦c d l e 0 p t i n l i z a t e d c f a f ic o n d i t i o 嬲o f h y d m i y s i s 锄a l y s i s c db ym e 懿p 丽m 锄to fs i i l 酉ef a c t o r 锄d 圮o m l o g o n a lt e s ta r e ：廿l er a t i oo fs o l i d - l i q u i d ，l ：8 ，t l l ec o n t e n do fp a p a y i i l ，5 ，t h c t e r i l p e 翻t i l r eo f h y d r o l y s i s ，5 0 ，m eh y d r o l y s i st i m e ，5l l m ep h v a l u eo f h y d m l y s ，6 7 b e c a u s en l er e a c t o ri sac i r c u l a t i n gs y s t e m ，m l dt l l er a t i oo fs o l i d - l i q u i d 1 ：8 ，t h ec y d ei s n o ts m o o 电s 0t l l er a t i oo fs o l i d l i q u 迥l ：lo h lt h em a c t o rt l l e 他a c t i o nc o n d i t i o 璐躺：血e r a t i oo f l i d - l i q u i d ，l ：l o ，t h ec o n t to f p a p a i n ，5 ，t l l et 即叩蹦灿r eo f h y d r o l y s i s ，5 0 ，a n d t l l ep hv a l u eo fh y d r o l y s i s ，6 7 ，c 0 n 衄哦t l l er e s u l to f5h o u r h y d r o l y s i se x p 耐m e n t 、j l ，i l o l i t m i c r o w a v er a d i a t i o nt ol2 0m i i lh y d r o l y s i se ) 【p 耐m e n tu n d e r4 8 0wi i l i c r o w a v er a d i a t i o 玛t t 嵋 r 鹪l l l ts h o w sm a tm ec o n t e n to fn i 仃。鲫g 饥e r a t c db y6 0m i n - h y d r o i y s i se x p 丽m e n tu n d 贫 m i c r o w a v er a d i a t i o nr e a c h e dm ec o n t a l to fl l i 仃o g 髓b y5h o u 卜h y d r 0 1 y s i se x p 舐m 饥tw i m o u t m i 删a v em d i a t i o i l t l l er a t eo fr e a c t i o ni n c r e a s 懿m o r et l l a n6 v et i m e s t h em i c r o w a v e s p o w c ro nm ei m p a c to f h y d r o l y s i sw e r es t l j d i e d ，t h eh i 曲e rp o w e r t l l es o o n e rh y d r o l y s i s sr a t e c o m p a r e dt l l ec o n t to f 抒a m i n o a c i dg e n e r a t e db y5h o l l r h y d r o l y s i se x p 幽e n t w i t i l o u tm i c r o w a v er a d i a t i o nt 06 0m i n h y d r o l y s i 曼e x p e r i m e n tu n d e r4 8 0 w - p o w * i i l i c r o w a v e r a d i a t i o nb yl i q u i dc h r o m a t o 伊a p h y 锄a l y s i s ，t h er e s u l t ss h o w c dt h a tm ec o n t to fe a c h f e e 锄i n o a c i d 觚dt h et o t a lf 沁e a n l i n o a c i d 锄eb a s i c a lt h es 锄n e f i n a l l mm ec 0 m m o nn a t i l r c 锄de n i a r g 锄e n to f t h er e a c t o rw e f es t u d i e d t h er e s e a r c hs h o w e dt 1 1 a tm i c r o w a v e m d i a t i o nc 锄a s s i s th y d r o l y s i s ，t h ed e s i 弘o ft l l e r e a c t o rc a ni n c r e a s et h er a t eo fa c 廿o n k e y w o r d s ：m i c r o w a v er a d i a t i o n p r o t e a s ec a t a l ”i cr e a c t i ) r p 印a i n ，s o yp r o t e i n ，i l i 仃0 9 c i l ， a m i n o a c i d ，l i q u i d - c h r o m a t o 哥a p h y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：岔继红。 日 期：彭z = 4 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：如然红z 一导师签名： 日 期：， 绪论 第一章绪论 1 1 微波化学的发展 微波化学是研究在化学反应过程中应用微波的一门新兴的前沿交叉学科，它是在人 们对微波场中物质的特性及其相互作用的深入研究基础上发展起来的一门科学【1 1 。 1 1 1 微波加速化学反应的机理 微波是指频率在3 0 0m h z - _ 3 0 0g h z 的高频电磁波( 其电磁波谱位于红外光波和无 线电波之间) ，其波长在0 1 锄一l o o 破间，由于微波的频率很高，所以也叫超高频 电磁波。微波的应用极为广泛，为了避免相互间的干扰，供工业、科研和医学使用的微 波频段是不同的。按国际惯例，用于工业生产和科学研究的有9 1 5m h z 、2 4 5 0m h z 、5 8 0 0 m h z 、2 2 1 2 5m h z 四个频段，而目前只有9 1 5m h z 和2 4 5 0m h z 被广泛使用，大多数家用 微波炉常用频率是2 4 5 0m h z ：在较高的两个频段还没有大功率的工业设备。微波对物 体加热的原理为：微波中的电磁场以每秒钟数亿至数十亿的频率变换方向，高频振动所 产生的极性变化作用于物体中的极性分子，例如水分子根本跟不上如此快速的方向切 换，做高速运动，从而产生摩擦而发热1 2 1 。微波加速有机反应是一个复杂的过程，学术 界还没有对微波加速化学反应有个公认，目前有两种不同的观点。 一种观点认为微波的热效应【3 5 1 ： 这种观点认为当用微波辐射的反应时间明显缩短的同时，反应的动力学和机理没有 改变。在微波辐射下，体系的温度迅速升高从而导致反应速率显著提高，反应速率的提 高仅仅是介电加热的效果。因为传统加热方式是通过辐射、对流及传导由表及里进行加 热，过程比较缓慢，为避免温度梯度过大，加热速度往往不能太快，也不能对处于同一 反应装置内混和物料的各组分进行选择性加热。而微波加热与传统加热不同：1 、微波 加热是其表面和内部同时进行的一种体加热，不需要热的传导和对流，不依赖于温度梯 度的推动，体系受热均匀，升温迅速。2 、物质吸收微波的能力与其介电常数密切相关， 微波可以对混和物料中的各个组分进行选择性加热，提高反应的选择性。3 、微波加热 无滞后效应，当关闭微波源后则无微波能传向物质，非常适合对温度控制要求高的反 应。他们认为微波应用于化学反应仅仅是一种加热方式，和传统的加热方式一样。对某 个特定反应而言，在反应物、催化剂、产物不变的情况下，该反应的动力学不变，与加 热方式无关。 微波引起化学反应速率加快是由于微波加热引起溶剂过热以及由高温而产生的压 力引起的；也可能是由于在某些物质( 如催化剂) 上形成比周围温度更高的“热点”， 造成速率加快。从本质上解释是微波能量只有约几个j m o l 一，因此不能引起分子能级的跃 迁，所以微波只会使物质内能增加，并不会造成反应动力学的不同。常见的微波炉的工 作频率为2 4 5 0 m h z ，即物体中的极性分子在微波的作用下，每秒中可振动2 4 亿5 千万次， 在与分子的化学键发生共振时，不可能引起化学键断裂，也不能使分子激发到更高的转 江南大学硕士学位论文 动或振动能级。微波对化学反应的加速主要归结为对极性物质的选择性加热，即微波的 致热效应。 另一种观点微波的非热效应【】； 微波对化学反应的作用是非常复杂的，一方面反应物分子吸收了微波能量，提高了 分子运动速度，致使分子运动杂乱无章，导致熵的增加。另一方面，微波对极性分子的 作用，迫使其仅用微波致热效应来描述的。微波除了具有致热效应外，还存在一种不是 由按照电磁场作用，每秒变化2 4 5 1 0 9 次，导致熵的减小。因此这种微波对化学反应的 作用机理是温度引起的非热效应。微波作用下的化学反应，虽不足以使化学键断裂，但 可以使化合物中某些化学键振动或转动，导致这些化学键的减弱，从而降低反应活化能， 改变反应动力学。在微波催化下许多反应速度往往是常规反应的数十倍，甚至上千倍 然而，对于微波加速反应机理的研究，还是一个新领域，有些反应结果尚缺乏实验上更 充分的论证，有许多实验现象需要更全面、细致和系统的解释。 1 1 2 微波辐射应用于有机化学的研究进展 微波技术在有机合成上的应用始于二十世纪八十年代，当加拿大科学家g e d y j 9 】等 人发现将微波加热技术应用于有机小分子合成能显著提高反应速度后，利用微波技术促 进有机反应便成为人们关注的焦点。目前涉及微波加热技术的有机合成反应有烷基化反 应、酯化反应、取代与消除反应、氧化反应、烯烃加成反应、缩合反应、重排反应、聚 合反应和有机金属反应等类型。研究表明，微波技术在有机合成上的应用不仅能使反应 速率提高几倍至几十倍，而且还具有操作方便、产率高、产品易纯化等优点。所以微波 应用于有机合成发展比较迅速。 ( 1 ) 酯化反应 酯化反应在工业上应用十分广泛，一直存在反应推动力小、反应时间长、设备利用 率低等问题。目前一元羧酸的酯化反应中的应用工业生产是以硫酸为催化剂酯化合成己 酸乙酯，缺点为副反应多，工艺复杂，且污染环境腐蚀设备，从而增加了生产成本。1 9 8 6 年g e d o 】将密封的反应器置于微波炉中首先研究了苯甲酸与醇的醋化反应，并与传统 的加热方法进行了对比，发现微波对酯化反应有明显的加速作用，反应在几分钟内完成。 与甲醇的反应比传统方法快9 6 倍。，李芳良【1 1 1 2 1 选用价廉易得、性质稳定的n 枷s 0 4 h 2 0 作催化剂，在微波辐射条件下进行合成反应，反应时间仅为1 8m i n ，而传统的加热回流 方式，反应时间却要长达7h 。 微波作用下的二元羧酸甲醋化反应也取得了成功。刘福安等研究了丁烯二酸与甲醇 的双酯化反应，微波作用下仅回流5 0m i n ，产率为8 0 ，若达到相近的产率，传统的加热 m 一 法需4 8 0m i n ，加快反应速率近1 0 倍。2 ，2 联二环己烷二甲酸( l ) 微溶于甲醇， 加大了酯化的难度，传统酯化需要4 2h 。m a i “c h 等【1 3 】在微波作用下回流o 5h ，产率达 8 5 ，反应速率提高8 4 倍；2 ，5 二氯苯甲酸的羟基旁边有两个氯基，酯化反应时在过渡 态空间阻力增大，酯化反应一般比较难，s h i e h 【h 】采用微波加热进行酯化反应，将2 ，5 2 绪论 二氯苯甲酸甲酯的合成时间从2 4h 缩短为2 4m i i l ，提高反应速率6 0 倍。 ( 2 ) 缩合反应 吴明书等人【1 5 1 利用微波辐射，不用催化剂，在强极性非质子溶剂d m f 中进行缩合反 应，经短时间( 2 5m i n 一1 0m i n ) ，较好收率合成了多一芳基亚甲基一l ，3 一二氢2 删l 哚斗酮类化合物。用类似的方法，同时不用微波辐射合成了3 环己亚基一1 3 二氢 q h 一吲哚堋需要时间为3h 一般合成方法都要用缩化剂。 ( 3 ) 重排反应 2 一甲氧苯基烯丙基醚在通常条件下加热到2 6 5 ，反应4 5m i n ，生成产率为7 l 的 重排产物；而在微波辐射下反应1 2m i i l 。产率即可达7 1 ，若在d m 中反应只需微波辐 射1 5m i n 产率高达8 7 。m o 蕾川d 锄【1 6 】等人研究发现，乙酸苯酯吸附在混有a 1 c 1 3 z n c l 2 的硅胶上，经微波辐射7m i n 可得到9 5 的f r i c s 重排产物。 ( 4 ) 酰胺化反应 周金梅等【1 刀报道了在微波辐射下苯胺和冰醋酸反应生成乙酰苯胺，反应时间2 0 m i n ，收率可达8 0 6 。微波辐射下合成n 一芳基甲酰胺，反应时间比传统方法缩短了 2 伊一1 2 0 倍。 棒2 砸嘲b ll 0 一舢型0 即 ( 5 ) 烷基化反应 2 0 0 0 年c h a t t i 及其同事【1 8 】研究了啡基化反应，在k o h 和相转移催化剂作用下， 用微波加热于1 2 5 反应5m i n 便可得9 8 的气谱产率，雨在常规加热下，相同条件仅得 l3 产率。酚盐与卤代烃形成酚醚的反应是微波最早应用的有机反应之一，氰基酚钠与 苄基氯在通常条件下反应1 2h ，产率仅为7 2 ；而1 9 8 6 年，g e d y e 首次成功用在微波作 用下反应4m i n ，产率就可达9 3 ，反应速度提高约2 4 0 倍。李军等人【1 明用微波法合成邻 异丁烯氧基苯酚，微波加热9 0s 产率达6 8 。而常规加热回流3h 产率为3 5 。 ( 6 ) 缩醛( 酮) 反应 应用微波技术，可在无溶剂条件下进行羰基化合物和羟基酸之间的缩醛( 酮) 反应。 ( 7 ) 羟醛( 酮) 缩合反应 孟志霞等人【冽以芳醛和丙酮为原料，在碱性条件下经微波辐射快速合成了一系列 1 ，5 一二芳基一l ，4 一戊二烯3 一酮，反应在lm i n 左右完成，产率6 1 一8 6 。 ( 8 ) 氧化反应 m o h 跚蚰a d 等人【2 1 】利用微波辐射条件下载lm i n 内用次氯酸钙将苄醇氧化合成相应 的酮和醛，根据与羟基相连的侧基的不同代产率从6 5 9 8 不等 ( 9 ) 水解反应 张青山等人【2 2 】采用微波辐射反应技术研究了苯乙腈、对羟基苯甲腈和吲哚一卜甲 腈在氢氧化钠水溶液中的水解条件及辐射功率和辐射时间对收率的影响。结果表明，最 适宜的功率为5 3 0w ，辐射时间分别为4m i n ，4 5m i n ，7m i n ，制备出苯乙酸、对羟基苯甲 3 江南大学硕士学位论文 酸和吲哚一卜甲酸的收率分别为8 7 9 ，8 5 8 ，8 9 6 。 ( 1 0 ) 消除反应 张敏、王科军在微波辐射下研究了蝶酚与甲醇醚化反应。张熊禄在微波作用下， 以较高收率在很短的时问内进行了消除成醚反应。 ( 1 1 ) 取代反应 p a u l 等报道了无溶剂条件下微波诱导合成口溴代烷基酮，口二溴代烷基酮。在相 同工艺条件下，微波辐射较常规加热产率高4 _ - 4 5 倍。李伟章等人【2 3 】研究发现d m s o 溶剂 中，各种胺经微波辐射卜l om i n 能与邻氯硝基苯衍生物发生亲核取代反应，高产率的 形成各种n 烷基化邻硝基苯胺衍生物。普通方法最直接的是由各种胺与邻硝基卤代芳烃 进行亲核取代反应制得。但普通加热条件下，只有亲核性较强的脂肪胺与邻氟硝基苯衍 生物之间的亲核取代反应产率较高，较为实用。而高品化的邻氟硝基衍生物较小。 ( 1 2 ) 成环反应 内酞胺的合成在常规条件下反应5h 只得6 5 的产率，用微波法反应1 5 0s ，其产率为 8 0 ，而微波干法只要9 0s 即可得9 2 的产率1 2 4 】。 矿仙岍蠢 ( 1 3 ) 聚合反应 刘成峰等人【2 5 】研究了在微波辐射下三氯氧磷与双酚a ( b p a ) 快速合成聚磷酸双酚a 酯。结果表明该方法条件温和，操作简便，远远优于传统加热的制备方法，反应l om i i l 就能达到满意的结果。张竞清等人【2 6 1 用微波辐射法直接用尿素于常压下制得了三聚氰 酸。其反应条件为：尿素9 og 励溶剂o 5 ，微波功率5 9 0w ，辐射时间3m i n ，收率8 3 5 。 产物精制后得率为6 5 3 。与常规加热融法相比，微波辐射法反应时间短，不需催化剂 和搅拌装置。 1 1 3 微波辐射辅助酶反应的技术的发展 酶工程是生物技术的一个重要组成部分，指在一定的生物反应器内，利用酶的催化 作用，进行物质的转化，其应用范围己遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、 能源开发和生命科学研究等各个方面。酶催化反应可以使许多官能团底物在无保护的条 件下温和、环境友好的转化，并具有高度的选择性。底物专一性、对映选择性等，酶反 应一般为可逆反应，且有些反应的速度很慢、选择性差。很多研究发现【2 7 - 3 1 1 ：微波辐射 可以改善酶的“微环境”，酶催化体系经微波辐射后，增强活性中心的立体结构与相关底 物的诱导和定向作用，可使底物分子中参与反应的基团和酶活性中心更加相互接近并严 格定位，可以是酶催化反应更具有高效率和专性，提高酶催化反应速度。但目前我国 对微波辐射酶耦合催化反应器研究很少，一般实验装置都是家用微波炉经改装而成， 存在很大的缺陷，如反应物料搅动困难和搅拌不均匀少，温度控制困难，微波辐射过量 或不足等，都会引起酶失活，从而影响反应速率和产率。工业微波辐射酶耦和催化反 应器的研究更是空白。因此有必要对微波辐射酶耦和催化反应器进行系统的研究。 4 绪论 1 2 大豆水解的意义 1 2 1 大豆及大豆蛋白 大豆原产于中国，是世界上产量最大的食用和饲用蛋白资源，是豆科植物中最富有 营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源。 中国是大豆世界第四大产国，主产地东北是世界上最适宜种大豆的地区之一，被称 为大豆种植的黄金地带，而黑龙江省是中国大豆主产区，年产量占全国总产量的4 2 左 右，居全国之首。由于地处高寒，黑龙江省黑河、绥化北部及建三江部分地区约有3 0 0 0 多万亩的耕地只能以种豆为主，这里的农民要赖“豆 生存。在今日世界上许多地方大 豆仍然是人和动物的主要食物。 大豆是世界上少见的高蛋白和高脂肪含量的作物，种子含1 7 的油和6 3 的粗粉， 粗粉中5 0 是蛋白质，其营养价值和经济价值都很高。因为大豆不含淀粉，所以特别适 于糖尿病患者食用补充营养成分。在传统的禾本科农作物中，大豆所含的植物蛋白质比 稻、麦及薯类、谷类作物高2 倍左右。大豆的一个重要用途就是提取豆油，但过去对榨 油后剩下的大量蛋白质却未能充分利用，只是用作饲料和肥料。随着食品工业的发展， 人们采用先进的工艺技术将脱脂豆粞加工成多种大豆蛋白制品，如浓缩大豆蛋白、分离 大豆蛋白、组织化大豆蛋白等，这些大豆蛋白制品蛋白质普遍含量5 0 以上，近年来的 研究发现大豆蛋白水解得到的大豆肽具有降胆固醇，降血压，提高免疫力，抗癌，促进 血红细胞恢复，抗氧化等多种功能。随着保健食品的广泛发展，高品质系列化大豆蛋白 产品的工业化大规模生产，极大地拓宽了大豆蛋白的应用范围。 大豆蛋白是生产大豆多肽的原料，大豆蛋白不仅蛋白含量高，而且质量也好。根据 世界卫生组织( w h o ) 建立的蛋白质推荐摄入量，大豆蛋白含有人体必需的所有氨基酸， 其营养价值与动物蛋白相当，能够很好地满足人类的营养需要。尽管与鸡蛋、牛奶相比 大豆蛋白所含必需氨基酸的比例稍差，但却是植物蛋白质中营养价值最高的蛋白质，其 所含八种人体必需的氨基酸含量，接近或高于联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织 m m o ) 建议的理想构成。在中国又称之为“植物肉”。表1 1 为大豆蛋白所含人体必需的 氨基酸与鸡蛋、牛奶、大米蛋白的比划3 2 m j 。 随着生物技术的发展，人们对蛋白质水解方式及其产物的功能性质进行了系统的研 究，为便于人体对植物蛋白的消化吸收，并适应生产不同食品的要求，要将植物蛋白进 行适当水解。这是因为植物蛋白的结构大都十分紧密，分子量很大，人体摄入后，不易 消化吸收，吸收率往往低于动物蛋白。但植物蛋白经过水解后，蛋白质分解成分子量相 对较小的多肽和氨基酸，结构变的疏松，易于人体消化吸收。大豆多肽作为一种新型大 豆深加工产品是大豆蛋白经水解后制成的低分子肽和氨基酸的混合物在氨基酸组成上， 大豆多肽几乎与大豆蛋白相同，富含人体必须氨基酸。但与大豆蛋白相比，大豆多肽往 往具有更良好的理化性质和生理活性。大豆多肽能有效改善原料蛋白质的不足，达到无 豆腥味，无蛋白质变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动性等特点，这些特 性有利于其在食品、医药等领域的开发和应用，因此大豆多肽的研制与应用倍受关注。 5 江南大学硕士学位论文 它便于人体内各种消化酶的吸收，蛋白质吸收率大大提高。改善蛋白质的功能性质，可 拓宽它的应用范围，作为保健食品基料，可应用于医药工业和食品工业。 表卜l 一些食品中的妊需氨基酸含量( 呦 t a b l e l l1 1 抡懿s e n t i a l 埘曲oa c i dc o n t l 瞰to f s o m ef o o d s ( 呦 1 2 2 大豆水解的国内外研究现状 美国和日本无论在基础理论方面还是在应用研究方面，均处于世界领先地位。美国 上世纪7 0 年代初研究的新型大豆深加工产品一大豆多肽，d e l t o w ns p e c i a t i o n 公司建成了 年产5 0 0 0 吨食用蛋白肽的工厂。日本上世纪8 0 年代开展此方面的研刘3 6 】，不二制油公司、 雪印、森永等乳业公司均己成功地将大豆肽应用于食品工业领域。不二制油生产的某系 列产品，有p m ，s ，r ，d 四种，最先用的是p m ，s 类，含2 3 个氨基酸残基【37 1 。目前，大豆 多肽己经工业化大规模生产，主要是根据所制得的大豆多肽生理活性不同，将其制成药 片、口服液或作为功能因子添加到各种食品中，发挥各种生理功能。除具有特定的生理 功能外，同时往往还具有多种功能。现己开发出婴幼儿食品、运动食品、发酵食品、减 肥食品、降压肽等一系列保健产品，取得了良好的经济效益和社会效益。 我国大豆肽的研究工作开始较晚但比较广泛，特别是近十年有突飞猛进之势。1 9 9 3 年盛国华【3 8 】报道了大豆多肽的功能及应用的研究。1 9 9 6 年赵新淮利【3 9 】用蛋白水解酶制备 大豆蛋白水解物，并用于生产酸性饮料。1 9 9 7 年郭凯等咖1 发明并申请了大豆肽氨基酸口 服液及其制备方法的专利，制备方法为用完全脱腥大豆蛋白粉，用选自1 3 9 8 蛋白酶、胰 蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种，于3 0 一5 0 、p h 值为2 o _ - 9 o 条件下处理，并静止再 提取上部清液，得到的大豆肽再与蛋白糖、氨基酸配制成口服液。同年李书国【4 l 】报道了 大豆多肽食品的开发。其生产大豆多肽的酶有胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木 瓜蛋白酶。开发出的食品包括饮料、恢复营养食品、老年人保健品。暨南大学和吉林农 业大学硕士学位论文大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究保健食品、运动员食 品、新型发酵类食品。2 0 0 1 年张玲华【4 2 j 等报道了大豆多肽的制备工艺研究，采用的水解 6 绪论 酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。钱方等报道了胃蛋白酶水解大豆蛋白的研究及最佳水解 条件。同年张日俊等研究发现经微生物降解的大豆粉中含有1 2 种小肽，其中包括谷肽甘 ( 生物防御作用) g l y h i s l 笋( 促生长，促进细胞生长分化) 等具有生物活性的肽类。2 0 0 2 年孔庆学等【4 3 】报道了大豆低聚肽的功能性质及其应用，指出大豆肽可用于制作酸奶、婴 幼儿食品、运动员食品、老年食品及患者食品，是有效的血管紧张素转换酶( a c e ) 抑制 剂、减肥食品配料等。 大豆多肽在饲料中的应用较少，原因可能在于大豆多肽的生产目前多采用酶水解 法，高价的动植物蛋白酶的使用提高了大豆水解成多肽的生产成本，不适合于饲料添加 剂中的应用。近几年来，有人用微生物发酵技术制备大豆多肽和微生物酶。这种方法不 需要添加额外的肽就可以生产出大豆多肽，大大降低了生产成本，这种制备技术使得大 豆多开发成为肽类饲料添加剂的可能。将大豆多肽应用于畜禽类生产中以提高畜禽生产 性能，改进畜禽品质，今后在饲料工业中应该具有广阔的前景，但还在试验领域。近几 年，大豆多肽的工业化生产己经在国内出现。黑龙江省的三乐源集团研制了“大豆蛋白 活性肽：武汉天天好生物制品有限公司在使用复合肽多级定向酶系统技术生产大豆多 肽方面处于国内领先水平，同时掌握了大豆蛋白肽的性能指标测定、检测方法以及功能 评价等技术。国内已经有专利报道，运用生物工程技术研制成了大豆肽氨基酸口服液及 保健品。 1 2 3 大豆水解的发展前景 随着我国社会主义市场经济的发展，国内食物结构已由温饱型向小康型过渡。 大豆蛋白水解成多肽和氨基酸后又很高的利用价值，主要有以下作用： 营养食品：大豆多肽的吸收率高，对一些做过外科手术的患者，或因疾病的原因， 对蛋白质吸收或消化不良的患者以及因缺乏酶系统而不能分解和吸收蛋白质的患者，都 是很重要的蛋白质营养供应源。此外，有些人，特别是婴儿，对牛乳蛋白或大豆蛋白有 过敏反应，而分子量在3 0 0 4 0 0 以下的肽不会引起过敏反应。因此肽可以满足这些人( 婴 儿) 对氨基酸的需要，保证其健康成长。 运动员食品：在体育活动中，一般消耗体内热量的4 一1 0 是由蛋白质提供的。由 于休内不储存蛋白质和不能合成必需氨基酸，所以必须及时地从外部补充氨基酸，以免 造成肌肉蛋白质的负平衡，小分子的肽则比蛋白质更容易被吸收，因而能迅速恢复和增 强体力【州。 老年人保健食品：一般老年人由于健康或衰老的原因食欲不振，摄取的蛋白质一般 都低于需要量，这样更容易引起疾病和衰老，由于肽容易吸收，老年人用肽补充蛋白质 是最理想的办法。 其他保健：更加促进人们生活水平的提高，随之而来的肥胖、心血管疾病等“富裕 病等严重的社会问题大豆多肽是一种多功能保健因子，其理化特性和营养功能比大豆 蛋白质和氨基酸在营养学上有许多优点，它还具有降低胆固醇作用、抑制血压升高、有 效的减肥等生理活性，既满足了人们营养需求，满足了人们保健的需要。 随着技术的成熟，它将作为一种新的原材料，在食品、药品乃至化妆品等诸多领域 7 江南大学硕士学位论文 会有更加广泛的开发应用前景。总之，随着理论水平的发展，认识和接受，成为人们日 常生活中的一种优质蛋白从而提高人们的生活水平，随着工艺条件的不断完善，大豆多 肽产品必定被更多的消费者做为蛋白质的营养品。 1 3 水解的现状 水解的方式有三种即酸水解、碱水解、酶水解。 1 3 1 酸水解 用酸水解生产水解大豆蛋白的一般过程如图1 1 所示【4 5 粕】。在反应釜中装入原料植 物组织如脱脂大豆、水和酸，对改善风味品质来说，最适用的酸是盐酸，即6 m o 儿盐 酸于1l o 一1 3 0 加热反应8h ，然后水解液以氢氧化钠中和至p h 约5 - _ 6 。制造低盐的水 解植物蛋白( h v p ) ，可选用氢氧化钾作中和剂。将中和后的水解液过滤，去除腐黑物( 主要 是不溶性的碳水化合物降解物) 。将滤渣洗涤液合并入水解滤液中。将此水解滤液进行 漂白和精制，用少于3 量的活性炭脱色，通过过滤除去活性炭。将滤液泵入贮罐即可使 用，也可将水解植物蛋白通过二种途径进行熟化处理。即l 、添加其它风味成分如谷氨酸 钠、孓_ 核苷酸、盐、香辛料、酵母，也可加入焦糖色素制成强化植物水解蛋白调味料； 2 、添加风味前驱物如还原性糖、氨基酸( 通常是半胱氨酸) 、微量营养成分( 如硫胺 素) 以及脂类，这样可补充水解植物蛋白在含硫氨基酸、某些维生素和脂类的不足，生 产营养丰富、具有特征强化肉香的风味料。以上生产的液体产品通过浓缩，用氢化植物 油作包覆物，经喷雾干燥可制得吸湿性强的喷雾干燥蛋白水解物。 图1 1 酸水解生产大豆蛋白的工艺流程图 f i g 1 11 1 1 ec r a f in o wc h a r to f a c i d - h y d r o l y s i s i l l g y p r o t e i i l 虽然酸水解是一高效水解蛋白质的方法，但工艺复杂水解程度难控制，活性肽含量 绪论 偏低，此法制成的h v p 含有微量的一氯丙醇( m c p ) 、二氯丙醇( d c p ) 致癌物( 德国规定 m c p 含量s l m g k g ，d c p 含量郢0 0 5 m 眺4 7 】；而且盐分含量高。而且在酸性水解中， h c i 是最通用的水解剂。这是因为h c l 既可用于液相水解模式也可用于气相水解模式， 而且水解过后容易蒸发除去，水解产物可以浓缩并重新溶解在很少的缓冲液中。所用样 品量可以很少，而这对于数量有限的蛋白质样品而言是非常重要的。在该条件下水解， 天冬酰胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则被完全破坏，半胱 氨酸不能从样品中直接测定。酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸和苏氨酸 被部分水解，损失分别为1 0 和5 【铝】。d 蝴曲等【4 9 】就酸性水解中水解时间对氨基酸的 损失进行了系统研究。对于后面两种氨基酸如果需要精确的定量分析可以应用修正因 子。他们的研究结果表明，在水解过程中太多数氨基酸残基都会发生不同程度的损失， 其中损失最大的是半胱氨酸和丝氨酸。蛋白质的氨基酸顺序对水解结果产生重要影响。 脂肪族氨基酸残基的侧链会产生空间位阻，蛋白质的三维结构也会对其伸展程度产生影 响。 1 3 2 碱水解 碱性水解特别适用于色氨酸的水解，因为色氨酸在碱性条件下非常稳定。另外当蛋 白质样品含有大量碳水化合物时碱性水解也得到应用【刈。碱性水解的主要缺点是丝氨 酸、苏氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外消旋化。碱性水解一般用 n a o h 、k o h 。过去几年里，对色氨酸的分析获得了成功。但有关蛋白质氨基酸组成分 析用碱性水解的文献较少。主要原因是对氨基酸损失比较严型5 1 】。 1 3 3 酶水解 蛋白酶促水解( 简称酶解) 反应的本质是在分子水平上对蛋白质主链结构的一种酶 法改性处理，通过将原始蛋白质降解为多肽和氨基酸等不同分子量大小的混合物而使蛋 白质源底物的理化性能及功能发生改变，使营养价值得到提高。酶水解反应条件温和， 不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物易分离，工艺简单成本低。因此 酶法水解蛋白质制备活性肽是目前生产活性肽的主要方法。反应产物与原料蛋白相比具 有特殊的理化性能与生理功能，所以肽基蛋白水解物成为蛋白制品的发展方向。用生物 方法生产肽类制品时，底物的选择主要是基于蛋白的营养价值、成本、口感、抗原性、 溶解性和功能性，目前较常用的原料包括酪蛋白、乳清蛋白及大豆蛋白。 酶解蛋白质的主要特点：l 、蛋白质的提取率高。2 、工艺简单易控制，酶水解反应 温度低，无环境污染。3 、产品理化性质稳定，营养价值高，提取的大豆蛋白粉( h v p ) 以低分子量的小肽和有生物活性的l 型游离氨基酸为主，速溶性好，易于人体消化、吸 收。但用常规方法酶解所需时间长、升温慢都会导致酶失活，从而影响水解的效率，并 且在工业大规模自动化生产时参数不易控制，生产效率比较底。 微波辐射辅助蛋白酶催化水解：本实验采取微波辐射辅助蛋自酶水解蛋白质的方 法，实验表明微波辐射不但可以大幅度缩短蛋白质水解反应时问，而且升温快提高了水 解产率，并且水解过程中参数易控制。 9 江南大学硕士学位论文 微波辐射蛋白酶催化反应与微波辐射有机化学虽有许多相似之处，但还有许多不 同，如酶的反应温度比较温和( 一般小于6 0 ) ，要求反应体系的温度，微波的功率等 严格控制，因此使用连续流动微波辐射的形式比较合适，且容易做到反应温度、微波辐 射量、辐射时间、反应液循环流速等参数的准确控制。 1 4 本课题的创新 在理解微波特性的基础上，设计和制造了合理的、实验规模的微波辐射辅助蛋白酶 水解的反应器，反应器可以进行参数准确控制；实验研究和优化了微波辐射下蛋白酶水 解大豆蛋白的反应工艺条件；对反应器的通用性和放大准则进行的初步探讨。 1 5 本课题研究内容 ( 1 ) 研制实验规模的微波辐射一蛋白酶催化反应器。 ( 2 ) 研究微波辐射一蛋白酶催化反应器的放大设计及系统的通用性。 ( 3 ) 研究常规下木瓜蛋白酶水解大豆蛋白的最佳水解条件。 ( 4 ) 研究和比较了微波辐射和常规条件下蛋白酶的催化反应和微波辐射功率与反 应速率的关系。 1 0 第二章实验设备的设计 第二章实验设备的设计 2 1 反应器的设计现状 微波化学反应器的研究经历了从高压到常压、从间歇到连续操作方式的变化。1 9 8 6 年g e d y e 等将苯甲酸和甲醇密封于用聚四氟乙烯制成的反应器，在微波炉内靠微波加热 进行酯化反应由于在密封反应器内进行，反应体系可以获得瞬间的高温高压，使反应 速度大大提高，5m i i l 后苯甲酸甲酯的收率达7 6 ，比传统加热提高反应速率9 6 倍。但是 这种高压条件使反应器容易变形或爆裂，同时也难以对反应进行控制和监测。为了使微 波常压反应得以实现，1 9 9 1 年m i n 曲u n 【5 2 】等人设计了可以调节反应器内压力的密闭罐式 反应器。为了测定密闭体系的反应温度，有效的控制反应，b a g l l 姗p 3 】成功使用光纤温 度传感器与计算机技术实现了对微波反应温度的检测。b o s d 卅等成功地对家用微波炉进 行了改造，在微波壁上开小孔，将冷凝管置于微波炉腔体外，盛反应溶液的圆底烧瓶经 过一玻璃接头与冷凝管相连，实现了微波常压有机合成，推动了微波化学的发展。1 9 9 4 年t e r e s aca ：b 1 州幽等人【5 5 1 研制出了一套新的微波连续反应装置( c m r ) ，这套反应系统的 反应器容积总体积为5 0m l ，物料流速约为l 玑，能在2 0 0 和1 4 0 0k p a 下正常运行。利 用此装置已经成功进行了用丙酮制备丙三醇等反应，反应速率都比常规反应得到了很大 的提高。但对于含固体或高粘度的液体的反应、需要在低温条件下进行的反应及原料或 反应物与微波能量不相容的反应( 含金属或反应物主要为非极性有机物) ，此套微波连 续反应装置就无法进行。屠树江等【5 6 1 利用改造后的带回流装置的三乐牌6 5 0 型家用