（环境科学专业论文）喹诺酮类抗生素与生物大分子的相互作用的荧光法研究.pdf

消化酶的成键类型与结合的位点数。 本文利用荧光共振能量转移光谱法建立了一个新的荧光共振能量转移体 系，在z z x k e m = 4 0 0 5 3 0 n m ，0 1 m o l l 的 i r i s h c i 溶液( p h = 7 0 ) ，异硫氰酸荧 光素和罗丹明6 g 能够发生有效的荧光共振能量转移，使得罗丹明6 g 荧光大大 增强，同时异硫氰酸荧光素的荧光猝灭而b s a 的加入使得罗丹明6 g 的荧光强 度减弱并且b s a 的加入量与体系的帆昱良好的线性关系，由此建立了一 种新的测定的b s a 的方法。研究结果表明，b s a 的含量在1 0 m g l - - 3 5 m g l 范围内与染料的荧光强度减弱程度呈良好的线性关系，方法最低检出限为 9 5 m g l ；该法用于合成样中b s a 的测定，回收率为9 6 5 。 本文同样建立了以罗丹明1 2 3 和罗丹明b 染料对为供受体的新的荧光共 振能量转移体系，在该体系中加入b s a ，发现在加入b s a 后罗丹明1 2 3 和罗 丹明b 的荧光强度都明显降低，且b s a 的加入量与罗丹明1 2 3 和罗丹明b 体 系的荧光猝灭程度呈良好的线性关系据此提出了罗丹明1 2 3 和罗丹明b 能 量转移体系测定b s a 的新方法。实验表明，在沁x 沁m = 4 7 8 5 8 0n m ，0 1 m o l l 的t d s h c i 溶液( p h = 7 0 ) t r i s 溶液( p h = 7 o ) 存在下，罗丹明1 2 3 和罗丹 明b 能够发生有效的荧光共振能量转移。b s a 含量8 m g m l 2 3 m g m l 的范围 内与体系猝灭程度呈良好的线性关系，方法的最低检出限为8 6 m g m l 应用该 体系测定了合成样中的b s a 含量，回收率达到9 2 3 。 本文运用分子荧光光谱法的荧光猝灭理论初步探索了喹诺酮类抗生素与 生物大分子结合反应的化学机理，为其毒理分析做了一些基础研究工作，为寻 找测定抗生素的光谱探针提供了理论依据。同时本文还研究了荧光共振能量转 移光谱法在保持活性的生物大分子测定中的应用，本文建立的这些新方法灵敏 度高、选择性好、简便快速，成本低廉，具有实际应用价值，同时也对新方法 的作用机理进行了探讨。 关键词：分子荧光光谱法；荧光猝灭；荧光共振能量转移光谱法；异硫氰 酸荧光素；罗丹明b ；罗丹明1 2 3 ：罗丹明6 g ；胰蛋白酶：胃蛋白酶；氧氟沙 星；依诺沙星；乳酸左氧氟沙星；喹诺酮 t h ef l u o r e s c e n c es t u d yo nt h e r e c i p r o c i t i e sb e t w e e n t h eq u i n o l o n e sa n t i b i o t i c sa n d b i o l o g i c a lm o l e c u l e s m a j o r ：e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e p o s t g r a d u a t e ：k u n t u t o r ：l is h u w e i i nr e c e n ty e a r s ，t h ep r o b l e mc a u s e db yt h ea n t i b i o t i c sa b u s eh a sb e e nm o r ea n d m o r es e r i o u s t h ei n f l u e n c e so ft h ev e s t i g t a la n t i b i o t i c s i ne n v i r o n m e n to n o r g a n i s mh a v eb e c o m et h ei m p o r t a n ta s p e c tt or e s e a r c h s p e c i a l l y ，t h es t u d yf r o m m o l e c u l ev i e wi sf e w t h et h r e ek i n d so fm o l e c u l a re m i s s i o n s p e c t r o s c o p y , t h es y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e ，t h e f l u o r e s c e n c eq u e e n c h i n ge m i s s i o ns p e c t r o s c o p ya n dt h ef l u o r e s c e n c er e s o n a n c ge n e r g yt r a n s f e r , w e l r gu s e dt or e s e a r c ht h er e c i p r o c i t ym e c h a n i s mb e t w e e nt h e v e s t i g t a la n t i b i o t i c si n e n v i r o n m e n ta n dt h e d i g e s t i v ef e r m e n t sw h i c hp l a yt h ei m p o r t a n tp a r ti nt h e d i g e s t i v es y s t e m t h et h e o r yd a t ao nt h ec o m b i n a t i o no ft h eq u i n o l o n e sa n t i b i o t i c sa n d b i o l o g i c a lm o l e c u l e sw a sg o t t e n ，w h i c ha f f o r d e dt h et h e o r yb a s i sf o r t h en e x tr e s e a r c h w h i c hw o u l db eo nt h ei n f l u e n c e so nt h eo r g a n i s mf r o ma n t i b i o t i c sa n dt h e c o m b i n a t i o no fn e wt y p e e n v i r o n m e n t f r i e n d l y a n t i b i o t i c s t h ec h a r a c t e ro f b i o l o g i c a lm o l e c u l e st oc o m b i n ew i t ht h em o l e c u l ee m i t t i n gp r o b ew a sa l s ou s e dt o b u i l dan e wd e t e r m i n a t i o n ，t h a tm a d es o m ed o n a t i o nf o rt h er e s e a r c hf r o m m i c r o s c o p i cv i e wi ne n v i r o n m e n t w h a tw eu s e di nt h i sp a p e rw a st h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gt h e o r y , f r e tt h e o r yi n m o l e c u l ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n dt h ee n o x a c i n ，o f l o x a c i na n dl e v o f l o x a c i n l a c t a t ea st h er e p r e s e n to ft h eo u i n o l o n e sa n t i b i o t i c s t h er e c i p r o c i t yb e t w e e nt h e ma n d d i g e s t i v ef e r m e n t sw a ss t u d i e du n d e rt h el a bc o n d i t i o n s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tw h e n m a i n t a i n i n gt h ec o n s i s t e n td e n s i t i e so fd i g e s t i v ef e r m e n t s ，t h ei n t e n s i t i e so ft h e i re n d o g e n s i s f l u o r e s c e n c ef e l lr e g u l a r l ya st h ei n c r e a s eo ft h eo u i n o l o n e sa n t i b i o t i c s c o n s i s t e n c i e s ，w h i c h t h ed e n s i t i e so fo f l xa n dl o f li n c r e a s e dr e g u l a r l yw h i l et h eo n eo fe n xm a i n t a i n e d i t w a sc o n c l u d e dt h a tt h eq u i n o l o n e sa n t i b i o t i c sr e a c t e dw i t ht h et r ya n dt y rr e s i d u e sa n dt h e n e wr i g i dm o l e c u l ef o r m e db e t w e e nt h eo f l x ，t h el o f la n dt h ef e r m e n t st om a k et h e p h e n o m e n o no ff r e th a p p e n e d t h ef u r t h e rr e s e a r c hb yt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gt h e o r y s h o w e dt h a tt h er e c i p r o c i t i e so ft h eq u i n o l o n e sa n t i b i o t i c sa n dt h ef e r m e n t sb e l o n g st ot h e s t a t i cq u e n c h i n g ，t h ec o m b i n i n gn u m b e ro fl o c u sa n dt h et y p eo ft h eb o n d i n gw e r ec a l c u l a t e d c o m b i n e dw i t ht h ef r e ta n dc h e m i c a lt h e r m o d y n a m i c st h e o r y an e wf r e ts y s t e mw a sb u i l tb y u s i n ge n e r g yt r a n s f e rf r o mf i t ct o r h o d a m i n e6 g i tw a sf o u n dt h a ta tt h ec o n d i t i o no fx e x l e m = 4 0 0 n m 5 3 0 n ma n d 0 1 m o l lt n s ( p h - - 7 o ) ，t h ee f f e c t i v ee n e r g yt r a n s f e rc o u l do c c i l rb e t w e e nf i t c a n dr h o d a m i n6 g n ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ff i t cr e d u c e da n dr h 6 gw a s s t r e n g t h e na tt h es a m et i m e b u ti fa d d i n gt h eb s a t ot h i ss y s t e m ，t h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t i e so fr h 6 gr e d u c e d s ot h i ss y s t e mo ff l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e rw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fb s a n ed e t e c t i o nl i m i to ft h i s m e t h o dw a s9 5 m g 儿n er a n g eo fd e t e r m i n a t i o nf o rn i t r i t ew a s1 0 - 3 5 m g ln e r e c o v e r i e sw e r e9 6 5 t h em e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fb s a i nm i x e ds a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s a n o t h e rn e wf r e ts y s t e mw a sb u i l ta l s ob yu s i n ge n e r g yt r a n s f e rf r o m r h o d a m i n e1 2 3t or h o d a m i n eb i tw a sf o u n dt h a ta tt h ec o n d i t i o no f k e x x e m = 4 7 8 n m 5 8 0 n ma n d0 1 m o l lt r i s ( p h - - 7 o ) ，t h ee f f e c t i v ee n e r g yt r a n s f e r c o u l do c c u rb e t w e e nr h l 2 3a n dr h b t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fr h l 2 3r e d u c e d a n dr h bw a ss t r e n g t h e na tt h es a m et i m e b u ti fa d d i n gt h eb s at ot h i ss y s t e m ， b o t l lo ft h e i rf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e sr e d u c e d s ot h i ss y s t e mo ff l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fb s 八n ed e t e c t i o n l i m i to ft h i sm e t h o dw a s8 6 m g l n er a n g eo fd e t e r m i n a t i o nf o rn i t r i t ew a s8 2 3 m g 几1 n h er e c o v e r i e s w e r e9 2 3 n em e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fb s ai nm i x e ds a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h ec h e m i c a lm e c h a n i s mo ft h er e c i p r o c i t i e sb e t w e e nt h eo u i n o l o n e sa n t i b i o t i c s a n dt h ef e r m e n t sw a ss t u d i e di n i t i a l l yw i t ht h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g t h e o r y i nt h i sp a p e rt h e b a s i cr e s e a r c hw o r kw a sd o n ea n da f f o r d e dt h et h e o r yb a s i sf o rt h en e w p r o b et ot b ea n t i b i o t i c s m e t i m ew ea l s os t u d i e dt h ea p p l i c a t i o no ft h ef r e ti nt h ed e t e r m i n a t i o no fb i o l o g i c a l o r g a n i s mm a i n t a i n i n gt h e i rb i o l o g i c a lc h a r a c t e r s t h es y s t e m sb u i l ti nt h i sp a p e rh a v et h e p r a c t i c a la p p l i c a t i o n v a l u ew h i c ha r e s e n s i t i v e ，w e l l - s e l e c t i n g ，c o n v e n i e n t ， i n e x p e n s i v e t h em e c h a n i s mo ft h en e w m e t h o d sw a sa l s os t u d i e d k e yw o r d s ：m o l e c u l ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ；f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ； f l u o r e s c e n c er e s o n a n c e t r a n s f e r ；f i t c ；r h o d a m i n eb ；r h o d a m i n e1 2 3 ； r h o d a m i n e6 g ；t r y p s i n e ；p e p s i n e ；e n o x a c i n ；o f l o x a c i n ；l e v o f l o x a c i n ；q u i n o l o n e s 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师奎挝佳指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印 刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库供 检索；2 ) 为教学、科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论文或解密 后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在有关网络上供阅读、浏览。 砷 月1 日 名 4 糙 年 作 文 加 论 ，br_!l ” 童 喹诺酮类抗生素与生物大分了的棚互作用的荧光法研究 1 前言 在漫长的医药发展史中，抗生素的使用对于挽救生命，减轻人们的痛苦可 谓功不可没。然而随着科技进步使抗生素更新换代和广泛的临床应用，其缺陷 也逐渐暴露出来。 整体来看，由于缺乏对于抗生素环境污染的相应重视，各国至今滥用抗生 素的现象仍然比较普：欧盟和瑞士每年约有5 4 6 t 抗生素用于人类，3 4 6 t 用于 动物健康【l 】，美国2 0 0 0 年大约使用了1 6 2 t 抗生素，全球抗生素的使用量估计 为1 0 0 0 2 0 0 0 t 2 1 ，我国亦是滥用抗生素最为严重的国家之一【3 1 。加之传统的 生物处理程序无法将其有效分解，致使大量的抗生素穿透污水处理系统而进入 水环境体系，再经由生物累积扩大效应而至整个生物圈，这就又给长期食用此 类食物的人们的健康带来了极大的潜在威胁，大量抗生素富集体内可以使人体 器官受损，破坏人体正常菌群，使病菌耐药性增强【4 】。据调查，我国每年有8 万人死于抗生素滥用。虽然国家加大了广谱抗生素类用药的监管力度，但收效 不尽人意。因此包括喹诺酮类药物在内的常用广谱抗生素己被列入新兴环境有 机污染物之列，并引起越来越多的研究者的重视。 目前对于抗生素残留的调查及残留物的转移和消除过程已有相关报道，但 是有关抗生素对环境、生物及生态系统的影响研究很少。虽然实验室中关于抗 生素对细菌的毒力已做了大量研究，但是由于抗生素对于大型生物体的具体影 响更多的体现在分子层面，这些影响在普通的毒理实验中较难观察到现象的产 生，因此抗生素污染对生物体的确切影响至今尚未明了【5 | 。所以，从分子层面 阐述抗生素对于生物体的影响也成为缓解抗生素污染，环境修复研究的重要方 面。 今天，抗生素( a n t i b i o t i c s ) 家族已发展到几千种，根据化学结构一般分 为6 类，它们分别是b 内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、大环 内酯类和喹诺酮类。其中的喹诺酮类药物( q u i n o l o n e s ) 由于出色的广谱抗菌 效果而在农、畜牧业及临床治疗中被广泛的用来抑制病菌生长，治疗细菌感染 性疾病【6 1 ，同时，也是造成目前抗生素污染的主要污染物之一川。因而本论文 选取其作为主要研究对象。 喹诺酮类抗生素类药物发展至已经历了四代。其中，第三代的氟喹喏酮类 喹诺酮类抗生素与生物大分子的相互作用的荧光法研究 药物由于其宽抗菌谱、使用方便、成本低廉、疗效显著等特点，几乎适用于临 床常见的各种细菌感染性疾病，是临床治疗细菌感染性疾病的主要药物，故成 为化学合成抗感染药物中发展最为迅速的一类。由于它的作用机制为抑制 d n a 旋转酶，影响d n a 的正常形态与功能，阻碍d n a 的正常复制、转录、 转运与重组，从而产生快速杀菌作用。因此，此类抗生素对于正常生物体中的 d n a 等生物大分子的毒理作用就成为人们研究的重要方向之一。 生物体内的生物大分子含量大，种类繁多，是生物体赖以生存的生命物质。 本文选取生物体主要消化器官中的消化酶胃蛋白酶和胰蛋白酶作为研究 对象，尝试从分子层面研究它们与抗生素的相互作用机理，探索行之有效的研 究手段，为后续抗生素的毒理研究及开发新的生物友好型抗生素提供数据基 础。 本论文所进行的实验研究主要采用分子发光光谱技术中的荧光共振能量 转移法，同步荧光法和荧光猝灭法，结合静态、动态猝灭理论对抗生素与生物 大分子的相互作用机理进行研究。 分子发光光谱是- a - 发展迅速、应用广泛、多学科综合性的光谱技术，其 包括分子荧光、分子磷光、化学发光、生物发光等光谱技术。八十年代以来， 分子发光光谱发展非常迅速，因其具有灵敏度高、选择性好、简便快速等优点 已成为重要的分析手段。九十年代中期，荧光共振能量转移光谱法、荧光猝灭 法、共振光散射光谱法相继被应用于生物与环境分析中，得到了很多污染物质 测定的重要方法。 1 9 9 9 年本实验室结合比浊法和共振光散射光谱法的基本原理，提出了一 种用共振光散射技术作为检测手段的新光谱分析方法一共振光散射比浊法，丰 富了分子发光光谱的研究内容。此后，我们探索了荧光法在环境科学其他领域 的应用并取得了一定的成效。 本论文沿承实本验室的科研方向，经自选后确定了本论文的研究内容，以 生物大分子与环境残留抗生素的作用为主要方向，从分子层面探明了胰蛋白 酶、胃蛋白酶与喹诺酮类抗生素中常用的氧氟沙星、左氧氟沙星、依诺沙星的 相互作用过程，以荧光光谱法为手段讨论了喹诺酮类抗生素与两种消化道酶荧 光猝灭的机理，分析了胰蛋白酶在与抗生素分子作用后其构象的变化，进而通 喹诺酮类抗生素与生物人分子的相互作用的荧光法研究 过荧光共振能量转移理论与生物大分子的猝灭理论综合得出了两种消化道酶 与喹诺酮类抗生素的反应类型、结合数、平衡常数、结合位点、作用距离等数 据，为探寻抗生素在生物体内的毒理过程提供了一定的理论依据。 一 其次，将荧光共振能量转移体系应用于生物大分子的测定，筛选了新的荧 光共振能量转移染料对异硫氰酸荧光素一罗丹明6 g 和罗丹明1 2 3 一罗丹明b ， 使用这些染料对分别建立了测定牛血清白蛋白的新方法。应用荧光共振能量转 移体系来测定生物大分子具有不破坏其生物活性、灵敏度高、选择性好、简便 快速的优点。为今后研究环境有机污染物对于大型生物的毒理分析提供了良好 的手段。 本文研究目的主要目的： ( 1 ) 从分子层面研究当环境残留抗生素与消化系统中的重要生物大分子 所发生的相互作用过程，初步分析其化学机理，为抗生素的毒理分子建立基础 理论数据； ( 2 ) 在保持生物大分子的活性的基础上，建立灵敏度高、可靠性好的检 测方法，以用于后续的对环境残留抗生素在生物体中的毒理分析。 本课题将分子发光光谱的几种手段应用到生物分析和环境分析领域，解决 了一些重要的分析中的问题，展现了良好的发展前景。 喹诺酮类抗生索与生物大分了的相互作用的荧光法研究 2 概述 2 1 环境残留抗生素概述 2 1 1 环境残留抗生素发展概述 抗生素( a n t i b i o t i c s ) 又称抗菌素，是指某些微生物的代谢中所产生的 化学物质，这些物质在很低的浓度下可以抑制或杀死其他微生物，而对宿主不 会产生严重的毒性l 引。通过抑制病原体微生物细胞壁、细胞膜、蛋白质的合成， 核糖核酸和脱氧核糖核酸的转录复制，抗代谢溶菌酶的形成而起到作用。2 0 世纪末抗病毒抗生素的筛选取得了突破性进展，如放线菌产生的o x t a n o c i n ， 其结构为腺嘌呤与四元环的新糖组成的核苷【9 1 。另外通过生物及化学方法修饰 开发已有的抗生素而获得新的抗菌活性方面也有极大的进展，如g o k a h a l e 等 通过操纵非核糖体多肽合成酶得到了新的肽类抗生素l 加】：g e 等通过修饰万古 霉素( v a n c o m y c i n ) 的糖链而得到的衍生物1 1 1 】。 2 1 2 环境残留抗生素的分类 常用的抗生素一般按化学结构的不同分成如下几类：b 一内酰胺类、四环素 类、氨基糖苷类、大环内酯类、氟喹诺酮类等1 1 2 。 b 内酰胺类抗生素是分子中含有一个四元的b 内酰胺环的药物。按作用机 理又可以分为两类：青霉素类和头孢菌素类。青霉素类抗生素是由青霉素g 发展起来的，是一类高效低毒的抗生素；头孢菌素类抗生素为化学方法裂解头 孢菌素c 而得到的7 一氨基头孢烷酸( 7 - a m i n o c e p h a l o s p o r a n i c a c i d ，7 a c a ) 的 衍生物，其抗菌谱广，临床上已广泛应用| 1 3 1 。 四环素类药物是一类母体为菲烷结构但取代基不同的抗生素，分子中含酚 羟基和烯酸型羟基，显弱酸性，同时含有二甲胺性，故为两性化合物，能溶于 碱性和酸性溶液中。由于毒副作现在只有少量仍在使用中，如四环素、会霉素、 土霉素素等【1 4 j 。 氨基糖苷类抗生素是指含有氨基糖的一类糖苷物质，由于他们都含有氨基 环醇的结构，又称为氨基环醇类抗生素。他们都是脱氧链霉胺 ( d e o x y s t r e p t a m i n e ) 与不同的氨基糖缩合而成的苷，因含有氨基或其他碱性 喹诺酮类抗生索与生物大分子的相互作用的荧光法研究 基团，故都呈碱性，可与酸性基团的某些物质形成离子缔合物。目前用于临床 的主要是卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素和链霉素及其衍生物的硫酸 盐等。 大环内脂类抗生素( m a c r o l i d ea n t i b i o t i c s ，m a l s ) 是由链霉菌属产生的结 构相似的天然抗生素，它们由十二元、十四元或十六元内酯环作为母核，连有 两个分子糖和一分子氨基糖苷。其代表药物有红霉素及相关物质，如交沙霉素、 阿奇霉素、罗他霉素、螺旋霉素、竹桃霉素、泰乐菌素、替米卡星、吉他霉素 竺【1 5 l 寸o 喹诺酮类药物是近年来迅速发展和广泛应用于临床的新一代广谱抗微生 物类药物，也称之为氟喹诺酮或4 - 喹诺酮或喹诺酮羧酸类药物。此类药物抗 菌性强、抗茵谱广、很少有耐药菌株、副作用少。目前用于临床的主要有：氟 哌酸( n o r f l o x a c i n ，n f l x ，诺氟沙星) 、甲氟哌酸( p e f l o x a c i n ，p e f x ，培氟 沙星) 、环丙氟哌酸( c i p r o f l o x a c i n ，c p f x ，环丙沙星) 、氟嗪酸( o f l o x a c i n ， o f l x ，氧氟沙星) 、氟啶酸( e n o x a c i n ，e n x ，依诺沙星) 、多氟哌酸( f l e r o x a c i n ， f l r x ，氟罗沙星) 、罗氟哌酸( l o m e f l o x a c i n ，l m f x ，罗氟沙星) 、司帕沙星 ( s p a r f l o x a c i n ，s p f x ) 、替马沙星( t e m a f l o x a c i n ，t m f x ) 掣1 6 - a ) l 。 另外，还有抗肿瘤类抗生素，其临床应用的代表是盐酸表阿霉素1 2 l 】、博 来霉素、平阳霉素、甲氨喋呤等；氯霉素及衍生物等。 2 1 3 环境残留抗生素的污染现状及其危害 随着抗生素的发展和应用，其污染问题也变得越来越严重。由于几乎所有 的抗生素都具有复杂的化学结构和较强的抑菌能力，因此在环境中很难降解， 一旦造成环境污染，容易在环境中富集，对环境乃至人类的健康造成严重的影 响。但是由于抗生素污染及其危害具有隐蔽性，并不像其他环境污染问题直观， 因此长期以来人们对环境污染的关注大多集中于传统的优先污染物，如环境中 持续存在且具急性毒性和致癌性的杀虫剂和工业副产物，对具有生物活性、可 能造成生态环境污染的抗生素的报道很少陋j 。 2 1 3 1 主要的环境残留抗生素污染源及途径 喹诺酮类抗生索与生物大分子的相互作用的荧光法研究 滥用抗生素是抗生素污染的根本原因。德国、瑞士、丹麦等欧洲国家及 美国对医用和畜用药物的环境行为的研究表明：多数药物在人和动物机体内都 不能够被完全代谢，多以原形和活性代谢产物的形式通过粪便排到体外，这些 物质最终会通过医院污水、城市生活污水、牲畜粪便等多种途径连同医药、工 业废水进入环境而造成污染田j 。由此可以发现，人畜粪便中的残留以及未有 效处理的废水是抗生素污染的主要途径，其污染源主要来自医用、兽用、饲用、 农用、工业抗生素。以下分别简要叙述各污染源及其污染途径。 医用抗生素被认为是目前抗生素污染的主要来源之一，主要有b 内酞胺 类、磺胺类、四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等抗生素。有 数据显示，德国1 9 9 4 年的医用抗生素总用量约为1 8 3 1 吨，其中青霉素约6 2 4 吨，另外每年有大约2 0 4 0 的抗生素因过期而被丢弃；1 9 9 5 年丹麦医用抗生 素总量为3 7 1 7 吨【矧。据世界卫生组织调查显示，目前我国住院患者抗生素药物 使用率高达8 0 ，其中使用广谱抗生素和联合使用两种以上抗生素的占5 8 ，远 远高于3 0 的国际水平。而家庭自备抗生素的也已达8 0 。这些抗生素通过 城市和医院污水排放系统，少部分直接渗漏到土壤与地下水中造成污染，大部 分经污水处理厂处理后排放汇入地表水。由于现有的污水处理技术很难将抗生 素彻底清除，所以处理后残留的抗生素同样会对地表水与土壤造成污染，继而 污染地下水1 2 4 乃j 。 用于防治动物感染性疾病的抗生素是抗生素污染的另一重要来源。1 9 9 5 年丹麦畜牧业抗感染抗生素总量为4 9 吨，每年美国用于动物的抗生素有9 2 1 5 吨到1 9 6 1 4 吨，它们绝大多数以原形被牲畜排泄物带进土壤后渗入地下水形成 污染i 矧。畜用抗生素主要有四环素类、青霉素类、大环内醋类( 螺旋霉素和泰 乐菌素) 、喹诺酮类( 卡巴多司和奥哇多司) 、聚醚类( 莫能菌素和盐霉素) 、卑霉 素、阿伏帕星、黄霉素、杆菌肤等种类。现代水产养殖业中有相当数量的抗生 素被用于防治鱼类疾病和加快鱼类生长。投放到水中未被食用及食用后又随排 泄物进入水体中的抗生素则造成新的污染。有人估计，水产养殖中使用的抗生 素至少有7 5 会进入水体并在底泥中形成蓄积性污染1 26 。这部分抗尘素主要 有磺胺类、氟哇诺酮类、四环素类、氯霉素、甲矾氯霉素、氟甲哇、氟苯尼考 和制霉菌素等。 喹诺酮类抗生豢与生物火分子的相互作用的荧光法研究 自2 0 世纪5 0 年代以来，抗生素作为饲料添加剂( 抗菌生长促进剂， a n t i m i c r o b i a lg r o w t hp r o m o t e r , a g p ) 7 7 j 被广泛用在畜禽养殖中。每年欧盟国家 和美国消耗的抗生素总量中约有一半用于饲料添加剂，而我国使用饲用抗生素 的现象也非常普遍。由于这些抗生素主要是通过动物的粪便进入环境，因此其 污染范围与动物的活动范围有很大的联系。 自1 9 6 3 年杀稻瘟菌素在日本的成功大面积应用起，世界各国都在致力于 寻找可以防治细菌性和真菌性植物病害的抗生素，近年来对抗病毒、抗衰老、 杀虫的抗生素也很重视。但是由于很多错误观念认为施用抗生素的种类越多、 剂量越大越有效，导致了滥用农用抗生素的问题。农用抗生素的污染途径主要 是在施用过程中，大量抗生素直接进入种植农作物的水体或地表土壤中，从而 造成大面积污染。 工业抗生素污染主要包括制药厂废水、废渣内抗生素残留对环境的污染。 制药厂在抗生素生产过程中会产生大量的有毒难降解的高浓度废水，这些废水 中不仅c o d 高，而且含有生产工艺产生的剩余中间产物、残留抗生素及有机 溶剂等【船2 9 l ，经生化处理后，废水内残留的抗生素不能被完全降解，排放至环 境中造成污染。另外，制药厂废水中的部分抗生素在废水处理过程中，由于吸 附作用而残留于废水处理后产生的污泥中，也是不可忽视的污染源。工业抗生 素的另一个污染源是生产废渣。由于利用微生物生物合成抗生素时，所用的菌 种在生产过程中会排放大量的废弃物( 菌丝体) ，这些废弃物中含有丰富的营 养物质及少量的抗生素，我国制药工业每年的抗生素菌丝体废渣多达几十万 吨，其中大部分由于缺乏相应的法律法规约束而随意排放，造成严重的抗生 素污染。 工业抗生素污染除集中在制药厂外，许多化工企业为了增加其产品的杀 菌效果，在所生产的工业或家庭用清洁卫生用品如洗涤剂、肥皂、洗澡液、清 洁剂等中加入了一定量的抗生素，使得工业抗生素污染的范围进一步扩大。 2 1 3 2 环境残留抗生素污染的潜在危害 进入到环境中的抗生素由于其本身的杀菌、抑菌特点，首先对水体及土 壤的微观生态系统造成直接影响：将其中不具耐药性的菌株杀死，而具耐药性 喹诺酮类抗生索与生物人分子的相互作用的荧光法研究 的优势菌得以大量繁殖，致使环境中的固有的生态平衡被破坏，进而影响整个 食物链和人类。其次，对其中的微生物造成潜在的危害【删：d i j c k 掣3 1 】研究了 饲料添加剂( a g p ) 对土壤和水环境中典型微生物的影响，发现有7 种微生物 表现敏感；张跃华等【3 2 】研究发现，1 2 5 m g k g 的阿维菌素明显抑制土壤微生物 的种群数量和细菌、真菌、放线菌的生长速度；b a c k z h a u s 等【3 3 j 通过费氏弧菌 的长期生物发光抑制试验对5 大类常用抗生素进行了研究，表明干扰蛋白质合 成以及干扰d n a 、r n a 合成的抗生素对该细菌具有强毒性，其中盐酸四环素 在所有的2 0 种被试验抗生素中毒性最强。 环境中抗生素的累积对动植物的生长发育同样具有潜在的危害。m i g l i o r c 等对不同植物的实验室和实地研究表明抗生素对植物出芽后的正常发育及根 系、胚轴和叶子的生长造成影响。l a n z k v 等发现小球藻种对抗生素灭滴灵( 甲 硝哒吐1 非常敏感。0 0 0 9 0 0 1 2 m g l 的四环素动物粪便已经足以对猩猩木的液 体培养物造成损害。3 0 0 9 0 0 m g l 的磺胺地索辛能明显抑制车前草、玉米等作 物的生长。伊维菌素对大型蚤的毒性大于鱼类，伊维菌素对太阳鱼和虹尊鱼 4 8 h 的半数致死浓度分别为4 1 8 肛g a 和3 1 # g l 。水蚤和鱼对大环内醋类药物比 较敏感，蓝绿藻细菌对很多抗生素药物敏感，如阿莫西林、青霉素、沙拉沙星、 螺旋霉素和土霉素等的e c 5 0 值均低于3 1 # g l 1 3 3 】，并对鱼的酶活性、免疫机 能和胚胎发育产生不良影响。 由于抗生素的难降解性，使其可以在食物链中不断累积，毒性也随之逐 级增加。因此对于处于各级食物链顶端的人类来说，所受的危害无疑是最大的。 长期食用存在抗生素残留的食品，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时会产生 多种急慢性中毒。如氯霉素的蓄积引起的“狄婴综合症”，严重是造成再生障 碍性贫血；四环素类药物可以抑制骨骼和牙齿的发育；磺胺类药物能够破坏人 体造血机能l 川，并引起秘尿系统损害；少数抗生素如红霉素等大环内酷类可 致急性肝中毒。另外，畜产品中残留的抗生素在食用后能引起易感个体的过敏 性反应，严重的还能引起过敏性休克，其中最具代表性的为青霉素类和喹诺酮 类，前者极易引起致死的过敏性休克，后者则可引起变态反应和光敏反应。 另外长期生活在抗生素污染环境中的动物，其体内病菌的耐药性将会迅 速提高，且病菌的耐药基因可以在动物种群、人畜之间交叉传递，由此可导致 喹诺酮类抗生素与生物大分子的相互作用的荧光法研究 许多疾病的常规治疗手段失效，引起人群中大范围的疾病蔓延。 除以上的明显毒性作用外，抗生素对人体还具有隐秘性极高的“三致作 用”，即为致癌、致畸、致突变作用。抗生素可引起基因突变或染色体畸变而 造成对人体的潜在危害。当人体长期食用含抗生素残留的乳、肉制品时，这些 残留物便会对人体产生不易察觉的有害作用，或在人体中蓄积，最终产生致癌、 致畸、致突变作用。如喹诺酮类药物的个别品种己在真核细胞内发现有致突变 作用；磺胺二甲啼睫等磺胺类药物在连续给药中能诱发锯齿类动物甲状腺增 生，并具有致肿瘤倾向；链霉素具有潜在的致畸作用。这些抗生素的残留量超 标无疑会对人类产生潜在的危害。 2 1 4 国内外对于抗生素污染的控制 由于抗生素污染对环境及人类自身健康的潜在危害，正逐渐引起世界各 国对其的重视。联合国粮农组织( a f o ) * n l ! t 界卫生组织( w h o ) - 早- 在1 9 6 9 年就 提出应对各种物性食品中的抗生素残留提出允许标准。日本于1 9 9 7 年规定乳 中抗生素残留限量0 t m g k g ，香港卫生署规定，输港生牛奶中均不能有抗生素 残留检出，美国、欧盟等西方发达国家明确规定中奶中不得检出抗生素。我国 1 9 9 0 年1 1 月颁布的乳及乳制品管理办法第四条明确规定，乳中应用抗生素期 间和停药后5 d 内的乳汁不得供食用。我国农业部2 0 0 1 年1 0 月发布实施的“无 公害食品的行业标准中牛奶的卫生要求是：牛奶抗生素不允许检出。农业部 2 0 0 2 年1 2 月2 4 日发布的动物性食品中兽药最高残留限量中规定奶中最 高允许残留量标准是：链霉素2 0 0 n g m l ：四环素为1 0 0 n g m l ；磺胺二甲基嘧 啶为2 5 n g m l ：青霉素类为4 n g m l , 土霉素为1 0 0 n g m l ：红霉素为4 0 n g m 1 1 3 5 】。 农业部2 0 0 3 年5 月2 2 日发布的兽药停期规定中规定对牛奶使用的停药期 分别为：土霉素7 d ，弃奶期3 d ；四环素1 2 d ，产期禁用注射用青霉素钠，弃 奶期3 d ；磺胺二甲基嘧啶注射液2 8 d 1 3 6 1 。 虽然世界各国都已经加大了对于抗生素使用的监管力度，并致力于研发 环境友好型的抗生素，但是对于已经造成的抗生素污染的消除，由于缺乏相关 的机理研究而进展缓慢。 喹诺酮类抗生素与生物大分子的相互作用的荧光法研究 2 2 抗生素与生物大分子的相互作用的研究背景 尽管国内外的科研工作者通过不懈的努力已经对主要的生物大分子的结 构有了基本的了解，并且深入研究了各类金属离子及金属螯合物及小分子物质 对生物大分子的相互作用机理，但是对于抗生素分子与生物大分子的相互作用 的机理探讨却起步较晚。2 0 世纪末，随着抗生素药物种类的几