（环境工程专业论文）海泡石固定化脱色菌及其对染料废水的处理研究.pdf

摘要 摘要 以海泡石作为一种新型的固定化载体，具有稳定性好、费用低、寿命长、传 质阻力小、可循环利用等特点，本文研究了不同热活化温度对海泡石的结构特性 和化学特性的影响，以及在去离子水和无机培养基中的基本性质，从结构和营养 角度对其作为固定化载体的可行性进行了探讨，并讨论了各种影响固定化的因 素。同时，还将固定化好的脱色菌应用到对染料废水的处理当中。以酸性红b 为目标染料，讨论了海泡石活化温度、环境温度、p h 值、不同海泡石的量、接 种量、摇床转数、染料浓度、盐度等因素对染料对脱色反应的影响程度，还研究 了对不同结构染料的降解情况，并运用紫外可见光谱法对降解过程和降解原理进 行分析。 实验结果表明，海泡石可以作为一种理想的固定化载体，固定化不仅提高了 生物量，还增强了微生物对环境的适应力。活化温度为4 0 0 的海泡石最适宜作 为固定化载体用于微生物的固定化，海泡石对微生物的最佳固定化条件为：温度 3 3 ，p h 值为7 9 ，摇床转数为1 2 0 r m i n ，载体结合时间为7 2 h 。对酸性红b 脱色 的最佳条件为：3 3 、p h 4 9 、载体量为1 0 扎、接种量为2 、摇床转数为 1 2 0 r m i n ，最高脱色率可达9 4 以上。盐浓度对固定化b 菌脱色率影响较小。对 结构简单的单偶氮染料分子降解比较容易，而对相对复杂的双偶氮染料则要难降 解。紫外可见光谱表明，b 菌对酸性红b 的降解，破坏了其结构中的共轭体系和 芳香环结构。 关键词：固定化；海泡石；微生物；生物强化技术；染料；降解；脱色 a b 咖拟 a b s t r a c t a ne x p e r i m e n t a ls y s t e mw a ss e tu pf o ri m m o b i l i z a t i o nb ys e p i o l i t e ，i th a dm a n y f e a t u r e s , s u c ha se x c e l l e n ts t a b i l i t y , l o wc o s t , l o n gl i f e ，s m a l lm a s st r a n s f e rr e s i s t a n c e ， r c e y c l a b l ea n ds oo n t h ep a p e rs t u d i e do nt h es t r u c t u r ea n dc h e m i cf e a t u r e so f s o p i o l i t ea td i f f e r e n tb e a t - t r e a t e dt e m p e r a t u r e s ，a n dt h eb a s i cf e a t u r e si nd e q o n i z e d w a t e ra n di n o r g a n i cc u l t u r em e d i u m f r o ms t r u c t u r ea n dn u t r i t i o np o i n t so fv i e w , f e a s i b i l i t y a n d e v e r y i n f l u e n c ef a c t o rw e r ed i s c u s s e d a l s o ，t h ei m m o b i l i z e d d e e o l o r i z i n gs t r a i nw a ss u p p l i e dt od e a l i n gw i t hw a s t ew a t e rc o n t a i n i n ga c i dr e db ， t h ei n f l u e n c eo fa c t i v a t i o nt e m p e r a t u r e ，c i r c u m s t a n c e st e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，t h e a m o u n to fc a r r i e ra n dm i c r o b e , t h er a t eo fs h a k e r , d y ec o n c e n t r a t i o na n ds a l td e g r e e o nt h es t r a i nd e e o l o r i z a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h ed e g r a d a t i o no fd i f f e r e n t s t r u c t u r ed y ew a sa l s os t u d i e d t h ep r o c e s sa n dp r i n c i p l eo fd e g r a d a t i o nw e r e a n a l y z e dt h r o u g hu v v i ss p e c t n m a i tw a ss h o w e dt h a ts e p i o l i t ew a sa b l et ob ea no p t i m u mi m m o b i l i z a t i o nc a r t i e r n o to n l yt h ea m o u n to fm i c r o o r g a n i s mi nt h es y s t e mi n c r e a s e d ，b u ta l s ot h e a p p l i c a b i l i t y o fb a c t e r i ai nd i f f e r e n tc i r c u m s t a n c e se n h a n c e d t h er e s u l t sa l s o i n d i c a t e dt h a ts e p o i l t eb e a t - t r e a t e di na i ra t4 0 0 。cw a st h eb e s ti m m o b i l i z e dc a r r i e ro f t h es t r a i n , a n dt h es u i t a b l ec o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z e dc e l l sw e r ed e t e r m i n e da s f o l l o w s ：t e m p e r a t u r e3 3 ，p h 7 9 ，1 2 0 r r a i nf o rt h er a t e o fs h a k e r ，7 2 hf o r c o m b i n i n g n eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ed y ed e c o l o r i z a t i o no fi m m o b i l i z e ds t r a i n w e r et e m p e r a t u r e3 3 c ，p h 4 9 ，t h ec a r d e ra m o u n to f l o g l ，t h em i c r o b ea m o u n to f 2 a n dt h es h a k e rs p e e do f1 2 0r r a i n ，t h eh i g h e s td e c o l o r i z i n gr a t ec o u l dr e a c h9 4 ， a n dt h ei n f l u e n c eo fs a l td e g r e ew a ss m a l l t h ed e c o l o r i z a t i o no fm o n o - a z od y e sw a s e a s i e rt h a nd i s a z od y e s u v ? v i ss p e c t r as h o w e dt h a tt h ec o n j u g a t es t r u c t u r ea n d a r o m a t i cp a r to f a c i dr e dbw e r ed e s t r o y e da f t e rd e g r a d a t i o n k e y w o r d s ：i m m o b i l i z a t i o n ；s e p i o l i t e ；m i c r o o r g a n i s m ；b i o a u g m e n t a t i o n ；d y e s ； d e g r a d a t i o n ；d e c o l o r i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼王些太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 诗圣；2签字日期：伽5 年f 月哆曰 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云挂兰些盍堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权云洼王些盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：焉圣汪导师签名： 签字日期：阳6 年f 。月砰h 签字日期：7 “年f 2 ，月疹日 学位论文的主要创新点 一、使用廉价环保的海泡石作为固定化载体，活化后的海泡石不 仅为微生物生长提高适宜的空间，而且其在溶液中溶解出的大量离 子，可以为微生物的生长的提供营养物质，同时，海泡石的吸附作用 也可为菌体聚集养料和染料，在促进生物繁殖生长的同时提高脱色速 率，增强微生物对环境变化的适应能力。 二、研究了海泡石在溶液中的溶解特性和吸附特性，确定出海泡 石活化温度、p h 值、摇床转数等因素对固定化过程的影响程度。 三、确定了海泡石活化温度、环境温度、p h 值、不同海泡石的量、 接种量、摇床转数、染料浓度、盐度、染料种类等因素在海泡石固定 化脱色对染料降解中的影响程度，并通过紫外光谱分析了染料降解的 过程和机理。 第一章前言 第一章前言 我国是纺织印染的第一大国，而纺织印染行业又是工业废水排放的大户，约 占整个工业废水排放量的3 5 。据不完全统计，全国印染废水年排放量达 7 2 1 0 8 m 3 ，由此而造成的生态破坏及经济损失是不可估量的，因而要实现印染 行业的可持续发展，必须首先解决印染行业的污染问题。 随着染料和印染工业的迅猛发展，染料的种类和数量不断增加，用于染料生 产和应用的染料废水的成分也随着工艺和技术的变化越来越复杂。据美国染料索 i 3 ( e o l o u r i n d e x ) ，商品染料已达数万种之多，每年可生产7 1 0 5 t 左右的染料。， 然而染色加工过程中的1 0 2 0 的染料被排放到废水中“1 。目前，生产用的染 料绝大部分为人工合成的化学染料，它们是芳香族化合物，结构复杂、难降解、 具有潜在毒性；而染料废水则由于染料的特殊性质不仅有机含量高，生化性差， c o d 高，b o d c o d 低，而且色度高，成分复杂，有毒性，因此，这种废水如直 接排放，则对环境造成严重污染，并可能通过食物链直接或恻接影响人们的身体 健康，许多国家立法控制某些染料尤其是偶氮染料的应用。1 。 随着环境法制力度的加强，越来越多的企业力求有效的废水处理技术，因此， 有关染料废水的有效处理及其对环境、人体影响研究则成为许多环保工作者的重 要课题。 目前，国内外染料废水处理技术多种多样，主要有物理法、化学法、物理化 学法以及生化法。但是物理法一般费用较高，且存在二次污染；化学法的c o d 去除率低等；与之相比，生物法则是经济有效、可被广泛接受的环保处理方法， 不仅价廉，而且无二次污染，符合可持续性发展的需要，因此，其应用最广泛且 技术上占有相当的优势。目前应用的主要生物处理法有活性污泥法和生物膜法， 其中活性污泥法既能分解大量的有机物质，又能去除部分色素，还可以小量调节 p h 值，运转效率高而费用低，因而被广泛采用。但目前活性污泥法去除c o d 不 完全，脱色效果也不理想，传统的生物处理法由于染料的可生化性差，不能被生 物完全降解，且生成的中间产物结构复杂，往往具有毒性或致癌性，从而使其处 理染料废水效果不佳。因此。寻求一种更安全、更有效、更彻底，也更价廉的生 物处理法则成为当务之急。 基于以上一些问题，为了提高工业废水生物处理系统的处理效率，国内外研 究者目前主要对生物强化技术( b i o a u g m e n t a t i o n ) 、固定化微生物技术( i m m o b i l i z e d m i c r o o r g a n i s m ) 和微生物活性增加技术( m i c r o o r g a n i s ma c t i v i t y e n h a n c e m e n t ) 等方 第一章前言 面进行了不同程度的研究，并取得了一定的效果“。7 1 。 1 1 生物强化技术 1 1 1 生物强化技术 生物强化技术指在传统的生物处理系统中投加具有特定功能的微生物，增强 它对特定污染物的降解能力，从而改善整个污水处理系统的处理效果。1 。生物强 化技术自2 0 世纪7 0 年代中期产生以来，经几十年的研究与应用，己在生物修复中 显现出了强大的生命力，该方法可有效提高有毒有害污染物的去除效果，将生物 强化技术融入到传统的生物修复，并结合现代分子生物技术提供的新方法、手段 进行监测、评价，已成为生物修复发展的一种趋势。 目前实施生物强化技术主要可通过如下2 条途径：( 1 ) 投加特效降解的微生 物：( 2 ) 投加遗传工程菌。生物强化技术投加的微生物可以来源于原有处理系统， 也可以是原来不存在的外源微生物或遗传工程菌。3 。投加菌一般是通过直接生物 降解和共代谢作用”1 来完成对目标污染物的去除。微生物具有分布广泛、数量巨 大、代谢类型多样和适应突变能力强的特点，因而任何存在污染物的地方都会出 现相应的降解微生物，并存在或强或弱的生物降解作用，通过驯化、筛选、诱变、 基因重组技术等可获得高效菌种，再经培养、繁殖可得大量的高效降解菌，投人 到该废水中，以目标污染物为唯一碳源和能源，从而达到提高污染物处理效率的 目的。生物强化技术的核心是投加高效微生物，这些投加的高效降解微生物般 满足3 个基本条件：所投加的菌体活性高、菌体能快速降解目标污染物、具有竞 争能力且能维持相当的数量。有3 种常用的处理菌体的方式：直接投加高效降解 微生物、固定生物、制成生物强化制剂。若将生物强化与为微生物降解作用创造 良好环境条件的生物促进( b i o s t i m u l a t i o n ) 结合起来，可以更好地发挥生物强化的 优势，取得最佳的修复效果。高效降解菌的生产流程见图1 - 1 伽。 第一章前言 选择污染环境 分离适应性菌株 选择特殊降解性菌株 真接 投加 高效 培养高效菌株 繁殖 固定 化微 生物 生物 强化 制剂 图1 - i 高效降解菌的生产流程图 1 1 2 应用于印染废水降解领域中的微生物 由于各印染厂水质不同，染料种类繁多且结构复杂，因此分离得到的菌种也 各有差异，目前已经分离出的脱色及降解菌种中国内以假单胞杆菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 和芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 居多，国外除这两种菌属以外，还包括白 腐真f 蠹o e h i t e r o t f u n g i ) 等“”。 1 1 2 1 假单胞菌属和芽孢秆菌属 黄晓维、张颖等“采用富集法自广州、佛山等地的印染厂的污泥中分离得到 一株假单胞菌属( p s e u d o m o n a sa p ) ，利用该菌株对7 4 种分属于活性、酸性、直接 和分散类别的染料进行脱色试验，发现该菌种对不同类型不同颜色及不同发色基 团的染料均具有明显脱色作用，其脱色率在8 0 以上的占染料总数的7 0 3 ，脱 色率低于5 0 的只占供试染料的1 3 5 。 j o s h uc h a n g 等“”从位于台湾中心地带的一家印染厂污泥中分离得到一株 假单胞杆菌( p s e u d o m o n a s l u t e o l a ) ，p 1 u t e o l a 对日本东京的s u m i t o m o 公司生产的活 第一章前言 性红2 2 具有较强的脱色性。 y a t o m e 等“”人用洋葱假单胞菌( p s e u a o m o n a sc e p a c i a1 3 n a ) 处理o r a n g ei ( o 0 4 5 r e t o o l l ) ，脱色9 h ，脱色率达9 0 。用斯图泽氏假单胞菌( p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 认m12 0 9 7 ) 处理o r a n g ei 、o r a n g ei i ( o 0 4 5 m m o l l ) 2 0 h ，脱色率为8 0 。 1 1 2 2 白腐真菌 f u m i n gz h a n g ，j e r e m ys k n a p p 等“”从腐烂的柳木中发现一种真菌f 2 9 ， 经鉴定它属于白腐真菌，经研究它对o r a n g e l i 具有9 5 以上的脱色率。 印度的r a j e s hk u m a rs a n i 和u t t a mc h a n db a n e r j e e “”从印度的一家印染厂的 污泥中筛选出了脱色能力极好的一株库特氏菌( k u r t h i as e ) ，它在有氧条件下对 三甲苯( t r i p h e n y l m e t h a n e ) 的脱色率达到9 8 ，在人工模拟印染废水中不仅脱色率 达到9 8 ，而且c o d 的去除率达到了8 8 。 d o r a l i e es l b a l a n 等“”从巴西植物园中采集培养物时发现了四种木生白腐 真菌( 觋眈一r o t f u n g i ) ，分别为p h e l l i n u sg i l v u s 、p l e u r o t u ss a j o r - c a j u ，p y c n o p o r u s s a n g u i n e u s ，p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 利用这四种菌对印染废水中的靛蓝染 料进行脱色研究，四天后脱色率分别达到1 0 0 、9 4 、9 1 、7 5 。 1 1 2 3 霉菌 李孱等“”从黑龙江省不同地区的土壤中利用虎红培养基分离得到l 株染料脱 色真菌，经鉴定为温特曲霉h d i “ s p e r g i l l u s w e n t i i h d i ) 该菌对虎红、酸性墨水蓝 g 、硫化宝蓝c v 、还原蓝b c 和碱性湖蓝等非偶氮染料均具较强脱色能力，脱色 率大于7 0 ，其中脱色率大于9 4 的占8 0 。 z h o u & z i m m e r m a n n “”用链霉菌( 跏倒。明，c p 阳s b w l 3 0 ) 降解几种染料，其中 对偶氮一铜大红1 7 1 ( 1 8 0 m g l ) 降解1 4 天，去除率达7 3 。 1 1 2 4 嗜水气单胞菌 y a t o m e 等“们人用嗜水气单胞菌似p r d 聊d 麟砂岫砷f 肠) 处理多种偶氮染料( 浓 度o 2 r n m o l l ) 。脱色2 4 小时，各种偶氮染料的脱色率为r 4 0 1 0 0 。 k u o - c h e n gc h e n 1 等人从多种污泥中( 包括清华大学湖底泥及长春石油化学 品厂污水处理厂的活性污泥) 筛选出六种菌，其中嗜水气单胞菌对各种染料都具 有较强的脱色能力，对红r b n ( 浓度3 0 0 0 m g l ) 在最佳条件下( p h 5 5 1 0 0 ，温度 2 0 3 5 c ) ：进行8 小时脱色，脱色率达9 0 以上。 1 1 3 微生物对染料的降解原理 一般认为生物法脱色主要有两种机理在起作用：吸附和降解，以降解为主。 第一章前言 生物降解又分两步：一是染料分子吸附到菌体上，部分透过细胞膜进入细胞体内； 二是利用微生物产生的酶催化氧化还原染料分子，破坏不饱和共轭体系，达到去 色的目的。中间产物进一步氧化还原分解并最终分解为c 0 2 和水或转化为细菌所 需的营养物质，组成新的原生质”“。 张志杰”1 等人证实，染料的脱色过程可分为两个阶段：第一阶段为污染物向 底泥絮凝沉降迁移富集阶段：第二为生物降解阶段，在该阶段染料被生物体内的 酶或分泌到细胞外的酶所降解。参与降解染料的酶主要有3 类”“： ( 1 ) 对偶氮还原酶。偶氮染料降解的关键是偶氮染料的偶氮键还原断裂形成 无色的芳香胺，由偶氮还原酶催化进行，这一过程形成的芳香胺通常比偶氮染料 毒性更大，对降解微生物毒害也更大。多数偶氮还原酶是厌氧的，在有氧条件下 便失活。假单孢菌k f 4 6 菌株的催化橙i i 染料偶氮键的橙i i 偶氮还原酶属于诱导 酶，它以n a d ( p ) h 为电子传递体，对底物的结构具有专一性o “。该酶可在厌氧 条件下将偶氮染料还原为芳香胺，后者可在有氧条件下脱氨生成酚类化合物，酚 类化合物可被开环而完全矿化汹1 。 ( 2 ) 胞外过氧化物酶系。白腐真菌通过分泌胞外过氧化物酶系实现对染料的 降解，主要包括两大类：木质素过氧化物酶和m n 过氧化物酶。这一酶系专一性 较差，都可氧化染料，同其它过氧化物酶一样，这两种酶与过氧化氢作用产生的 羟自由基在降解芳香化合物中起着重要作用。对于含苯环的染料，中间产物分 析表明，醌类及醛类物质可能是其中间产物，白腐真菌对于含苯环的染料的降解 过程是这样的：脱去苯环上的取代基、醌的形成、羟基化、甲基化，再形成醌、 接着发生脱甲基反应形成醌，再羟基化，最终发生苯环开环反应啪。3 。m n 过氧 化物酶以m n 2 + 作为中间递体，而木质素过氧化物酶，是以藜芦醇作为电子递体， 藜芦醇通过提高羟基自由基的产量来提高木质素过氧化物酶的活性川。 ( 3 ) 链霉菌过氧化物酶。该酶属于血红素过氧化物酶，它在缺乏过氧化氢的 情况下不能使染料脱色，而且其脱色过程被k c n 所抑制。”3 ，另外，研究还发现， 当偶氮染料作为木质素过氧化物酶的适宜底物时，则链霉菌胞外过氧化物酶很难 氧化此染料，该酶与m n - 过氧化物酶的专性很相似，作用底物类型也基本一致 3 3 】 o 典型染料降解菌脱色基因大都定位于质粒上。曹孟德等1 从印染废水污染环 境中分离到一株对偶氮染料活性艳红x 一3 b 脱色的气单胞菌r d 2 ，脱色质粒的检 测、高温消除及接合转移实验表明r d 2 菌株对偶氮染料的降解活性是由其质粒控 制的。 另外，有些难以降解的化合物不能被完全矿化利用，降解微生物必须从其它 底物获得大部分碳源和能源，这样的过程叫做共代谢。对于这类有机物，利用微 第一章前言 生物进行共代谢降解也不失为一条行之有效的方法，但是目前对于共代谢的机理 人们还不清楚，还需要进一步的研究去探索。 1 1 4 染料结构与微生物降解 w i f f 氏发色团说认为染料的化合物分子中，含有一n = n 一，一n = o 等色素基 团，染料废水色度由染料的颜色决定，而染料颜色又与其结构密切相关。其共轭 键增长或苯环增加都会导致颜色加深。一般来说，色度高，脱色就团难。因此， 染料的分子结构同微生物之间有着一定的关系，有人报导染料结构因取代基种 类，数目及位爱而造成的微小变化对微生物降解可以产生明显的影响。c l 基，磺 酸基和硝基取代基的存在会减少其微生物降解速度：丽羧基和羟基等取代基的存 在则有利于微生物降解过程。在偶氮染料中，当取代基靠近偶氮双键时，其降解 速度就慢，当有邻羟基存在时，易于和偶氮双键形成分子内氢键，染料难于降解； 当羟基从邻位取代改为对位取代时，其降解速率就会增高。此外，取代基的数目 对脱色也有影响。一般情况下，芳香族化合物的微生物降解性依其取代基的数量 增多而依次降低。因此，当存在两个或两个以上取代基时，染料就愈难降解。若 两个取代基中有一是磺酸基时，其半降解时间为两个取代基均为羧基时的8 倍。 磺酸基抑制微生物脱色，而羧基则能促进染料的微生物降解。细胞膜渗透试验表 明，磺羧基抑制的是微生物的渗透系统，而不是偶氮染料的自身还原。因此，磺 化的偶氮染料比未磺化的偶氨染料难于降解。此外，含萘环的染料对微生物的抑 制作用较含苯环的染料的抑制作用要小”1 。 1 1 5 目前的研究状况 中科院微生物研究所鲜海军”3 研究了7 种脱色降解菌，在处理含偶氮染料、 三苯甲烷染料、聚乙烯醇、洗涤剂、助剂等各种难降解的印染废水试验中，都取 得了明显的效果。 杨东虎等”从保定市某印染厂曝气池废水中分离到一株对染料直接大红 g b e 有高效脱色效果的菌株h d i ，属沙门氏菌属( s a l m o n e l l a ) ，在2 5 3 7 、p h 6 8 范围内对染料具有明显的脱色效果，氧气对脱色具有一定的抑制作用。染料 脱色产物的紫外一可见光谱分析表明，可见光区4 8 8 n m 处的吸收峰完全消失，而 在紫外区出现了两个吸收峰，表明该菌株已经将染料大分子降解为小分子。 徐文东等”从驯化后的处理毛纺厂染料废水活性污泥中分离到1 株嗜热鞘氨 醇杆菌( s p h i n g o b a c t e r i u mt h a l p o p i l u m ) ，该菌株5 d 内对派拉丁蓝( f 冰n ) 的脱色率达 至u 3 4 ，与驯化污泥同期的脱色率相比有很大提高。 第一章前言 1 1 6 微生物降解染料的应用及展望 目前应用微生物来处理染料废水的实践已经取得了一定的成果，但仍存在一 些问题。为此，国内外学者提出应用生物强化技术来提高降解菌对环境污染物的 降解效率，如：向环境中投加营养或添加底物类似物来刺激降解菌的生长，提高 其降解活性；通过遗传工程手段改良环境污染物降解茵“”。通过遗传工程改良或 构建环境污染物降解菌有多种手段m 1 ： 1 构建“超级细菌” 把相容性的降解质粒转化到一种菌株里，赋予该菌株能够同时降解多种染料 的能力。当然，也可以把不同的降解基因通过体外重组组建到同一个质粒或载体 上去，然后再把这个质粒转化到特定环境的优势菌株中去。这样，就可以构建“超 级细菌”，从而扩大其对污染物的降解范围，提高治理效果，增强其净化环境的 作用。 2 原生质体融合 在有些情况下，两种或多种微生物在共同存在时才能降解某种污染物，单独 存在时不能降解该污染物，这可能是因为彼此为对方提供了生长所必须的条件或 为对方消除了生长的障碍，使得它们在共存的条件下能够顺利降解环境污染物。 在这种情况下，可以采用原生质体融合技术融合这两种微生物，融合子就会具备 两个亲本的基因与优点，能够降解某种环境污染物“”。 3 降解酶或降解基因的改良 通常，从自然界筛选的降解菌其降解酶的活性较低，不能满足实际需要。可 通过各种分子生物学技术来提高其活性，以增强降解菌对污染物的降解能力，如 通过定向诱变或随机突变等技术来筛选高活性的降解基因或降解酶。d n a 改组 技术是1 9 9 4 年由美国的s t e m m e r 博士“”首先提出来的，是一种在试管内模拟达尔 文进化的过程。自d n a 改组技术诞生以来，得到了迅猛的发展和广泛的应用， 美国已经开始应用该技术去除环境污染物。 虽然，直接投加高效微生物虽然简单可行，但是所投加的特效微生物容易流 失，或易被其他微生物吞噬，不能长期在处理系统的群落结构中占据优势地位， 从而会增加污水处理的成本，为大多数企业不能承受，所以固定化技术将是进一 步发展的方向。 第一章前言 1 2 固定化技术 1 2 。1 固定化技术的定义及发展概况 “固定化生物催化剂( i m m o b i l i z e d b i l c a t a l y s t s ) ”这一术语于1 9 8 3 年首次出 现在美国著名杂志e n z y m em i c r o b i a l t e c h n 0 1 上，国内也很快采用。1 9 7 1 年召开 的首届国际酶工程会议对“固定化酶”作了相关的定义中，其中对固定化生物催 化剂定义如下：“固定化生物催化剂是指用物理或化学方法限制或定位在某一特 定空间范围内，保留了其固有的催化活性，能被充分和连续使用的酶、微生物、 动植物细胞、细胞器等生物催化剂。”固定化技术是使生物催化剂更广泛、更有 效应用的一种重要手段。 最早的固定化可追溯道古代，人们在酿造工业中添加各种固形物，使微生物 附着在其表面，以提高微生物的酿造效果。在我国，固定化生物技术的研究始于 2 0 世纪7 0 年代，中国科学院微生物研究所和上海生物化学研究所同时开始了固 定化酶的研究工作“”。2 0 世纪7 0 年代后期，研究人员在固定化酶研究的基础上 又发展了固定化细胞即固定化微生物技术。由于它具有细胞密度高，反应速度快， 不流失和反应过程易控制等优点，在发酵工业、医学、化学分析及环境保护等领 域得到了广泛应用。 固定化技术在环境保护中的应用主要集中在环境监测和三废的治理，尤其以 废水的治理中应用最多，通过将活性污泥中分离、筛选出来的优势菌种加以固定， 组成一个快速、高效、连续的废水处理系统，这样就可以免除污泥处理的二次污 染；它与传统的悬浮生物处理法相比，有处理效率高、稳定性强、反应易于控制、 菌种高纯高效、生物浓度高、产污泥量少、固液分离效果好、丧失活性可恢复等 优点，因此固定化细胞技术很快成了研究热点。 国内外从2 0 世纪8 0 年代末9 0 年代初开始用固定化细胞技术进行印染废水脱 色研究，通过将活性污泥中分离、筛选出来的优势菌种加以固定，组成一个快速、 高效、连续的废水处理系统，脱色率在8 0 以上，c o d 的去除效果良好，预示着 固定化微生物技术在处理印染废水方面具有广阔的应用前景1 。 1 2 2 固定化方法 国内外不同的研究工作者对固定化法采用不同的分类方法，目前较合理的固 定法大致有吸附法、包埋法、共价结合法和交联法四大类“”。 1 2 2 1 包埋法 第一章前言 包埋法是用物理方法将微生物细胞包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜 聚合物的超滤膜内。根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为凝胶包埋法和半 透膜包埋法两种。凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固 定的方法；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内而使 细胞固定的方法。目前工业应用中以凝胶包埋法固定细胞最为广泛，虽然包埋法 具有操作简单、能保持微生物细胞的多酶体系、对微生物活性影响较小的特点， 但是其空间位阻较大，载体不能再生。 1 2 2 2 吸附法 吸附法又叫载体结合法，是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面 张力和黏附力的作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方 法，可分为物理吸附法和离子吸附法两种。常用的吸附载体有：硅胶、活性碳、 多孔玻璃、石英砂和纤维素、木屑、塑料、硅藻土等，微生物依靠范德华力、氢 键或静电作用吸附在其表面上使之固定化。这是一种最古老的方法，操作简单， 反应条件温和，载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。后者根据细胞 在解离状态下可因静电引力( 即离子键合作用) 而固着于带有相异电荷的离子交 换剂( 如d e a e 纤维素、d e a e s e p h a d e x 、c m 纤维素等) 上。 1 2 2 3 共价结合法 共价结合法是细胞表面上功能团( 如小，e 氨基、舡，1 3 - 或丫羧基、巯基或羟 基、咪唑基、酚基等) 和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接， 从而成为固定化细胞。该法细胞与载体之间的连接键很牢固，使用过程中不会发 生脱落，稳定性良好，但反应剧烈、操作复杂、控制条件苛刻。 1 2 2 4 交联法 交联法是利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团( 如氨基酸、 羟基、硫基、咪唑基) 发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其 结合力是共价键。常用的交联剂有戌二醛、甲苯二异氰酸酯等。使用该方法，微 生物间的结合强度高，稳定性好，经得起温度和p h 值等的剧烈变化。由于交联 固定法化学反应比较激烈，固定化微生物的活力在多数情况下较脆弱，因而酶活 性有所降低。另外，这种方法所用的交联剂价格较贵，从而限制了该方法的广泛 应用。 综上，可以看出，各种固定化方法都有其各自的优缺点，详细比较见表1 1 “： 第章前言 表1 1 各种吲定化方法的比较 总之，各种固定化方法各有千秋，需根据所选择的菌种和使用情况，对固定 化方法进行选择和改进。由于各种方法之间存在优缺点的差异，有的研究者就考 虑将不同的固定法方法有机的结合起来，来互相弥补它们之间的缺点，因此，在 实际过程中各种固定化方法的联合应用比较常见。有的为了使吸附在载体上的微 生物结合得更牢固，或者使包埋后的微生物不易漏出，往往需要对微生物进行交 联化处理。如先用结合法将微生物吸附到载体上，再用交联法将细胞交联起来形 成“细胞网”结构；或可先用结合法处理，再用高分子聚合物进行包埋，这样可 以克服结合法结合强度低和交联法中微生物活性低的不足；此外还可用载体置换 的方法来提高固定化强度及微生物活性，比如将固定化后的海藻酸钙凝胶置换成 海藻酸铝。 1 2 2 5 无载体固定法 利用热处理或化学药剂使微生物细胞内的酶固定在细胞内，经过处理后制备 成固定化细胞，称为无载体固定化技术。这种固定化方法是一种全新的概念：在 自絮凝颗粒形成过程中，同时形成了微生物的适宜生态环境，使之有利于微生物 代谢之间的协调。这种方法相比于以往的一些固定方法具有显著的优势，在环境 工程中的污水处理领域得到广泛的应用“”。 总之，具体采用哪种固定化方法应依据不同情况丽定。作为工业规模的微生 物固定化方法要求具备如下条件：载体价廉，固定化费用低。对于一次性固定化 微生物这一点尤为重要；载体最好能再生并重复利用；固定化收率高，制备工艺 简单，而且结合强度高；载体机械强度高；载体物理及化学性质稳定：固定化后 微生物的活性损失少，而稳定性增加较多”。 第一章前言 1 2 3 固定化载体的选择 理想的固定化载体应具有对微生物细胞无毒、传质性能好、性质稳定、使用 寿命长、价格低廉等特点。( 1 ) 化学偶联制备固定化生物分子的前提是载体表面 应具有化学活性基团，这些基团可以直接与生物分子偶联，或经过较为温和的化 学方法活化后与生物分子偶联。( 2 ) 载体应具备一定的容量，可以偶联足够多的 生物分子，这对于提高实验的效率和节省成本是很重要的。( 3 ) 载体应是惰性的。 载体的作用仅是使生物分子固定化，而不应干扰生物分子的功能。( 4 ) 载体应具 有良好的生物相容性，这一点对于细胞培养的微载体及载体药物来说尤为重要。 ( 5 ) 载体应具有足够的稳定性，包括机械、物理和化学的稳定性。( 6 ) 水不溶性。 ( 7 ) 载体应传质性能好，强度高，寿命长。( 8 ) 固定化过程操作简单。( 9 ) 载体应 是价格低廉易得的。 就目前在固定化细胞技术中所使用的载体材料而言，主要分为三大类：有机 高分子载体、无机载体和复合载体。 1 2 3 1 有机高分子载体 有机高分子载体分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体。天然 高分子载体一般对生物无毒性，传质性能好，但强度较低，在厌氧条件下易被微 生物分解，寿命短，常见的有琼脂、角叉莱胶、海藻酸钙、甲壳素等。在这几种 天然载体中，琼脂强度最差。天然的角叉菜胶在分离出影响其强度的 一角叉莱 胶成分后，强度和稳定性有所提高，但价格较贵。由于甲壳素不溶于普通试剂， 其应用受到很大限制。近年来，通过对其进行化学改性，引入多功能基团，提高 其溶解性，开发更高一级的新用途，已成为一个较活跃而深入的课题。相比之下， 海藻酸钙具有价格低廉、制备容易、传质性能好等优点，应用最为广泛。 合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对 细胞活性有影响。常见的此类载体有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇( p v a ) 、光硬化树脂、 聚丙烯酸凝胶等。聚丙烯酰胺凝胶在包埋细胞时，由于交联过程中的放热以及交 联试剂本身的毒性，细胞在固定化过程中往往失活。p v a 凝胶是目前国内外研究 最为广泛的一种包埋固定化载体，它具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解 性强、对细胞无毒且价格低廉等一系列优点，因而具有很大的利用价值。 1 2 3 2 无机载体 无机载体如多孔陶珠、红砖碎粒、砂粒、活性炭等，具有机械强度大、对微 生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长等特性，因而是一类 重要的载体材料。 第一章前言 无机载体大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应， 从而把微生物固定。无机载体内部有较大的孔隙度，可以容纳不断增殖的微生物， 使得载体内细胞浓度增大，提高了处理效率。无机载体的固定化方法简单易行， 只需把载体放入含有微生物一定浓度的溶液中，固定一段时间即可。 1 2 3 3 复合载体 由于有机和无机载体材料各有优缺点，而两类材料在许多性能方面互补，因 此，可将这两类载体材料结合，组成复合载体材料，以改进材料的性能。 目前，有很多相关文献报道。为了弥补有机合成高分子和天然高分子各自的 缺陷，闵航等研究了以聚乙烯醇为主要包埋材料的混合载体法固定厌氧活性污 泥处理有机废水，混合载体主要成分为聚乙烯醇、海藻酸钠、铁粉、碳酸钙和二 氧化硅粉末。研究结果表明：混合载体法可以有效地解决固定化细胞技术用于废 水处理所面临的成球难、易破碎、活性散失大以及因产气而发胀上浮等问题。 l i n 。”利用海藻酸钙联合包埋固定可以分解五氯酚( p c p ) 中间产物的真菌细胞和 粉末活性炭用于降解p c p ，结果表明复合固定化体系对p c p 降解效果更好。 1 2 4 影响固定化的条件 影响微生物固定化的主要因素有三大类：微生物本身的性质、所用载体性质 和环境特征o ”。 1 2 4 1 微生物的性质 ( 1 ) 微生物的浓度 根据微生物固定化的基本过程，水中初始微生物浓度( 即开始处于悬浮态的 微生物的浓度) 在某种程度上对其向载体表面输送的速度有影响，同时也决定了 其与载体表面接触几率的高低，从而影响固定化进程。 在低初始微生物浓度的情况下，随浓度的升高，微生物在载体表面的附着固 定速率提高，而当初始浓度足够高时，微生物的载体表面的固定化速率将保持恒 定而不受其影响，但是在此之| ，存在一个临界浓度。当初始浓度低于临界浓度 时，微生物从液相向载体表面传递、扩散是决定固定化速率的控制步骤，而超过 临界浓度后，其固定化速率将受可供其附着的载体表面积控制。 微生物初始浓度对最大附着量影响不大，这主要由于当载体材料提供的比表 面积一定时，决定微生物在载体表面固定化数量的将不再是初始微生物浓度，而 是所提供的可供微生物生长附着所利用的载体表面积的大小。 ( 2 ) 微生物的活性 微生物的活性高，即其比增长速率高，相应微生物的能量水平也会提高。微 第一章前言 生物固定化初期的活性对固定化速率的影响主要表现在三方面： 高的微生物活性，将利于通过其代谢作用而分泌更多的多聚糖类物质，依 靠多聚糖所具有的黏性作用可促进微生物与载体的黏附，缩短附着时问，从而加 快固定化进程。 较高的微生物活性使其具有较高的能量水平，有利于微生物在向载体表面 的主动或被动输送和附着过程中，克服和削弱各种作用力的不利影响，提高其初 始积累速率。 。 有研究表明，微生物的活性不同，其表面性质也有所不同。微生物表面的 化学组成直接影响其在载体表面的附着固定过程。目前，对微生物表面组成改变 对其固定化进程影响的趋势还有待深入研究。 1 2 ，4 2 载体的性质 ( 1 ) 载体的表面粗糙度 载体材料的表面越粗糙，越有利于微生物在其表面的附着固定。表面粗糙度 的影响主要表现在两方面：一是与光滑表面的载体材料相比，表面粗糙的载体材 料可提供更多的有效接触和附着面积；而是粗糙的表面，如空洞、缝隙等对已经 吸附的微生物具有保护伞的作用，免受水力扰动、剪切和冲刷的影响，从而提高 负载生物量和稳定性。 ( 2 ) 载体的表面带电性 一般环境条件下，微生物表面通常带负电，因而，使用表面带有正电荷的材 料作为载体物质，有利于加速固定进程，使微生物在液相中象载体表面的输送变 得更为容易。目前常用的载体材料大多是高分子聚合物，如这些物质进行适当的 表面处理( 化学氧化、低温等离子转型处理等) ，使他们表面带有正电荷，可达到 提高固定化速率的目的。 1 2 4 3 环境特征 环境因素对微生物固定化进程的影响因素颇多，由于采用的处理工艺不同、 所处理的肥水性质不同、工艺设计参数的不同以及所需达到的处理要求和目标不 同等，都将使微生物处于不同的环境条件中，从而不仅将改变微生物的生长和作 用特性，还将影响微生物的固定化过程，以下主要介绍p h 值和水流状态的影响。 ( 1 ) p h 值 微生物的生命活动、物质代谢与p h 密切相关。p h 值是影响生理生化反应 的重要影响因子，环境的p h 值的变化会引起微生物细胞表面特性的变化，从而 引起细胞体生理生化过程的变化，最终导致微生物代谢与生长的变化。 p h 值对微生物在载体表面的固定化速率的影响主要表现为微生物的表面带 第一章前言 电特性。一般来说，不同的微生物具有不同的等电点( 细菌的等电点在3 5 左右) 。 当p h 值大于细菌的等电点时，细菌表面将由于氨基酸的电离作用而显示负电性： 反之，若p h 值小于细菌的等电点时，细菌