（生物化学与分子生物学专业论文）扩展青霉脂肪酶的异源表达及分子突变.pdf

福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名) 刍亡鱼圭 学号竺兰3 !专业 竺垒! 坠萱氢金查竺塑篷所呈交的论文( 论文题 目种艇魄月白瞄硇獬惰起蛾瓮崆莨 ： ) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范大学有关保 留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学位论文并允许论 文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容；学校可以采用 影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名 垒仑至! l 兰二 指导教师 签名日期 ! 缉鱼且土旦一 签名饥勋卜 福建师范大学邹有土硕士学位论文 摘要 扩展青霉脂肪酶( p e l ) 是一类特殊的酯键水解酶，可在油水界面催化甘油三酯生 成脂肪酸和甘油，在工业上起着重要的作用。本研究将扩展青霉脂肪酶基因( 1 i p 0 7 ) 导入巴斯德毕赤酵母( 尸鼬谊p 口s f d 廊) 中，以甘油醛3 磷酸脱氢酶( g 4 p ) 启动子来 表达p e l 。巴斯德毕赤酵母是一种理想的真核蛋白表达系统，能够稳定高效表达外 源蛋白。利用g h p 启动子，无需像彳似z 启动子那样，在诱导表达阶段需要剔除非 甲醇的碳源，且不以甲醇为诱导物，避免了有毒物质的积累。以葡萄糖或甘油为碳 源，重组脂肪酶( p e l p o 婶z a 1 i p 0 7 ) 均得到了表达。通过优化发酵条件，酶活从 开始的5 3 o u m l 提高到了2 2 1 5 u f m l 。本研究还利用定点突变技术对p e l 进行了分 子突变，共获得了9 株脂肪酶突变体。其中p e l e p 8 k 2 0 2 a 热稳定性得到很大改善， m 值比野生型提高了2 6 3 ，并具备与野生型相当的脂肪酶表达量。 一：p e l 基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 将编码扩展青霉脂肪酶的c d n a ( 1 i p 0 7 ) 克隆到酵母表达质粒p g a p z a ，利用 z e o c i n 抗性及限制性酶切鉴定筛选重组表达载体p q 廿z a 1 i p 0 7 ，然后电转化宿主菌 毕赤酵母g s l l 5 ，以g 卯为启动子进行胞外表达。橄榄油鉴定板检验表明重组菌的 发酵上清具有脂肪酶活性，s d s p a g e 分析得出重组脂肪酶的分子量约为2 8 k d ，与 野生型扩展青霉脂肪酶一致，发酵上清液中脂肪酶的含量约占分泌蛋白的9 5 以上。 通过优化发酵条件，结果表明，以甘油作为碳源发酵表达p e l 时表达量最高，以橄 榄油为底物进行酶活测定，9 6 小时发酵上清的脂肪酶酶活可达到2 2 1 5 u m l 。 二：p e l 基因的定点突变 为提高扩展青霉脂肪酶的热稳定性，本论文采用重叠延伸p c r 的方法对p e l 基因进行了多个定点突变，包括在野生型l j p 0 7 上的单点突变和在随机突变体e p 8 ( 为 本课题组构建的热稳定性提高的突变脂肪酶) 上的叠加突变。将突变后的p e l 基因 连接到毕赤酵母表达载体上，并转化进入毕赤酵母g s l l 5 构建突变脂肪酶基因工程 茵。在甲醇的诱导下进行突变脂肪酶的表达并测定其对温度的敏感性。 ( 1 ) l 心0 2 a 单点突变及叠加突变 叠加突变体p e l 广e p 8 k 2 0 2 a 的最适作用温度比野生酶上移了2 0 ，热稳定性 ( m ) 比野生型提高2 6 3 ，比随机突变体p e l e p 8 提高了1 2 1 。表达量约为 福建师范大学邹有土硕士学位论文 2 6 0 吮咖l ，发酵酶活约为5 0 4 7 u m l ，比活力约为1 9 4 1 0 u m g ；单点突变体 p e i ，l i p 0 7 k 2 0 2 a 最适作用温度不变，热稳定性( z m ) 比野生型降低1 9 5 ，表达 量约为1 2 5 吮g m l ，发酵酶活约为2 7 3 0 u 恤l ，比活力约为2 1 8 4 o u m g 。 ( 2 ) n 7 3 t 叠加突变 叠加突变体p e l e p 8 n 7 3 t 最适作用温度比野生型p e l l i p 0 7 降低5 ，热稳定 性( m ) 降低o 5 5 ，表达量约为4 0 陬咖l ，发酵酶活约为7 1 o u m l ，比活力约 为1 7 7 5 0 u m g 。 ( 3 ) s 1 5 3 p 、q 1 7 6 p 单点突变 单点突变体p e l l i p 0 7 q 1 7 6 p 和p e l 广l i p 0 7 s 1 5 3 p 的热稳定性均下降，z m 值分 别为3 7 8 1 和3 6 3 6 ，分别比野生型下降了1 2 2 和2 6 7 。 ( 4 ) k 2 0 2 e 、s 9 1 k 、h 1 0 7 r 、n 1 5 7 y 单点突变 单点突变体p e l l i p 0 7 k 2 0 2 e 、p e l 广l i p 0 7 - s 9 1 k 、p e i 厂l i p 0 7 h 1 0 7 r 及 p e l l i p 0 7 n 1 5 7 y 均不能够在y p o m 板上形成透明圈，s d s p a g e 分析亦无脂肪酶 目的蛋白，突变体发酵上清不具备脂肪酶活性。 关键词：扩展青霉脂肪酶，g _ p 启动子，表达，突变，热稳定性 福建师范大学邹有土硕士学位论文 a b s t r a c t p p 咒记f z 以h 聊唧口甩s “小l i p a s e ( p e l ) p l a y s 柚i m p o r t a mr o l e i i l i n d u s t 巧f o r i t s c a t a l y t i cc h a r a c t e r s p j 砌肠s 幻厂西i sav e r y9 0 0 de u k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mt h a tc 觚 s t a b l ye x p r e s sh e t e r o l o g o u sp r o t e i n s a t h i g l l l e v e l e x p r e s s i o n w i t ht h eg 么p p r o m o t e “p 训i sm e t h 卸o l f r e ea n ds o m e t i m e st h el e v e lo fe x p r e s s i o nc a i lb es l i g l l t l y h i g l l e r t h 柚t h a to b t a i n e dw i t ht h e 彳0 灯p r o m o t e r p e lc o d i n gg e n ew a sc 1 0 n e d 柚d i n t r o d u c e di i l t oy e a s ti n t e 伊a t i v ep l a s m i dp q 廿z a 粗dt h e nt r 柚s f b 珊e di n t oa 幽妇 严s 幻，括 g s l l 5t oc o n s t n l c tar e c o m b i n 卸tw h i c h e x p r e s s e dl i p a s eu s i n g 酉y c e r a l d e h y d e s 3 - p h o s p h a t ed e h y d m g e n a s eg e n e ( ( m p )勰p r o m o t e r t h el i p a s e e x p r e s s i o nl e v e lo ft h er e c 0 m b i n 弛ts t a i nw a su pt o2 2 1 5 u m lw h e n 百y c e r o lw 勰u s e d 弱 c a r b o ns o u r c c f 研s t u d i i l gt h e 册o s t a b i l i t yo fp e ln i n em u t 锄t sw e r ec r e a t e db y s i t e - d 沁c t e d m u t a g e n e s i sb a s e d o nt h es t n l c t u r eo ft h e p r o t e i n am u t a n t0 f p e l e p 8 k 2 0 2 a w 孙o b t a i n e dw h i c ht h e 册o s t a b i l i t ys h o w s2 6 3 h i g l l e r t h 锄t h a to ft h e w i l d - t y p e 1 、o v e n x p s s i o no fp e lg e n ei n 砌而缸p 船幼由 t h e 砌f c f 肼“肌巴印口咒s “ml i p a s e ( p e l ) e n c o d i n gg e n ew a sd o n e d 卸di n t r o d u c e d i l l t ot h ey e 硒ti n t e g r a t i v ep l 签m i dp g a p z 八b yu s i n gz e o c i n 豳as e l e c t i o nr e a g e n t ，t h c r e c o m b i n a n tp l a s m i dp g a p z a l i p 0 7w a ss e l e c t e d 觚dt r a n s f o 珊e di n t oj 强咖砌p 口s 幻厂括 g s1 1 5t 0c o n s t m c tar e c 0 m b i n a n ts t a i ng s - p g a p z a - l i p 0 7w l l i c he x p r c s s e dl i p a s eu s i i l g g z p 勰p r o m o t e r t i l l ee x p r e s s i o np r o d u r e c 0 m b i n 柚tp e l s h o w sl i p o l y t i ca c t i v i t i e s w h e ni tw a st e s t e d0 n 柚o l i v eo i la g a rp l a t eo rm e a s u r e db yt i t r a t i o no fn a o h s d s - p a g ea n a l y s i so ft h er e c 0 m b i i l a n tp r o t e i ns h o w st h a tt h em o l e c u l 扯m a s so ft h e r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sa b o u t2 8 k d ，w h i c hi st h es 锄ew i t ht h a to ft h ew i l d - t y p e p e l l i p 0 7 t h el i p a s ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h er e c o m b i n 柚ts t a i nw a su pt o2 2 1 5 u m l w h e n 醇y c e r 0 1w a su s e d 勰c 缸b o ns o u r c e 2 、s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fp e l n i n em u t a t i o ng e n e sw 髂c r e a t e db ys i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i su s i n gw i l dt y p el i p a s e g e n e ( 1 i p 0 7 ) 柚dt h er 柚d o m - m u t a i l tg e n ee p 8 ，w h i c hs h o w sh i g h e rt h e 珊o s t a b i l i t y ，觞 i 福建师范大学邹有土硕士学位论文 t e m p l a t e s t l l l em u t a n tg e n e sw e r es u b d o n e di n t 0p a 0 8 1 5o rp p i c 3 5 l a n dt h e n t 姗s f o m l e di n t ot h ea c 细册s 幻廊g s l l 5f o re x t r a c e l l u a re x p r e s s i o nu n d e rt h ec o n t r 0 1 0 ft h e 彳0 灯p r o m o t e r ( 1 ) k 2 0 2 as i n g l em u t a n ta n dd o u b l em u t a n t t h e p e i ，e p 8 - k 2 0 2 a ，am u t a n to b t a i n e db yu s i n ge p 8a st e m p l a t e ，h a sa no p t i m u m t e m p e r a t u r e2 h i g h e rt h 柚t h a to ft h ew i l d t y p e t l l ez mo fi t i s2 6 3 h i g i l e rt h 柚 p e i 广i i p 0 7 觚d1 2 1 h i g l l e rt h 卸p e i ，e p 8 t l h ee x p r e s s i o ny i e l do ft h es t r a i ni s 5 0 4 聊n l ，2 6 0 陬g m l ，姐d t h es p e c i f i c a d i v i t yi s1 9 4 1 o u m g w h i l et h em u t 孤t p e l l i p 0 7 - k 2 0 2 八am u t 柚t a b t a i n e d b yu s i n gl i p 0 7 嬲t e m p l a t e ，h a so p t 血u m t e m p e r a t u r co fs i i i l i l a rt ot h ew i d e - t y p ep e i ，l i p 0 7 ，w m l et h et l l e m o s t a b i l i t yi s1 9 5 1 0 w e rt h 柚t h a to fw i d et y p e n ee x p r e s s i o ny i e l di sa b o u t1 2 5 毗i i d ，t h es e c r e t e d a c t i v i t yi sa b o u t2 7 3 0 u m l 卸dm ec a t a l y t i ca c t i v i t yi sa b o u t2 1 8 4 0 u 】m g ( 2 )n 7 3 td o u b i em u t a n t n em o fp e l 印8 一n 7 3 ti s3 8 4 8 ，w h i c hi s0 5 5 1 0 w e ri h 锄t h ew j l dt y p e n e o p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp e i ，e p 8 - n 7 3 tw 勰5 l o w e rt h 觚t h ew i l dt ) r p e t h e e x p r e s s i o nl e v e l i sa b o u t7 1 0 u m l ，4 0 毗g m l ，a n dt h es p e c i f i c 耐i v i t yi s1 7 7 5 0 u m g ( 3 ) s 1 5 3 p 、q 1 7 6 ps i n g l em u t a n t t h ez h lo fp e i ，l i p 0 7 - q 1 7 6 pa n dp e i ，l i p 0 7 - s 1 5 3 pi s3 7 8 1 a n d3 6 3 6 ，l o w e r t h 锄t h a to ft h e w i d e t y p e b u tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei ss i m i l a rt ot h ew i d et y p e ( 4 ) k 2 0 2 e 、s 9 1 k 、h 1 0 7 r 、n 1 5 7 ys i n g i em u t a n t t 1 1 ef o u rs i n 出em u t a l l t ，p e l 广l i p 0 7 一k 2 0 2 e 、p e l 广l i p 0 7 一s 9 1 k 、p e l l i p 0 7 - h 1 0 7 r 卸d p e i ，l i p 0 7 - n 1 5 7 yd i dn o ts h o wl i p o l y t i ca c t i v i t i e sw h e nt h e yw e r et e s t e do na no l i v eo i l a g a u rp l a t e 柚da c t i v i t ym e a s u r e 1 嘶w o r d s ：砌f c f 盯f 比所巴x p 口咒5 “肌l i p a s e ，g z 只s i t e d i r e c t e dm u t a g e n s i s ，t h e n _ i l o s t a b i l i t y i 、， 福建师范大学邹有十硕士学位论文 中文文摘 扩展青霉p f 8 9 8 是经多代诱变育种而获得的脂肪酶高产菌株，本课题组己完成 对p e l 基因c d n a 序列和基因组d n a 序列的克隆和序列分析，并实现了该基因在 毕赤酵母g s l l 5 宿主菌中的高效表达。该表达以彳0 灯为启动子，表达需要以甲 醇为诱导物。虽然甲醇可严格调控和诱导彳d n 基因的表达，且表达量高，但甲醇 为有毒、易燃物质，操作麻烦，在某些情况下，该启动子不适用。为进一步完善扩 展青霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达，我们采用甘油醛3 磷酸脱氢酶基因 ( 舀y c e r a l d e h y d e s - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n 弱e ) 为启动子进行p e l 的表达。( 认p 启动子 具有很强的组成型表达能力；以葡萄糖、甘油等无毒物质为碳源；表达时无需更换 碳源；发酵工艺更为简单。因此，本研究构建了以倒p 为启动子的脂肪酶基因工程 菌p q 心硷l i p 0 7 g s l l 5 。在p h 7 5 ，以甘油为碳源的发酵条件下，重组脂肪酶 ( p e l p g a p z a 1 i p 0 7 ) 的发酵酶活达到2 2 1 5 u m l ，1 0 陬g m l 。同时，为研究p e l 基因结构与功能的相互关系，改善其酶学性质，提高热稳定性，我们利用蛋白质工 程手段对p e l 进行了改造，获得了热稳定性m 值比野生型提高2 6 3 的脂肪酶突 变体。 一、p e l 基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 重组表达载体的构建：p c r 扩增p e l 的编码基因l i p 0 7 ，产物经低熔点胶回收 后与经d r v 线性化的p s k 相连，转化e c d 席d h 5 a t 1 ，经含x g a l 的a m p 板蓝 白斑筛选，抽提质粒以砌r i 、劢d i 两次酶切鉴定，成功构建重组质粒( p s k - l i p 0 7 ) 。 p s k - l i p 0 7 以艮d ri 酶切，回收片段与经d r i 酶切并去磷酸化的p q z a 进行连 接，转化e c d 以d h 5 a t 1 ，重组质粒酶切鉴定后，构建出重组表达载体p q 廿z a 1 i p 0 7 。 将重组表达载体进行基因序列测定，结果表明构建过程中未发生基因突变。 工程菌构建：重组表达载体p g a p z a 1 i p 0 7 经彳阡u 臼印a 2i ) 酶切线性化后， 电转化毕赤酵母g s l l 5 。先经含z e o c i n 的y p d 平板进行筛选，将出现的克隆接种 至y p o m 板，筛选能形成透明圈的菌株，获得了g s - p g a p z a 1 i p 0 7 表达重组子。 g s - p g a p z a 1 i p 0 7 表达条件优化：分别以不同碳源培养基、不同甘油浓度、不 同起始细胞密度、不同培养基起始p h 值对g s - p g a p z a 1 i p 0 7 进行摇瓶发酵条件优 化，结果表明：以4 甘油为碳源、起始p h 为7 5 的条件下，发酵酶活可达到 2 2 1 5 u m l 。s d s p a g e 电泳结果显示：在银染和考染的扫描图上都能形成清晰的条 福建师范大学邹有土硕士学位论文 带；表达蛋白分子大小约为2 8 l ，与野生型p e l l i p 0 7 一致；蛋白条带与标准b s a 比照得出：其蛋白含量约为1 0 0 毗咖l ，酶的比活力约为2 2 1 5 0 u f m g 。 二：p e l 基因的定点突变 本文采用定点突变的方法，对p e l 进行改造。共选择了7 处突变位点，进行了 9 次定点突变，包括在野生型( 1 i p 0 7 ) 上的单点突变和在随机突变体( e p 8 ) 上的叠加 突变。在p e l 分子无规卷曲上的突变有：e p 8 k 2 0 2 a 、l i p 0 7 k 2 0 2 a 、l i p 0 7 s 1 5 3 p 、 l i p 0 7 k 2 0 2 e 和l i p 0 7 s 9 1 k 。在a 螺旋上的突变有：e p 8 n 7 3 t 、l i p 0 7 q 1 7 6 p 、 l i i ) 0 7 一h 1 0 7 r 和l i p 0 7 n 1 5 7 y 。 利用重叠延伸p c r 获得突变基因后，与经限制性内切酶砌r v 线性化的p s k 质粒连接，构建重组载体。对重组载体进行髓d r i 酶切，回收后与经d r i 酶切并 去磷酸化的表达载体p a 0 8 1 5 连接，构建出重组表达载体。或者重叠延伸p c r 获得 突变基因后，经砌口b i 及砌r i 双酶切，然后与同样双酶切的p p i c 3 5 k 表达载体相 连，转化大肠杆菌t o p l 0 f ，小量抽提质粒用z 耿7 l d i 、勘忉h r l 两次酶切鉴 定，得到p p i c 3 5 k - e p 8 n 7 3 t 重组表达载体。此两种重组表达载体z i 线性化后电 转化上协4 缺陷型巴斯德毕赤酵母j i l 缸艘s 幻，西) g s l l 5 。经过y p o m 板，p c r 鉴 定，筛选阳性重组子。重组子甲醇诱导表达1 2 0 h ，发酵液经灿烂绿、橄榄油鉴定板、 s d s p a g e 分析、n a o h 滴定法测定酶活及最适作用温度和热稳定性z m 值。 ( 1 ) 单点突变体p e l ，l i p 0 7 k 2 0 2 a 和叠加突变体p e l 广e p 8 k 2 0 2 a 是将p e l 表 面一段无规卷曲上的赖氨酸残基( k ) 突变为丙氨酸( a ) 。通过测定得：野生型 p e l l i p 0 7 的热稳定性z m 为3 9 0 3 、发酵酶活为6 0 8 5u m l 、表达量为3 0 0 毗m l 、 比活力为2 0 2 8 0 u m g 。随机突变体p e l e p 8 的m 值为4 0 4 5 、发酵酶活为 4 3 2 5 u m l 、表达量为2 1 0 毗g m l 、比活力为2 0 5 7 o u m g 。叠加突变体p e 【厂e p 8 一k 2 0 2 a 的最适作用温度提高2 0 ，热稳定性( m ) 比野生型提高2 6 3 ，比随机突变体 p e l e p 8 提高了1 2 1 。表达量约为2 6 0 吮咖l ，发酵酶活约为5 0 4 7 u m l ，比活力 约为1 9 4 1 0 u ，m g ；p e l e p 8 k 2 0 2 a 的酶活为野生型的8 2 9 4 ，降低了1 7 0 6 ，比 随机突变体提高了1 4 3 1 。单点突变体p e l 广l i p 0 7 k 2 0 2 a 最适作用温度不变，热稳 定性( 7 m ) 降低1 9 5 ，表达量约为1 2 5 毗咖l ，发酵酶活约为2 7 3 0 u h l ，比活 力约为2 1 8 4 o u m g 。单点突变酶的酶活为野生型的4 4 8 6 ，降低了5 5 1 4 。 在4 0 下，野生型p e l l i p 0 7 和随机突变体p e l e p 8 温育3 0 分钟后，残余酶活 福建师范大学邹有土硕士学位论文 仅为3 8 2 7 和5 4 6 7 ，而叠加突变体p e l 广e p 8 k 2 0 2 a 仍有7 1 3 6 的活性。此时， 野生型酶活为2 3 2 8 7 u m l ，叠加突变体为3 6 0 1 5 u m l 。叠加突变酶比野生型反而高 了1 2 7 3 u m l 。由此可见，在温度较高( 4 0 ) 的反应条件下，叠加突变酶 p e l e p 8 k 2 0 2 a 即能够显示出其热稳定性提高的优良特性。可以看出k 2 0 2 a 突变对 热稳定性表现出双重性，即在以野生型l i p 0 7 为模板获得的单点突变酶 ( p e l 广l i p 0 7 k 2 0 2 a ) 表现出热稳定性的下降，而以随机突变体e p 8 为模板获得的叠 加突变酶( p e l 广e p 8 k 2 0 2 a ) 表现出热稳定性的提升。其原因可能是单个突变将赖氨 酸残基突变为丙氨酸后，虽然增加了酶分子结构稳定性，但是却影响其最佳活性结 构状态，同时也增强了蛋白质分子构象的张力，而且后者的作用强度大于前者，使 得酶活和热稳定性均低于野生型。而在随机突变的基础上进行叠加突变，两次突变 后的氨基酸之间可能相互影响，使肽链结构更趋于稳定，刚性增强，从而带来脂肪 酶热稳定性的提高。以此看来，在随机突变酶p e l e p 8 酶活下降，热稳定性提高的 情况下，通过叠加突变引进k 2 0 2 a 突变将热稳定性进一步提高，酶活也比p e l e p 8 提高。 ( 2 ) 叠加突变体p e l 广e p 8 n 7 3 t 是在p e l 分子表面的一段a 螺旋上的天冬酰胺 ( n ) 进行的突变，将其替换成苏氨酸( d 。叠加突变体p e l e p 8 n 7 3 t 最适作用温 度比野生型降低了5 ，m 值为3 8 4 8 ，比随机突变体p e l 广e p 8 低1 9 7 ，比野 生型低o 5 5 。表达量约为4 0 陬咖l ，发酵酶活约为7 1 0 u m l ，比活力约为 1 7 7 5 0 u m g ，其酶活为野生型的1 1 6 7 ，随机突变体的1 6 4 2 。这与预期结果相 差甚远，这可能是由于天冬酰胺虽然不利于螺旋结构的稳定，但是突变为苏氨酸后， 不但不能改变这种状况，而且增加螺旋构象的张力，使酶分子结构更加趋于不稳定。 也正是这种不稳定，使得该突变酶在较低温度下，即可表现出较高的酶活。 ( 3 ) 分别将1 5 3 位的丝氨酸( 处于p e l 分子表面的无规卷曲上) 突变为脯氨 酸( p ) ；1 7 6 位的谷氨酰胺( a 螺旋上) 突变为脯氨酸，获得单点突变体p e i 厂l i p 0 7 s 1 5 3 p 和p e l 广l i p 0 7 q 1 7 6 p 。这两个突变体的最适作用温度没有改变，均为4 0 。 p e l 广l i p 0 7 s 1 5 3 p 的酶活为2 3 0 u m l ，z m 值为3 6 3 6 ，比野生型下降了2 6 7 。 p e l i i p 0 7 q 1 7 6 p 的酶活为1 0 0 u m l ，z m 值为3 7 8 1 ，比野生型下降了1 2 2 。 这可能是突变后的酶蛋白结构改变较大，从而影响其有效的折叠和包装，并最终影 响其蛋白分泌的效率，使得酶活和热稳定性都下降。 ( 4 ) 单点突变体p e l l i p 0 7 h 1 0 7 r 、p e l 厂l i p 0 7 n 1 5 7 y 及p e l l i p 0 7 k 2 0 2 e 、 福建师范大学邹有士硕士学位论文 p e l l i p 0 7 s 9 1 k 不能够在y p o m 板上形成透明圈。天冬酰胺( n 1 5 7 ) 、组氨酸( h 1 0 7 ) 和赖氨酸( 1 ( 2 0 2 ) 、丝氨酸( s 9 1 ) 分别位于a 螺旋和无规卷曲上，突变后产生的突变 体从理论上可以稳定p e l 的a 螺旋和无规卷曲结构。但结果却不能产生脂肪酶酶活， s d s p a g e 也无法检测到目的蛋白的存在。 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 脂肪酶( i j p a s e ，t r i a c y l 酉y c e r o la c y l h y d r o l a s e s ，e c3 1 1 3 ) 是一类作用于甘油酰 基的酶，这类酶的活性包括催化三酰甘油酯分解生成二酰甘油酯、单酰甘油酯并可 进一步分解生成甘油和脂肪酸；可在无水或少量水体系中催化水解的逆反应( 酯化 反应) ；以及酯交换等【1 1 。2 0 世纪初国外科研人员首次发现了微生物脂肪酣2 1 。微生 物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，其种类多；比动植物脂肪酶的作用p h 、作用 温度以及对底物的专一性类型更广；便于进行工业化和获得高纯度酶制剂，这些因 素促进了微生物脂肪酶的研究。我国脂肪酶的研究有4 0 多年的历史。施巧琴【3 】于 1 9 8 1 年发表了我国第一篇关于碱性脂肪酶生产菌 册记f 肌研蹦即刀s “棚) 选育的研究 论文。目前微生物脂肪酶在洗涤添加剂、饲料添加剂、皮革毛皮脱脂、纸浆脱墨、 食品、医药等工业上有着广泛的应用。特别是在催化生物油脂生成生物柴油方面， 脂肪酶催化法显示了其巨大的发展前景【4 j 。 脂肪酶的产量、活力、最适作用温度、稳定性等问题一直是科学和生产实践共 同关注的热点问题。随着基因工程技术的迅速发展，大大加快了脂肪酶的研究步伐。 迄今，在巴斯德毕赤酵母( a 曲妇即5 幻，西) 中已成功的表达了十多种脂肪酬5 1 。毕 赤酵母表达系统的外源蛋白表达量可达细胞总蛋白的5 4 0 ，据报道破伤风毒素 蛋白的产量高达1 2 9 刖引。白咒砒妇r “g 口脂肪酶重组毕赤酵母菌经过2 8 0 h 的发酵培 养，酶活为1 5 0 u m l 【7 】；励c f 地s 咖e 册d c 口胞咒“肠f z 岱b t l 2 脂肪酶基因克隆至表达质粒 p p i c z a a ，在毕赤酵母g s l l 5 中表达，上清脂肪酶蛋白含量达3 0 9 ，0 0 0 u m l 【8 】；k o l l i l o 掣9 】利用蛋白质工程使砌z 叩“s 刀f y e “s 脂肪酶热稳定性z h l 提高了1 5 ；z l l e nq i 锄等【1 0 l 通过分子突变成功地获得了催化活性提高的白甩幽妇彳以砌厂c 矗叩i j p a s eb 突变体； a c h a r y a 【1 1 】通过定向进化使b s “6 “凰脂肪酶的半衰期延长了3 0 0 倍。可见分子生物技 术的发展为脂肪酶的工业化进程提供了广阔的前景。 本课题组的扩展青霉p f 8 9 8 是由出发菌株经过多代诱变而得到的一株具有工业 价值的脂肪酶高产菌株，可在碱性条件下分解三酰甘油产生脂肪酸及甘油【1 2 】。目前扩 展青霉脂肪酶( p e l ) 已实现了工业化生产。近年来本课题组完成了扩展青霉脂肪酶 c d n a ( g e n b a i l l 【a c c e s s i o nn o a f 2 8 4 0 6 4 ) 和基因组d n a ( g e n b a i l ka c c e s s i o nn o a f 3 3 0 6 3 5 ) 的克隆，该脂肪酶c d n a 由8 5 5 个碱基组成，编码1 个由2 8 5 个氨基酸 福建师范大学邹有土硕士学位论文 残基组成的酶蛋白，其信号肽及前肽部分由2 7 个氨基酸残基组成，成熟肽部分由 2 5 8 个氨基酸残基组成1 1 3 ，1 4 】，已经实现了其在大肠杆菌、真核细胞毕赤酵母以及在 酿酒酵母中的有效表达【1 5 ，1 6 l 。在此基础上，本课题组采用蛋白质工程的方法对p e l 进行改造，初步改善了p e l 的最适作用温度和热稳定性。袁彩【1 7 】通过定点突变技术， 使得p e l 的最适作用温度下降了1 5 。蔡少耐1 8 】利用叠加突变的方法改造p e l ， 使之热稳定性得到提高，其中p e i ，e p 8 k 1 1 5 r 叠加突变体热稳定性7 i m 比p e l 提高 了3 5 ，同时发酵上清酶活提高1 7 8 。 扩展青霉脂肪酶( p e l ) 在毕赤酵母g s l l 5 宿主菌中得到高效表达【1 6 1 ，林俊涵【1 9 l 通过增加p e l 在宿主菌中的基因剂量( 3 个拷贝) ，有效地提高了脂肪酶在毕赤酵母 中的表达水平，酶活比单拷贝工程菌提高了3 6 倍。两者均是在醇氧化酶启动子 ( n 伽) 下，以甲醇为诱导物进行表达。虽然甲醇可严格调控和诱导彳0 灯基因的 表达，且表达量高，但在某些情况下，该启动子仍不太合适、方便。例如，在锥形 瓶中培养，甲醇易快速蒸发，难以检测甲醇浓度，且重复添加甲醇，操作麻烦；另 外，大量甲醇存在大容积、高密度的发酵罐中，可能成为火灾的隐患，而且不适合 食品等蛋白的生产。甘油醛3 磷酸脱氢酶基因 ( 舀y c e r a l d e h y d e s - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ，g z p ) 启动子具有很强的组成型表达能力， 且以葡萄糖、甘油等无毒物质为碳源，表达时无需更换碳源，发酵工艺更为简纠加1 。 本文以例p 为启动子( p 谢，在毕赤酵母g s l l 5 中实现了p e l 的高效表达；并 通过p e l 基因定点突变基因工程技术构建9 个扩展青霉脂肪酶表达突变体，以期获 得热稳定性得到改善的工业用酶。 1 2 毕赤酵母表达系统 在近2 0 年来，巴斯德毕赤酵母( a 幽妇朋s 幻胁) 已经成为一种能够高效表达外 源重组蛋白的表达系统，见表1 1 1 。大多数毕赤酵母应用菌株都是来源于野生型 y - 1 1 4 3 0 【2 1 l 。目前应用的表达宿主菌有g s l l 5 、l 洲7 1 、p m a d l l 、p m a d l 6 等，见 表1 1 2 。它们均含有彳0 衄基因，在甲醇为唯一碳源时，彳0 船启动子被强烈诱导， 宿主菌以野生型速率生长。而蛋白酶缺失的宿主菌s m d l l 6 8 、s m d l l 6 3 、s m d l l 6 5 ， 可减少表达蛋白的降解，对表达蛋白酶敏感的蛋白具有重要意义。 毕赤酵母是一种嗜甲醇酵母，能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长， 这是由于其胞内过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径的必需酶，如醇氧化酶( a l c o h o l o x i d a s e ，彳似) ，二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中醇氧化酶是甲醇利用途径中 第l 章绪论 的第一个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛和过氧化氢【勿。当细胞在以葡萄糖、甘油、 乙醇为碳源的培养基中生长时，不能检测到任何的彳凹的活性，而将碳源换成甲醇 时，醇氧化酶可达胞内可溶性蛋白的3 0 因j 。 由于该表达系统的诸多优点，人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统 来生产目的蛋白。自1 9 8 7 年g r e g g 等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原 ( h b s a g ) 以来，国内外已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。许多有代表性的 外源蛋白已经获得高效生产，例如：( 1 ) 疫苗抗原类：破伤风毒素片段c 、乙肝表面 抗原、百日咳抗原p 6 9 、h 1 外膜糖蛋白g p l 2 0 、登革热病毒e 蛋白等f 铊7 1 ；( 2 ) 细胞因子类：肿瘤坏死因子( tnf ) 、表皮生长因子、内皮素抑制因子、巨噬细胞 抑制因子、人和鼠的内因子等【2 8 。3 1 】；( 3 ) 蛋白酶类：人溶菌酶、a 葡萄糖苷酶、乙醛 氧化酶、人胃促胰酶、人肝单胺氧化酶、人胎盘碱性磷酸酶掣3 2 。3 7 1 ；( 4 ) 蛋白类激素： 胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素等【3 8 ，4 1 】；( 5 ) 抗体及单链抗体、受体等生物活性蛋 白【4 0 1 2 】 uo 越来越多的外源蛋白成功表达的例子证明，巴斯德毕赤酵母表达系统是用来表 达复杂真核蛋白的一类较为理想的表达系统，在基因工程产品产业化生产中具有很 好的商业前景。近年来，随着对该甲醇营养酵母分子遗传学研究和认识的进一步深 入和实践经验的不断积累，人们已经生产出更多更好的来自人类、动物、植物和微 生物的活性蛋白，对整个生命科学和人类健康产生重要影响。当然，作为一种表达 系统，毕赤酵母也存在一些不足之处，如发酵周期长，易污染，筛选成本高，也存 在一些蛋白的低表达或不表达。随着对该系统不断深入的研究和实践积累，相信不 久的将来，它将在分子生物学及工业应用的各个领域发挥更大的作用。 表1 1 1 毕赤酵母表达系统的优点 1 a b l e1 - 1 - 1t h es t r o n g p o i n to ft h e 融缸p 口s 肭e x p r e 豁i o ns y s t e m 3 福建师范大学邹有土硕七学位论文 表1 1 2 毕赤酵母宿主菌一览表 t a b l e1 1 2n ea 幽缸即s f d 胁s t a i n s 1 2 1 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达系统的载体主要分为附加型和整合型。附加型载体由于含有来自 酵母天然质粒躯复制起始点序列，能够独立于酵母染色体外自主复制，拷贝数通常 可达3 0 以上。但是不稳定，在传代过程中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。 巴斯德毕赤酵母表达系统所用载体一般是采用整合型质粒作为外源基因的表达载 体，亦即穿梭载体。目前，i l l v i t r o g e n e 公司已开发出多种表达载体，常见的胞内表 达载体有p p i c 3 、p p i c 3 5 k 、p h i l 广d 1 、p h i l 广d 2 、p a 0 8 1 5 、p p i c z 、p q 廿z 等； 常见的分泌型表达载体有p p i c 9 、p p i c 9 k 、p h l l s l 、和p p l c z a a b ，c 系列等。 表1 2 1 毕赤酵母的常见表达载体 1 一a b l e l 2 1t h eg e n e r a le x p 陀s s i o nv e c t o r0 fm 谊p 口s 正d ，妇 第1 章绪论 用于转化适合酵母宿主细胞的表达载体的大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒，其主 要元件包括：启动子，信号肽，多克隆位点，终止子，选择标记，以及可以诱导基 因发生重组的同源序列和在大肠杆菌中的复制起点及抗药性基因。复制起点及抗药 性基因是由来自酵母的部分基因序列和细菌的部分基因序列所组成。原核部分主要 包括可以在大肠杆菌中复制的起始序列( d ，f ) 和特定的抗性基因序列( 如a m p ，k 觚 抗性基因) 。这两部分主要是作为在大肠杆菌宿主中的增殖和筛选组分。酵母部分包 括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列( 如衄s 4 基因序 列) 或特定的抗生素抗性基因序列( 如：抗z e o c i n 和n e o m y c i n 的基因序列) ，以及编码 特定蛋白的基因启动子和终止子序列。后两者之间为多克隆位点。通常外源编码序 列的第一个盯g 与彳0 灯的a t g 距离越近，表达效果越好1 4 3 1 。该位点通常与大多 数多克隆位点的第一个限制性酶切位点一致。 1 2 1 1 启动子 毕赤酵母作为表达宿主菌，需要一个强启动元件，人们根据不同酵母菌的研究 已发现了多个可以利用的强启动子。最早成功应用的启动子是巴斯德毕赤酵母醇氧 化酶启动子( a l c 0 h o lo x i d a s e “0 灯) 。对于异源蛋白在大体积、高密度发酵罐中的培 养，只朋s 幻廊酵母玖d 肌得到了有效、广泛的应用。甲醇可严格调控和诱导彳0 盼 基因的表达，以甲醇为碳源进行摇瓶培养时，彳0 灯基因编码的醇氧化酶可达细胞 可溶性蛋白总量的5 ，用发酵系统培养时可达到或超过细胞可溶性蛋白总量的3 0 。彳0 灯基因表达水平的调控发生在转录水平，以甲醇为碳源生长的细胞能检测 到彳0 灯基因的转录( 占总m 对峪的5 ) ；而在其它碳源中生长的细胞则检测不到 彳d 肌转录的信息，据此可用甲醇诱导巴斯德毕赤酵母表达外源目的蛋白。彳o 盼存 在抑制去抑制和诱导两种调控机制：培养物中抑制物( 如葡萄糖) 去除后，并不能 使彳0 肌基因大