（发酵工程专业论文）褐环粘盖牛肝菌培养条件的研究.pdf

摘要 褐环粘盖牛肝菌是一种优良的外生菌根真菌，但在液体培养条件下生长缓慢，因 而给其应用推广带来困难。为了探明影响该菌生长速度的因素，建立有利于该菌快速 生长的培养体系，本文研究了培养基、种龄、添加物、p h 及碳、氮源浓度对其菌丝 体生长的影响。结果表明，褐环粘盏牛肝菌生长的最佳培养基为p a c h 培养基：合适 的种龄为6 8 d ；添加蘑菇汁对褐环粘盖牛肝菌的生长有促进作用，其中以金针菇汁 的促进作用最为显著；五种松树的叶、枝、根浸提液对褐环粘盖牛肝菌的生长没有明 显影响；柠檬酸一磷酸氢二钾缓冲液适用于褐环粘盖牛肝菌的培养，且以3 0 一4 0 的体 积浓度加入到培养基时，菌丝生长最好：褐环粘盖牛肝菌生长的最适p h 为4 5 ；在 不同p h 条件下，褐环粘盖牛肝菌的最适碳源浓度随p h 的升高而增大，而最适氮源浓 度差异较小，最适于菌丝生长的p h 与碳源浓度组合，在固体培养和液体培养条件下 均为p h 4 5 - 葡萄糖浓度0 1 m o l l ，菌丝生长的最适p h 与氮源浓度组合，固体培养条 件下为p h 4 5 - 酒石酸铵浓度0 0 1 4 m o l l ，液体培养条件下为p h 4 5 - 酒石酸铵浓度 0 0 0 7 l l 。 关键词：褐环粘盖牛肝菌：p h ；缓冲液：培养条件 s t u d yo nt h ec u l t u r ec o n d i t i o n so fs u i l l u sl u t e u s a b s t r a c t s u i l l u sl u t e u si sas u p e r i o rm y c o r r h i z af u n 舀，b u ti t sa p p l i c a t i o ni ss t i l ll i m t e df o rt h e s l o wg r o w t hi nl i q u i dc u l t u r e i n t h i sp a p e r , t h ee f f e c to fc u l t u r em e d i u m ，i n n o c u l a t i o n t i m e ，a d d i n gs u b s t a n c e ，p h ，c a r b o n r e s o u r c ec o n c e n t r a t i o na n d n i t r o g e n r e s o u r e c o n c e n t r a t i o no nh y p h a lg r o w t hw e r ei n v e s t i g a t e d ，w a sp r o c e e d e dt od e t e r m i n ei n f l u e n c e f a c t o ro fs u i l l u sl u t e u sg r o w t ha n de s t a b l i s hae f f e c t i v ec u l t u r es y s t e r m t h er e s u l ts h o w e d t h a t ，t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i aw a sp a c h t h eo p t i m u mi n n o c u l a t i o n t i m ew a s 6 8 d m u s h r o o me x t r a c t sp r o m o t e dt h eh y p h ag r o w t ho fs u i l l u sl u t e u s a n dt h ef l a m m u l i n a v e l u t i p e se x t r a c t sw a st h em o s tu s e f u l t 1 l ec i d ea i c a - k 2 h p 0 4 b u f f c rw a s o p t i m u m f o rt h e h y p h a lg r o w t h ，a n dt h eo p t i m u mb u f f e rc o n c e n t r a t i o nw a s3 0 4 0 s u i l l u sl u t e u sg r e ww e l l i np h 4 5 u n d e rd i f f e r e n tp hc o n d i t i o n s ，t h eo p t i m u mc a r b o nr e s o u r c ec o n c e n t r a t i o nw a s i n c r e a s e dw i t ht h ep hi n c r e a s i n g ，a n dt h eo p t i m u mn i t r o g e nc o n c e n t r a t i o nh a v eal i t t l e c h a n g e u n d e rs o l i dc u l t u r ec o n d i t i o n ，t h eo p t i m u mp ha n dc a r b o nr e s o u r c ec o n c e n t r a t i o ns c o m b i n a t i o nf o rh y p h ag r o w t hw a sp h 4 5 - g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n 0 1 m o i l t h eo p t i m u mp h a n d n i t r o g e n c o n c e n t r a t i o nsc o m b i n a t i o nw a s p h 4 5 - t a r t a d c a m m o n i u m c o n c e n t r a t i o n o 0 1 4 m o l l u n d e rl i q u i dc u l t u r ec o n d i t i o n ，t h eo p t i m u mp ha n dc a r b o n r e s o u r c ec o n c e n t r a t i o nsc o m b i n a t i o nf o r h y p h ag r o w t h w a s p h 4 5 - 西u c o s e c o n c e n t r a t i o n 0 1 m o 儿t h eo p t i m u mp ha n dn i t r o g e nc o n c e n t r a t i o nsc o m b i n a t i o nw a s p h 4 5 - t a r t a r i ca m m o n i u mc o n c e n t r a t i o n0 0 0 7 m o m l k e yw o r d s ：s u i l l u sl u t e u $ ；p h ：b u f f e r gc u l t u r ec o n d i t i o n s oir e t t e db y ：p r o f c h e ny o u j u n ( p h 。d ) a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：l i uy a n g ( m a s t e r o f f e r m e n t a t i o n e n g i n e e r i n g ) ( c o l l e g eo f b l o c n 酉n e e r i n g , i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y , h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c l u n a ) 1 图1 2 图2 3 图3 4 图4 5 图5 6 图6 7 图7 8 图8 9 翻9 1 0 图1 0 1 1 图1 l 1 2 图1 2 1 3 图1 3 1 4 图1 4 1 5 图1 5 1 6 图1 6 1 7 图1 7 1 8 图1 8 1 9 图1 9 2 0 图2 0 2 1 图2 1 2 2 图2 2 2 3 图2 3 2 4 图2 4 2 5 图2 5 2 6 图2 6 2 7 图2 7 2 8 图2 8 2 9 图2 9 3 0 圈3 0 3 1 图3 l 3 2 图3 2 3 3 幽3 3 插图和附表清单 培养基筛选结果1 0 接种龄对褐环粘盖牛肝菌生长的影响1 l 不同蘑菇汁对褐环粘盖牛肝菌生长的影响1 2 培养1 4 d 后菌丝干重1 2 不同松树浸提液对褐环粘盏牛肝菌生长的影响1 4 培养l o d 后菌丝干重。1 4 非缓冲液体系下初始p h 对褐环粘盖牛肝菌生长的影响1 6 培养1 4 d 后菌丝干重1 6 非缓冲液体系下p h 对液体培养菌丝生长的影响1 8 液体培养后基质的p h 变化1 8 色素吸收光谱1 9 不同p h 条件下液体培养菌丝色素分泌程度1 9 p h 4 5 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液对褐环粘盖牛肝菌生长的影响2 0 p h 5 0 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液对褐环粘盖牛肝菌生长的影响2 0 p h 6 0 柠檬酸一拧檬酸钠缓冲液对褐环粘盖牛肝菌生长的影响2 l 在不同缓冲液体系中褐环粘盖牛肝萤的生长情况2 3 柠檬酸一磷酸氢二钾缓冲液浓度对褐环粘盏牛肝菌生长的影响2 3 培养1 6 d 后菌丝干重：2 4 n a 离子浓度对褐环粘盖牛肝菌生长的影响2 6 缓冲液体系下p h 对褐环粘盖牛肝菌生长的影响2 7 培养1 4 d 后菌丝干重2 7 不同p h 条件下褐环粘盖牛肝菌的菌落形态2 8 缓冲液体系下p h 对液体培养菌丝生长的影响2 9 液体培养后基质的p h 变化2 9 不同p h 条件下液体培养菌丝色素分泌程度3 0 p h 3 0 不同葡萄稽浓度对褐环粘盖牛肝菌生长的影响3 1 p h 4 0 不同葡萄糖浓度对褐环粘盖牛肝菌生氏的影响3 l p h 4 5 不周葡萄糖浓度对褐环粘盖牛肝菌生长的影响3 2 p h 5 0 不同葡萄糖浓度对褐环粘盖牛肝菌生长的影响3 2 p h 5 5 不同葡萄糖浓度对褐环釉盖牛肝菌生长的影响3 2 p h 6 0 不同葡萄糖浓度对褐环粘盖牛肝菌生长的影响3 3 p h 3 0 不同酒f i 酸铵浓度对褐环粘盖牛肝苗生长的影响3 7 p h 4 0 不同酒右酸铵浓度对褐环糨盖牛肝菌生长的影响3 8 3 4 图3 4 3 5 图3 5 3 6 图3 6 3 7 图3 7 p l i 4 5 不同酒石酸铵浓度对褐环粘盖牛肝菌生跃的影响 p h 5 0 不同酒石酸铵浓度对褐环粘盖牛肝菌生长的影响 p h 5 5 不同酒石酸铵浓度对褐环粘盖牛肝菌生长的影响 p h 6 0 不同酒石酸铵浓度对揭环艳盖牛肝菌生长的影响 3 8 3 8 3 9 3 9 表i 在不同培养基中褐环粘盖牛肝菌日均生长量的差值( 单位：m m d ) 1 l 表2 在含不同蘑菇汁培养基中褐环枯盖牛肝曲日均生长量与菌丝干重和对照的差值1 3 表3 不同松树浸提液培养基中褐环枯盖牛肝菌日均生长量与对照的差值( 单位：m i d ) 1 4 表4 不同松树浸提液培养基中褐环粘盖牛肝菌菌丝干重与对照的差值( 单位：g ) 。1 5 表5 非缓冲液体系不同p l i 条件下褐环粘盖牛肝菌日均生长量差值表( 单位：哪d ) 1 7 表6 非缓冲液体系不同p h 条件下褐环粘盖牛肝菌菌丝干重差值表( 单位：g ) 1 7 表7 液体培养不同p h 条件下菌丝干重差值表1 9 表8 不同p h 和缓冲液浓度处理下的褐环粘盖牛肝菌日平均生长量和菌丝干重2 1 表9p h 与缓冲液浓度对褐环粘盖牛肝茁生长影响的方差分析2 2 表l o 在不同缓冲液体系中褐环粘盖牛肝菌日均生长量差值( 单位：m d ) 2 3 表l l 在不同缓冲液浓度下褐环粘盖牛肝蔼日均生长量的差值( 单位：m d ) 2 4 表1 2 在不同缓冲液浓度下褐环粘盏牛肝菌菌丝干重的差值( 单位：g ) 2 5 表1 3 褐环粘盖牛肝菌日生长量与对照的差值( 单位：m d ) 2 6 表1 4 缓冲液体系不同p h 条件下褐环粘盖牛肝菌日均生长犀的差值( 单位：岫d ) 2 8 表1 5 缓冲液体系不同p 珏条件f 褐环釉盖牛肝菌菌丝干重的差值( 单位：g ) 2 8 表1 6 液体培养菌丝干重差值( 单位：g ) 3 0 表1 7 培养1 4 d 后菌丝干重( 单位：g ) 3 3 表1 8 液体培养菌丝干重( 单位：g ) 3 4 表1 9 培养后基质p l l ，3 5 表2 0 液体培养菡丝色素分泌程度，3 6 表2 l 液体培养葡萄糖消耗率( 单位：) 3 6 袁2 2 培养1 4 d 后菌丝干重( 单位：g ) 3 9 表2 3 液体培养菌丝干重( 单位：g ) 4 0 表2 4 培养后基质p h 4 l 表2 5 液体培养菌丝色泰分泌程度j 4 2 表2 6 液体培养铵消耗率( 单位：) 4 2 表2 7 液体培养葡萄糖消耗率( 单位：) 4 3 魄孤观n忆箸i他眠扼妃钒饥弧乳娩鼢强眠喜飘孤弧觚钆钇融弛 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知。除了文中特别加以标注和致谢盯 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：銎l 盔踅日期： lt 7 2 - o 。7 舌 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期闻论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的棠印件和电 。 子文档，允许论文被查阅和借阔学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印缩印或其他手段保存论文 论文作者签名 指导教师签名 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 褐环粘盖牛肝菌( 曲，船l u t e u s ) 是一种应用价值很大的外生菌根真菌，它 具有拮抗性强、适生范围广、菌根效益显著等特点“1 。自然界大部分植物都有菌根， 有些植物没有菌根就不能生长或生长不好。1 。菌根能代替根毛扩大寄主植物根系的 吸收面积，有效促进植物对土壤营养的吸收”；产生的植物激素、抗生素、酶和挥 发性物质，对植物生长发育及分化起着调控等多重作用；对根部土传病害有屏障 作用，增强寄主植物的抗病性”：能极大提高植物对寒冷、高温、干旱、过湿、高 盐以及含有过量有毒物质等不良环境的适应能力“”，提高新建苗圃、引进树种的 育苗成活率“。 随着人们对外生菌根与植物生长关系的认识不断深入，外生菌根在生态稳定， 农林生产等方面所表现出来的重要性已越来越引起人们的关注，并积极开展对外生 菌根菌应用的研究。主要的应用方式是将外生菌根菌的予实体、菌丝、孢子等制成 菌剂，用于菌根化苗木和大面积造林。其中菌丝是真菌无性繁殖的营养体，具有遗 传性能稳定、不需要经过孢子萌发阶段、能迅速与树木形成菌根等特点1 ，因此对 外生菌根真菌菌丝体菌剂的应用研究最为广泛。国外对外生菌根菌菌丝体菌剂开发 应用较早，8 0 年代初，美国的d a n i e s o n 和b o y l e 用菌丝悬液接种班克松和黑云杉苗木 根系，菌根形成较好。目前，美国已研制成功十几种商业剂型，比较大的菌剂生 产商是p h c 公司和f m a 公司。法国是将菌丝体包埋于海藻胶丸内，形成胶丸菌剂。澳 大利亚也完成了胶丸菌剂生产的工业化技术研究酬。国内对外生菌根真菌菌丝体 菌剂的研究起步较晚，目前正处于发展阶段闫伟等将彩色豆马勃菌丝体粉碎后， 与一定浓度的海藻酸盐溶液混匀，并注入固化剂中固化成型，研制成功了高效胶囊 菌剂。中国林业科学研究院林木菌根研究开发中心8 2 0 世纪8 0 年代以来通过筛选 出适合不同立地条件和树种的优良菌根真菌，已研制成功多种剂型菌根剂，并建立 了我国首条菌根制剂生产线，年产可达1 0 0 0 t 嘲。 外生菌根真菌菌丝体菌剂的生产方式主要有两种，一种是固体培养，另一种是 液体培养。固体培养是指利用自然底物如木质、草质进行固体发酵，其主要特点是 发酵体系没有游离水存在，菌丝的生长是在有足够湿度的固态底物上进行。底物则 既不溶于水，也不悬浮于水中，它不仅起到一个提供碳源、氮源、水分、无机物和 其它营养物的作用，同时也为微生物的生长提供了一个固定的位置。用营养液浸湿 的蛭石和草炭是产生外生菌根真菌菌丝的极好基质。”。中科院沈阳应用生态研究所 和北京林业大学等，先后用棉子壳、麦麸子、木屑、玉米粉等为基质扩大培养菌根 菌，取得了良好效果8 “。液体培养是采用液体基质，通入无菌空气或加以振荡和搅 拌来进行菌丝体的培养。液体培养与固体培养相比有很多优越性：1 ) 生产周期短， 菌种在液体培养下的生长周期一般为l o 1 5 天，而固体培养一般需要3 0 天左右。， 仅发菌时阳j 就比固体培养节省了2 3 1 2 ：2 ) 产量高，在液体深层培养中，菌丝细 2 褐环粘盖牛肝西培养条件的研究 胞能在反应器内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条件下生长，呼吸作用所 产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长分裂迅速，能在短时 间内产生大量的菌丝体；3 ) 菌龄一致，由于固体培养是菌丝在固体基质中蔓延 长成的，这样处于基质顶部和底部的菌丝体菌龄差异较大，往往底部菌丝刚开始生 长，顶部菌丝就已接近老化。而液体培养就不一样，菌种生长发育均匀一致，菌龄 整齐；4 ) 产物易加工，固体培养的菌丝与固体基质紧密结合，不易分离。液体培 养的菌丝取样容易，可以精加工成各种类型菌剂。因此利用液体培养的方法生产外 生菌根真菌菌丝体前景更为广阔。鲁达科夫利用洁净的甘蓝或马铃薯l o o g ，用 1 0 0 0 m l 清水煮沸后过滤其残渣留下汁液并加入0 3 的葡萄糖和微量的维生素b 。，混 匀后经高温灭菌消毒接入菌根菌种进行培养，待菌丝体长好后用消毒研钵碾碎菌丝 体并配制成悬浮液接入通气的液体培养液中进行再次扩大培养，可以获得大量的菌 丝体。”。m a r x 利用m m n 培养液接种菌种，在摇床和发酵罐中进行液体培养，在高强 度通气条件下，菌丝体可大量繁殖“”。童竞心等采用液态通气的方法扩培彩色豆马 勃( p i s o l i t h u st f n e t o r i u s ) 菌丝体，用于接种国外松，取得了较好的效果t 3 3 ) 。 王学聘等对厚环粘盖牛肝菌( 砌j wg r e v i l l e i ) 进行深层发酵培养，认为该菌 具有发酵周期短，生长迅速，易于工业化生产等特点。 但到目前为止，只有少数几个菌种可以通过液体培养的方法生产出菌丝体菌 剂，其主要原因是大多数外生菌根真菌在液体培养的条件下生长缓慢甚至不能生 长，无法繁殖出足够的菌丝体在生产实践中使用“”。外生菌根真菌菌丝体的生长不 仅取决于菌种本身的性能，关键还要赋予它合适的生长条件。因此，在纯培养的条 件下对外生菌根真菌的生长特性进行研究显得尤为重要。根据以往的研究，褐环粘 盖牛肝菌在液体培养的条件生长比较缓慢，所以无法制成菌剂，限制了它的迸一步 应用推广。本论文以固体纯培养和液体纯培养的方法，对褐环粘盖牛肝菌的培养条 件进行了研究，旨在为以后的工业化生产其菌剂提供理论依据。 1 1 真菌培养条件的研究 影响真菌生长的因素主要包括培养基、p h 、种龄等方面，各个影响因素也不是 单一作用，它们之间的关系比较复杂，而且在实际运用当中这些因素还是处于不稳 定的状态。 1 1 1 培养基 培养基是按一定比例配制的多种营养物质混合物，其主要作用可概括为形成结 构( 参与细胞组成) ，提供能量( 机体进行各种生理活动所需要的能量) ，和调节 作用( 构成酶的活性成分和物质运输系统) 。培养基的组成对菌体的生长繁殖、生 物合成都有重要的影响，因此优化培养基是优化真菌培养的首要前提。郭思琪等通 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 过对厚环粘盏牛肝菌的菌种培养基筛选研究表明，适宜厚环乳牛肝菌生长的培养基 组成为：麦芽糖2 9 ，葡萄糖2 9 ，可溶性淀粉2 9 ，硫酸镁0 1 5 9 ，硝酸钙0 1 5 9 ，磷酸 二氢钾0 1 2 5 9 ，水1 0 0 0 m l ”1 。姚庆智等人通过对l l 株外生菌根真菌菌株纯培养营养 生理特性的研究表明，l l 栋外生菌根真菌适宜的基础液体培养基为麦芽汁培养基和 p a c h l e w s k i 培养基。王平章以麦芽为原料制成麦芽汁培养基来培养毕赤酵母 ( p i c h i a p a s t o r i s ) 基因工程菌，其经济效益及产出与投入之比是合成培养基的2 0 0 倍。z h u 等用黑箱模型，设计优化轮枝链霉菌( s t r e p t o v e r t i c i l l i u m ) 的产酶培 养基，使酶活提高了4 倍。培养基的组成成份主要有碳源、氮源、无机盐及微量元 素和生长因子等。 1 1 1 碳源 碳源的主要作用是供给真菌生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成分和代谢 产物中的碳素来源。由于各种真菌的生理特性不同，不同的真菌利用碳源的品种也 不完全相同。常用的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、玉米粉、以及动 植物油脂、矿油、碳氢化合物等。大多数外生菌根真菌可以利用单糖，有一些可以 利用双糖和多糖。p a l m e r 等人研究了粘盖牛肝菌( s u l l l u sb o v i n u s ) 对不同碳源的 利用情况，发现较理想的碳源依次为葡萄糖、甘露糖、木梨糖和麦芽糖，而对甘油 和蔗糖利用效果不理想“”。t o m o y u k i 等通过对十几种牛肝菌的营养特性的研究得出 结论，葡萄糖是这些外生菌根菌普遍利用良好的碳源，并且高浓度的碳源会促进真 菌的生长”。t a k e f u m 等研究了外生菌根真菌将不同脂肪酸和油酸作为碳源的能力， 发现不同菌种对脂肪酸和油酸的利用能力不同。腐生真菌可以通过分泌纤维素酶、 半纤维素酶、淀粉酶等胞外酶分解利用纤维素和木质素，外生菌根真菌由于分泌纤 维素酶的能力较差而普遍不能利用。纤维索酶是一种诱导酶，肖光辉对香菇 ( l e n t i n u se d o d e s ) 的研究发现，培养基加入少量的易利用的碳源如米糠，可逐步 诱导纤维素酶的产生。当培养基中加入少量葡萄糖为起始碳源，黄口蘑可适度利 用纤维素。l a m b 等研究发现，在葡萄糖的存在条件下，一些粘盖牛肝菌可以很好的 利用糨精和可溶性淀粉。碳源浓度对真菌生长的影响极为明显，在一定的浓度范 围之内，菌体生长量随碳源浓度增加而增加，但是碳源浓度过高，渗透压增大会影 响菌体生长。花晓梅对彩色豆马勃的最佳营养源进行了研究，结果表明。彩色豆马 勃的最佳碳源为玉米粉，当浓度为4 时，菌丝干物重最大，当浓度超过4 ，于物重 逐渐下降。另外，碳源浓度过高，会促进真菌分泌酸性物质，使培养基的p h 下降 l 。 1 1 1 2 氮源 氨源是用来合成真菌细胞中的含氮物质的。常用氮源主要分为有机氮源和无机 4 褐环粘盖牛肝露培养条件的研究 氮源。有机氮源除含有丰富的蛋白质和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂 肪、无机盐、维生素及某些生长因子。常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水。真 菌在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝体生长迅速的特点。如大多数 食用菌在有机氮源培养基上生长健壮、速度快，在无机氮源培养基上生长缓慢、细 弱1 。外生菌根真菌对酰胺类的有机氮源利用较好，如谷氨酰胺和门冬酰胺m ，。对 无机氮源中的铵盐利用较好，某些外生菌根真菌非但不能利用硝酸盐，反而会受到 毒害。郭秀珍等从油松上分离的一种牛肝菌和厚环粘盖牛肝菌，对有机氮利用最好， 其次是铵态氮，而对硝态氮的利用最差。”。但有些外生菌根真菌对硝酸盐的利用效 果与铵盐一样，如外生菌根真菌白毒伞( a m a n i t av e r n a ) ，磷酸氢二铵和硝酸钾是 其生长的最好氮源1 。t i b b e t t 分析了外生菌根真菌h e b e l o m a 印p 在无机氮源和有机 氮源的生长时发现大部分株系在有机氮源即谷氨酸生长要优于无机氮w 。 a b u z i n a d a h 等以有机氮源作为外生菌根真菌的氮源研究发现，不同的外生菌根真菌 对不同形式的有机氮源的吸收利用存在很大差异，有的真菌能在蛋白质和多肽上生 长，有的则生长较弱“”。真菌对无机氮源的利用迅速，菌丝生长启动较快，以后的 生长比较平缓；在有机氮源上生长的真菌菌丝启动较慢，但能保持较长的高生长率 时期。因此，在真菌培养的研究当中，很多都利用无机氮源和有机氮源按一定比例 配制的复合氮源作为真菌生长的氮源。如花晓梅等的研究结果表明，以蛋白胨和氯 化铵组成的复合氮源培养彩色豆马勃菌丝体，菌丝体的生长势要优于单一氮源。 一般来说，氮源浓度与真菌的生长有很大关系，氮源浓度高，菌丝体生长旺盛，但 会使培养基p h 偏高，氮源浓度过低，则菌丝体繁殖量少。d i c k i e 等在不同浓度的蛋 白质培养基上对彩色豆马勃等7 种真菌实验证实，供试的7 种真菌中有5 种在高浓度氮 上生长很好，有1 种在低浓度上生长很好，有1 种没有差别。”。此外，c o l p a e r t 研究 认为，真菌氮的代谢可能与p h 值有关，因为在不同的p h 值时真菌a m a n i t am u s c a r i a 表现出不同的蛋白酶形态c s ”。 1 1 1 3 无机盐及微量元素 无机盐为真菌生长、发育代谢所不可缺少的重要营养元素。它们参与真菌细胞 的合成、辅酶代谢、能量转移，作为酶的激活剂控制原生质的物理性质和细胞的渗 透性，在菌体与培养基之间起重要的缓冲和调节作用。一般真菌所需要的无机盐包 括硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁化合物等。外生菌根真菌对磷酸盐的需 要量较大，但培养基中磷酸盐浓度过高同样会对菌根真菌的生长产生抑制m ，。袁玲 等通过研究钾离子对外生菌根真菌菌丝生长的作用时发现，液体培养基中的钾离子 会影响真菌分泌酸性物质和对其他养分的吸收利用”。n a g a r a j a n 指出，适量的钠 盐对菌根真菌细胞质代谢有促进作用“”。b l o m b e r g 则发现，在0 0 5 m o l l 一0 2 m o l l 之日j ，钠盐抑制了菌根真菌菌丝酶的活动“”。 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 微量元素包括铜、锰、锌、铁、钴、铝、碘、溴等，它们多数是辅酶的成分， 参与酶蛋白的合成，是酶的激活剂。如二价铁离子对克雷伯氏菌( 1 ( a b s i e l a o x y a c a ) 的1 。3 一丙二醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶都有激活作用。外生菌根真菌等 大型真菌对微量元素的需求量很少，浓度过高反而会影响其新陈代谢，导致菌丝的 生长不良。白淑兰等通过微肥对菌根真菌菌丝体的生长的研究发现，浓度为0 0 1 的n a ：甄0 ，对外生菌根真菌l a c c a t a 的菌丝体生长有促进作用，其它浓度的n a ：b ，西 以及m n s 0 4 、z n s 仉、( n h 。) 枷0 ，对l a c c a 招均有抑制作用”1 。 1 1 1 4 生长因子 生长因子指那些微生物生长所必需的而且需求量很小，但微生物自身不能合成 或合成量不足以满足机体生长需要的有机物，根据据化学结构与功能可分为三大类： 维生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶。很多外生菌根真菌真菌对生长因子是异养的，例如 牛肝菌( b o e t u s ) 在生长中就需要维生素b 。和维生素b 2 ，黄色须腹茵( r h i z o p o g o n l u t e o l u s ) 在生长中需要肌醇，土生空团菌( c e d o c o c c u mg e o p h i l u m ) 需要维生素 h 【3 1 1 。但生长因子超过一定浓度时，就会抑制真菌的生长。k a h l o s 报道说，在麦芽汁 和固体培养基中分别加入丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和丝氨酸， 当浓度为0 1 9 l 时，除了在麦芽培养基中的甲硫氨酸外，其它所有氨基酸均促进了 桦褐孔菌( n o n o t u so b i q u u s ) 菌丝体生长。在浓度为0 9 9 l 时，在固体培养基中 的所有氨基酸均减缓了该菌的生长。甲硫氨酸有最强的生长抑制作用。 1 1 1 5 添加物 在微生物工业中，为了进一步大幅度提高发酵产率，培养基中除了碳源、氮源、 无机盐、生长因子等成分外，考虑到代谢控制的方面，还需要添加某些特殊功用的 物质。例如，在博莱霉素发酵培养基中加入前体物质天然或非天然博莱霉素的末端 胺，可以抑制其它天然博莱霉素的生成，并生成包含该种末端胺的新的博莱霉素产 物“”。有研究表明，同样存在着某些物质对真菌的生长分化起着特殊作用。杜爱玲 等在研究覆土对双孢蘑菇( a g a r f c u s b i s p o r a s s i m b a c h ) 子实体形成作用时，发现 双孢蘑菇栽培必须覆土才能形成子实体，从而推定覆土层中的微生物或其它未知因 子对蘑菇菌丝体生长和子实体形成有影响。佟丽华发现某些伴生菌或其培养液的 有机溶剂提取物对牛肝菌菌丝体生长具有明显促进作用旧1 。f r i e s 认为红酵母和宿主 植物根系浸出物是引发菌根真菌孢子活化因子”1 。许旭萍等研究发现，红菇 ( r u s s u 肠s p p ) 在人工培养条件下虽然能够进行组织分离而获得纯培养菌株，但 其孢子却难以发芽，野生条件下，植物根系分泌物对红菇孢子的萌发有刺激作用， 可在野生条件下逐步发育成子实体1 。因此，开展微生物提取物、寄主植物提取物 和土壤提取物对外生菌根真菌菌丝体生长影响的研究，并分析其中的各种促进和抑 6 褐环粘盖牛肝菌培养条件的研究 制因子，也是研究外生菌根真菌菌丝生长条件的条途径。 1 1 2p h 真菌生长的最适p h 范围一般在j 一8 之间。”，过高或过低的p h 对大多数真菌都有 害，但酵母菌中有些种类如椭圆酵母( s a e c h a r o m y c e se l l i p s o i d e u s ) 和酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y e e sc e r e v i s i a e ) 最低可分别在p h 2 5 和p h i 9 中生长1 。大部分外生 菌根真菌的最适p h 在4 - 6 ，有一些菌根真菌中性或微碱性条件下生长较好。s a n c h e z 等发现，供试的大部分菌根真菌在p h 为2 5 时，生物量最小1 。y a m a n k a 认为所研究 的外生菌根真菌的最佳p h 生长环境为5 6 ”1 。姚庆智等对1 1 种外生菌根真菌的最适p h 进行了研究，结果表明这1 1 种外生菌根真菌适宜p h 值为6 - 7 “1 。p h 也会对真菌的酶活 产生影响，从而改变真菌的代谢途径，如黑瞳霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 在p h 2 3 时 合成柠檬酸，在p h 接近中性时积累草酸。谷氨酸生产菌在中性和微碱条件下积累谷 氨酸，在酸性条件下形成谷氨酰胺”。大多数真菌能分解糖，产生酸性物质，造成 环境的p h 值下降，少数真菌能分解尿素成氨，使环境p h 值上升，蛋白质脱羧产胺反 应也会使p h 值上升”，外生菌根真菌在生长过程中会分泌有机酸如柠檬酸、草酸、 甲酸等，使周围环境p h 大幅度下降。所以说，真菌的代谢活动会改变环境的p h 值。 p h 的变化对真菌生长的影响也很大，m y u 报道说，p h 的降低会抑制尼p n e u m n i n a 合n 成 2 ，3 一丁二醇”。h e b b a r 等研究认为将培养基的p h 由7 0 调至1 0 0 ，镰孢菌( f u s a r i u m ) 产生的厚垣孢子的成活率会大大提高“”。c o l l n i g 等人发现黄曲霉( a s p e r g t l l u s f l a v u s ) 的细胞壁厚随p h 的增加而减小，其菌丝在p h 为6 o m j - 为2 - 3um ，在p h 为7 4 为2 一1 8um 1 。因此必须掌握真菌生长过程中p h 变化规律，使它处于菌体生长最佳状 态。在工业发酵中，可以通过流加酸、碱或补料的方式来控$ 1 j p h ，而在实验室条件 下首要的控制方法是调整培养基配方和添加缓冲体系。添加缓冲体系比较直接有效， 但选择了不适当的缓冲体系也会带来负作用。比如尹艳丽等研究了不同摇瓶条件对 侧耳菌( p l e u r o t u ss p o ) 的生长及漆酶分泌的影响时发现，用硫酸调p h 时的漆酶活 力和生物量要高于缓冲液体系调节p h 的结果“”。 1 1 3 种龄 在对真菌的研究当中，需要将真菌逐级扩大繁殖，用于扩繁的起始菌种称为种 子，种子培养时| b j 称为种龄。由于真菌在生长过程中，不同生长阶段的生理活性差 别很大，种龄的研究就极为重要。在种子培养过程中，随着培养时间的延长，菌体 量逐渐增加。但是菌体繁殖到一定程度，由于营养物质消耗和代谢产物的积累，菌 体量不再继续增加，而是逐渐趋于老化。一般以菌体处于生命力极为旺盛的对数生 长中后期为宜，此时的种子活力高，接入培养基后能较快地进入对数生长，有利于 缩短培养周期。若种子培养不完全就接入培养基，往往出现前期生长缓慢，导致培 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 养周期延长，接入过老的种子，由于菌体活力不够，会引起产能下降和菌体过早衰 老、自溶。杨梅等人研究了白背木耳深层培养条件，认为最佳种子培养周期为5 d ， 周期过长或过短，都会使菌丝生物量下降”。 1 2 本研究的目的与主要内容 褐环粘盖牛肝菌是一种优良的外生菌根真菌。在对该菌最适p h 的研究中，不同 的研究者所得到的研究结果不一致，而且所采用的研究方法几乎都是每次改变一个 因素的单次单因子法，这种方法不能考察各因素之间的交互作用，这就使得在每个 因素的最佳实验点的操作条件下，通常得不到预期的实验效果。本研究利用缓冲液 体系对褐环粘盖牛肝菌的生长最佳p h 进行了研究，并对培养过程中的影响因素p h 和 碳、氮源浓度间的协同作用进行了初步探讨，为以后的深入研究做了基础工作。主 要的研究内容有： 1 ) 筛选出了褐环粘盖牛肝菌生长的最佳基础培养基； 2 ) 研究了种龄对褐环粘盖牛肝菌生长影响： 3 ) 研究了2 1 种添加物对褐环粘盖牛肝菌生长的影响； 4 ) 首先以缓冲液体系研究t p h 对褐环粘盖牛肝菌生长的影响，然后通过筛选缓冲液 和缓冲液浓度确定了最佳缓冲液体系，最后通过最佳缓冲液体系得到了褐环粘盖牛 肝菌生长的最佳p h ； 5 ) 在不同的p h 条件下分别研究了碳、氮源浓度对褐环粘盏牛肝菌生理生长的影响， 并得出了其生长的最佳碳、氮源浓度。 2 材料与方法 2 1 供试菌种 褐环粘盖牛肝菌，由内蒙古农业大学林学院菌根技术研究室提供。 2 2 试验方法 2 2 1 固体培养 选用培养了6 8 d 的菌种，接入供试固体培养基，2 5 恒温培养。每隔2 d 用游 标卡尺测量相互垂直两个方向的菌落直径，取平均值。培养1 4 d 后，将固体培养基 加适量水加热熔解，过滤后，用蒸馏水清洗3 次，然后收集菌丝。收集的菌丝于6 0 。c 烘干，万分之一分析天平测干物重。每个试验重复4 次。 2 2 2 液体培养 选用培养了6 8 d 的菌种，从上切取一圆形菌块接入液体培养基中，装液量为 1 0 m l 1 0 0 m l 2 5 ( 2 恒温静置培养。培养1 4 d 后，滤出液体培养基中的菌丝，蒸馏水 8 褐环粘盖牛肝菌培养条件的研究 冲洗三次，6 0 。c 烘干，万分之一分析天平称重。培养后的培养液分别用p h s 一3 b 精密 p h 计测定p h 、用w f z 8 0 0 一d 3 a 型分光光度计处测0 d 。；，。以显示色素分泌程度、用砷 钼酸比色法”1 测定残糖、用纳氏比色法”测定残氮。每个试验重复3 次。 2 3 试验设计 2 3 1 基础培养基的筛选 根据相关文献，选用p a c h 、m m n 、m m 、综合p d a 和蛋白胨酵母膏五种培养基， 分别配制固体培养基，p h 调至5 5 。接种后2 5 c 下培养，以菌丝的日均生长量为指 标，寻找适合褐环粘盖牛肝菌生长的基础培养基。 2 3 2 菌种种龄与活力试验 分别将培养了4 、6 、8 、1 0 、1 2 、1 4 d 的菌落作为起始菌种接种于p h 5 5 的p a c h 固体培养基上，接种后2 5 。c 下培养，以此研究种龄与生长状况之间的关系。 2 3 3 添加物试验 2 3 3 1 蘑菇汁褐环粘盖牛肝菌生长的影响 将平菇( p 1 e u r o t u s o s t r e a t u s ) 、香菇( l e n t i n u se d o d e s ) 、鸡腿菇( c o p r i n u s c o m a t u s ) 、双孢菇( a g r i c a sb i s p o r u s ) 、蟹味菇( h y p s i z y g u s m a m m o r e u s b y g e i o 枋、 金针菇( 用a 册j j 加v e u t l p e s ) 榨汁，3 0 0 0 转m i n 离心2 0 m i n ，取上清液灭菌， 按1 0 的体积比加入到p 8 c h 培养基中，p h 调至5 0 ，制成固体培养基，接种后在2 5 下培养。观察不同蘑菇汁对褐环粘盖牛肝菌生长的影响。 2 3 3 2 松树叶、枝、根的浸提液对褐环粘盖牛肝菌生长的影响 分别选取油松( p i n u st a b 以a e f o r m i sc a r t ) 、白杆( 丹c e am e y e r ) 、侧柏 ( p 1 a t y c a d u ss p a e h ) 、杜松( j u n l p e rb e r r y ) 、圆柏( s a b y n a 彪- - ) 的松叶、 松枝和松根各l o g ，l l o 灭活后8 0 烘干1 2 h ，捣碎加入l o o m l 蒸馏水。煮沸浸提 4 0 m i n 后过滤，将滤液按体积比1 0 力1 入到p a c h 培养基中，p h 调至5 0 ，制成固体 培养基，接种后在2 5 下培养。观察不同松树浸提液对褐环粘盖牛肝菌生长的影响。 2 3 4p h 和缓冲液体系对褐环粘盖牛肝菌的影响 2 3 4 1 非缓冲体系下p h 对褐环粘盖牛肝菌生长的影响 以p a c h 培养基为基础培养基。用l m o l l 的k o h 和h c l 将p h 分别调节到3 0 、 4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、7 0 、8 0 ，分别制成固体和液体培养基，接种后在2 5 下培养。 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 2 3 4 2 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液体系下褐环粘盖牛肝菌的生长情况 用柠檬酸和柠檬酸钠配制成p h 4 5 、5 0 和6 0 的缓冲液，以1 5 、3 0 、4 5 、6 0 的体积比加入到p a c h 培养基中，制成固体培养基，接种后2 5 ( 2 下培养。 2 3 4 3 适宜缓冲液体系的研究 分别配制p h 4 5 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸一氢氧化钠一盐酸缓冲液、柠 檬酸一磷酸氢二钾缓冲液和乙酸一乙酸钠缓冲液，以体积浓度4 0 加入到p a c h 培养基 中，以酸碱调节p h 的培养基为对照，分别配制成固体培养基，接种后2 5 下培养。 以菌丝生长量为指标来确定最佳缓冲液。 将最佳缓冲液配制成p h 4 5 的缓冲液，以体