（植物学专业论文）喜树细胞培养生理、生化特性的研究.pdf

、 象， 石 贞 士学位论文 m k s t f r s t h e s i s 细胞生长速度慢时有明显区别，显示了细胞生长和生理生化特性之间的 相关性。 在喜树细胞固体培养中，适宜的接种量为3 g 鲜重 / 5 0 m 1 培养基;蔗 糖的最佳添加量为 3 0 g / l ;作为碳源，葡萄糖的效果优于蔗糖，随着葡 萄糖的浓度升高，细胞生长速率呈上升趋势，且在葡萄糖浓度为 3 0 g / l 时最有利于细胞生长;添加 0 . 1 %的琼脂糖能促进喜树的细胞生长;而水 解乳蛋白却对细胞生长有抑制作用。 关键词:愈伤组织诱导 细胞生长 光照 喜树 理化因子 b 6 士学位论文 1 i % s t e r s t h e s i s _一-.一. 一 ab s t r a c t c a m p t o t h e c i n i s a k i n d o f a n t i c a n c e r m e d i c i n e h a v i n g g o o d p r o s p e c t o f e x p l o i t a t i o n . b u t l a c k i n g o f r e s o u r c e s , p r o d u c t i o n o f c a m p t o t h e c i n b y c e l l c u l t u r e m a y b e a p r o mi s i n g c h o i c e . i n t h i s p a p e r , b a s e d o n t h e y o u n g l e a v e s o f c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a d e c s n e . , c a l l u s w e r e i n d u c e d a n d s c r e e n e d , a n d t h e i n fl u e n c e s o f l i g h t , h o r m o n e s a n d s e v e r a l f a c t o r s o n t h e g r o w t h , p h y s i o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r s o f s o l i d c u l t u r e o f c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a d e c s n e . w e r e p r i m a r i l y s t u d i e d , t h e r e s u l t s w e r e a s f o l l o w s : t h e o p t i m a l m e d i u m o f c a l l u s i n d u c t i o n a n d g r o w t h o f c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a d e c s n e . w a s b 5 w i t h t h e a d d i t i o n o f 0 . 5 m g / l 2 , 4 - d , 1 . o m g / l n a a a n d 0 . 5 m g / l k t . i n d i f f e r e n t l i g h t q u a l i t i e s , t h e c e l l g r o w t h c i r c l e s w e r e a b o u t 2 7 d a y s , a n d t h e c e l l g r o w t h c u r v e w a s l i k e s . t h e g r e e n l i g h t a c c e l e r a t e d c a l l u s s g r o w t h , w h i l e t h e b l u e l i g h t d i d t h e o p p o s i t e e f f e c t . wh e n c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a d e e s n e . wa s c u l t u r e d i n d i f f e r e n t i l l u mi n a t i v e c o n d i t i o n s , t h e c o n t e n t s o f s o l u b l e p r o t e i n , a c t i v i t i e s o f p e r o x i d a s e ( p o d ) , s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) a n d e s t e r a s e a l l s h o w e d t w o p e a k s w h i c h w e r e o n t h e d i f f e r e n t d a y s ; t h e v a r i e t i e s o f t h r e e e n z y m e s a c t i v i t y w e r e a l l c o n s i s t e n t w i t h w h i c h c . a c u m i n a t a s c e l l t r o w t h r a t e i n i l l u mi n a t i o n w a s q u i c k e r t h a n t h a t o f i n d a r k . t h e e l e c t r o p h o r e s i s a n a l y s i s o f p r o t e i n s c o m p o s i t i o n a n d i s o z y m e s s h o w e d : t h e y a l l h a d c h a n g e d i n c a l l u s c u l t u r e c y c l e a n d r e v e a l e d t h e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e c a l l u s g r o w t h a n d p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e mi c a l c h a r a c t e r s . i n t h e s o l i d c u l t u r e , t h e i n o c u l u m q u a n t i t y o f 3 g . f w/ 5 0 ml m e d i u m w a s b e t t e r ; t h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n o f s u c r o s e w a s 3 0 g / l; a s t h e s o u r c e s o f c a r b o n , t h e e f f e c t o f g l u c o s e w a s b e t t e r t h a n t h a t o f s u c r o s e , a n d t h e m e d i u m w i t h 3 0 g / l g l u c o s e w a s g o o d t o c e l l g r o w t h ; t h e m e d i u m w i t h a d d i t i o n o f 0 . 1 % a g a r o s e i n c r e a s e d t h e q u a n t i t y o f c e l l g r o w t h , b u t l h i n h i b i t e d i t . ke y w o r d s : c a l l u s i n d u c t io n ; l i g h t ; p h y s i c a l a n d c h e m i c a l f a c t o r s ; c e l l g r o w t h ; c a m p t o t h e c a a c u mi n a t a d e c s n e . 、纂 b ;1 士学位论文 t l s t e r s t h e s i s 第一章前言 随着人类对植物资源化学组成的不断了解，开发利用的植物种类逐 渐增多。在众多的资源植物中，药用植物越来越受到重视，人们力图从 植物中去寻找高效、低毒、价廉的植物药，尤其是用于严重危害人类生 命和健康的疾病，如心血管、癌症、爱滋病等。生物技术的突飞猛进， 尤其是植物细胞全能性的广泛证实，科学家们借鉴微生物发酵工业的成 就和经验，已能够通过高等植物细胞的大量培养，即植物生物工程以获 得某些有用的次生代谢产物。 喜树 ( c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a d e c s n e . ) 为琪桐科旱莲属植物， 别名 旱莲木、水桐树、千张树，是我国特有的植物。为落叶乔木，高 2 0 - 2 5 米，树干直， 树皮光滑，单叶互生。分布于长江流域及西南各省，台湾、 广西等地亦产。喜温暖气候，不耐严寒。根、果及树皮、树枝、叶均入 药。含有抗肿瘤作用的生物碱:喜树碱、喜树次碱及 1 0 - 羚基喜树碱、 甲氧基喜树碱等2 6 1 喜树碱 ( c a m p t o t h e c i n e , c p t ) 是色氨酸一 菇烯类生物碱， 功能抗癌、 清热、杀虫，是继紫杉醇之后又一个从植物提取衍生的抗癌药物，也是 一类化学合成困难和成本很高的临床植物用药。1 9 6 6 年， 美国北卡罗来 纳大学、 伊利诺伊大学和n c i 的研究人员w a l l 等川首次分离得到喜树碱 并确定了它的化学结构。此生物碱在体外对 h e l a细胞，1 . 1 2 1 。 细胞和啮 齿类动物显示出较强的抗癌活性，引起人们的极大关注 $ i 从 1 9 6 8年开始，我国即对这一特有植物开展了研究工作，c p t钠 盐 7 0年代初即用于临床，证明对胃肠道腺癌、绒毛膜上皮癌、圆柱形 腺癌即急慢性粒细胞白血病等恶性肿瘤有一定疗效，但部分病人有尿 血、 尿急、 尿频等副作用。 鉴此， 研究人员又将目光转向c p t的衍生物， 发现 1 0 - 基喜树碱钠盐对胃腺癌有一定疗效，且未见明显副作用，引 起了人们的重视。其后的研究则主要着眼于喜树中所含化学成分的分离 鉴定及c p t的分离纯化。 在临床上试治各种癌症、急慢性白血病等，外 用以治银屑病。 近年来，对喜树碱的研究主要集中在以下几个方面。 图 黔 t5 r u*i 轰 1喜树碱类药物研究 1 9 8 5 年， 美国h i s a n g 等3 发现c p t 能 使 哺乳 动物细胞中的d n a 迅 速地片段化，认为c p t能阻断细胞中d n a拓扑异构酶 i ( t o p o - i )断 裂一 复合反应中的再结合步骤，即抑制了t o p o - 1 的活性，t o p o - 1 能使 超螺旋d n a解旋， 在d n a复制、 转录、 重组以及染色体凝集等方面有 重要作用。 正是这一发现使 c p t又重新受到广泛的重视。 c p t的抗癌效 果很好，但水溶性差、毒副作用大的缺点限制了其临床应用。因此，人 们一直在寻找水溶性更好、 抗癌活性与c p t类似或更高的 c p t类似物， 至今己得到合成或半合成c p 丁类似物近二十种， 其中部分正在进一步的 临床试验中。几种主要的抗癌c p t 类似物结构式如图1t21. 喜树碱，r = r = r 2 = r 3 = h 1 0 - 轻基喜树碱，r = r r = r 3 = h , r 2 = 0 h 1 0 一 甲 氧基喜树碱，r = r = r 3 = h , r 2 = 0 m e 9 - 硝基喜 树碱， r = r 2 = r 3 = h , r = n 0 2 9 - 氨基喜 树碱， r = r 2 = r 3 = h , r r = n h 2 1 0 , 1 1 一 亚甲 双氧喜树碱， r = r r = h , r 2 = r 3 = 0 c h 2 0 7 一 乙基一 1 0 - 4 - ( 卜 六氢毗睫) - 1 - 六氢毗吮j 碳酞氧喜树碱 ( c p t - i i。 !肇: 硕士学位论又 u 6 t e r s t 1 1 f s 1 5 1 1 ) ， r i = r 3 = h , r = c 2 h 5 , r 2 =-0 -c -n 9 一 二甲 氮甲 基 一 l 0 - 轻基喜 树碱( t o p o t e c a n ) , r = 刃= h ,r 2 = o h , r i = c h 2 - n ( c h 3 ) 2 h c l 图1喜树碱和喜树碱类似物 依莲洛特肯 (i r i n o t e c a n , c p t - 1 1) 和拓扑特肯(t o p o t e c a n , t p t) 均为喜树碱的半合成品，对一系列小鼠体内的人类克隆肿瘤移植物均有 很好的抑制作用，且没有明显的毒副作用。现已得到美国f d a的认可， c p t - 1 1 用于治疗结肠癌， t p t用于治疗卵巢癌1 9 1 0 c p t及其衍生物对固 体肿瘤的治疗也有所进展， 临床上对非小细胞的肺癌， 宫颈癌，卵巢癌， 结直肠癌和乳腺癌有效率达2 0 - 3 0 %，对小细胞癌有效率达 3 0 - 4 0 %，加 顺铂治疗对非小细胞癌有效率达4 0 - 5 0 % 1 3 1 。其它c p t 衍生物还很多， 如 9 - 氨基喜树碱 ( 9 - a c ) ，也己被证明对免疫缺陷型小鼠体内带有的三 种人类结肠癌细胞系疗效显著， 且毒性较低2 1 1 。 而1 0 - 经- c p t 是这一系 列药物中活性最强的，可惜它的天然含量比c p t少 1 0倍，但朱关平等 2 2 1 经筛选发现， 曲酶t - 3 6 菌株能实现从c p t到 1 0 - 轻- c p t的生物转化。 美国超基因公司(s u p e r g e n) 最近又从喜树中新获得一种抗癌有效成 分 ( 类似 c p t - 1 1 和 t p t ) ，命名为 r f s - 2 0 0 0 ，也是 t o p o - 1 抑制剂，用 它治疗胰腺癌，能使存活率提高一倍，且口服副作用很小，该公司认为 此药将全面超过紫杉醇l l 2 喜树碱的作用机理研究 2 . 11 喜树碱的抗癌作用 s t e w a r t l4 认为， c p t 对d n a t o p o - 1 的 抑制作用依赖于c p t 对旋转 的直接作用，而 d n a 的旋转又是由 t o p o - 1中带负电的连接结构域 ( l i n k e r d o m a i n)决定的，故 c p t的作用目标实际上是此结构域。 p a n t a z i s 16 认为c p t 能与d n a t o p o - i 复合物连接， 从而破坏d n a的复 制，缺少复制 d n a 的细胞最终将进入细胞程序性死亡或凋亡 。但 d e p t a l a 等 s 7 却认为， 正是c p t 损伤了r n a聚合酶， 引 发的碰撞诱导了 石 节 士学位论又 、 1 、 、 r 、川 、 宜 、 育 g ， 期细胞 核中p 5 3 的积累 及 细胞周期 依赖 性激酶抑制因 子p 2 i w a f 的 产 生。 g 。 期细胞的变化引起了己 被c p t 损伤的d n a复制叉的碰撞， 最后 导致核中p 5 3 的积累、前凋亡蛋白b a x 的产生以及细胞的凋亡。最近， c o h e n 等1 7 1 在慢性 b细胞淋巴白血病 ( b - c l l )病人的淋巴细胞毒性实 验中发现， c p t衍生物能抑制护 h 尿营的掺入， 故推* j c p t 衍生物对淋 巴细胞的作用主要和 r n a合成的抑制有关，而不是 d n a合成的抑制。 由以上实验得知， c p t 在抗癌方面的作用可能同时表现在两个方面， 一是对 d n a复制的抑制;二是对 r n a合成的抑制。 2 . 2 喜树碱抗反转录病毒作用 我们已经知道，c p t是真核细胞t o p o - i 的专性抑制剂。近年来的 研究表明，c p t不仅具抗癌活性，还有抗反转录病毒、真菌以及人类乳 头瘤空泡病毒的活性。p r i e l 等( 1 3 在研究中发现，马传染性贫血病毒 ( e i a v ) ， 人体免疫缺陷性病毒 i型( h i v - i ) ， 莫罗尼氏鼠类白血病病毒 ( m o - m u l v ) 颗粒中均存在t o p o - i 的活性。 在e i a v中， 具t o p o - i 活性 的酶位于病毒的核心， 虽然此酶和细胞的t o p o - i 特征不同， 但e i a v p i i 的核衣壳蛋白和t o p o - 1 却有着类似的抗原决定簇， 而且此酶也能被c p t 所抑制。实验证明，非细胞毒性剂量 ( 指既能抑制复制，又不影响宿主 细胞的生活力和生长率的剂量)c p t作为一种抗 e i a v药物，能够阻断 慢性感染细胞中e i a v的复制。 相反， t o p o - i i 专性抑制剂a r n s a c r i n e 对 e i a v的复制却不起任何作用。 由此可见， e i a v的复制是直接与t o p o - i 相关的。c p t对 e i a v 的抑制并不是专性的，研究人员在实验中将 mo - mu l v和f r i e n d 脾病灶形成病毒 ( s f f v ，能引起红白血病)分别感 染小鼠， 在活体中测试了非细胞毒性剂量c p t的作用。结果表明，c p t 能有效抑制感染早期 mo - mu l v和 s f f v的复制及整合，且未见任何毒 副作用12 1 1 。此外，低剂量的c p t能抑制e i a v p 2 6 的表达， 却不影响整 体蛋白质的合成， 故推测病毒 r n a的合成可能对 t o p o - i 的抑制更为敏 感，即t o p o - i 直接参与了病毒蛋白质的表达， 但对 t o p o - i 在 e i a v生 活史中的地位和作用还有待于进一步的研究。 h i v - 1 是 a i d s病原体 h i v的原病毒， 被 h i v - 1 或其它人类反转录 :暑 b 1 士学位论文 m a s t e r s t i i e si s 病毒感染后，需经过反转录、整合、从原病毒 d n a转录的程序形成原 病毒。因此，h i v - 1的转录是病毒复制必不可少的步骤，而原病毒的表 达又是由长末端重复 ( l t r )控制的，所以病毒的复制和进行性免疫抑 制实际是与l t r的活性相关的。 l i 等【 1 4 . 1 5 1 在研究中发现， c p t能同时 抑制 h i v - 1 l t r的顺式和反式激活，前者由肿瘤坏死因子a ( t n f ) 和乙 酸肉豆u佛波醇( p m a ) 介导， 后者由与反式激活应答顺序( t a r ) 基元相连 的一种病毒反式激活子( t a t ) 介导。实验结果表明c p t 通过t a r的介导 能选择性的抑制 h i v - 1 l t r的定向基因表达。此外，c p t不能抑制劳式 肉 瘤病毒( r s v ) 启动子的活性和细胞基因g r o的表达，这些都说明 c p t 抑制的对象是一种特异的转录因子。 对这种高度选择性机制的解释有两 种: 一是d n a t o p o - i 可能选择性地与t a t / t a r或它们相连的蛋白质作 用，从而影响了t a t / t a r介导的转录;二是 c p t对 h i v - i l t r的抑制 与它对 d n a t o p o - i 的抑制无关， c p t的真正目标可能是一种新的细胞 因子，可能就是与t a t / t a r相连的蛋白质。 一般的抗病毒药物主要在两个方面起作用， 一是在病毒感染早期阻 断其复制， 二是在慢性感染细胞中抑制病毒的表达。而c p t对病毒的抑 制作用同时表现在这两个方面。因此，c p t在这一点上优于其它的抗病 毒药物。 从以上资料可以看出， 非细胞毒性剂量的c p t极有希望发展成 为一种普遍的，正规的抗反转录病毒药物。 3 扩大喜树碱药源途径的研究进展 p e r d u e 1 6 的研究认为， 喜树产生c p t的部位是树皮， 茎干和种子。 随着人们对半合成衍生物的认可，以及在肿瘤治疗上对 c p t及其衍生 物的持续研究，c p t的需求量将迅速增加。为了避免喜树资源的严重破 坏，人们展开了对 c p t药源的研究。 1喜树碱积累部位和持续收获 1 9 9 4年， l o p e z - m e y e r ( 1 7 等收集温室内 1 1 个月树龄喜树的不同组 冷冻干燥后提取 c p t和 1 0 - 经- c p t ，再用 h p l c定量测定。 3.织 员发现 c p t含量最高的部位是茎端的幼叶，而枝干上叶中 c p t 研究人 含量却 6 ,5 士学位; 仑 又 爵 火匕夕尹、 ， 州 r、 急剧下降。 这就意味着c p t的含量与叶龄有关， 与它们的绝对位置无关。 1 0 - 轻- c p t的含量在树皮中是最高的，与c p t的含量多少无关。虽然幼 叶中c p t含量极高，但却没有证据显示 c p t的合成部位是幼叶，实验 结果表明，c p t生物合成的早期发生在其它组织中，之后，c p t或一种 水溶性前体才被运输到生长点。1 9 9 7年，v i n c e n t 1 8 1 等设计了一系列的 实验，以确定喜树幼叶是否能成为 c p t的一种持续性资源。 他们发现每 4或 6 周采集的新叶能基本保证 c p t的含量， 此收获周期也能保持树木 老叶和促进侧芽发育。 但由于喜树本身产c p t的个体差异极大， 故建议 选用高产量的树木。以上实验为c p t提供了一个简便、 成本低廉且不具 毁坏性的药源。 3 . 2喜树组织培养研究 利用离体培养的喜树细胞生产 c p t及类似物是扩大 c p t来源的重 要途径。它具有不破坏自然资源及不受自然条件限制等优点。 喜树体外培养的研究始于 1 9 7 3 年， mi s a w a 等进行了喜树的组织培 养。他们从喜树茎、叶等得到的愈伤组织及其培养细胞，分别培养 1 月 和 1 5 天后能累积喜树碱， 但其含量很低， 仅为原植物的十分之一。 s a k a t o 等2 6 . 2 7 于1 9 7 4 年报导了 喜树愈伤组织和悬浮培养细胞的生长情况以 及 从悬浮培养细胞中分离和鉴定c p t 的方法。 1 9 9 2 年a rj o n 2 8 1 又试验了 不 同培养基上喜树愈伤组织诱导和细胞悬浮培养的情况。他们用 t l c , h p l c和 g c - m s 三种方法精确测定了c p t的含量，并与原始植物材料 中c p t的含量做了比较， 得出结论: 喜树愈伤组织的最佳诱导培养基和 细胞悬浮培养的最适培养基都是 ms( 盐类)十 b 5( 有机类) ，且 n a a 或 2 , 4 - d是必需的激素 因子; cp t 只在胞 内积 累， 不 向胞外释放 ; c p t含 量 与 细胞 生 长 呈 正相 关， c p t的产 量受naa的 调 控 和 培 养 基 中 蔗 糖 含 量 的 限制 。 1 9 9 6 年， a s h o k 9 1等又成功地通过顶芽 培养， 实 现了 喜树的克隆繁 殖，且移栽成活率超过9 0 %。研究人员运用组织培养方法，在体外对幼 年喜树的顶芽进行增殖，再使其分别生根，最后移栽;对喜树克隆繁殖 所需的条件也进行了摸索， 结果认为试管苗的最适基本培养基为b 5 ， 可 硕士学位论文 i % s tf r s t l i . si s 能是b 5 中n 0 3 - / n h a + 的高比例更适合喜树顶芽的生长; 最适生芽培养基 中的植物激素只能是 b a ;最适生根培养基中的植物激素是 i b a。这一 实验为喜树的大量快速繁殖提供了方法。 3 . 3 基因工程研究 虽然通过人工合成的途径已经能够得到 c p t ，但此途径却步骤多、 路线长、 成本高。 而c p t生物合成的精确途径尚不清楚， 利用分子生物 学和基因工程方法进行基因表达尚有一定难度， 但近年来对 c p t生物合 成过程中的关键酶研究己 取得了一些积极进展12 3 . 2 a o c p t生物合成过 程中，h mg r ( 3 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m e a r e d u c t a s e )可能 是一个限速酶， h mg r能催化 h mg - c o a转化成甲轻戊酸，甲轻戊酸又 能合成类异戊二烯，而类异戊二烯不仅是植物体内次生代谢物的原料， 更是一些重要基础代谢物的前体物质，是叫 pr生物碱的合成原料之一。 b u r n e t t 2 5 1 等己 于1 9 9 3 年 从喜 树中分离到h m g l 基因。 此酶由5 9 3 个氨基 酸组成， 有三个内含子， 大约在种子发芽两周时表达。 研究人员还把h m g l 的启动子与g u s 融合并转入烟草， 发现伤害和茉莉酸甲酷能诱使 g u s 活 性迅速增强1 5 - 2 0 倍。 可以看出，茉莉酸甲酷对于h m g l 的启动及之后 的 c p t生产是一种非常有效的诱导子，但这一点尚需在实验中证实。 c p t 生物合成途径中还有一个重要酶，那就是色氨酸脱梭酶 ( t d c) o 它能将色氨酸转化成色胺，从而向叫睬生物碱的前体 s t r i c t o s i d i n e提供 合成原料。 它直接衔接了植物的初级和次级代谢， 所以也是 c p t合成中 的调节酶o l o p e z - me y e r 等从喜树基因文库中筛选到t d c l 和t d c 2 两个基 因。 前者在种子发芽十天，即c p t和 1 0 - 轻- c p t含量达顶峰的前两天时 达到最大表达。 用酵母提取物和茉莉酸 甲酷处理， 都能诱导 t d c 2的表达， 但 c p t和 1 0 - 轻- c p t的含量却没有增加。由此可见，t d c i 和 c p t的合 成相关; t d c 2 和环境胁迫有关，与c p t的合成无关。 随着这些关键酶的 克隆和研究，极有可能在将来建立起转基因的微生物体系以大量生产 cp t. 总之，抗癌药物喜树碱应用范围的不断扩大，己使开发、利用喜树 成为一个备受瞩 目的研究课题。随着分子生物学、基因工程方面研究的 髦 : 硕士学位 论文 1 1 sc e r 5 : . i e s i s 不断深入，进行工业化生产以制备喜树碱类抗癌药物将为期不远。 目前，可用的获得高细胞培养物和次级代谢物产量的最令人满意的 方法是两步法:第一阶段尽可能快地获得高水平的细胞生物量，第二阶 段是使次级代谢处于活化状态，大量生产次级代谢物。这样通过两步培 养法，在离体条件下植物次级代谢物的生产可以达到或超过原植物的产 量，从而达到商业化生产。植物本身的遗传特性、生长状况和形态分化 等因素对所建立的细胞培养物中次级代谢物的含量有很大的影响。通过 调节环境中的物理和化学因素不仅可以影响培养细胞的生长量，还可以 调控次级代谢物的合成和积累的程度。外界环境条件包括光照、温度、 搅拌以及接种量的大小等，内部环境条件包括培养基成分、前体、胁迫 因子、通气和培养物的混合以及培养基的p h值。 本文以喜树幼嫩叶片为材料，初步探讨了光照、激素、理化等部分 因子对喜树愈伤组织诱导和生长的效应，为获得高水平的喜树细胞生物 量打下一些基础。 肇: 硕士学位 论文 u a s 丁 f r % r f ; f s t s 第二章喜树愈伤组织的诱导 1材料和方法 1 . 1实验材料 供试材料为华师校园内春天初发的喜树 ( c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a d e c n e . ) 幼嫩叶片。 1 . 2 培养基 采用 b s 基本培养基，附加 2 %蔗糖及不同浓度的 2 , 4 - d. n a a . 6 - b a和 k t ，调至 p h 5 . 8 ，加 0 . 9 %琼脂，在高压灭菌锅中 1 2 0 下消毒 1 5分钟。 1 . 3 愈伤组织的诱导 取喜树幼嫩叶片，用清水冲洗干净，再用 7 0 %乙醇浸一下，放入 0 . 1 %升汞溶液中消毒 6分钟，无菌水冲洗数次。将叶片剪成 4 x 4 m m2 大小的块，接种于按正交设计法设计的培养基中 ( 见表2 ) , 2 5 培养。 观察各种培养基中愈伤组织产生的时间及长势，1 5天后统计各培养基 中的愈伤组织块数，计算愈伤组织诱导率 ( 愈伤组织诱导率= 愈伤组织 块数/ 接种的叶片块数) ，并从中选取喜树愈伤组织生长的最佳培养基。 表 1 l 16 ( 4 5 )因素和水平表 因素 水 平 a 2 , 4 - d浓度 ( m g / l ) 曰 n a a ( m g / l ) c d 浓度 6 - b a浓度k t浓度( m g / l ) ( m g / l ) 2结果与讨论 2 . 1 不同培养基对喜树愈伤组织诱导的作用 不同培养基对喜树愈伤组织诱导的作用见表 2 . 硕士学位论文 n 4 5 f f r s 丁 l i 卜 表 2 不同培养基对喜树愈伤组织诱导的作用 因素 实验号 a 2, 4 - d b 1 1 3 a c na d k i e y 夕 愈伤组织 诱导率 ( %) -6峪 -，、气4 -0111凡 11，山，jj任 112、j.斗 112，jq 11，廿1气j4 11气乙，j4 ，一，乙 ，jjq，.1 ，一弓乙 20，才 气j内j.阳咔1 ，、月马1饰乙月特，j勺1 ，j月呀1，山，j4 ，、，jrjrj月t444 nui，、j件气丈u 0”0了1111111 2 . 2 正交实验结果分析 正交实验结果分析见表 3 0 其中k表示各因素列中相同水平所对应的诱导率之和，用k , , k 2 , k 3 , k ; 分别表示各因素列的第 1 、第 2 、第 3 、第 4水平所对应的诱导 率之和。 k表示各因素列中相同水平下的平均诱导率， k = k / 水平重复数， 以k , , k 2 , k 3 , k 4 分别表示各因素列在第 1 、第2 、第3 、第4 水平下的 平均诱导率。r值为极差，可衡量k 值波动的幅度大小，决定因素的主 次顺序，r = k 值中的最大值一k 值中的最小值。r 。 为空列r值。 表 3 实验结果分析 因素a ( 2, 1 5 5 3 4 5 . 7 3 21 . 2 3 6 5 . 3 3 8 . 7 5 4 - d)b ( i b a) 2 8 3 . 6 2 7 6 . 6 2 9 6 . 7 3 2 9 . 3 7 0 . 9 c ( 6 - b a) 2 2 9 . 3 2 91 . 2 31 4. 2 3 51 . 5 5 7 . 3 2 5 d ( kt) 2 6 0. 5 2 4 9. 6 3 21 . 1 3 5 5 6 5 . 1 2 5 e( 空列) 2 5 7. 8 2 7 3 . 8 3 21 . 6 3 3 3 6 4. 4 5 ki从札暇kl 8 6 . 4 2 5 8 0 . 3 91 . 3 2 5 5 2 . 5 7 5 6 9 . 1 5 7 4 . 1 7 5 8 2 . 3 2 5 1 3 . 1 7 5 7 2 . 8 7 8 . 5 5 8 7 . 8 7 5 3 0 . 5 5 6 2 . 4 8 0 . 27 5 8 8 . 7 5 2 6 . 3 5 6 8 . 4 5 8 0 . 4 8 3 . 2 5 1 8 . 8 ( r d 场幻城r 本实验中， r a r c r p r q r b ， 所以b因素， 即i b a的效应是不可靠 的。a , c , d三者中，a是主要因素，c , d次之，进一步在实验中验 证得出最优水平组合为2 , 4 - d o .5 + n a a i .o + k t o . 5 . .，j月.ji|扳 、肇) 硕 士 学 位 论 又 、 以s t f r s i i i e 1i s 第三章不同光质对喜树愈伤组织增殖 及生理生化特性的效应 、，、吸1毛 1 材料和方法 1 . 1 实验材料 喜树愈伤组织由喜树叶片诱导、继代而来。 1 . 2 培养方法 以 b 5 + 2 , 4 - d o .5 十 n a a i .o + k t o 。 为基本培养基，实验中每试管分装 i o m l 培养基，每管接种量约为2 0 0 m g 愈伤组织， 分别在黄光、蓝光、红 光、绿光、白光 5 种光质的培养箱中培养，以黑暗培养为对照，各种光 源均系冷光源，由复旦大学光源研究所研制，荧光灯主要技术参数如表 4 ，各单色光处理每天光照 1 0 - 1 2小时，光照强度 1 5 0 0 - 2 0 0 0 l u x ，培养 温度 2 5 c ( 实验中若无特殊说明，条件相同) 。 表 4 不同光源 卞91林犬参豹 处 理黑暗 白光红光 黄光绿光 41 0 - 6 9 06 0 0 - 9 0 0 蓝光 4 1 0 - 5 4 05 2 0 - 65 0 4 9 0 - 5 9 0 ( n m) 波长 ( n m) 额定 (w ) 峰值 6 6 0 5 8 0 功率 1 .3 数 据 统 计一 接种后每隔2天，取不同光质条件下培养的愈伤组织，称重并计算 出每管愈伤组织的生长量 ( 鲜重) ，绘出愈伤组织增殖曲线，实验重复 三次， 取平均值。 2生理生化指标测定 接种后，每隔两天取材一次，按 1 : 2 ( v: w)加双蒸水4 下冰浴 匀浆，低温离心 ( 1 2 , o o o r p m) 2 0 分钟，取上清液供分析用。 硕士学位论文 ma s t e r s the si s 2 . 1可溶性蛋白质含量测定 用f o l i n - 酚试剂法 3 0 进行 测定， 单位为 毫克 / 克 鲜重( m g - g -f w) , 以小牛血清蛋白作标准曲线。 f o l i n酚试剂甲:将溶液 a 5 0 m l 与溶液 bl ml 混合即成，现配现用。 溶液a : 1 g 碳酸钠溶于5 0 m l 0 . l m o l / l 氢氧化钠中。 溶液 b :将 1 %硫酸铜和 2 %酒石酸钠 ( 钾)等体积混合。 f o l i n酚试剂乙:在 1 . 5 1,容积的磨口回流瓶中，加入 i o o g钨酸钠 ( n a 2 wo 4 . 2 h 2 0 ) , 2 5 g 铝酸钠 ( n a 2 mo 0 4 . 2 h 2 0 )以及7 0 0 m 1 蒸馏水， 再加入5 0 m l 8 5 %磷酸及 l 0 0 m l 浓盐酸， 充分混合， 接上回流冷凝管，以 小火回流 1 0 小时。 回流完毕， 加入1 5 0 g 硫酸铿， 5 0 m l 蒸馏水及数滴液 体滨，开口继续沸腾 巧 分钟，以除去过量的嗅，冷却后用蒸馏水稀释 至 1 0 0 0 m l ，过滤，滤液呈微绿色，置于棕色瓶试剂瓶中保存。使用时用 标准氢氧化钠滴定，以酚酞为指示剂，最后用蒸馏水稀释 ( 约 1倍) ， 使最终酸度为 1 . 0 m o l / l a 2 . 2酶活性测定 2 . 2 . 1过氧化物酶活性测定 过氧化物酶广泛分布于植物的各个器官中。在有过氧化氢存在下， 过氧化物酶能使愈创木酚氧化， 生成茶褐色物质，用愈创木酚法3 1 ,3 2 测 定， 单 位为 a 4 7 0 分 一 克 鲜 重 一 ( a a 4 7 0 m i n - m g f w ) o 2 . 2 . 2超氧化物歧化酶活性测定 按b e a u c h a m p ( 1 9 7 1 ) 3 6 所建 立， b e w l e y 等 ( 1 9 7 9 ) 3 7 1 改 进的方法， 以抑制氮蓝四哇 ( n b t )光还原反应达 5 0 %为一个超氧化物歧化酶活力 单位( u g f w) 。 反 应混合 液总 体积为3 m l ， 其中 含5 x 1 0 2 m o 1/ l 磷 酸缓冲液( p h 7 . 8 ) , 1 3 x 1 0 -3 m o l/ l 蛋氨酸、 7 5 x 1 0 -6 m o l/ l n b t , 1 0 0 n m o l / l e d t a以及2 x 1 0 - 6 m o l / l核黄素。 2 . 2 . 3酷酶活性测定 按改 进的陈巧云3 3 的方法测定， 单位为。 一 蔡酚m m / m g 蛋白 质 3 0 分钟 。 翁 b pi 士学泣 ; 之 二 / v s : i d 泉 炙 1 、 试剂 5 % ( w/ v ) s d s 溶液:5 . o g s d s ，双蒸水 l 0 0 m l ，微热溶解。 0 . 0 3 m。 一 醋酸蔡酷丙酮液:0 . 5 5 8 g 。 一 醋酸蔡酷用少量丙酮溶解，双 蒸水定容至 l o o m l o 1 % ( w/ v ) 坚牢蓝b水溶液: 1 鲍 坚牢蓝b , 1 0 0 m l 双蒸水， 用前过滤。 3 x 1 0 - 4 m。 一 醋酸蔡醋:i m 1 o . 0 3 m a 一 醋酸蔡酷用0 . 0 4 mp h 7 .0 磷酸缓 冲液定至 i o o m l o i m m。 一 蔡酚溶液: 0 . 0 0 3 6 g 。 一 蔡酚，以少量丙 酮溶解，用 0 . 0 4 m磷 酸缓冲液( p h 7 .0 ) 定至2 5 m 1 o 显色剂:5 % s d s a %坚牢蓝 b = 5 : 2 ( v / v ) ，现配现用。 2 、活力测定方法 绘制标准曲线 取六支干净试管，按下表加入试剂，旋涡混匀器混匀后，室温放置 3 0分钟 横坐标 ， 编号 1 mm a ，6 0 0 n m处比色，重复三次求平均值。以a一 蔡酚的毫摩尔数为 以 o d值为纵坐标，作曲线。 一 蔡酚( m l ) 0 .0 4 mp b s ( p h 7 . 0 ) ( m l ) 显色剂( m l ) 1 0 . 0 4 5 . 9 6 i 2 0 . 0 8 5 . 9 2 1 3 0 . 1 2 5 . 8 8 1 4 0 . 1 6 5 . 8 4 1 5 0 . 2 0 5 . 8 0 1 n广0 测定 反应混合液为3 x1 0 a ma - 醋酸蔡酷5 m l , 0 . 0 4 mp h 7 . 0 磷酸缓冲液 1 m 1 ,酶液o . l m l , 3 7 水浴振荡3 0 分钟，加入i m l 显色剂，旋涡混匀 器混匀后室温放置3 0 分钟，6 0 0 n m处比色，重复3 次求平均值。计算 每毫升酶液生成的。一 蔡酚数，酶原经蛋白质含量检测得出蛋白质含量 ( m g / m l ) ，计算比 活力( a 一 蔡酚m m / m g 蛋白 质/ 3 0 分) 。 2 . 3蛋白质组分及同工酶电泳分析 采用垂直板型聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( p a g e ) ，分离胶浓度为 7 . 0 %, 浓缩胶浓度为 3 . 0 %,澳酚蓝为指示剂。上样量每槽 5 0 p 1 ，起始电压 3 0 0 v，进入分离胶后 2 5 0 v, 4 0c 下电泳 7小时。 愁咧 biis - 3 ii i 11ster s iii is 蛋白质组分用考马斯蓝染色法染色， 染色液为:0 .2 5 g考马斯蓝 8 2 5 0 ， 用9 0 m l 甲醇: 水= 1 : 1 ( v / v ) 和l o m l 冰乙酸的混合液中溶解， 脱色液为:不加染料的甲醇一 乙酸溶液; 过氧化物酶同工酶显色液为: o . l g 联苯胺用少量无水乙醇溶解， 再 用 0 . 1 mp h 5 . 0醋酸缓冲液定至 1 0 0 m 1 , i临用前加入 0 . 5 m l 3 %双氧水。 于2 5 下反应 1 0 分钟， 即可观察到棕红色的过氧化物同工酶带， 弃去 联苯胺试剂， 用蒸馏水冲洗后， 将胶板放入5 %醋酸中固定， 弃去醋酸， 用蒸馏水保存; 超氧化物歧化酶染色参照王爱国等4 7 的方法:将凝胶浸泡在 2 .4 5 x 1 0 3 m n b t 2 0分钟，取出后放入含有 0 . 0 2 8 m 四甲基已二胺 ( t e m e d ) , 2 . 8 x 1 0 - 5 m核黄素和0 . 0 3 6 m磷酸钾缓冲液溶液 1 5 分钟， 最后将凝胶浸在含有 0 . 0 5 m磷酸缓冲液、1 0 -4 m e d t a溶液中，并在 4 0 0 0 l u x下光照 3 0 - 4 0分钟，s o d的活性谱带是出现在蓝色背景上的 无色透明区带; 酷酶同工酶显色液为:2 5 m g 。 一 醋酸蔡酷、2 5 m g 0 一 醋酸蔡酷和 1 0 0 m g坚牢蓝r r盐，用4 m l 丙酮溶解， 溶解后倒入9 6 m l 的0 . 1 m磷