（运动人体科学专业论文）有氧运动对apoe小鼠no信号传导相关细胞因子的影响及机制初探.pdf

摘要 研究目的：本研究试图以a p o e - - 小鼠为研究对象，并以n o 信号传 导相关机制作为研究线索，以有氧运动作为主要的干预措施，对运动 干预及动粥样硬化形成进行研究，试图在有氧运动与n o 信号传导相 关机制之间进行探索。 研究方法：采用1 0 周龄c 5 7 b l 6 j a p o e ( 一一) 小鼠4 8 只，8 ，s p f 级， 体重( 1 8 2 4 士o 6 0 ) g 。随机分为安静组( 对照组) 、有氧运动组、给药 组( 普伐他汀钠片) ，每组1 6 只。对三组( a p o e 一一) 小鼠进行1 2 周 干预后对实验小鼠采用血清血检测、砸染色胸主动脉切片观察其形 态学变化、应用酶联免疫吸附法( e l i s a ) 测定、逆转录多聚酶链 式反应( 肌p c r ) 等实验技术，分别检测血清中胆固醇( t c ) 、甘油 三脂( t g ) 、高密度脂蛋白( h d l ) 、低密度脂蛋白( l d l ) 、( 一氧 化氮) n o 、内皮素( e t ) 、降钙素基因相关肽( c g r p ) 、( 一氧化氮合 酶) n o s ，胸主动脉中( c 反应蛋白) c i 冲、( 两面神激酶) j a k 、( 信 号传导及转录激活因子) s t a tm r n a 的表达水平等n 0 相关细胞因 子。 研究结果：有氧运动组，给药组( 普伐他汀钠片) 血脂成份中t c ， t g ，l d l 含量与对照组相比较具有统计学意义；其中t c ，t g ，l d l 的检测结果显示运动组与给药组相比较无统计学意义；有氧运动组血 清h d l 含量均低于对照组，给药组( p o 0 5 ) ；对n o 的检测结果显 示运动组血清n o 水平明显高于对照组且( p o 0 1 ) ，高于给药组且 ( p o 0 5 ) 。通过m 染色对a p o e - - j 、鼠胸主动脉的形态学观察， 1 结果显示有氧运动能明显减轻主动脉的斑块形成。e l i s a 法检测血 清中内皮素( e t ) 浓度以对照组最高，给药组、运动组随之降低； 对照组与给药组，运动组比较差异具有显著统计学意义( 正o 0 1 ) ， 运动组与给药组比较无统计学意义( 矿0 0 5 ) 。血清中降钙素( c g i 心) 的浓度以对照组最低；而对照组与运动组、给药组比较差异具有显著 统计学意义( f 0 0 1 ) ，而运动组与给药组比较差异具有统计学意义 ( p 0 0 5 ) 。血清中一氧化氮合酶( n o s ) 的含量以运动组最高，给药 组、对照组随之降低；其中运动组与给药组，对照组比较差异均具有 统计学意义( p o o1 ) 。r t - p c r 法检测j a km r n a 表达对照组最 高，给药组最低，其中运动组与给药组、对照组比较差异具有统计学 意义( p o 0 5 ) 。c r p 训 斟a 表达以对照组最高，运动组与给药组的 条带亮度无明显差异，但均弱于对照组；对照组分别与运动组，给药 组相比较差异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。s 吖汀删 矾a 表达以对照组 最高，给药组次之，运动组最弱；运动组与对照组比较差异具有显著 统计学意义( 胯0 0 1 ) ，给药组与对照组比较差异具有统计学意义 ( 正o 0 5 ) 结论：通过髓染色对a p o e 一小鼠胸主动脉的形态学观察，表明 有氧运动干预能明显减弱主动脉的斑块形成。通过对实验对象的血 脂及n o 相关细胞因子的实验结果比较分析，表明有氧运动与给药 ( 普伐他汀钠片) 均能从某种程度对a p o e 一- j 、鼠动脉粥样硬化的形 、 成进行良性干预作用，但实验结果显示两者对相关细胞因子干预程度 不同。通过对各组a p o e 一小鼠血清检测可以表明有氧运动及给药 i i 均能降低血脂成份，实验表明有氧运动能提高血清中n 0 、n o s 、 c g p r 的含量，降低e t 的含量；在胸主动脉m r n a 表达方面，有 氧运动能抑制c r p ，s 仉钮，j a k 的表达，进而对缓解动脉粥样硬化 ( a s ) 形成产生干预作用。 关键词：动脉粥样硬化；有氧运动：a p o e 一小鼠；n 0 信号传导因 子 i i i a bs t r a c t o b j e c t i e s ：t h i ss t u d ya t t e m p t st oa p o e - - m i c ea st h er e s e a r c ho b j e c t ， t h en 0s i g n a l 饥m s d u c t i o nm e c h a n i s m sa sc l u e s ，t h ea e r o b i ce x e r c i s ea s t h em a i ni n t e r v e n t i o n sf o r r e s e a r c h i n g e x e r c i s ei n t e r v e n t i o na n d d y n a m i ca t l l e r o s c l e r o s i sf o r m a t i o n ，t 呵t 0e x p l o r eb e 伽e e na e r o b i c e x e r c i s ea n dn o s i g n a l 仃a n s d u c t i o nm e c h a n i s m m e t h o d s ：b y1ow e e k so fa g ec 5 7 b l 6 jo fa p o e ( - 一) m i c e ，4 8 ，m a l e a n dl e v e lo fs p f ，b o d yw e i g h t ( 1 8 2 4 + 0 6 0 ) g w e r er a n d o m l yd i v i d e d i n t oq u i e tg r o u p ( c o n t r o lg r o u p ) ，e x e r c i s eg r o u p ，m e d i c a t i o ng r o u p ( p r a v a s t a t i ns o d i u mt a b l e t s ) ，l6r a t si ne a c hg r o u p a r e r12w e e k so f i n t e e n t i o n ，t h r e eg r o u p so f ( a p o e - - ) m i c e a r ed e t e c t e db y s e m mb l o o d d e t e c t i o n ，r e v e r s et r a n s c r i t i o np 0 1 y m e r s e c h a i n r e a c t i o n ( i m p c r ) ， e n 巧m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) a n dh es t a i n i n go ft h o r a c i c a o n i cs e c t i o n st oo b s e et h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e s w h i c hc ”o k i n e s c h o l e s t e r o l ( t c ) ，t r i g l y c e r i d e ( t g ) ，h i g hd e n s i 够l i p o p r o t e i n ( h d l ) ，l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i n ( l d l ) ( n i t r i co x i d e ) n 0 ，e n d o t h e l i n ( e t ) ，c a l c i t o n i n g e n 印e p t i d e ( c g r p ) o fn o s ( n i t r i co x i d es y n t h a s e ) w e r ed e t e c t e di n s e r u m ，t h eo t h e ri nt h o r a c i ca o i r t a 一( c r e a c t i v ep r o t e i n ) c r p ( j a n u s k i n a s e ) j a k ，( s i g n a l - t r a n s d u c t i o n - a n d - t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r ) s 1 a t m r n a t h e s er e l a t e dc y t o k i n e sw e r ed e t e c t e dw i t ht h en o s i g n a lt r a n s d u c t i o n b ya b o v ee x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e s r e s u l t s ：a e r o b i ce x e r c i s eg r o u p ，t r e a t m e n tg r o u p ( p r a v a s t a t i ns o d i u m t a b l e t s ) i nt h el i p i dc o m p o s i t i o no ft h et c ，t ga n dl d l c o n t e n tw e r e s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n tc o m p a r e dt ot h ec o n 仃o l 铲o u p ；w h e r e t h et c ，t g a n dl d ld e t e c t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x e r c i s e 舒o u pa n d 仃e a t r i l e n t g m u pw a u sn os i g i l i f i c a n td i 舭r e n c e ；t h ea e r o b i ce x e r c i s eg r o u ps e m m h d ll e v e l s 、e r e1 0 、e rt h a nt h ec o n t r 0 1g r o u p ，t r e a t m e n tg r o u p ( p 0 0 5 ) ； n od e t e c t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a ts e m mn o1 e v e l si nt h ee x e r c i s eg r o u p w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p ( p o o1 ) ，a n dh i g h e rt h a n t h et r e a t m e n tg r o u p ( p o 0 5 ) b yh es t a i n i n go fa p o e 一- m i c e t h o r a c i ca o r t am o 印h o l o g i c a lo b s e a t i o n ，m er e s u l t ss h o w e dm a ta e r o b i c e x e r c i s ec a ns i g n i f i c a n t l yr e d u c et h ep l a q u eo ft h ea o r t a e l i s at o d e t e m i n es e m mc o n c e n t r 撕o no fe n d o t h e l i n ( e t ) l e v e l sw a st ot h e h i g h e s ti nt h ec o n t r o l 铲o u p ，t r e a t m e n tg r o u p ：s p o i r t sg r o u pd e c r e a s e s ； c o n t r o l 黟o u pc o m p a r e d t ot r e a t m e n t g r o u p a n d s p o r t sg r o u p ， t h e d i f f e f e n c e 、) l ，习l ss t a t i s t i c a u ys i g n i n c a n t ( p o 0 5 ) t h eq u i e tg r o u p w e r et h el o w e s ti nt h e s eg r o u p sf o rt h ec o n c e n t r a t i o no fs e m mc a l c i t o n i n ( c g i 冲) ；c o m p a r e dw i t ho t h e rt w og r o u p s ，t h ed i f r e r e n c ew a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t ( p o o1 ) ，w h i l et h e e x e r c i s e g r o u pa n d t r e a t m e n tg r o u p d i f i f e r e n c e sw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n c e ( p 0 0 5 ) t h ee x e r c i s eg r o u p 、r et h eh i 曲e s ti nt h e s eg r o u p sf o rn i t r i co x i d es y n t h a s e ( n o s ) i ns e m m l e v e l s ，t r e a t m e n tg r o u pa n dc o n t r o lg r o u pd e c r e a s e s ；a n de x e r c i s eg r o u p c o m p a r e dw i t h t r e a t m e n tg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p ，t h ed i f f e r e n c e sw e r e v s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a m ( p 0 o1 ) ( 4 ) b yi m p c ra s s a yt h ej a km r n a e x p r e s s i o n 1 e v e l st ot h eh i g h e s ti nt h ec o n t r o lg r o u p ，t h el o w e s t 仃e a t m e n t g r o u p ，距de x e r c i s eg r o u pc o m p a r e dw i t h 仃e a t m e n tg r o u pa n dc o n t r o l g r o u p ，t h ed i f f e r e n c e sw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( p o 0 5 ) c r pm r n a e x p r e s s i o nl e v e l st ot h eh i g h e s ti nt h ec o n t r o l 掣o u p ，a n de x e r c i s eg r o u p a n dt r e a t m e n tg r o u pw i t hb r i g h 恤e s sw a sn o s i g n 诳c a n td i f f e r e n c e ，b u ta r e w e a k e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p s 仉町m r n ae ) 中r e s s i o nl e v e l st ot h e h i g h e s ti nt h ec o n t r o lg r o u p ，t r e a t m e n tg r o u pi sw e a k e r ，f o l l o w e db yt h e e x e r c i s eg r o u pi st h ew e a k e s t ；t h ee x e r c i s eg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p d i 虢r e n c ew a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i n c a n t ( p o o1 ) ，t h e t r e a t m e n tg r o u p c o m p a r e dw i t hc o n 缸o lg r o u p d i 航r e n c ew a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i 丘c a n t ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ： b yh es t a i n i n g o f a p o e - 一 m i c et h o r a c i ca o r t a m o 印h o l o g yo b s e r v e d ，i n d i c a t i n gt h a tt h ea e r o b i ce x e r c i s ei n t e r v e n t i o n s i g n i f i c a l l t l y r e d u c e da o r t i c p l a q u e f o r i n a t i o n t h r o u g h t h e c o m p a r a t i v ea n a l y s i so fl i p i d so n t h es u b je c t sa n dt h ee ) 巾e r i m e n t a lr e s u l t s o fn o r e l a t e d c y t o k i n e s ， t h a ta e r o b i ce x e r c i s ea n da d m i n i s t r a t i o n ( p r a v a s t a t i ns o d i u mt a b l e t s ) c a nt o s o m ee x t e n to nt h e a p o e - 一m i c e a t h e r o s c l e r o s i sf o r m a t i o n ，b o t ha r et h er o l eo fb e n i g ni n t e r v e n t i o n ，b u tt h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hc ”o k i n e sd e g r e eo fi n t e r v e n t i o n d i 虢r e n t g r o u p so fa p o e 一一m i c es e r as h o w e dt h a ta e r o b i ce x e r c i s e a n dm e d i c a t i o nc a nl o w e rb l o o d1 i p i d c o m p o s i t i o n ，t h ee x p e r i m e n t s v i s h o 、e dt h a ta e r o b i ce x e r c i s ec a ni n c r e a s es e m mn 0 ，n o sa n dc g p ri n t h ec o n t e n t ，r e d u c i n gt h ec o n t e n to ft l l ee t ；f o rm 王心j i ae x p r e s s i o no ft h e t h o r a c i ca o n a ，a e r o b i ce x e r c i s ec a ni i l l l i b i tt h ee x p r e s s i o no fc r p ，+ s 1 a t a i l dj a k ，a j l d 廿m st oa st h ef o r m a t i o no ft h e i n t e r v e n t i o n i s tr o l et o a l l e v i a t ea t l l e r o s c l e r o s i s ( a s ) k e y w o r d s ：a t h e r o s c l e r o s i s ；a e r o b i ce x e r c i s e ；a p o e _ - i nm i c e ；n os i g n a l t r a n s d u c t i o nf a c t o r s v i i 有氧运动对( a p o e 一一) 小鼠n 0 信号传导相关细胞因子的影响及机制初探 1 前言 流行病学调查表明，动脉粥样硬化( a t i l e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是对 人体健康危害严重的心血管系统常见病，多发病，是导致心血管疾病 的主要因素之一，每年因此原因导致1 2 0 0 万人丧生【1 1 。众所周知， 动脉粥样硬化是中老年人常见的疾病，且其具有并发症发生率较大， 较长，疾病较严重的特点。据资料显示a s 的发病率在世界范围内居 高不下，在我国的发病率也较高，有资料显示5 0 岁以上的老年人中， 约每万人中就有7 7 个得此疾病。 研究a s 确切的发病机制及如何防治以被许多专家学者所关注， 近十几年来国内外有关此方面的研究取得了一定的成就，但在选取研 究对象及研究的侧重点来看还是有诸多区别及争议。多数研究认为运 动通过降低血脂而降低a s 的发生和发展，其中运动防治a s 在运动 医学领域虽早已开展，但运动阻抗a s 的发生机制探究还有待深化。 自高血脂产生的危险因素于1 9 6 1 年被w i l l i 锄k a m e l 在研究中 首次提出以来，对动脉粥样硬化发生相关的因素的描述得以深入研究 【2 ，引。新英格兰医学杂志在1 9 8 4 年刊载了由k i s t l e 首次提出用于 表达动脉粥样硬化血栓形成的专业用语。有研究表明动脉粥样硬化的 形成原因可能是血管平滑肌细胞和动脉血管内皮细胞受到的各种损 伤造成的【4 1 。而目前较认可的四种形成动脉粥样硬化的理论机制有： ( 1 ) 血栓形成的理论：当确定病灶和血栓形成相关的物质( 如纤维 蛋白原，血小板释放产品等) 会存在内皮损伤，凝血和纤溶异常时， 其对a s 产生有重要影响；( 2 ) 脂质浸润理论：对血浆脂质侵入性反 硕士学位论文 应病变的血管壁将促进a s 病灶形成。( 3 ) 内皮细胞损伤反应理论： a s 是一种炎症过程，在血管壁上的血管结缔组织增生性病变促使炎 性细胞因子的促纤维增生性反应进而使动脉粥样硬化的形成。( 4 ) 炎 症反应理论：a s 的形成过程与慢性炎症反应的特点相一致，慢性炎 症参与其中并成为导致a s 形成直接的危险因素【5 】。 本研究侧重点在于研究运动对动脉粥样硬化的影响，其实验对象 的选取和模型的构建的方式相当重要。在运动对动脉粥样硬化的干预 的研究过程中，部分学者以人为研究对象，并取得了一定的研究成果， 但就以人作为研究对象有其局限性，样本获取难，实验过程难以控制， 容易受到外界因素的干扰同时也牵涉到一些伦理道德的问题等。有些 研究此领域的专家学者选择以动物为研究对象，如以家兔为研究对象 及构建动脉粥样硬化实验模型，但在建模过程中发现其形成动脉粥样 硬化的时程较慢，对一些致高脂血症的食物较为敏感等劣势。有些研 究者以大鼠为研究对象构建动脉粥样硬化模型，以s d 大鼠为例，其 容易饲养，价格便宜，解剖生理特点与人近似，相对于以人及家兔来 说，构建动脉粥样硬化模型较简单，但相对与基因敲除小鼠比较，就 构建模型的客观性，公正性是无法比拟的。白1 9 9 2 年有关专家在 n a t u r e 、c e l l 、美国国家科学院院刊杂志发表了这一研究领域的有 关转基因小鼠成功研制的报道以来，研究突变转基因小鼠得以广泛应 用并使转基因小鼠在研究过程中成为首选常用的实验动物 6 7 】。 s h z h a n g 在1 9 9 2 年报道第一例基因敲除小鼠的相关研究，他们用基 因靶向技术成功研制成载脂蛋白e ( a p o l i p o p r o t e i ne ，印o e ) 基因缺失的 有氧运动对( a p o e 一一) 小鼠n 0 信号传导相关细胞因子的影响及机制初探 小鼠，并且在实验中证实：因为印o e 丢失，小鼠对胆固醇转运受到影 响，导致胆固醇流通系统受阻，从而导致高胆固醇和动脉损伤。 运动是一种公认的安全和有效的抗动脉粥样硬化，心脑血管健康 的方法。有研究表明运动在预防动脉粥样硬化的生理效应包括：改善 血管内皮依赖性舒张功能；减轻血管内皮的炎症反应；抗氧化能力增强； 抑制血管平滑肌细胞的增生和血管内皮细胞的增殖及调节脂质代谢。 对某些内皮激素如内皮素( e t ) ，降钙素基因相关肽( c g i 冲) 等的影 响，而有资料显示e t 作为一种n o 的拮抗剂影响着动脉粥样硬化形 成过程中血管内皮依赖性舒张模式，而n o 的调节有助于c g i 冲的释 放【8 】o 气体小分子一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n 0 ) 在1 9 8 7 年被发现后，很快 成为动脉粥样硬化发病机制研究的新标向。许多研究表明，除了促进 血管舒张，一氧化氮还具有抗氧化，抑制血小板聚集和单核细胞的粘 附，降低平滑肌细胞增殖可能性等作用，是一个公认的抗动脉粥样硬 化的因素。n 0 系统功能障碍可导致动脉粥样硬化形成，而n o 是由 l 一精氨酸和一氧化氮合酶相互作用产生的【9 1 。有资料显示其c g m p 的依赖性和n 0 独立的机制参与体内许多生物过程，如一些蛋白激酶 ( 丝裂原活化蛋白激酶) 、激酶( j a n u s 激酶) 、( 信号传导和转录激活 因子) s 尉虹的激活可以输送进入细胞核，激活转录因子并达到信号 传导效应。与动脉粥样硬化相关的细胞因子之间并不是孤立的，需要 通过细胞内相关信号转导通路发挥作用，并且信号转导通路相互影 响，相互关联1 0 】。在目前发现的与动脉粥样硬化形成相关信号转导 硕士学位论文 通路中，j a n u s 激酶信号传导转录激活因子( j a k s 吖汀) 和丝裂原活化 蛋白激酶( m a p k ) 两条信号通路对相关因子产生的影响更为有意义。 m a p k 信号传导通路是在1 9 9 1 年在哺乳动物细胞中发现细胞外 信号调节激酶( e r k ) 而被关注的，并对其后续研究也相当深入。蛋白 激酶( m a p k ) 经一些生物及相关细胞因子刺激激活然后通过某些信息 编码及转录环节通过对苏氨酸( t ) 和酪氨酸( t y ) 双位点磷酸化激活 m a p k 【1 1 1 。 近年来新发现的一条细胞内的信号转导途径j a n u s 激酶信号 传导与转录激活因子( j a 刚s m 虹) 信号途径在细胞的炎症反应，细胞的 增生，细胞的病变方面及动脉粥样硬化形成的过程中起到一定的作 用。通过受体一酪氨酸激酶信号转导子与转录活化子靶基因的协同工 作并被激活，使得这条j a k s 彤口信号传导通路把细胞膜外的信息 传递至细胞内并与相应受体结合至核内。( s 吖汀) 是细胞质内潜在的转 录因子，其7 个家族成员分别是s t a t l 、s t a t 2 、s n 盯3 、s 吖汀4 、 s t a t 5 a 、s t a t 5 b 和s t a t 6 ，有资料显示其中的二个家族成员s t a t 3 的下游靶基因与细胞增生、分化、凋亡密切相关。作为非受体型酪氨 酸蛋白激酶，j a k 的家族成员包括j a k l 、j a k 2 、j a k 3 和t y k 2 。 细胞相关因自信号通过s t a t 蛋白从细胞膜传递至核内，结合特定的 d n a 序列，对靶基因的表达进行调控并有效发挥其生物学功能1 9 】。 靶细胞上相应受体与相关信号传导因子结合后引起j a k 活化，其酪 氨酸残基相互靠近而且交互磷酸化，此时相对应的受体与s n 盯蛋白 结合并形成新的位点，j a k 激酶催化s t a t 磷酸化，并通过调节靶基 有氧运动对( a p o e 一一) 小鼠n o 信号传导相关细胞因子的影响及机制初探 因的表达，充分发挥其生物学效应1 2 】。 2 材料与方法 2 1 实验动物 1 0 周龄c 5 7 b l 6 ja p o e ( 一- ) 小鼠4 8 只，8 ，s p f 级，体重 ( 18 2 4 土o 6 0 ) g ，购于北京维通利华实验动物有限公司 ( s c c k ( 京) 2 0 0 6 o 0 0 8 ) ，每只实验小鼠分笼饲养，温度调控在 2 3 2 5 ，相对湿度为4 0 一6 0 ；饮水自由。 2 2 主要试剂与仪器 2 2 1 主要试剂 ( 1 ) 普伐他汀钠片：购买于第一三共制药( 上海) 有限公司，批号： 0 9 0 0 7 0 规格：2 0 m 片，临用前用灭菌生理盐水配制。 ( 2 ) o 9 氯化钠注射液、甲醇、冰醋酸、无水乙醇、磷酸氢二钠、 多聚甲醛、磷酸二氢钠等常用分析纯试剂均购于上海化学试剂公司； ( 3 ) 1 0 水合氯醛：由邵阳市中心医院提供； ( 4 ) 溴化乙啶：购白b i o m e d i c a l l l c ； ( 5 ) 琼脂糖粉：购自s h a n g h a i y i t ob i o i n s t r u m e n tc o m p a n y ； ( 6 ) r n a i s or e a g e n t 、d e p c 处理水、r n a p c rk i t ( a m v ) 均购白 t 擞a r ab i o t e c h n o l o g y ( d al i a n ) c o l t d ； ( 7 ) t a q 聚合酶、d n t p 、d n al a d d e r 均购自f e m e n t a s 公司； ( 8 ) 据g e n eb a n k 核酸数据库中a p o e - j 、鼠各因子c d n a 序列， 用p r i m e r 5 o 设计p c r 引物。 硕士学位论文 表1 1c r p 、j a k 和s 盯p c r 引物设计 注：卜a c t i l l 为着家基因 2 2 2 主要仪器 表l 。2 主要试验仪器及其生产厂家 主要仪器 生产厂家 天能( 1 a n o n 3 5 0 0 ) 凝胶成像系统 天能凝胶成像处理系统4 0 p c r 仪 全自动酶标仪 高速台式冷冻离心机 超净工作台 紫外可见分光光度训 超低温冰箱 移液枪 全自动立式压力蒸汽电热灭菌器 台式恒温电热干燥箱 快速混匀器s k 一1 上海天能科技有限公司 上海天能科技有限公司 德国b i o m e t r a 公司 杜雷电子有限公司 德国h e t t i c h 公司 卜海智城分析仪器有限公司 天津瑞斯普仪器有限公司 1 1 1 e 肌oe l e c 仃0 nc o r p o r a t i o n 上海大龙医疗设备有限公司 上海博迅伟业有限公司医疗设各厂 上海精宏实验设备有限公司 江苏中大仪器厂 6 有氧运动对( a p o e 一一) 小鼠n 0 信号传导相关细胞因子的影响及机制初探 稳压稳流电泳仪d y y - 1 0 c 型 d y c p 31 d 型水平电泳槽 自动纯水双重蒸馏器 电子天平 d k s 2 2 型恒温浴锅 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 日本s h i m - a d z u 公司 上海精宏伟业设备有限公司 2 3 实验方法 2 3 1 实验动物模型 随机分为安静组( a s ) 、有氧运动组( a e ) 、给药组( a d ) ，每组 1 6 只。饲喂含2 1 脂肪，o 1 5 胆固醇的饲料，连续投喂1 2 周，以 构建病理改变典型的动脉粥样硬化模型。以定期取小鼠尾血进行检测 其与形成动脉粥增硬化相关的指标对实验模型进行监控分析，并得之 所建模型符合实验要求。 2 3 2 运动方案及给药 有氧运动组所采用的运动训练方案是依据加拿大f e m a n d o 等 学者研究方法改良：采用o 坡度跑台，速度为1 3 州m i n ，于每天下午6 7 时进行时长为6 0 m i n 的跑台训练，每周进行5 次，共1 2 周。给药组小鼠 用辛伐他汀每天( p m 6 时) 灌胃一次1 0 m k g ( 根据当时体重用生理 盐水定量至o 5 m l 配成悬浮液) ，共给药12 周。 2 3 3 血清与组织的采集 实验进行至1 2 周后对小鼠进行禁食并过夜，以摘眼球的方式取 血并分离血清，保存2 0 恒温冰箱中；在液氮充足的情况下取胸主 动脉段血管部分8 0 恒温冰箱保存，部分用1 0 多聚甲醛固定并进 行石蜡包埋切片。取部分胸主动脉血管置于有充o ：的平皿，d e p c 水冲洗后，将血管固定在软木片上，用眼科小剪剥离结缔组织和脂肪 组织，剪开血管，用0 1 胶原酶消化6 0 m i n 获取血管内皮细胞。部 硕士学位论文 分内皮细胞包好后用1 0 多聚甲醛固定，并用石蜡包埋。 2 3 4 血清血检测血脂中相关因子含量的检测 2 3 4 1 血清t c 及t g 测定 取待测血清4 冰箱放置3 0 分钟，室温放置3 0 分钟，待其充分 溶解后，应用酶偶联比色法，根据说明书要求取血清1 0 “l 加入1 m l 工作液中，3 7 水浴1 0 分钟，应用半自动生化分析仪进行测定。最 后结果按说明书公式计算t c t g 浓度= ( a 样品a 标准) 水标准浓度 ( m m o l 1 ) 。 2 3 4 2h d l 测定 按1 ：1 混均血清与沉淀剂，室温放置1 0 分钟，3 0 0 0 转分，离 心1 5 分钟，取上清液1 0 “l 移入1 m l 工作液中并在3 7 水浴5 分钟， 用半自动生化分析仪进行测定。计算公式为瑚) l 浓度= ( a 测a 标) 水2 丰标准浓度( m m o l 1 ) 。 2 3 4 3l d l 的坝4 定 按2 ：1 混均血清与沉淀剂，放置15 分钟后3 0 0 0 转分，离心15 分钟，取1 0 “l 上清液加入到1 m l 工作液中并在3 7 水浴5 分钟，应 用半自动生化分析仪进行测定。其所得结果由以下公式计算：上清液 胆固醇含量= ( a 样a 校) ：i = 校准品浓度水1 5 ，l d l 浓度= 总胆固醇一 上清液胆固醇。 2 3 4 4 血清一氧化氮( n o ) 的检测 取制备的血清，按一氧化氮试剂盒说明书采用化学法检测血清 n 0 含量。具体方法如下： 有氧运动对( a p o e 一一) 小鼠n 0 信号传导相关细胞因子的影响及机制初探 空白管标准管测定管 蒸馏水( m 1 ) 0 1 2 0 p m m o l l 亚硝酸钠( m 1 ) 0 1 样品( m 1 ) 0 1 l 号试剂( m 1 ) o 8o 8o 8 2 号试剂( m 1 ) o 4o 40 4 混匀后放置1 0 分钟，3 5 0 0 4 0 0 0 转分，离心1 0 分钟，取澄清的上清液 上清液( m 1 ) 0 8o 80 8 显色剂( m 1 ) 0 40 40 4 对制备好的实验样本经1 5 分钟后在光径为o 5 c m 的比色皿中并 将分光光度仪调至5 5 0 n m 比色，并进行对应公式进行测定。 2 3 5e l i s a 法检测血清中n o 信号传导相关因子的含量 将与信号转导系统相关的血清细胞因子如内皮素( e t ) ，降钙素 基因相关肽( c g i 冲) ，一氧化氮合酶( 一氧化氮合酶) ，严格按照试 剂盒说明书中的过程是：实验前先检测所需的己包被抗体的e l i s a 板孔数是否正确，并将试剂盒及待测标本在室温( 1 8 1 2 8 ) 情况下平 衡，其余则包好后放入冰箱中。将准备好的同排孔中顺次加入l o u l 标准品，然后每孔加入处理后的血清样本1 0 ul ，并做好标记。分 别加入l 酶联亲和物5 “于待测样本孔及标准品孔中，按要求混匀。 再通过6 0 分钟并在3 7 恒温温育后丢尽各孔内液体，反复冲洗5 次排孔( 稀释好的洗涤液) 后扣干孔内残留水分。各用移液枪把 5 u l 显色液a 、显色液b 分次各自加入标记孔中，确保搅匀后让其避 光反应1 5 分钟( 室温) 当反应物为蓝色并带有明显的梯度后每孔 加入终止液5 u l ，充分混匀后待其为黄色，终止反应。使用酶标仪 q 硕士学位论文 测定各组o d 值，酶标仪定值在4 5 0 衄处，并记录其数值。 2 3 6r t - p c r 法检测n o 信号传导相关因子m r n a 的表达 2 3 6 1 小鼠胸主动脉的总m r n a 的提取 在冰浴状态下分离经麻醉处死后的a p o e - 小鼠的胸主动脉片 段，确保在充足的t r i z o l 的环境下加入液氮对主动脉进行研磨，然 后放入e p 管内，用移液枪反复捣碎组织并进行振荡至混匀。在室 温情况下加氯仿2 0 0 p l 后振荡混匀1 5 s 并放置5 1 0 分钟。5 1 2 0 0 0 印m 离心5 m i n ，在以预先消毒的e p 管中吸取其中的上清，然 后再加入异丙醇5 0 0 “l 并混均直到有r n a 白色絮状后，把反应物于 2 0 冷冻冰箱保存3 小时以上。对所取样品4 1 2 0 0 0 印m 离心 l5 m i n 并去上清，然后7 5 乙醇洗涤后平稳放置。再经1 2 0 0 0 印m 离心5 m i n 并去上清。d e p c 水于沉淀物中并进行振荡摇匀。对 所测样品a 值1 9 a 2 6 0 a 2 8 0 2 o 之间的然后对其浓度均调为 1 0 叫皿，再才能用核酸浓度测定仪测定吸光度( a ) 值1 4 1 。 2 3 6 2r t - p c r 反应 ( 1 ) 反转录：对所测样本m i 矾a 的浓度先计算出所取样本a 2 6 0 的 值，然后对其浓度通过d e p c 处理水后使其浓度为1 斗p l 。反转录总 反应体系为2 0 斗l 。在p c r 管中加入3 p l r n a ，然后再加入6 “10 1 i g o p r i m e r ，再在管内加入d e p c 处理水3 p l ，4 p l5 r a c t i o n b u 虢r 、1 p l i 斟a s ei 1 1 1 1 i b i t o r 、2 “ld n t p m i x 、1 肛la m v 反转录酶( 严格要求在冰浴 情况下操作以上步骤。再用e p 管混匀以上混合液，再离心，再放入 恒温水浴箱经4 5 水浴6 0 m i n 中性变性，再7 2 5 m i n ，再保存8 0 1 0 有氧运动对( a p o e - 一) 小鼠n 0 信号传导相关细胞因子的影响及机制初探 冷冻冰箱，制成c d n a 的第一链。( 2 ) 聚合酶链式反应：在冰浴状态 下迅速取c d n a 模板1 肛l ，再加入g o1 a p g r e e nm a s t e rm i x2 x 1 2 7 5 “l ，m u c l e a s e t r e ew 乱e r9 5 “1 ，并将上游引物和下游引物各1 “1 分别按1 ：1 混匀。再将反应物置于p c r 反应仪中经过9 5 5 分钟， 9 5 3 0 秒，退火温度3 0 秒，7 2 3 0 分钟，3 0 3 5 个循环，7 2 延 伸5 分钟程序。( 3 ) 琼脂糖凝胶电泳：待p c r 反应完毕后在e p 管内 加入5 “l6 l o a d i n gb u 圩e r ，再把反应物来回打匀后并取p c r 产物1 0 “l 经2 琼脂糖凝胶电泳再经e b 染色后，在凝胶成像系统中观察电泳 结果，再放入凝胶电泳成像分析仪中经图像分析系统对条带扩增产物 进行分析，然后通过电脑测算所取样本的积分光密度值( i a ) 。 2 3 7 质量控制 对实验中所要用到的玻璃仪器均用洗涤液进行预先清洗后，然后 使用重铬酸钾液使其在特定容器中浸泡2 4 小时以上，再使有清水冲 洗过后，用蒸馏水润洗3 次。对用于r t - p c r 检测的离心管、匀浆器、 手术器械等全部用冷藏的d e p c 水浸泡4 8 小时以上，以消除对蛆酶 的活性，然后经高温灭菌并烘干密封待用。 在对实验对象a p o e - j 、