（物理化学专业论文）生物体的培养与纳米技术.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：详砼日期：叮； 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名谭磋导师签 s 。| 上海师范大学理学颐士论文 摘要 摘要 纳米技术是2 0 世纪8 0 年代初迅速发展起来的新的前沿科学领域，它是一门 在i n m 1 0 0 n m 尺度空间内，研究电子、原子和分子运动规律与特性的高技术学 科，它的最终目标是人类按照自己的意志直接操纵单个原子，制造具有特定功能 的产品，它是现代科学与现代技术结合的产物。纳米技术涉及各个领域，纳米材 料与纳米生物学、纳米化学、纳米物理等共同构成了纳米技术。其中纳米技术在 生物领域中的渗透就形成了纳米生物学，它是目前国际最前沿的研发热点，它是 生命科学与生物技术发展的关键，因此研究纳米技术在生物领域中的应用具有重 要的理论意义和应用价值。纳米气泡和磁性纳米粒子这两种截然不同的纳米材料 近年来引起许多研究者的广泛关注。故本论文分别把纳米气泡对食蚊鱼生存的影 响和免疫磁性纳米粒子的制备及其应用作为研究对象来阐述纳米技术在生物领 域中的应用，取得了以下几个有意义的结果： 。( 1 ) 通过比较研究食蚊鱼在三次脱气水中的生存状况，并采用原子力显微镜可以 直接观察到在固液界面上真空脱气对纳米气泡的影响，证明：1 ) 真空脱气使液 体中的纳米气泡消失；2 ) 固液界面上确有纳米气泡存在。由此可以推论溶解氧 和纳米气泡都是鱼类赖以生存的氧气的主要来源。从另一方面来说，人工鳃的制 作是否能从纳米气泡提取氧气的角度来改进。 ( 2 ) 通过化学沉淀法制备了具有超顺磁性的r f e ：0 3 纳米粒子，在其表面包裹具 有生物亲合性的二氧化硅，并在其表面通过化学修饰使其成为生物功能化的磁性 纳米粒子。再通过一定的化学连接方法将单克隆抗体连接到生物功能化的磁性纳 米粒子表面使其成为免疫磁性纳米粒子磁性纳米粒子的存在可方便扩增产物的 分离。在外加磁场中即可实验产物的分离和纯化。所得的免疫磁性纳米粒子主要 应用于细胞分离、免疫检测、生物大分子纯化等方面的研究。 ( 3 ) 首次使用自制的免疫磁性纳米粒子，从脐血中分离并纯化出c d l 3 3 细胞， 并分别对单个核细胞( 对照组) 和c d l 3 3 细胞( 实验组) 进行红，粒系集落扩 增培养1 4 天、2 l 天培养的结果表明：用自制的免疫磁性纳米粒子分离出来的 c d l 3 3 细胞具有很好的活性，能够很好的增值，形成红、粒系集落。同时根据单 上海师范大学理学硕士论文 摘要 个核细胞( 对照组) 和c d l 3 3 细胞( 实验组) 培养1 4 、2 1 天时的红、粒祖细胞 系集落扩增倍数的比较，可知c d l 3 3 细胞具有更强的增殖能力( p 0 0 1 ) ，它是 造血干祖细胞分化抗原标志，从而为i 临床上各种血液病的治疗提供了定的技 术支持。 关键词：纳米技术：纳米气泡：免疫磁性纳米粒子；原子力显微镜 2 上海师范大学理学硕士论文 摘要 a b s t r a c t n a n o t e c h n o l o g yi st h en e w f r o n ts c i e n t i f i cd o m a i nw h i c hh a sd e v e l o p e dr a p i d l y s i n c et h eb e g i n n i n go f1 9 8 0 s ，i ti sas u b j e c ts c i e n c ei nt h el n m - 1 0 0 n m ，i t sr e s e a r c h r a n g ei n c l u d e se l e c t r o n ，a t o m i c a n dm o l e c u l a r t r a n s p o r tr u l ea n dc h a r a c t e r i s t i c h i g h t e c hd i s c i p l i n e i t su l t i m a t et a r g e t sa r e t od i r e c t l yc o n t r o ls i n g l ea t o ma r t i f i c i a l l y t om a n u f a c t u r et h es p e c i f i c l yf u n c t i o n a lp r o d u c t i ti sap r o d u c tc o m b i n gm o d e m s c i e n c ea n dm o d e mt e c h n o l o g y n a n o t e c h n o l o g yi n v o l v e se a c hd o m a i n ，n a n o m a t e r i a l s w i t hn a n o m e t e rb i o l o g y ,n a n o m e t e rc h e m i s t r y , n a n o m e t e rp h y s i c sa n ds oo n c o n s t i t u t e d n a n o t e c h n o l o g yt o g e t h e r i nw h i c hn a n o t e c h n o l o g yh a sf o r m e d n a n o m e t e rb i o l o g yi nt h eb i o l o g i c a ld o m a i ns e e p a g e ，i ti st h ep r e s e n ti n t e r n a t i o n a l m o s tf r o n tr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n th o ts p o t a n dt h ek e yp o i n to fd e v e l o p m e n to f l i f es c i e n c e sa n d b i o l o g i c a lt e c h n o l o g y , t h e r e f o r e i ti s n e c e s s a r y t o s t u d y n a n o t e c h n o l o g y t of i n dt h ei m p o r t a n tt h e o r e t i c a l s i g n i f i c a n c e a n dt h ev a l u b l e a p p l i c a t i o ni nt h eb i o l o g i c a ld o m a i n m a n yr e s e a r c h e r sa r ew i d e l yi n t e r e s t e di nt w o e n t i r e l yd i f f e r e n tn a n o m a t e r i a l s e s ；n a n o b u b b l e sa n dm a g n e t i cn a n o m e t e rg r a n u l e si n r e c e n t y e a r s t h e r e f o r et h ep r e s e n tp a p e rs e p a r a t e l ye l a b o r a t e s t h ei n f l u e n c eo f n a n b u b b l e st ot h em o s q u i t of i s hs u r v i v a la n dt h ep r e p a r a t i o na n dt h ea p p l i c a t i o no f i m m u n i t ym a g n e t i s mn a n o m e t e rg r a n u l e sa st h eo b j e c to fs t u d i n gn a n o t e c h n o l o g yi n t h eb i o l o g i c a ld o m a i na p p l i c a t i o n o b t a i n i n gt h ef o l l o w i n gs e v e r a ls i g n i f i c a n c e r e s u l t s ： ( 1 ) t h em o s q u i t of i s hw e r ep u ti n t ot h r e ed e g a s i f i c a t i o nw a t e ra n do b s e r v et h e i r s u r v i v a lc o n d i t i o n s a t o m i cf o r c em i c r o s c o p ew a su s e dt om o n i t o rt h el i q u i d s o l i d i n t e r f a c e t h ed e e pd e g a s i f i c a t i o nc o u l ds t r o n g l yi n f l u e n c et h en a n o m e t e ra i rb u b b l e s p r o o f ：1 ) a tt h el i q u i d - s o l i di n t e r f a c e ，t h ee x i s t e n c eo fn a n o b u b b l e sh a sb e e no b s e r v e d b ya f m 2 ) t h ev a c u u md e g a s i f i c a t i o nc a u s e st h el i q u i dn a n o b u b b l e sv a n i s h i n g ； f r o mt h i sp o i n t ，o n em a yd e d u c et h a tt h ed i s s o l v e d o x y g e na n d n a n o b u b b l e sa l lw e r e t h em a i ns o u r c e sf o rf i s hk e e p i n ga l i v e 。t h ea r t i f i c i a lg i l lm a n u f a c t u r em a yi m p r o v e 3 上海师范大学理学硕士论文 摘要 w h e nc o n s i d e rt h ec o n d i t i o n so f n a n o m e t e ra i rb u b b l e s ( 2 ) t h es u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p a t i c l e s w e r e s y n t h e s i z e db y t h ec l a s s i c c o p r e c i p i t a t i o nm e t h o d t h eb i o l o g i c a lc o m p a t i b l es i l i c aw a sc o a t e dt ot h es u r f a c e o f t h e s em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s t h eb i o f o n c t i o n a lm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r eo b t a i n e d b ，m o d i f y i n gt h en a n o p a r t i c l e sw i t h a m i n og r o u p s t h ee x i s t e n c eo fm a g n e t i c n a n o m e t e rg r a n u l em a yf a c i l i t a t ei n c r e a s e st h ep r o d u c tf o rc e l ls e p a r a t i o n t h e nt e s t s t h ep r o d u c ti nt h ee x t e r n a lm a g n e t i cf i e l dt h es e p a r a t i o na n dt h ep u r i f i c a t i o n a n o b t a i n e di m m u n i t ym a g n e t i s mn a n o m e t e rg r a n u l em a i n l ya p p l i e st oc e l ls e p a r a t i o n ， i m m u n i t ye x a m i n a t i o n ，b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l ep u r i f i c a t i o nr e s e a r c ha n ds oo n ( 3 ) t h el m m u n o m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r eu s e df o rt h ef i r s tt i m et os e p a r a t ea n d p u r i f yt h ec d l 3 3c e l l sf r o mt h eu m b i l i c a lb l o o d m o n n u c l e a rc e l l s ( c o n t r a s tg r o u p ) a n dt h ec d l 3 3c e l l s ( e x p e r i m e n t a lg r o u p ) w e r ee x p a n d e dt ot h er e db l o o dc e l l sa n d t h eg r a n u l a rc e l l sf o r1 4o r2 1d a y sr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e s e l f - m a d ei m m u n o m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sc o u l ds e p a r a t ec d l 3 3c e l l sf o r mt h e u m b i l i c a lb l o o dw e l l s i m u l t a n e o u s l y ，a c c o r d i n gt ot h en u m b e r so ft h er e dc o l o n i e s a n dg r a n u l a rc o l o n i e s ，i ti st u r n e do u tt h a tt h ec d l 3 3c e l lh a st h e s t r o n g e r m u l t i p l i c a t i o na b i l i t i e s ( p 0 0 1 ) ，i ti st h es y m b o lf o rt h eh e m a t o p o i e t i c a n c e s t o r c e l l s ，t h u si ti sat e c h n i c a ls u p p o r tf o rt h en o s o h e m i at r e a t m e n to nt h ec l i n i c k e y w o r d s ： n a n o t e c h n o l o g y ；n a n o b u b b l e s ；i m m u n o m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ； a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e 4 上海师范大学理学硬士论文 第一章 第一章文献综述 一、研究意义 早在1 9 5 9 年诺贝尔奖获得者就指出，在设定的空间内，人们可以利用特定 的技术逐个原子地制造物质。8 0 年代西方国家的科学家们开始意识到纳米技术 已经来临并着手开始研究。1 9 9 7 年7 月，第一届国际纳米科技会议的召开，标 志着纳米技术的诞生。到目前为止，纳米技术已经涉及到现有科学技术的所有领 域i l 】o 纳米技术在新世纪将推动生物医学、环境科学、信息技术、自动化技术和 能源科学的发展。将极大地影响人类的生活、衣、食、住、行、医疗等方面【2 j 。 正如钱学森院士所预言的那样：“纳米左右和纳米以下的结构将是下一阶段科技 发展的特点，会是一次技术革命，从而将是2 1 世纪的又一次产业革命。” 纳米技术与纳米材料紧密相连，自从纳米技术与原子力显微镜、扫描探针显 微镜、计算机技术、核分析技术、微电子显微技术等的结合，便具有了观察、制 造、分析原子水平物质结构的能力，为生物医学工作者等提供了在分子水平或亚 细胞水平研究生命现象的应用前景l ”l 。这使得纳米技术在生物领域中的应用日 益广泛，身受广大研究工作的关注，成为目前国际最前沿的研发热点。 固液界面的纳米气泡是一种特殊的纳米材料，它是在表面疏水长程引力的作 用机制的研究过程中提出来的。从上世纪开始研究者们先后利用间接和直接的证 据证明了它的存在。纳米气泡的存在得到证实以后无疑推动了对疏水长程作用本 质的认识，疏水长程引力是表面问最基本、最重要的一种作用，与表面润湿、物 质在表面的吸附和胶体聚集、分散密切相关，也是了解蛋白质折叠、生物膜自装 和乳状液的稳定性的基础【5 ，6 】；固液界面的纳米气泡造成液体的边界滑移在实际 中也有着重要的意义。例如，输送液体过程中若能在管道内表面和液体界面上存 在气体，则可以提高液体的边界滑移而大大减少流动的粘滞阻力【”。另外，纳米 气泡与生物学也密切相关。在生物学领域中，除了与材料表面有关一些生物现象 外，一些问题是否与纳米气泡有关是一个非常值得研究的问题。目前看来，若是 纳米气泡真的起作用，那么它的来源和存在时问是更加的错综复杂。在细胞内， 各种生物分子和生物膜之间，水的厚度有时仅有几个分子，在受到生物大分子表 5 上海师范大学理学硕士论文 第一章 面限制的这种空间内水的性质是否与体相水明显不同呢【8 1 7 还有人提出纳米气 泡的形成为酶解过程提供了能量p 1 ；而本论文研究纳米气泡对鱼的影响存在什么 意义呢? 众所周知，水中存在溶解氧，鱼在溶解氧充足的情况下一般能正常存活， 若鱼在三次真空脱气水中生存时，除了溶解氧对鱼的生存有影响外，是否纳米气 泡或与纳米气泡相关的因素对鱼的生存有一定的影响呢? 这对于人工鳃的制作、 储氢设备是否能从纳米气泡提取氧气的角度来改进具有重要的意义。 磁性纳米粒子是另外一种重要的新型的纳米材料，它以其特殊的磁学性能， 在生物医学、信息技术等领域具有广阔的应用前景【1 0 l 。如细胞分离技术【1 l 】、靶 向药物【12 1 、d n a 1 3 】、固定化酶1 1 4 1 、磁流体【1 5 , 1 6 、高密度信息储存【切、控制释放 【1 8 】、核磁共振1 1 9 l 等。其中生物细胞分离是纳米技术在生物领域中应用的一个十 分重要的技术，它关系到研究所需要的细胞标本能不能快速获得的关键问题。以 往的细胞分离技术主要采用反复传代法、流式细胞分选法、梯度离心法等存在纯 度不高、制备量偏小、仪器设备昂贵、影响细胞活性等不足，也因此未能广泛用 于细胞的纯化研究。近几年，随着对磁性纳米粒子研究的深入，人们开始利用磁 性纳米粒子来分离细胞。单纯的磁性纳米粒子由于易于团聚和生物亲和性不好等 因素，本论文在磁性纳米粒子表面包裹s i 0 2 ，保证了它很好的单分散和生物亲 和性。在其表面通过化学修饰使其成为生物功能化的磁性纳米粒子。再通过一定 的化学连接方法将单克隆抗体c d l 3 3 连接到生物功能化的磁性纳米粒子表面使 其成为免疫磁性纳米粒子，然后利用自制的免疫磁性纳米粒子从单个核细胞中分 离出c d l 3 3 细胞，并分别对单个核细胞和c d l 3 3 细胞在体外短期培养中的动态变 化进行了初步观察和比较。结果表明使用自制的免疫磁性纳米粒子能较好的分离 脐血中的c d l 3 3 细胞，分离与纯化出来的c d l 3 3 细胞不仅细胞活力不受影响，而 且与单个核细胞相比具有更强的增殖能力。 二、研究进展 l 、纳米气泡 自从2 0 0 2 年发现纳米气泡以来，作为一个新兴的研究热点纳米气泡吸引了 越来越多的研究者的重视。纳米气泡是生成于固体和水的界面上，与水紧紧相关 的，研究它我们能获得更多的水的性质和特性。水是地球上储存量最大的液体， 6 上海师范大学理学硕士论文第一章 研究水的性质有利于我们更好地利用它。在水与其他物质两相的界面处通常存在 纳米气泡，它的存在对于该物质的性质有没有影响，以及影响的程度，这些都是 需要研究的，也正是许多材料研究者所关心的。生物体内的水的储存量也是很庞 大的，在水与其他生物组织的接触的界面上时常存在着纳米气泡，研究它的存在 是否能够促进组织间气体和物质交换是很有意义的。 纳米气泡的研究曾一度受到争议，原因是根据经典热力学的计算结果显示纳 米级的气泡的存在时间只有1 0 0 微妙 2 e l 。由于理论计算与实验结果有着很大的差 别，纳米气泡的争论经历了好长时间。随着原子力显微镜( a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y , a f m ) 的广泛应用，不断有研究者【2 1 丛1 采用a f m 观测纳米气泡的文章的发表。 才使得纳米气泡逐渐被人们认识和接受，他们的研究成果如图1 1 0 所示。 上世纪末期h u g o 等人1 2 6 】在研究疏水长程力的时候就是纳米气泡的开端，将 表面问的疏水作用与固液界面的小气泡相联系，只是当时还没有能在纳米尺度上 获得表面力表征的高分辨率的仪器，他们的研究是利用表面力装置( s u r f a c ef o r c e a p p a r a t u s ，s f a ) 溺0 定疏水长程作用力时用干涉仪对两表面间液体的变化情况进行 观察，发现表面间形成了“空穴”，他们的解释是水汽化形成的一个蒸汽泡。 1 9 9 8 年c a r a m b a s s i s l 2 7 1 等利用胶体探针a f m 得到了疏水作用的精细特征。他 们从5 个方面论述了这种作用由固液界面存在纳米气泡引起的观点：( 1 ) 实验上测定 的疏水作用是一种引力，理论上当气泡在水平方向伸展，能量较低的固气界面代替 能量较高的固液界面的过程也是造成两个固体表面问相互吸引；( 2 ) 疏水引力是 在两个表面的趋近过程中突然形成的，与两作用表面间的距离没有指数关系，这 表明疏水引力不是表面引起的静电作用的结果；( 3 ) 疏水作用的力程在一定范围 内变动可解释为纳米气泡大小不一致导致的结果；( 4 ) 疏水引力开始作用之前， 两个表面间存在着微弱的斥力，这表明在真正的固体表面存有突出物；同时也否 定了表面趋近过程中空化现象造成的疏水作用，因为空比导致的作用应该只有引 力而不会有斥力；( 5 ) 在小球与基底表面真正接触之前还有一个作用区域，它呈 现出软物质问的作用特征，应该是气泡被压缩发生侧向扩展的结果。c a r a m b a s s i s 等人的这些研究结果为纳米气泡存在并导致疏水作用提供了重要的证据。 进入2 1 世纪后，随着a h v l 的液相技术的出现，能够用它在液相中进行实验， 同时又具有纳米级的分辨率，还带有利于像气泡这样柔软的样品测试的t a p p i n g 模式。所以，更多的研究者在各种界面上能用a f m 做出纳米气泡的形态，为它 7 上海师范大学理学硕士论文 第一章 的存在提供更加直接的证据。相继出现了一系列的纳米气泡的图像1 2 1 岱】( 见图一) ， 引起学术界的轰动，c h e m i c a i e n g i n e e r i n gn e w s 和p h y s i c sn e w su p d a t e 等都 对此进行了评论，认为“纳米气泡的a f m 直接成像对长久以来的一个科学之谜 进行了探索和解释”1 2 s ，2 9 l 。 之后，s t e i t z 等人在用n r ( n e u t r o nr e f l e c t o m e t r y ) 研究水与疏水基底之间界 面的内部结构时得出的结果也证实了固液界面有气体富集。他们经过一系列的实 验发现中子反射的s l d ( s c a t t e r i n gl e n g t hd e n s i t y ) 减少，他们的最初解释是有机 污染但是他们也用大气泡实验发现，s l d 也是会减少的，所以再经过仔细思考 得出了出现明显的反差是由于在界面处富集了一层气体。通过n r 仪器的计算这 层气体的厚度是2 5 n m 。同时他们还证实气体的厚度与液体中的气体含量紧密相 关的【2 4 l 。s c h w e n d e l 等测定了几种不同s a m s ( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ) 修饰表 面的重水密度，发现在表面2 n m 高的区域水的密度大约只有体相的9 ，在表面 5 n m 的区域水的密度也大约只有体相的8 8 。他们认为是疏水界面夹杂空气或是 纳米气泡造成水密度降低【矧。l s h i d a 等在测量力曲线时发现水的界面处的长程力 比空气中的固体表面的大，他们的解释是当固体表面浸入到水中就在表面形成了 气泡，而且气泡不会在短时间内消失，气泡就会先于表面与探针接触，由此产生 很强的长程力是由于气液界面相的较小韵张力和压力。这不仅为纳米气泡的存在 提供了证据，同时也更进一步验证了疏水长程作用是由固液界面存在纳米气泡引 起f 2 4 1 。 8 上海师范大学理学硕士论文 第一章 图1固液界面纳米气泡的a f m 图像。采甩t a p p i n g 模式在( a ) 云母；( b ) 石 墨；( c ) 金；( d ) 氘标记聚苯乙烯修饰的硅表面；( e ) 疏水修饰硅片。 2 、磁性纳米粒子 磁性纳米粒子的种类很多，较常用的有金属合金、氧化铁、铁氧体、氧化铬 等，其中氧化铁( r - f e 2 0 3 f e 3 0 4 ) 磁性材料应用最多【3 1 】。而r - f e 2 0 3 磁性纳米粒 子因其易于制备、粒径比较均一、团聚程度与f e 3 0 4 相比小而倍受广大研究人员 的关注【3 2 1 。生化及医学等领域对磁性纳米粒子的物理、化学及药理学如化学组 成、粒度大小、晶体结构、磁功能、表面形貌、吸附性、溶解性及低毒性都有严 格要求，研究高分散、粒度分布均匀，并能方便地进行表面化学修饰的的磁性纳 米粒子的主要合成方法如下： 2 1 共沉淀法 在含有多种离子的溶液中加入沉淀剂，让所有离子完全沉淀1 3 3 】以f c 3 0 4 磁 性纳米粒子为例，主要有两种方法i 弘蚓。一是在碱和氧化剂存在下，使f c 2 + 氧化 得到f e 3 0 4 ：二是在碱性条件下共沉淀f e 2 + 和f e 3 + 离子混合物，f e “和f + 的摩 尔比为1 ：2 。磁性纳米粒子的大小、形状和成分可通过铁盐的类别( 盐酸盐、硫 酸盐、硝酸盐或磷酸盐) 来控制；另外，通过调节p h 值和介质离子强度能够防 止粒子聚沉，并将粒子尺寸控制在一个数量级上( 2 1 5 ) p 7 l 。其中，第二种方 法是目前最常用的制备方法，被广泛应用在生物化学及生物医学等领域。共沉淀 上海师范大学理学硕士论文 第一章 法与其他方法相比，该法简洁，而且通过向沉淀混合液中加入有机分散剂或络合 剂，可以提高粒子的分散性，使粒子具有相当好的稳定性，克服了易于团聚的缺 点【3 s 4 0 。这种方法也是制备r - f e 2 0 3 的较好方法1 4 1 1 。 2 2 微乳液法 微乳液是两种不相混溶的液体通过表面活性剂分子作为界面膜，形成热力学 稳定、各向同性的分散体系【4 2 l 。微乳液分为水分散在油中( w 柚和油分散在水中 ( o w ) i 两种体系，其中w o 体系被广泛用于纳米粒子的制备。分散性好、大小均 一的磁性纳米粒子可通过形成胶束的铁前体1 4 3 】和w o 乳液反应1 4 4 4 7 l 得到。例如 表面活性剂丁二酸一2 一乙基已基磺酸纳( a t o ) 溶于正已烷中形成( w o ) 反相微乳 液体系【3 4 ，鸺】( 图1 ) 。f e “和f c 2 + 盐溶于反相液滴的亲水核中，在n 2 存在下，加 入n a o h 得到直径较小( 1 5 n m ) 、高分散的氧化铁磁性纳米粒子。微乳液合成也 能得到两亲共聚物保护的磁性纳米粒子【4 9 l 。微乳液合成的优点是纳米粒子的大 小可通过乳液液滴的大小来控制。但是，在医学领域的应用受到限制，通常需要 在氧化铁磁性纳米粒子的表面修饰上亲水分子，使氧化铁磁性纳米粒子溶于水， 能应用与生物、医学领域。 案 图2a t o 正己烷反相微乳液体系结构 2 3 热分解法 通过非水解过程制备磁性纳米粒子的方法中，分解合适的铁化合物前体 4 9 1 。 例如将铁和n 一亚硝基一p 一苯核铵配合物( i r o nc u p f e r r o n ，f e ( c u p ) 3 ) 的辛胺溶液 注射到热的三辛胺中，得到包覆的r - f e 2 0 3 磁性纳米粒子由f e ( c 0 ) 5 分解得到， 通过改变f e ( c o ) 5 和油酸的比例，控制氧化铁磁性纳米粒子大小在4 1 6 栅【哪2 l 。 在聚亚乙烯基二氟存在时，f e ( c o ) 5 在溶剂d m f 中进行反应，得到球形或锥形结 构f e 2 0 3 磁性纳米粒子f 5 3 1 。f e 3 0 4 磁性纳米粒子可以通过铁一三乙酰丙酮酸酯配合 物( f e m ct r i a c e t y l a c e n a t e ，f e ( a c a c ) 3 ) 热分解得到f 5 4 弼。高温热分解制氧化铁磁性 1 0 上海师范大学理学硕士论文 第一章 纳米粒子分散性好，通常只溶于有机溶剂。氧化铁纳米粒子也可以通过电化学途 径制锝，产物纳米粒子的尺度可控制在3 8n m 【5 6 】。 2 4 生物合成法 磁性纳米粒子也可以通过生物途径得到。以氧化铁的生物合成法为例，铁蛋 白是一种储存铁的蛋白质，它在制备氧化铁及其他纳米粒子时提供模板。天然铁 蛋白形成一个外径为1 2 n m ，而内径8 n m 为的壳，内部环绕一个6 n m 的r - f e o o h 纳米粒子核。移出天然r o f e o o h 纳米粒子核形成空壳，称之为脱铁铁蛋白。在 a r 或n 2 、6 0 一6 5 、p h = 8 5 下，将f e 2 + 水溶液逐滴加到脱铁铁蛋白溶液中，然 后部分氧化，可得到包含在铁蛋白壳内的直径为的纳米粒子或f e 3 0 4 r - f e 2 0 3 ( 图 3 ) 【5 剐。许多具有象铁蛋白的蛋白如d n a 结合蛋i 自( d n a - b i n d i n gp r o t e i n sf r o m s t a r v e dc e l l s ，d p s ) 5 9 , 鲫、缸豆变色斑病毒( c o w p e a c h l o r o t i cm o t t l ev i r u s ，c c m v ) 【6 1 1 、 小热激蛋白( as m a l lh e a t s h o c kp r o t e i n ，s h s p ) 1 62 1 、烟草花叶病毒( t o b a c c om o s a i c v i r u s ，t m v ) 6 3 柳噜作为模板被用于制备磁性纳米粒子( 表1 ) 。缘铁蛋白一样，李 斯特细菌也能提供5 n m 的内穴合成氢氧化亚铁磁性纳米粒子【6 8 , 6 9 1 ，f c 3 0 4 磁性纳 米粒子也可以通过趋磁细胞合成【7 2 1 ，其中氧化铁磁性纳米粒子被包埋在磷脂双 层胶囊中，称为“磁原体”1 7 3 1 ，将细胞壁破坏后，可用于磁性分离。 i i s c i i ：c 0 0 1 1 n & 1 j 仍 f e 2 0 ，wv c ( 0 ，o h 强 论夕 a p o f c a r i t i n f c - s - 1 ! o ! 叫卜8 s 6 盯c n ， f l o a r f c 2 0 i 围3 以铁蛋自为模板合成磁性氧化铁纳米粒子 表l 用于磁性纳米粒子合成不同蛋白质空穴内外直径 怕r s p k e nf e r r i t i ns 印sf r o m li t r o e a a6 “p d k 4 x , f i er r c , t t kx i r a s 2 4 脚f mm ，j a m y a h h i t 8 b h ) n - o m i tv i r u s- i 1 2 9 2 s 1 2 i s 二1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 73 3 、核壳结构二氧化硅磁性纳米粒子 由于磁性纳米粒子( f e 2 0 3 、f e 3 0 4 、f e 、c o 、各种氧化体化合物) 具有高 1 1 上海师范大学理学硕士论文 第一章 比表面积，高比表面能，以及粒子各异性的偶极距作用从而很容易团聚，有些磁 性粒子如f e 3 0 4 、f e 很容易被氧化成r - f e 2 0 3 ，从而导致粒子发生聚集和沉淀， 不能形成稳定的分散体系，使其在生物医学中的应用受到限制。通过对磁性纳米 粒子的表面修饰可以降低其表面能，提高粒子的抗氧化能力，得到分散性好的纳 米复合粒子；同时适当的表面修饰可以调节磁性纳米粒子与其他材料的相容性和 反应特性。由于s i 0 2 具有以下优异的性能：可以屏蔽磁性粒子之间的偶极相互 作用，阻止粒子团聚【7 4 l ；具有良好的生物相容性、亲水性以及非常好的稳定性【7 5 1 ； 并且微球的制备技术已经相当成熟，为制备高质量的s i 0 2 修饰的磁性纳米离子 提供了技术支持。 目前，核壳结构二氧化硅磁性纳米粒子的制备主要有溶胶一凝胶法 ( s 0 1 g e l ) 、反相微乳液法( r e v e r s em i c r o e m u s i o n ) 、气溶胶高温分解法( a e r o s o l p y r o l y s i s ) ，其中溶胶一凝胶法又可以分为硅酸钠水解法、正硅酸乙酯水解法、 s t o b e r 法。 3 1 溶胶一凝胶法 3 1 1 硅酸钠水解法 该方法以硅酸钠为原料，制备饱和硅酸，硅酸在酸性或者碱性条件下进一步 缩合形成s i 0 2 包裹在磁性粒子的表面。m d 。b u t t e r w o r t h 等【7 6 1 将硅酸溶液通过离 子交换树脂得到饱和的硅酸，然后将该硅酸将入到f c 2 0 3 粒子的分散体系中缓慢 滴加盐酸调节反应体系的p h 值到1 0 左右，实现在f e 2 0 3 粒子表面包覆一层或多 层s i 0 2 ，再在复合粒子的表面原位包裹聚毗咯，结果表明复合粒子中磁性粒子 的含量高达1 7 5 ，且材料是超顺磁性的，饱和磁化强度达到了1 0 9 e m u g ，但 是复合粒子的分散性不好。 3 1 2 正硅酸乙酯( t e o s ) 水解法 该方法是利用正硅酸乙酯在酸性条件下发生水解生成s i o h ，然后缩合形成 s i 0 2 溶胶包覆在磁性颗粒表面。i a nj b r u c e 等【7 7 1 分别采用硅酸钠水解法和正硅酸 乙酯水解法在f e 2 0 3 颗粒表面多次包覆s i 0 2 ，并作了对比，结构表明随着包覆次 数的增加复合粒子中的s i 0 2 含量不断增加，相同包覆次数时，前一种方法包覆 到磁性颗靛上的量较后一种方法的少，即每一次包裹t e o s 水解法的包覆效率比 较高；耐酸性测试测试结果表明用硅酸钠水解法制备的包覆粒子包覆一次和多次 上海师范大学理学硕士论文第一章 的耐酸性基本相同。而t e o s 水解法制备的包覆粒子随着包覆次数的增加，耐酸 性不断增强。推测认为t e o s 法中每一次包裹形成的s i 0 2 层是多孔且包覆不完 全，而硅酸钠法中s i 0 2 层则要致密得多，且一次就能够包覆完全，n 2 气吸附脱 附数据表明t e o s 法制备的复合粒子具有更大的比表面积，从而验证了上述推 测。 3 1 3s t o b e r 法 该方法是s t o b e r i 7 8 】利用在1 9 6 8 年提出的在醇溶液中制备单分散的s i 0 2 微球 的方法实对纳米颗粒包裹的溶胶一凝胶法。s t o b e r 首先利用碱( 氨水、氢氧钠) 加快硅酸酯类( t e o s 、t m s ) 在醇中水解以及缩合反应制备出单分散的s i 0 2 微球。随后利用该方法对材料进行s i 0 2 表面改性的研究层出不穷。目前该方法 实现对金属【”、金属氧化物【8 0 j 、金属硫化物 8 1 】等表面包覆改性，对各种材料形 态如单分散颗粒【7 9 】、纳米线【8 2 】，团聚体【8 3 】都能进行包覆。应用该方法的关键是 被包裹的颗粒能够在醇介质中形成稳定的分散体系，以及控制硅酸酯、水、碱之 间的合适比例。 3 2 反相微乳液法( i c v c r s cm i c r o e m u s i o n ) 反相微乳液法一般是由表面活性剂、助表面活性剂( 一般为醇) 、油( 通常 为碳氢化合物) 、水( 电介质溶液) 等组成的热力学稳定体系。其中油为连续相， 水相被表面活性剂和助表面活性剂的单分子曾包围形成彼此分离的微乳颗粒，成 为一个个“微反器”中进行可以形成球形颗粒，有效得控制产物的尺寸及防止颗 粒进步团聚。目前反相微乳液法也广泛应用于制备核壳结构复合纳米粒子，具 体制备又分为两种：复合粒子中的磁性粒子可以在微乳液中原位生成，或者通过 两步法即在包裹之前先制备出磁性粒子，然后在微乳液中实现s i 0 2 对其包裹。 前者复合粒子中的磁性粒子的磁性往往较差，而且难以控制，后者则克服了前者 的缺点并且制备方法还能应用到其它粒子的s i 0 2 包裹上。 3 3 气溶胶高温分解法( a e r o s o lp y r o l y s i s ) 气溶胶高温分解法是在气溶胶反应器中先通过加热蒸发合成气溶胶，然后进 行热处理制备球形胶体粒子的方法。该方法具有简单、实用、快速等优点，特别 适合制备中空的复合粒子。t a r t a j 等1 8 4 j 以甲醇、t e o s 为原料，采用气溶胶高温 分解法制得s i 0 2 包裹的r - f e 2 0 ，磁性复合粒子。若且可以通过改变铁盐的浓度， 1 3 上海师范大学理学硕士论文 第一章 得到具有中空结构或实心结构的磁性复合粒子。 4 、免疫磁性纳米粒子 免疫磁性纳米粒子由载体粒子和免疫配基结合而成。载体粒子的核心为金属 小颗粒( r - f e 2 0 3 、f e 3 0 d ，核心外包裹一层无机材料( s i 0 2 ) 或高分子材料( 如 聚苯乙烯、聚氯乙烯) ，最外层是功能基层，如氨基( n h 2 ) 、羧基( 一c o o h ) 、 羟基( 一o h ) 。由于载体粒子表现物理性质不同，可结合不同的免疫配基( 如抗 体、抗原、d n a 、r n a ) 。免疫磁性纳米粒子的大小和形状的均一性，可使靶细 胞迅速和有效地结合到磁性纳米粒子上；它的超顺磁性可使粒子置于磁场时，显 示磁性，从磁场移出时，磁性消除，粒子分散；保护性壳可防止金属微粒漏出【8 5 1 本论文使用的载体粒子的核心为r - f e 2 0 3 ，核心外包裹一层s i 0 2 ，最外层的功能 基层是n h 2 ，最后连接是的免疫配基是抗体c d l 3 3 。 4 1 免疫磁性纳米粒子的应用 4 1 1 细胞分离 细胞分离是免疫磁性纳米粒子目前最主要的一个方面，传统细胞分离技术有 密度离心、羊红细胞重新形成、流式细胞等，这些方法有的比较费时，有的十分 昂贵，由免疫磁性纳米粒子分离细胞时只需要抗体和一个磁铁，既简便灵敏又经 济快捷。分离细胞有两种方式：用免疫磁性纳米粒子直接从细胞混合液中分离靶 细胞的方法为阳性分离，用免疫磁性纳米粒子去除无关细胞使靶细胞得以纯化的 方法为阴性分离。马东初【8 6 悃g p i i b l i i a 血小板单克窿抗体结合磁性纳米粒子 分离人骨中的巨核细胞，其纯度达到8 7 5 9 7 1 ，且5 0 的巨核细胞具有生物 活性，且磁性纳米粒子分离的巨核细胞超微结构保持完整，可用于巨核细胞的细 胞生物学和分子生物学等方面的研究。宋振岚等【舯】采用免疫磁性纳米粒子与激 活的巨噬细胞对1 8 例白血病人的骨髓和外周血进行进化研究发现，体外免疫磁 性纳米粒子可净化2 个3 个对数级的白血病细胞。这是一种快速、简便、稳定 的净化方法，有望用于自血病的治疗。陈伟1 8 8 l 等也用免疫磁性纳米粒子从脐血 中分离出c d 3 4 造血干细胞。 4 1 2 蛋白质和d n a 的分离 蛋白质和d n a 的