耳聋上课资料PPT课件.ppt

遗传性非综合征型耳聋 1 目录 一 概况二 分类三 临床表现四 耳聋诊断五 耳聋基因诊断六 耳聋常见基因介绍及待检基因的选择六 基因突变检测技术七 风险评估与预防 2 一 概况 1 流行病学听力丧失是最常见的感觉障碍 先天性听力丧失在新生儿中的发病率约为1 1000 2 1000 在成年之前 每1000名儿童中就有1名有重度或深度听力丧失 世界卫生组织2005年估计全世界听力障碍人数达2 78亿 2006年第二次全国残疾人抽样调查显示 我国现有听力残疾人约2004万 我国每年还将增加耳聋患儿 万余名 3 耳聋一半是由非遗传性原因引起 另一半则是遗传性的原因 非遗传性致聋因素包括很多 遗传性耳聋多数为单纯听力障碍 称为非综合征型耳聋 部分还伴有其它器官异常 称为综合征型耳聋 遗传性非综合征型耳聋 NSHL 可表现为多种遗传方式 包括常染色体显性遗传 DFNA 常染色体隐性遗传 DFNB X连锁遗传 DFN Y连锁遗传 DFNY 和母系遗传等 4 2 耳聋病因 5 3 NSHI的相关基因 到2008 7 遗传性非综合征型耳聋位点及相关基因数据库 6 二 分类 按类型 传导性神经耳聋 感觉神经性耳聋 混合性聋 中枢的听觉异常 按发病期 学语前聋 学语后聋按听力的严重度 轻度的 26 40dB 中度的 41 55dB 适度严重的 56 70dB 严重的 71 90dB 深度的 90dB 7 图片来源于 JosefFinsterer Nuclearandmitochondrialgenesmutatedinnonsyndromicimpairedhearing 8 三 临床表现 1 耳聋 先天性或突发性的耳聋 2 头痛 耳鸣 3 眩晕 4 少数患者可有耳周围沉重感 麻木感 5 耳镜检查 外耳道无异物 鼓膜清晰 标志正常 音叉试验提示感音神经性聋 6 纯音测听 听力损害重 听力曲线呈高频陡降型甚或全聋的感音神经性聋曲线 7 声阻抗检测正常 呈正常鼓室压测量曲线 8 前庭功能检查 常用冷热交替试验结合眼震电图描记 试验结果可能正常 减退或完全消失 9 还有一些耳聋患者可能伴有其他器官或系统的异常 这些症状提示其耳聋与综合征型耳聋相关 如 皮肤异常角化 色素异常缺失或过度沉着 眼睛视网膜的色素沉着 高度近视 斜视 夜盲等 发育畸形 如颅面部畸形 脊柱四肢 手指 足趾的异常 患者或其家族中有人表现心脏的异常 泌尿系统的异常 或甲状腺的异常肿大等 10 小结 常染色体显性遗传多为语后感音神经聋 DFNA3 8 12 19外 在家系中呈垂直遗传 每代都有患病个体 发病年龄可从几岁到五十几岁 大多数病例从高频听力开始下降 进行性加重累及多个频率 多不伴眩晕 同一家系不同患者之间起病时间和症状可能有差异 常染色体隐性遗传性非综合征型多为语前感音神经聋 DFNB8例外 为发展迅速的语后聋 在家系中隔代遗传 耳聋程度多为重度或全聋 X连锁非综合征型耳聋可为语前聋或语后聋 线粒体12SrRNA基因A1555G点突变可导致先天性聋或药物性聋 11 四 耳聋诊断 诊断耳聋的诊断包括定性 定量 定位和病因的诊断 耳聋的定性和定量诊断主要通过相关的听力学 听功能 检查来确定 而定位和病因诊断要经过病史采集 全身系统的检查 耳部检查 听觉和前庭功能的检查 影象学技术和相关实验室诊断手段 进行全面分析 才能明确 12 A 病史及体格检查B 听功能检查C 前庭功能检查法D 耳部影象学诊断法E 耳聋的实验室诊断法F 耳聋的基因诊断法G 新生儿听力筛查 13 五 耳聋基因诊断 1 国外耳聋基因的研究情况1 GJB22 GJB33 GJB64 PDS5 WFS16 COCH7 POU3F48 MitochondrialMutation 14 2 国内耳聋基因的研究情况 1 GJB22 线粒体突变3 其他基因研究较少 15 3 我室研究情况 我室自上世纪90年代末开展耳聋研究工作 在多年的工作基础上 结合国际耳聋研究的最新进展于2003年底建立了耳聋基因诊断体系 并在实际应用中不断改进 该诊断体系根据不同NSHL基因异常导致不同的临床表型进行待检基因的选择 大大降低了耳聋基因诊断的盲目性 这也是本室进行耳聋基因诊断的特色和创新的集中所在 目前 针对不同的基因 我室采取不同的基因诊断技术 力求经济 快速 有效 16 我室常检基因及方法 17 六 耳聋常见基因介绍及待检基因的选择 1 GJB2基因除少数人群外 GJB2是最常见的耳聋疾病相关基因 约50 的遗传性学语前性NSHL与GJB2有关 GJB2基因突变所致的耳聋临床表型较复杂 从遗传方式上看 既可以常染色体隐性遗传 DNFB1 也可以常染色体显性遗传 DFNA3 从听力损失的严重程度看 轻度至深度耳聋都可能与GJB2基因突变相关 GJB2基因小 CDS681bp 适宜筛查 前言 18 1 2GJB2突变特点 在北欧犹太人群中突变主要以137delT为主 人群137delT携带率就有3 4 在欧洲其他人群和北美人群中则以35delG为主 占了GJB2突变的70 在东亚人群中主要的突变类型是235delC 19 SLC26A4基因引起耳聋的介绍 流行病学SLC26A4基因又名PDS 由21个外显子组成 编码一种穿膜蛋白pendrin 后者主要在甲状腺 内耳和肾脏表达 PDS基因突变可导致呈常染色体隐性遗传的NSHL DFNB4 OMIM600791 占5 10 仅次于GJB2 导致学语前聋的NSHL 20 临床表现 患者表现为常染色体隐性遗传或散发的学语前聋 可为进行性并伴前庭功能异常表现 影像学检查常可发现内耳结构异常 前庭导水管扩张 EVA 或内淋巴囊扩张 Mondini 据统计 PDS突变所导致的耳聋70 80 伴有EVA或Mondini畸形 因此临床上可通过对伴有EVA表现及内耳异常的非综合征型耳聋进行SLC26A4基因的突变筛查 21 22 GJB6 WFS1和COCH基因简介 23 相关位点 遗传方式 临床特点 24 线粒体基因 除核基因外 线粒体基因突变也可导致综合征型或非综合征型耳聋 由于线粒体位于细胞质内 其突变所致疾病的传递方式呈母系遗传 线粒体耳聋是多基因遗传因素决定的 耳聋症状是否出现 严重程度决定于线粒体基因 核基因和环境因素共同作用于靶细胞 突变热点 A1555G 2019年12月19日 前言 25 26 27 遗传性NSHL相关基因检测候选基因确定流程 2019年12月19日 28 28 六 基因突变检测技术 1 变性高效液相色谱技术 DHPLC 变性高效液相色谱 DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography DHPLC 技术是近年来比较盛行的突变筛查方法 大量研究报道其在突变检测中具有高效性 高通量 低成本和操作方便简易等许多优点 在基因诊断中具有广阔的应用前景 29 DHPLC突变检测的原理 图片来源于 30 DNA的分离和提取 引物的选择和设计 PCR扩增 WAVE系统分析 杂交 产物过柱 洗脱 结果分析 测序 单个洗脱峰 两个以上洗脱峰 分析突变类型 未检测到突变 实验流程 31 待检模板经PCR扩增后 用PAGE胶检测产物的特异性和产量 当都满足要求时 可行DHPLC筛查 PDS基因4号外显子的PAGE胶图 32 待测样品与野生型样品混合 变性和杂交 野生型样品与突变型样品混合 经变性再缓慢复性后可形成两种异源双链 heteroduplexes 和两种同源双链 homoduplexes 这一步中异源双链的形成是DHPLC检测的前提 图片来源于 33 预实验 把经测序证实为阳性的病人模板作为大批量实验之前的预实验样品 既可以验证DHPLC技术的可靠性也可以优化检测条件 如 PDS10 58 1 M4563是已经测序鉴定为10号外显子存在突变的病人 34 2 RFLP 线粒体 RFLP 35 耳聋病人的线粒体诊断 PCR RFLP 自左向右起第一道100bpMarker 第二道到第四到是酶切前的产物 第五道到第七到是酶切前的产物 1 2 3 4 5 6 7 36 3 耳聋基因诊断试剂盒 多重PCR RFLP 一 优点二 选择依据三 研究方法四 筛查的结果 37 优点 多重PCR可同时检测多个基因的多个突变位点 使已往多次PCR扩增 多次限制性内切酶分析过程简化为一次PCR反应 一次限制性内切酶分析 且大大的节省了标本用量 提高了PCR对遗传性聋病诊断的临床应用价值 38 选择的依据 1 GJB2相关位点GJB2在遗传性非综合征型耳聋 NSHI 中所占比例相对较高 占的NSHI50 左右 235delC则是东亚人群发病率最高的突变 有研究报道中国人中儿童语前聋的26 33 为GJB2基因突变所致 而235delC检出率为13 64 21 5 仅有一个编码外显子 便于研究 进行GJB2筛查后可减少再进行其他高花费的检测 此类检测也可以预测将来后代的再发风险 39 2 SLC26A4相关位点 临床比较常见的NSHL相关基因SLC26A4 又名PDS 仅次于GJB2 5 10 的语前聋与之相关 不同种群的SLC26A4基因突变谱不尽一致 最近研究发现中国人群的SLC26A4基因突变以IVS7 2A G为最常见 占所有SLC26A4基因致病突变的69 1 SLC26A4的突变可引起的大前庭水管征 研究表明可通过筛查IVS7 2A G热点突变诊断大庭水管 早期发现此类耳聋患者多可以通过正确的指导和严格的活动限制措施来保存患者较好的残余听力 使患者可以溶入正常的教育环境和社会 40 3 线粒体相关位点 对中国语前聋人群的研究发现线粒体突变所致耳聋亦较常见 约占语前聋的5 且绝大部分系1555A G mtDNAA1555G突变筛查对药物聋的预防作用 应用基因诊断手段进行孕期母亲或新生儿的线粒体DNAA1555G突变的普遍性筛查 对存在线粒DNA中A1555G突变的个体进行科学的防聋宣教 可以在全国范围内有效的减少药物性耳聋 41 研究方法 抽提门诊耳聋病人的外周血gDNA DNA的溶解 测OD值 然后把摸板统一稀释到30ng uL 订制3对引物 处理引物且每条引物被稀释为100ng uL多重PCR扩增基因GJB2 SLC26A4 PDS 12srRNA的相应片段PAGE胶或琼脂糖胶检测 当目的片段和特异性都很好时 可行酶切三酶切再次PAGE胶检测结果判读 42 酶切前后示意图 结果判定表 43 应用价值 本试剂盒每筛查一个病人的成本只需要10块左右 价格的低廉易于推广 且具有可关的经济效应前景 本试剂盒可以用于基层医院 包括相当一部分的上级医院和科研院所 广泛开展不明原因耳聋 或怀疑药物性耳聋 或代替昂贵的颞骨CT的工具 提前诊断大庭水管综合征患者 使基因筛查提供可能 本试剂盒只需要简单的实验设备 PCR仪器及跑胶的电泳槽及分子成像仪 筛查大批量耳聋病人的模板所得出的结果能在统治学上得出有用的耳聋突变数据 数据显示出这3个常见突变引起遗传性耳聋占较大的比例 结果显示湖南地区非综合性耳聋的三个热点突变基因的致病单体的检出率为21 7 筛查这些常见突变能快速提高病因诊断 产前诊断及聋儿康复等起作用 44 七 风险评估与预防 1 由于与耳聋相关的基因很多 且表型各异 耳聋具有高度的遗传异质性 2 对于低频和中频感音神经性听力损害应高度怀疑为遗传性 3 建议对GJB2基因突变阳性的耳聋患者作电子耳蜗移植 而对临床上颞骨CT提示前庭水管扩大或Mondini畸形的耳聋患者应进行PDS基因突变检测 45 4 重在早诊断早治疗原则 使患者在最佳时机得到听力和语言的训练 达到最佳效果 5 对于常染色体显性遗传非综合征型耳聋杂合子 患者同胞约有1 2为患者 子代约有1 2为患者 每次生育有1 2为患者 如双亲为杂合子患者 子代有3 4为患者 仅1 4正常 46 6 对于常染色体隐性遗传非综合征型耳聋 当一个夫妇生出一个患儿后 说明夫妻双方都为致病基因携带者 他们再生出患儿的的风险概率为1 4 男女患病的几率均等 有1 2的概率生出无症状的携带者 有1 4的概率生完全正常的孩子 7 对于X连锁隐性遗传的非综合征性耳聋 如父亲正常 母亲为携带者时 后代儿子中有1 2机会患病 女儿无患病风险 但有1 2机率为携带者 如父亲患病 母亲正常时 后代中儿子无患病风