（内科学专业论文）pten基因对t淋巴细胞分化的影响.pdf

目录 i i ii ii iii l lrl r l l l li i 19 010 6 3 中文摘要 0 00000000 oooooo ooo 1 英文摘要 o ao oooooooo 3 研究论文p t e n 基因对t 淋巴细胞分化的影响 前言 一 一 6日u 舌 一 一 b 材料与方法 7 结果 o ooo oq ooq oooo oo ooo o oo po o ooo 1 3 附图 o oooio000000 1 6 附表 一 o ooboo 2 3 讨 仑 2 4 结论 2 6 参考文献 o ooooo 2 6 综述c d 4 t 细胞的分化调节 2 8 致谢 o oooooo d o ooooo oooo 3 9 个人简历 o qo oooooo 4 0 中文摘要 p t e n 基因对t 淋巴细胞分化的影响 摘要 目的 根据分泌细胞因子和参与的免疫反应的不同t h 细胞被分为 功能不同的t h l 和t h 2 两个效应细胞亚群 t h l 细胞分泌i l 2 i f n 吖 t n f 1 3 等细胞因子 t h 2 细胞则产生i l 4 i l 5 i l 6 i l 1 0 i l 1 3 等细胞因子 t h l t h 2 细胞参与不同的免疫应答 t h l 细胞通过分泌的 细胞因子 具有抗病毒及其他细胞内病原体 清除癌变细胞 介导迟发 性超敏反应和器官特异性自身免疫性疾病的作用 t h 2 细胞则通过产生 的细胞因子介导体液免疫应答 与过敏性疾病 抗细胞外感染 移植物耐 受 抑制自身免疫疾病等有关 在造血干细胞移植免疫中 t h l 细胞被认 为和g v 皿反应相关 而t h 2 细胞具有诱导免疫耐受 减少排异反应的作 用 对t 淋巴细胞的分化调控机制进行深入研究有助于阐明g v h d 免疫反 应发生机制具有重要意义 舅 已知t b e t 是t 淋巴细胞向t h l 分化的重要转录因子 调控i f n 丫的分 泌 g a t a 3 基因是t 淋巴细胞向t h 2 分化的重要转录因子 调控i l 4 的分 泌 影响t h 细胞分化的p 1 3k a k t p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 k i n a s p r o t e i n k i n a s eb 途径 m a p k 有丝分裂原激活蛋白激酶 途径亦是与张力蛋白同 源的1 0 号染色体缺失的磷酸酶基i n p h o s p h a t a s ea n dt e n s i n h o m o l o gd e l e t e d o nc h r o m o s o m et e n p r e n 作用的重要通路 为了研究p t e n 基因介导的 p 1 3 k a k t 途径对t 淋巴细胞分化的作用 本研究以人t 淋巴细胞白血病细 胞株j u r k a t 细胞为研究对象 j u r k a t 细胞具有分泌i f n 吖和i l 4 的功能 因此 可以作为研究t 淋巴细胞的分化的靶细胞 通过转染p t e n 基因 了解转 染后过表达的p t e n 基因对j u r k a t 细胞t b e t g a t a 3 表达的影响 以及 j u r k a t 细胞分泌i l 一4 和i f n 丫的变化 为进一步揭示t 淋巴细胞分化的信号 转导机制打下基础 方法 用携带有野生型p t e n 基因及编码绿色荧光蛋白基因的腺病毒 a d p t e n g f p 或空载体腺病毒 a d g f p 转染i u r k a t 细胞系 r t p c r 检测转染p t e n 基因后对t b e t g a t a 3 的表达的影响 以及细胞分泌i l 4 中文摘要 和i f n 吖的变化 结果 1 用a d p t e n g f p 或a d g f p 转染i u r k a t 细胞系 a d p t e n g f p 的j u r k a t 胞内p t e n 0 7 0 2 0 1 水平明显高于未作任何处理的j u r k a t 细胞组 0 3 0 7 4 0 0 3 和a d g f p 转染组 o 3 0 6 0 0 2 p o 0 5 2 转染4 8 h 后 转染a d p t e n g f p 的i u r k a t 细胞内t b e t 0 6 0 3 士0 1 水 平明显高于未作任何处理的j u r k a t 细胞组 o 3 2 3 4 0 0 2 和a d g f p 转染组 o 3 1 9 0 0 4 p o 0 5 3 转染4 8 h 后 转染a d p t e n g f p 的j u r k a t 细胞内i f n 3 1 0 6 1 3 4 0 0 1 明 显高于未作任何处理的j u r k a t 细胞组 o 3 4 5 0 0 2 和a d g f p 转染组 o 3 4 3 4 0 0 4 p o 0 5 4 转染4 8 h 后 转染a d p t e n g f p 的i u r k a t 细胞内g a t a 3 水平 o 1 3 2 0 0 2 明显低于未作任何处理的j u r k a t 细胞组 0 3 9 6 士0 0 5 和 a d g f p 转染组 o 3 8 9 4 0 0 6 p o 0 5 5 转染4 8 h 后 转染a d p t e n g f p 的j u r k a t 细胞内i l 4 水平 o 2 8 9 0 01 明显低于未作任何处理的j u r k a t 细胞组 o 8 51 4 0 0 2 幂na d g f p 转染组 o 8 4 8 0 0 1 p o 0 5 结论 本研究成功的应用携带有野生型p t e n 基因及编码绿色荧光蛋 白基因的腺病毒 a d p t e n g f p 转莉u r k a t 细胞系 使p n n 基因的表 达明显增强 p t z n n 高表达使t 淋巴细胞的t b e t 和i f n 丫的表达明显增 高 而g a t a 3 和i l 4 基因的表达水平降低 这些结果提示p t e n 基因可以 促使t 淋巴细胞向t h l 细胞方向分化 关键词 p t e n j u r k a t 转染 反转录p c r 分化 英文摘要 r e g u l a t i o no f tl y m p h o c y t ec e l lp o l a r i z a t i o nb yp t e n g e n e a b s t r a c t o b j e c t i v e h e l p e rt c e l l sa r ef o u n di nt w od i s t i n c tc e l lt y p e s t hla n d t h 2d i s t i n g u i s h e db yt h ec y t o k i n e st h e yp r o d u c ea n dr e s p o n dt oa n dt h e i m m u n er e s p o n s e st h e ya r ei n v o l v e di n t hlc e l l sp r o d u c ep r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e sl i k ei f n 吖 n 师 1 3a n di l 2 w h i l et h 2 c e l l sp r o d u c et h ec y t o k i n e s l i k ei l 一4 i l 一5 i l 一10 i l 6a n di l 一13 t hl a n dt h 2 一h e l p e rc e l l sd i r e c t d i f f e r e n ti m m u n er e s p o n s ep a t h w a y s t hlc e l l sd r i v et h et y p e 一1 p a t h w a y c e l l u l a ri m m u n i t y t of i g h t v i r u s e sa n do t h e ri n t r a c e l l u l a r p a t h o g e n s e l i m i n a t ec a n c e r o u sc e l l s s t i m u l a t ed e l a y e d t y p eh y p e r s e n s i t i v i t y d x h r e a c t i o n sa n do c c u ro r g a ns p e c i f i ca u t o i m m u n ed i s e a s e s t h 2c e l l sd r i v et h e t y p e 一2p a t h w a y h u m o r a li m m u n i t y t op r o d u c eh u m o r a li m m u n e r e s p o n s e i r r i t a b i l i t yr e s p o n s e a n de x t r a c e l l u l a ri n f e c t i o u s d i s e a s e s a u t o i m m u n ed i s e a s e sa n db ec r e d i t e dw i t ht o l e r a n c eo fx e n o g r a f t s i ni m m u n i t yo fh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n r e c e n tr e s u l t s h a v es u g g e s t e dt h a ta c u t eg v h di sm e d i a t e db yt h 1 l y m p h o c y t e sa n dt h a t t h 2l y m p h o c y t e sm a ye x e r tap r o t e c t i v ee f f e c tb u tm a yh a v ear o l e i n m e d i a t i n gc h r o n i cg h v d t h es t u d yo ft h er e g u l a t i o nm e c h a n i s mt o t l y m p h o c y t ed i f f e r e n t i a t i o nc a nh e l pu se l u c i d a t i n gt h ep a t h o g e n e s i so fg v h d i m m u n er e s p o n s e t b e ti si m p o r t a n tt r a n s c r i p t i o nf a c t o rt ot l y m p h o c y t e sd i f f e r e n t i a t i o n l a k etl y m p h o c y t e st h ld i f f e r e n t i a t i o n w h i l egat 3itc a nm a k el y m p h o c y t e se m e r g e a l t t e r e n t l a t l o nw i l l i ea 3i sa l s ol u a l l s i m p o r t a n tt r a n s c r i p t i o nf a c t o rt otl y m p h o c y t e sd i f f e r e n t i a t i o n i tc a nm a k et l y m p h o c y t e se m e r g et h 2d i f f e r e n t i a t i o n t h e c e l l sp a t h w a y sm a p ka n d a k t p 1 3 kw h i c hi n f l u e n c etc e l ld i f f e r e n t i a t i o ni sa l s ot h ei m p o r t a n tc e l l s p a t h w a y so fp t e n p h o s p h a t a s ea n dt e n s i n h o m o l o gd e l e t e do nc h r o m o s o m e t e n j u r k a tc e l l si sh u m a ntl y m p h o m ac e l ll i n e i tc o u l ds e c r e t ei f n 丫a n d i l 4 t h e r e f o r e i tc o u l db e c o m et h e r e s e a r c h i n go b j e c t f o rtc e l l 3 英文摘要 d i f f e r e n t i a t i o n t h r o u g ht r a n s f e c t i n gr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sv e c t o r p t e n a d p t e n g e n ec o n t a i n i n gg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n a d p t e n g f p o rt h e e m p t ya d e n o v i r u sv e c t o rc o n t a i n i n gg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n a d g f p i n t o ju r a k tc e l l s t od e t e c tt h ei n f l u e n c eo nju r k a tc e l lb yp t e ng e n e m e t h o d t h er e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sc o n t a i n i n gg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g f p g e n e a n dp t e ng e n e a d p t e n g f p o re m p t yv e c t o r a d g f p w a s t r a n s f e c t e di n t oj u r k a tc e l l s t h e nt h ep t e nt b e tg a t a 3i l 4a n di f n g a m m am r n ae x p r e s s i o nl e v e l sw e r em e a s u r e db yr t p c r r e s u l t s 1w h e n j u r k a tc e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t ha d p t e n g f po ra d g f pf o r4 8 h o u r sa tm o i 2 0 0 t h ep t e nm r n ae x p r e s s i o nl e v e li na d p t e n g f p g r o u p o 7 0 2 士0 1 w a sh i g h e r t h a nt h a ti nt h en o n t r e a t m e n t g r o u p o 3 0 7 士0 0 3 a n di nt h ea d g f pt r a n s f e c t e dg r o u p o 3 0 6 士0 0 0 2 尸 o 0 5 2w h e n j u r k a tc e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t ha d p t e n g f po ra d g f pf o r4 8 h o u r sa tm o i 2 0 0 t h et b e tm r n a e x p r e s s i o nl e v e li na d p t e n g f pg r o u p o 6 0 3 士0 1 w a sh i g h e rt h a nt h a ti nt h en o n t r e a t m e n tg r o u p o 3 2 3 土0 0 2 a n d i nt h ea d g f pt r a n s f e c t e dg r o u p o 31 9 士0 0 4 o 0 5 w h i l et h e r ew a s n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ni nt h en o n t r e a t m e n tg r o u pa n di nt h e a d g f pt r a n s f e c t e dg r o u p 胗0 0 5 3w h e n ju r k a tc e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t ha d p t e n g f po ra d g f pf o r4 8 h o u r sa tm o i 2 0 0 t h e1 t n g a m am r n a e x p r e s s i o nl e v e li na d p t e n g f p g r o u p o 6 13 士0 01 w a sh i g h e rt h a nt h a ti nt h en o n t r e a t m e n t g r o u p 0 3 4 5 土0 0 2 a n di nt h ea d g f pt r a n s f e c t e dg r o u p 0 3 4 3 士0 0 4 p 0 0 5 w h i l et h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ni nt h en o n t r e a t m e n tg r o u p a n di nt h ea d g f pt r a n s f e c t e dg r 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m b i n a n ta d e n o v i r u sc o n t a i n i n gg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n g f p g e n ea n dp t e ng e n e a d p t e n g f p o re m p t yv e c t o r a d g f p w a ss u c c e s s f u lt r a n s f e c t e di n t oi u r k a tc e l l s a n dt h ee x p r e s s i o no f t h ep t e n g e n ei na d p t e n g f pg r o u pw a sm u c hh i g h e rt h a ni nt h ec o n t r o l g r o u p t h eh i g he x p r e s s i o no fp t e ng e n ei nj u r k a tc e l l sm a k et h ee x p r e s s i o n o ft b e ta n di f n g a m as i g n i f i c a n t l ye l e v a t e w h i l et h ee x p r e s s i o no fg a t a 3 a n di l 4d e s c e n d t h e s er e s u l t sr e v e a lt h a tp t e ng e n ec a nm a k etc e l l s di f f e r e n t i a t et o t h1d i r e c t i o n k e yw o r d s p t e n t r a n s f e c t j u r k a t r t p c r r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d i f f e r e n t i a t i o n 5 研究论文 p t e n 基因对t 细胞分化的影响 刖声 白血病是造血系统的恶性肿瘤 是严重危及人类生命的疾病 白血病 传统的治疗方法是联合化疗 但通过化疗只能暂时缓解病情 不能治愈 绝大多数会复发 造血干细胞移植 h s c t 的研究为治疗良性及恶性血 液系统及非血液系统疾病提供了广阔的前景 但是 由于供者体内t 细胞 介导的移植物抗宿主病 g v 皿 的发生 使其应用在很大程度上受到很 大限制 目前仍缺乏特异有效的治疗和预防g v h d 的方法 去除t 细 胞的骨髓移植方案及非特异性的免疫抑制剂的应用虽然有一定的作用 但 是 前者易导致白血病的复发 后者需要反复用药 易导致感染和免疫抑 制 在造血干细胞移植免疫中 t h l 细胞被认为和g v h d 反应相关 而 t h 2 细胞具有诱导免疫耐受 减少排异反应的作用心3 对t 淋巴细胞的分 化调控机制进行深入研究有助于阐明g v h d 免疫反应发生机制 具有重 要意义 对c d 4 t h 细胞如何分化为t h l 或t h 2 细胞的机制 有许多学者进 行了深入的研究 己取得一些成果 总的认为双信号刺激 抗原抗体结合 及抗原呈递细胞与t 细胞表面共刺激分子相互作用 介导活化的c d 4 t 细胞 活化信号向t 细胞内部传导 可以启动多条信号转导通路 从而激 活转录因子 转录因子结合到目的基因的启动子区域 可使细胞增殖基因 细胞因子基因及细胞因子受体基因等得到表达 产生的细胞因子通过自分 泌和旁分泌产生生物学效应 促使t h 细胞增殖克隆 随之分化为具有不同 功能的的t h l 和t h 2 效应t 细胞 部分细胞可以分化为记忆性t 淋巴细胞 有关t 淋巴细胞分化的细胞信号转导途径的研究有很多 主要的信号转 导途径包括 j a k s t a t 途径 p 1 3 k a k t 途径 i r s 1 2 途径以及 r a s m a p k 途径等 已知t b e t 是t 淋巴细胞向t h l 重要转录因子 调控 i f n 吖的分泌 g a t a 3 基因是t 淋巴细胞向t h 2 分化的重要转录因子 调控i l 4 的分泌 细胞因子在t 细胞的活化 增殖过程中起着十分重要 的作用 而且在初始t 细胞的分化过程中也被认为是最重要的因素b 1 研究论文 影响1 1 1 细胞分化的p 1 3 k j a k t 途径 r a s m a p k 途径等亦是与张力 蛋白同源的1o 号染色体缺失的磷酸酶基i 园 p h o s p h a t a s ea n dt e n s i n h o m o l o g d e l e t e do nc h r o m o s o m et e n p t e n 作用的重要通路 有报道敲掉p t e n 基 因的t 淋巴细胞i l 4 分泌增多 向t h 2 方向分化 以往对t b e t g a t a 3 的调控研究认为和m a p k 激酶有关 对p t e n 基因及a k t p 1 3 k 途径研 究较少 j u r k a t 细胞株为人t 淋巴细胞白血病细胞株 具有分泌i l 4 和i f n 吖 的功能 可作为t 细胞分化的研究对象 通过转染p t e n 基因 了解转 染后过表达的p t e n 基因对i u r k a t 细胞t b e t g a t a 3 的表达的影响 以 及细胞分泌i l 4 和i f n 吖的变化 l 材料 1 1 仪器 材料与方法 仪器名称与型号产地 恒温水浴箱 舣s h 哈尔滨东联公司 紫外透射仪 u v 2 0 0 0 上海天能公司 读胶仪 a l p h a l m a g e r l 2 0 0 美国s t 公司 紫外分光光度计t u 18 0 0北京普析通用仪器公司 普通光学显微镜日本o l 洄u s 公司 电子天平a e l 0 0德国m e t t l e r 公司 8 0 低温冰箱日本s a n y o 公司 2 0 低温冰箱日本s a n y o 公司 4 低温冰箱青岛海尔公司 低温高速离心机德国h e r a e u s 公司 台式离心机 l a b o f u g e 4 0 0 德国h e r a e u s 公司 电泳仪 d y y i i l 4 型 北京六一厂 c 0 2 培养箱美国n a p c o 公司 倒置显微镜日本0 l 啪u s 公司 1 2 试剂 研究论文 胎牛血清杭州四季青公司 r p m i 16 4 0 细胞培养基美国g i b c o 公司 d m e m 培养基美国g i b c o 公司 胰蛋白酶 美 蚕s i g m a 公司 t r i z o l 北京赛百盛公司 r n a s i n 美 雪p r o m e g a 公司 d n t p 美国p r o m e g a 公司 d e p c北京赛百盛公司 m m l v 逆转录酶 美m p r o m e g a 公司 r a n d o mp r i m e r 美m p r o m e g a 公司 琼脂糖北京赛百盛公司 t r i s北京赛百盛公司 e d t a北京华瑞公司 g o l dv i e w北京赛百盛公司 硼酸北京赛百盛公司 s y b rg r e e nr e a lm a s t e rm i x北京天根 p c r 引物北京赛百盛公司 5 x b u f f e r 北京赛百盛公司 植物血凝素 p h a 北京赛百盛公司 1 3 主要试剂及溶液的制备方法 1 p b s 缓冲液 磷酸盐缓冲液 o 0 1 m o l ln a c l8 9 k c lo 2 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 3 6 3 9 k h 2 p 0 40 2 4 9 溶于重蒸水 d d h 2 0 中 用l m o l lh c l 调p h 至7 4 加d d h 2 0 定容至 1 l 高压灭菌2 0 m i n 4 c 保存 2 胰蛋白酶液 用0 0 1 m m o l lp b s i 伍时配制 浓度为0 2 5 抽滤灭菌 3 d e p c 水 配1 0 0 0 m l 的d e p c 处理水 加l m l d e p c 磁力搅拌器搅拌过夜 第 二天高压蒸汽灭菌1 2 1 2 5 m i nd e p c 分解成二氧化碳和酒精 封闭冷 藏备用 4 5 x 电泳缓冲液 8 研究论文 5 4 9t r i s 碱 2 7 5g 硼酸 2 9 2 3g e d t a 溶于重蒸水 d d h 2 0 中 用l m o l lh c l 调p h 至8 o 加d d h 2 0 定容至1 l 5 电泳工作液 5 x 电泳缓冲液1 9 0 m l l o s d s1 0m l d w 定容至1 0 0 0m l 4 c 保 存 1 4 细胞系 人t 淋巴细胞白血病细胞系j u r k a t 细胞 及人胚肾母细胞瘤细胞系 2 9 3 a 细胞 1 5 重组腺病毒 a d p t e n g f p 和a d g f p 由河北医科大学第二医院消化内科张晓岚 教授惠赠 在人胚肾母细胞瘤细胞系2 9 3 a 细胞中进行扩增及滴度测定 2 研究方法 2 1 细胞复苏 从液氮罐中取出细胞冻存管 迅速放入3 7 度水浴箱中 并左右晃动 使细胞尽快解冻 解冻后用7 5 酒精擦拭消毒冻存管后 在无菌净化台上 打开冻存管 吸出细胞悬液 移入离心管中 再补加1 0 m lr p m i1 6 4 0 或高 糖d m e m 培养液 吹打使细胞悬浮 低速离心 1 0 0 0 r p m 5 分钟 向细 胞沉淀中加入完全培养基 移入培养瓶中 置3 7 度温箱培养 次日更换一 次培养液后继续培养 2 2 细胞培养 j u r k a t 细胞采用含有1 0 胎牛血清 青霉素 1 0 0 u m 1 和链霉素 1 0 0 ug m 1 的r p m i1 6 4 0 培养基培养 并用植物血凝素 p h a 5l ag m l 刺 激活化 2 9 3 a 细胞采用含有1 0 胎牛血清 青霉素 1 0 0 u m 1 和链霉素 1 0 0l ag m 1 的高糖d m e m 培养基 两种细胞均置于3 7 度 5 c 0 2 饱 和湿度环境下培养 待长满8 0 9 0 后传代 其中2 9 3 a 为贴壁细胞用0 2 5 胰蛋白酶消化传代 2 3 腺病毒扩增 2 9 3 a 细胞融合度达9 0 左右时 加入病毒原液继续培养4 8 h 后 荧光 倒置显微镜下观察 当全部细胞均表达绿色荧光蛋白 且回缩变圆呈 葡 萄串样 时 将细胞悬液转移至离心管 1 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 上清转 移至消毒容器4 度保存 用于病毒扩增 细胞用l x p b s 稀释 吹打悬浮 研究论文 后转移至1 5 m le p p e n d o r 管 置于 8 0 度冰箱保存3 0 m i n 取出在3 7 度水浴 箱快速融化 复置于 8 0 度冰箱 经过反复3 4 次 最后在离心机2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 将上清转移至另一消毒的e p p e n d o r 管 8 u m 一次性滤器过滤后 8 0 度冰箱保存 此即为扩增的病毒原液 如还需要可 转染 收集 冻融 扩增病毒 不可用下一代病毒再次扩增 2 4 腺病毒滴度测定 1 在9 6 孔板上以1 0 4 个细胞 孔密度接种2 9 3 a 细胞 2 待细胞达到9 0 融合时 用无血清无抗生素d m e m 培养基将病 毒液进行1 0 3 1 0 1 0 梯度稀释 各取1 0 0 9 l 稀释液加入9 6 孔板2 9 3 a 细胞上 每种病毒每个滴度感染3 个复孔 3 3 7 5 c 0 2 孵育2 4 h 后 倒置荧光显微镜下计数绿色荧光蛋 白 g f p 阳性细胞数 按以下公式计算病毒滴度 病毒滴度 p f u m 1 g f p 阳性细胞数 病毒稀释倍数 0 1 m l 计算3 孔 平均值 2 5 细胞转染 取1 0 6 个对数生长期j u r k a t 活化细胞 1 0 0 0 r p m 离心去上清 用r p m i 1 6 4 0 无血清无双抗培养液洗涤细胞2 次 按2 0 0 m o i 值加入病毒原液 3 7 度孵箱孵育2 h 每隔15 m i n 轻轻晃动一次 将病毒液摇匀 之后等体积加 入含2 0 f b sr p m i1 6 4 0 培养基再孵育2 4 7 2 h 荧光显微镜下观察绿色荧 光蛋白表达情况 2 6r t p c r 检测p t e n t b e t g a t a 3 i f n 卟i l 4 的表达 2 6 1 t r i z o l 提取细胞总r n a 1 在含有约5 x 1 0 6 个单个核细胞的e p p e n d o r 借中加入1 0 m lt r i z o l 此时也可以冻存于 8 0 c 转移入1 5m le p 管中 室温放置1 0 分钟 2 j i d n 2 0 0 9 l 氯甲烷萃取 剧烈震荡1 5 秒 冰浴静置l o 分钟 3 4 1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟 4 将水相约2 s 0 p l 移至新的e p p e n d o r 蹭中 加入等体积异丙醇 轻 轻颠倒混匀 静置1 0 分钟 5 4 c1 2 0 0 0 r p m 离一1 二 1 0 分钟 可见少量白色沉淀 6 小心吸去上清 力d 7 5 乙醇1 0 m l 倒置混匀 4 c8 0 0 0 r p m 离心5 分钟 研究论文 7 小心吸去上清 冰上干燥 8 沉淀干燥后加1 0 2 0 9 ld e p c 水溶解 取l l 测浓度 9 d e p c 水中 取2 u l 经1 5 琼脂糖凝胶电泳 含e b 在 紫外透 射仪上显示有2 8 s 1 8 s 部分可见n s s 两条r n a 说明提取的r n a 完整 1 0 使用s m a 3 0 0 0 仪器测定r n a 浓度 首先用d e p c 水校正 取总 r n a1 9 l j j d 样 读取o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值 选择该比值范围在1 6 2 0 之间的 标本作为逆转录合成c d n a 之用 按下述公式计算r n a 浓度 r n a 浓度 g g 9 1 浓度读数 g g m 1 稀释倍数 1 0 0 0 然后按2 嵋仙的浓度稀释 标本r n a 经定量的r n a 于 8 0 保存或进行逆转录反应 2 6 2 逆转录步骤 操作步骤适用于模板量为5 0 n g 2 9 9 如果超出反应体 系 则相应扩大模板量 1 将模板r n a 在冰上解冻 引物 1 0 x r tb u f f e r 其中包括r n a s i n 和d t t d n t p 混合液 r n a s e f r e ed d h 2 0 在室温 1 5 2 5 解冻 解冻后迅速放在冰上 使用前将每种试剂旋涡震荡均匀 简短离心以收集 残留在管壁上的液体 2 逆转录体系 2 0 9 l 体系 按以下反应体系配置混合液 彻底混匀 简短离心 置于冰上 i o x r tm i x t u m2 9 l d n t p 混合液2 9 l o l i g o d t l5 或r a n d o mp r i m e r2 山 q u a n tr e v e r s et r a n s c r i p t a s e1 山 r n a s e f r e ed d h 2 0 3 山 3 将模板r n a j l l 入混合液中 彻底混匀 简短离心以收集残留在 管壁上的液体 4 4 2 孵育6 0 分钟 5 逆转录产物可以用于后续p c r 反应 2 6 3p c r 扩增反应及所用引物 1 p c r 反应体系按照r e a l m a s t e r m i x s y b rg r e e n 试剂盒配制 s y b r 反应体系共2 5 9 1 2 5 x r e a l m a s t e r m i x 10 t l 2 0 x s y b rs o l u t i o n 1 2 5 i t l c d n a 模板2 9 l 1 0 p m o l g l 的上 下游引物各0 5 9 l 余用去离子 水补足至2 5 9 l p t e n 的扩增条件为 9 5 预变性5 分钟 9 5 变性l m i n 5 5 退 火l m i n 7 2 c 延伸l m i n 经历3 5 个循环后7 2 c 延伸1 0 m i n 扩增片段 长度1 0 1 b p 研究论文 t b e t 的扩增条件为 9 5 预变性5 分钟 9 5 c 变性1 m i n 5 5 退 火l m i n 7 2 延伸l m i n 经历3 5 个循环后7 2 延伸1 0 m i n 扩增片段 长度1 3 2 b p i f n 吖的扩增条件为 9 5 预变性5 分钟 9 5 变性l m i n 5 4 退 火l m i n 7 2 延伸l m i n 经历3 5 个循环后7 2 延伸1 0 r a i n 扩增片段 长度1 5 4 b p g a t a 3 的扩增条件为 9 5 预变性5 分钟 9 5 变性l m i n 5 5 退火1 m i n 7 2 延伸l m i n 经历3 5 个循环后7 2 延伸1 0 m i n 扩增片 段长度2 0 5 b p i l 4 的扩增条件为 9 5 预变性5 分钟 9 5 变性l m i n 5 3 退火 1 m i n 7 2 延伸l m i n 经历3 5 个循环后7 2 延伸1 0 m i n 扩增片段长度 1 9 8 b p 1 3 a c t i n 的扩增条件为 9 5 预变性5 分钟 9 5 变性l m i n 5 5 退 火l m i n 7 2 延伸l m i n 经历3 5 个循环后7 2 延伸1 0 m i n 扩增片段 长度4 4 3 b p 2 6 4p c r 反应扩增产物的半定量分析 取上述4 9 l 产物经2 琼脂糖凝胶电泳 含g o l d v i e wi 型核酸染色剂 9 0 v 5 0 分钟 电泳缓冲液为0 5xt b e 在紫外灯下观察结果 并在读 胶仪a l p h a i m a g e r l 2 0 0 z 进行扫描 在相应位置上显示有条带者 为有目 的基因的表达 反之为没有目的基因的表达 应用分析软件 各基因的相 对表达水平以其各自的灰度值除以相同标本p a c t i n 的灰度值表示 所用引物如下 1 p t e n 上游引物5 a t a c c a g g a c c a g a g g a a a c c 3 下游引物5 t t g t c a t t a t c c g c a c g c t c 3 产物大小为1 0 1 b p 2 t b e t 上游引物5 g c c t a c a g a a t g c c g a g a t t a c t 3 下游引物5 g g a t g c t g g t g t c a a c a g a t g 3 7 产物大小为1 3 2 b p 3 i f n 一丫 研究论文 上游引物5 g g a g a c c a t c a a g g a a g a c 3 下游引物5 c g a c a g t t c a g c c a t c a c 3 7 产物大小为1 5 4 b p 4 g a t a 3 上游引物5 c g a g a t g g c a c g g g a c a c t a 3 7 下 游引物5 a g a g c c c a c a g g c a t t g c a g 3 7 产物大小为2 0 5b p 5 i l 4 上游引物5 a c t c t g t g c a c c g a g t t g a c c 3 7 下游引物5 g t c g a g c c g t t t c a g g a a t c 3 7 产物大小为1 9 8 b p 6 1 3 a c t i n 上游引物5 c g g g a a a t c g t g c g t g a c 3 下游引物5 t g g a a g g t g g a c a g c g a g g 3 7 产物大小为4 4 3 b p 3 统计学处理 所有数据采用s p s s l 3 0 统计软件进行分析 检验水准取a 0 0 5 方差 齐性检验水准取a 0 1 结果 1 重组腺病毒载体转染j u r k a t 细胞株 为了观察p t e n 基因对t 淋巴细胞分化的作用 我们以j u r k a t 细胞系为靶 细胞 应用a d p t e n g f p 作为真核表达载体 在体外进行腺病毒的扩增 和转染 结果显示 当m o i 2 0 0 时 重组腺病毒转染转染j u r k a t 的效率 a d p t e n g f p 为 4 7 1 0 5 2 a d g f p 为 4 4 7 0 4 6 图1 显示了 转染前后 荧光显微镜t j u r k a 细胞表达绿色荧光蛋白的情况 a 图为正常 j u r