（食品科学专业论文）大豆降血压肽产品稳定性及安全性研究.pdf

汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 墨) ，保密期至加o 年华月，6 日为止。 学生签名：立鱼堇至导师签名：2 尘2 丝 力声8 年仁月厂归 广 血压肽活性 抑制活性检 初步研究温 以及冷冻干 、无菌过滤 灌胃剂量和 降血压效果关系进行了研究。以酶解浓缩溶液灌胃k m 小鼠，对其进行急性毒理分析。 体外检测结果表明：酶解反应体系由1 l 放大到5 l ，a c e 活性抑制率均达到8 0 以 上；酶解物在3 0 9 0 下处理2 h 后，a c e 抑制活性与原样相同；调整酶解物p h 至 4 1 0 ，5 0 下处理2 h 后，体外活性保持稳定；热杀菌处理中，8 5 、1 0 0 处理1 h ，其 a c e 抑活性保持稳定；1 2 1 加热3 0 m i n 以上，活性抑制率降至5 9 6 9 ；酶解物p h 调 至4 5 和5 4 ，经相同热杀菌处理后，结果大致相同；无菌过滤产品抑制率为8 5 8 5 ， 浓缩液和冷冻品调整至原来浓度后其活性抑制率分别为8 4 4 7 ，8 4 9 ；热杀菌样品、 无菌过滤产品和冻干品在1 8 0 d 贮藏期间，其a c e 活性抑制率未发生显著性变化。 体内检测结果表明：酶解物灌胃s h r ，2 h 后最大降压值( p o 0 5 ) 为1 8 2 m m h g ； 经热杀菌处理后样品灌s h r ，降压效果明显下降；酶解液8 5 、处理1 5 m i n ，其最大降 压值( p o 0 5 ) 仅为1 1 6 m m h g ，而其它样品降压值均在1 0 m m h g 以下；减压浓缩、 冷冻干燥、无菌过滤等方法处理后的样品，最大降压值( p 0 0 5 ) 分别为1 7 9 m m h g 、 1 8 8 m m h g 、1 8 4 m m h g ；灌胃剂量增大至4 倍后，降压效果不再改变；在9 0 d 贮藏中， 无菌过滤样品和冻干品均保持体内活性稳定性。体外活性检测与体内试验差异说明：与 原液相比，肽液中肽组成在热作用下发生变化，使得肽在体内代谢后抵达靶器官或组织 后，仅保留了较少的有效肽成分。急性毒理试验表明：大豆蛋白酶解物不具有毒性。 关键词：降血压肽。稳定性体内外活性检测，血管紧张素转化酶，a c e 活性抑制率，原发性 高血压大鼠，稳定性 t a b s t r a c t o nt h eb a s i so fw o r ka h e a d ，w i t ht h e h y r o l y s a t ef r o ms o y b e a np r o t e i nf o rr e s e a r c h o b j e c t ，s t a b i l i t y a n d s e c u r i t yo fa n t i h y p e r t e n s i v e p e p t i d e s d e r i v e df r o m s o y b e a nw e r e i n v e s t i g a t e d a c t i v i t yd e t e c t i o ni nv i t r oa n di nv i v ow e r eu s e dt oe v a l u a t et h ea n t i h y p e r t e n s i v e p e p t i d e s ，t h a ti st os a yt h a tt h ea c ei n h i b i t i o na c t i v i t yd e t e c t i o na n dt h es b p 1 0 w i n ge f f e c to f p e p t i d e sa f t e ra d m i n i s t r a t i n gs p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ( s h r ) v o l m eo fr e a c t i o ns y s t e mw a s e n l a r g e dg r a d u a l l y ，a n dt h ea c t i v i t yo fh y r o l y s a t ei nv i t r o a n di nv i v ow e r ed e t e c t e d ；s e v e r a lm e t h o dw e r eu s e dt od e a lw i t ht h eh y r o l y s a t e s ，s u e h a sh e a t a n da c i dt r e a t m e n t ，s t e r i l i z i n g ，f i l t r a t i o n s t e r i l i z i n g ，v a c u h i t ic o n c e n t r a t i o na n dl y o p h i l i z a t i o n t h e nt h ea c t i v i t yo fs a m p l e si nv i t r oa n di nv i v ow e r ea l s om e a s u r e dr e s p e c t i v e l y ；t h eh e a t s t e r i l i z i n gs a m p l e s ，f i l t r a t i o ns t e r i l i z i n gs a m p l e sa n dl y o p h i l i z a t i o ns a m p l e sw e r ep r e s e r v e df o r m o n t h s ，a n dt h ep e r i o d i c a c t i v i t y d e t e c t i o no ft h e mw a s p e r f o r m e d f u r t h e r m o r e t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd o s eo fa d m i n i s t r a t i o na n ds b p 1 0 w e r i n ge f f e c tw a si n v e s t i g a t e d a c u t e t o x i c i t y t e s tw a sp e r f o r m e dt oe v a l u a t et h es e c u r i t yo ft h eh y r o l y s a t ea f t e ra d m i n i s t r a t i n gk m r a t s t h er e s u l ti nv i t r os h o wt h a t ：t h ev o l u m eo fr e a c t i o ns y s t e m sw a s e n l a r g e df r o m1lt o5 l ， b u tt h ea c e a c t i v i t yi n h i b i t i o nr a t e so ft h eh y r o l y s a t ew e r ea l lm o r et h a n8 0 ；i nt h er a n g eo f 30 * ( 2 9 0 。ca n dp h 4 - p h10 ，t h ea c ei n h i b i t i o na c t i v i t y k e e ps t a b i l i t y ；t h ea c ei n h i b i t i o n a c t i v i t yo fh y r o l y s a t ea f t e rs t e r i l i z i n ga t8 5 。ca n d10 0 。cd i d n td e c l i n ea n ym o r e w h i l et h e s a m p l e s a f t e rs t e r i l i z i n ga t121 f o rlhw e n td o w nt o5 9 6 9 ，a n da si sa l s ot h ep h 5 4 s a m p l e sa n dp h 4 5s a m p l e sa f t e rt h es a m eh e a ts t e r i l i z i n gt r e a t m e n t t h ea c ea c t i v i t y i n h i b i t i o nr a t eo ff i l t r a t i o ns t e r i l i z i n gs a m p l ew a s8 5 8 5 ，t h a to ft h ev a c u u mc o n c e n t r a t i o n s a m p l ea n dl y o p h i l i z a t i o ns a m p l ew e r e8 4 4 7 a n d8 4 9 ，w h i c hh a db e e nd i l u t e dt oo r i g i n a l c o n c e n t r a t i o n a c ea c t i v i t yi n h i b i t i o nr a t eo ft h es a m p l e si ns t o r ed i dn o tf l u c t u a t ei n t e n s e l vi n 1 8 0 d t h er e s u l ti nv i v os h o wt h a t ：t h em a x i m u md e c r e a s e ( p 1 5 0 0 5 9 9 5 5 4 2 5 4 5 2 o 3 7 0 0 2 1 3 6 4 2 9 0 5 2 l l k p n m2 4 l k p f y k f i v y i m y d g l t k y l t f f a f a v l g l y o 3 2 1 6 7 1 1 6 0 4 8 1 8 0 2 1 6 2 3 l 2 7 3 6 9 1 7 1 l 8 8 4 2 1 8 7 4 5 l ( 2 m 跳，4 h ) 【3 6 】 2 8 5 3 2 0 ( 6 m g k g , 2 h ) 一3 6 ( 1 h ) 5 5 ( 1 h ) 3 7 ( 2 h ) 【3 7 】 4 9 ( 2 h ) ( 均为5 0 m g k g ) - 5 ( 4 m g k g ，4 h ) 9 ( 8 m g k g ，4 h ) - 1 5 ( 1 5 m g k g ，4 h ) 一6 ( 2 2 5 m g k g ，2 h ) - 1 0 5 ( 4 5 m g k g ，2 h ) - 1 4 5 ( 9 m g k g ，2 h ) 【3 8 1 酶解产物灌胃： 3 9 1 2 0 ( i g k g ，6 h ) g k k v l q 1 9 - 2 8 ( 2 8 m g k g ) 血红素 【4 0 】 f q l k v v a 5 8 3 2 ( 3 2 m g k g ) 7 续表 蓝| 胎贝 鸡胸肉 油菜籽 沙j 。鱼肉 e v m a g n l y p g g p x g t x g l x g p ( x = h y p ) v w v w i s i y r i y a m q s m p r y m y l y y l k w g r p r f h a k k r v y g w a p 1 9 3 ( t g m 1 )- 1 9 ( 1 0 m g k g ) 4 2 1 6 6 0 3 7 2 8 1 0 0 0 4 4 7 5 l 1 9 3 3 8 5 8 2 1 6 3 2 0 3 3 0 3 1 3 2 0 5 6 3 8 6 【4 l 】 f 4 2 】 【4 3 】 - 1 0 8 4 - 2 7 ( 7 5 m g k g ，2 h ) - 1 2 5 4 - 3 ( 1 2 5 m g k g ，2 h ) - 9 8 2 1 ( 7 5 m g k g ，2 h ) 1 4 4 1 11 34 - 1 8 ( 7 5 m g k g ，4 h ) 【4 5 】 注：表中所示降压值中，无标准差的数据为估算值。 目前存在的问题是，只有较少文献报道体外加工、杀菌、包装、贮藏因素对a c e 抑制活性的影响，而且尚未有报道以体内活性检测来考察外界因素对降压活性的影响。 目前，根据生理作用的相关酶类对a c e 抑制肽的影响将其归纳为三类【3 3 】：一、抑制肽型 ( i n h i b i t o rt y p e ) ：在有无a c e 或消化道酶的影响下，均表现a c e 抑制活性；二、底物型 ( s u b s t r a t et y p e ) ：具有a c e 抑制活性，但经过a c e 或消化道酶作用后，不具有抑制活性； 三、药物前体型( p r o d r u g t y p e ) ：a c e 抑制肽经过a c e 或消化道酶作用后，其a c e 抑制 述 经过a c e 或消化道酶作用后，表现出抑 目前，研究者已经从各个方面系统地阐述了降血压肽的丌发利用情况，但还存在诸 多问题亟待解决。首先，对加工、杀菌、包装、贮藏过程降血压肽活性稳定性的研究较 少，尤其是以酶解和发酵产物为对象的稳定性研究；其次，降血压肽的制备方面，除了 发酵制品外，终端产品研发方面的报道较少。在分离和人工诱导发酵技术尚未工业化的 今天，酶解法产品以低廉的成本和相对较低的生产技术可以作为终端产品而出现。目前 尚未见到相关食源降血压肽毒性、致突变性等相关毒理分析的报道。在降血压肽研究中， 药物方向研究相对全面，而从毒副作用相对较低、作用周期长的保健品的研发还在起步 当中。根据2 0 0 6 年的统计数据来看，按照w h o 对高血压的最新标准，全世界有6 5 亿人 患有不同程度的高血压病症，我国有2 亿人患高血压，并以每年3 0 0 万的速度递增；其中 高血压向青年化发展，已经成为严重的社会公共卫生问题。高血压病提高了其它相关的 心脑血管疾病的发病率，例如：高血脂、冠状动脉硬化、心肌梗死、脑卒中等。就目前 来看，对高血压病的预防及治疗仍以化学合成药物为主，但合成降血压药物具有一定的 副作用，所以开发具有降血压效果肽类具有广阔的市场前景。 1 8 本实验方案概述 本实验是建立在已知大豆蛋白的酶解优化条件的基础之上，得到大豆蛋白酶解液。 在不同条件下，对a c e 抑制剂进行体外检测和体内检测，研究其降压效果变化及产品稳 定性。实施方案如下： 1 利用前期筛选的最适蛋白酶，在其最佳水解条件下，以体外a c e 抑制活性为指 标，进行酶解大豆分离蛋白放大试验，制取大豆多肽液； 2 在不同因素下处理酶解液，然后对s h r 灌胃，研究其降压效果变化及产品稳定 性； ( 1 ) 选取温度、p h 等因素，对酶解制品分别进行处理，分别对s h r 灌胃，研究不 同处理因素后多肽液的降压效果； ( 2 ) 对样液浓缩、冷冻干燥处理，分别对s h r 灌胃，确定及分析其降压效果； 9 第一章义献综述 3 以小鼠对多肽制品进行毒理性分析实验。 1 0 c s l 0 1 2 c 电热鼓风干燥箱 6 0 3 3 电热鼓风干燥箱 p h s 3 c 精密p h 计 l d 4 2 低速离心机 t d l 4 0 b 低速大容量离心机 d k $ 2 6 电热恒温水浴锅 j j 3 型控温定时电动搅拌器 u v 7 5 5 b 紫外分光光度计 7 2 2 型分光光度计 t 18 b a s i c 微量均质机 可调微量移液器 r b p 1 b 型大鼠血压计 w x 8 0 a 旋涡混合器 r e 5 2 a a 旋转蒸发器 s h z d ( i i i ) 循环水式真空泵 y h d g j 冷冻干燥机 重庆四达仪器制造厂 大连第四仪表厂 上海雷磁仪器厂 北京医用离心机厂 上海安亭科学仪器厂制造 上海森信实验仪器有限公司 江苏金坛中大仪器厂 上海精密科学有限公司 上海精密科学仪器有限公司 广州i k a 公司 上海联胜实验仪器厂 中日友好临床医学研究所 上海精科实业有限公司 上海亚荣生化仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 料j 方法 2 1 4 实验动物 自发性高血压大鼠( s h r ) ( s p f 级) w i s t a r 大鼠( s p f 级) k m 小鼠( 1 8 2 2 9 ) ( s p f 级) 2 2 溶液及试剂配制 2 2 1 福林酚试剂的配制 s i g m a 公司 s i g m a 公司 丹麦诺维信公司 沈阳市新西试剂厂 长春化学试剂厂 辽宁省医药经贸公司试剂厂 天津市天河化学试剂厂 沈阳新兴试剂厂 上海斯莱克动物有限公司 大连医科大学 大连医科大学 甲液：由下列四种溶液配制。( 1 ) 4 n a a c 0 3 溶液；( 2 ) 0 2 m o l l n a o h 溶液；( 3 ) 1 硫酸铜溶液；( 4 ) 2 酒石酸钾钠溶液。 在使用前，将( 1 ) 与( 2 ) 等体积混合配成碳酸钠氢氧化钠溶液；将( 3 ) 与( 4 ) 等体积 混合配成硫酸铜。酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种溶液按比例5 0 ：1 混合，即为f o l i n 酚甲乙试剂。该试剂只能使用一天，过期作废。 乙液：在1 l 的磨口回流装置内加入钨酸钠5 0 9 ，钼酸钠1 2 5 9 ，蒸馏水3 5 0 m l ，8 5 磷酸2 5 m i ，浓盐酸5 0 m l ，充分混合后，以小火回流1 0 h 。再加入硫酸锂7 5 9 ，蒸馏水 2 5 m l ，数滴液体溴。然后，开口继续沸腾1 5 m i n ，以驱除过量的溴。冷却后，定溶至1 0 0 0 m l ， 过滤，滤液呈绿色。标定f o l i n 酚乙试剂的酸度，用f o l i n 酚乙试剂滴定标准氢氧化钠 1 2 第二章材料j 方法 溶液( 1 m o l l 左右) ，以酚酞为指示剂。当溶液变为紫色，紫灰，再突然转变为墨绿色 时即为终点。该试剂酸度一般为2 m o l l ，此为贮存液。也可以用氢氧化钠滴定f o l i n 酚乙试剂，但终点不易掌握。此时溶液由浅黄绿色变为浅绿，再变为紫灰色时为终点。 使用前应予以稀释，使其成为l m o l l 的酸，此为f o l i n 酚乙应用液。 以上两种乙液均应装于棕色瓶内，贮于冰箱中，可长期贮存。 2 2 2 三氯乙酸( t c a ) 溶液的配制 取6 5 4 9 三氯乙酸定容于1 0 0 m l 容量瓶中。 2 2 3 硼酸缓冲溶液的配制 取硼酸3 7 1 0 4 9 ，硼砂3 8 1 4 3 9 ，氯化钠1 7 5 3 2 9 ，溶解，然后定容至1 0 0 0 m l ，配成 0 1 m o l l 的硼酸钠缓冲液。 2 2 4 马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) 溶液的配制 取2 1 4 7 5 m g h h l 溶于1 0 m l 缓冲液中，配制成5 m m o l l 底物溶液。 2 2 5 血管紧张素转化酶的配制 取0 1 u a c e 溶于4 m l 冷的去离子水中，配制成2 5 m u m l a c e 溶液。 2 2 6 盐酸溶液的配制 取8 6 m l 浓盐酸( 浓度为3 6 5 ) 容于1 0 0 m l 容量瓶中，配制成l m o l l 。 2 3 实验方法 2 3 1 大豆蛋白酶解液的制备 1 大豆蛋白溶液的制备。准确称取大豆蛋白粉末1 5 9 于烧杯中，加入去离子水( 体 积不高于6 0 0 m 1 ) ，搅拌均匀。经分散机进行均质，分散机的转速约为1 8 0 0 0 r m i n ； 1 3 第二章材料2 j 方法 2 豆蛋白溶液的酶解。将大豆蛋白溶液倒入酶解罐，加去离子水大约至9 5 0m l ； 置于沸水浴中，密封；加热3 0 m i n 后用去离子水定容至1 0 0 0m l 。 3 酶解罐置于5 5 水浴锅，待内外温度一致时加入酶液；电动搅拌器持续搅拌使 底物与酶充分混合。酶解1 h 后，置于9 0 水浴加热5 m i n 以钝化酶，迅速冷却，完全 冷却后再次定容至1 0 0 0m l 。离心后得到澄清溶液，即大豆肽液。上述为1 l 酶解体系 参数，反应体系体积改变，则参数相应进行调整。 2 3 2 可溶性氮测定 2 3 2 1 小牛血清蛋白标准曲线的绘制 一组试管中分别加入o 、o 1 、o 2 、o 3 、0 4 、o 5 、0 6 、0 7 、o 8 m l 的标准结晶牛血 清蛋白( 浓度为5 0 0l ag m 1 ) ，加去离子水定容至1 0 0 m l ，再各加入5 m l f o l i n 酚甲溶液， 摇匀后室温下静置1 0 m i n ，再依次向各管加入0 5 0 m l f o l i n 酚乙溶液，摇匀。在3 0 下， 显色3 0 m i n ，在5 3 0 n m 下测光密度值，平行做三份，以牛血清蛋白溶液的浓度为横坐标， 以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2 3 2 2 水解前后可溶性氮测定 分别取2 m l 大豆蛋白水解前溶液，空白样，大豆蛋白水解后溶液( 稀释1 5 倍) ，加 入2 0 t c a ( 三氯乙酸) 2 m l ，静置一会后离心1 0 m i n ；分别取上清液l m l 于另6 支试 管中，加入f o l i n 酚甲5 m l ，静置1 0 m i n ，加入f o l i n 酚乙0 5 m l ，振荡均匀，置于3 0 水浴中显色3 0 m i n ，选用可见光分光光度计在5 3 0 n m 下测其吸光度。在根据标准曲线计 算出其可溶性氮含量。 2 3 3 水解度计算 n 2 。n 1 d h = 1 0 0 n o n l 注：n 一一大豆蛋白酶水解前2 0 t c a 中可溶性氮( m g m 1 ) n 2 一大豆蛋仁j 酶水解后2 0 t c a 中町溶性氮( m g m 1 ) n 0 _ 一大豆分离溶液含量( m g m 1 ) 1 4 公式( 2 1 ) 3 7 。c ，p h - - 8 3 的条件下催 ( h h l ) 即马尿酰组氨酰亮 当加入a c e 抑制剂时，a c e 通过测定加入抑制剂前后生 活性抑制率记为i ，则公式 o d b 一底物h h l 中加入a c e 和抑制肽，反应后所测定的光密度 o d c 一不加入a c e 和抑制肽的底物h h l ，在经历相司反应条件后所测定的光密度 公式( 2 2 ) 1 o d a 的测定( 不存在a c e i 时) ： ( 1 ) 试管中先后加入0 1 m l h h l 、0 0 5 m l 缓冲溶液( 代替抑制剂) ，预热后加 0 1 m l a c e ，恒温水浴3 7 1 h ；加入0 2 5 m l h c l 溶液，摇晃以中止反应； ( 2 ) 加入2 0 m l 乙酸乙酯，振荡充分混匀后，离心1 5 m i n ； ( 3 ) 取上层酯液l m l 于另一试管中，1 0 0 下烘干1 h ； ( 4 ) 冷却，加入去离子水2 m l ，剧烈振荡，混匀后，测定2 2 8 n m 的吸光度。 2 o d b 的测定( 存在a c e i 时) ： 其方法同上，但以0 0 5 m 1 分离出的多肽溶液代替0 0 5 m l 缓冲液； 3 o d c 的测定( a c e 与a c e i 都不存在时) ： 其方法同o d a 的测定方法，但以0 1 5 m l 缓冲液代替a c e 和a c e i 。将不同条件下 的o d b 值带入到抑制率公式，最终得出a c e 的抑制率。 2 3 5s h r 血压测定 将主机和大鼠固定器安装好以后，打开大鼠固定器的开关，预热3 0 r a i n 左右，待其 上面的红色发光二极管熄灭，并间断复燃，说明大鼠固定器已达到测试温度。然后将待 1 5 第二章材料j 方法 测的大白鼠放入预热箱，预热1 0 1 5 m i n ( 预热时间与周围室温有很大的关系) ，取出并 装入合适的固定网套内，然后将其固定在滑动式的大鼠固定台上，选择合适的尾套，套 住尾根，鼠尾置于探头底槽正中央平贴光敏电阻处。让大白鼠休，窟, 2 m i n 左右，使其安静。 开启主机电源丌关，从发光二极管排阵上观察容积脉搏波的幅度，待达到红色发光二极 管指示区域时即可开始测量。测血压前可先纪录心率，测量血压时，首先用气球加压阻 断鼠尾血流，通常设定阻断压力应高于实际血压3 0 m m h g 左右。待脉搏波消失后以每秒 2 3 m m h g 的下降速度均匀放气，并注视着血压表的指针，待听到脉搏波恢复到先前节 律的第一搏动声音时，此点的血压即为大鼠的收缩压。测量一般重复2 3 次，每次间隔 大约1 m i n ，以均值作为收缩压值。 2 3 6 样品处理 2 3 6 1 热和酸处理 分别对等量大豆肽液进行热处理，温度选取为3 0 、5 0 、7 0 、9 0 ，分别检 测其a c e 抑制活性；用盐酸和氢氧化钠调大豆肽液的p h 至4 、6 、8 、1 0 ，然后分别检 测其a c e 抑制活性。 2 3 6 2 热杀菌处理 大豆蛋白酶解液中加入柠檬酸，分别调p h 值至5 4 和4 5 ；加上原肽液共三种样品， 分别在8 5 、1 0 0 、1 2 1 下作杀菌处理，时间选取1 5 m i n ，3 0 m i n 和6 0 m i n 。处理后 的样品分别进行体外和体内检测。 2 3 6 3 减压浓缩、冻干、无菌过滤 大豆肽液置于旋转蒸发仪中减压浓缩，开始温度控制在4 0 。c 以内，随着肽液浓度 的增大，温度适当提高，浓缩至4 倍左右，整体温度范围是4 0 。5 5 。浓缩液稀释至 原酶解液浓度后作a c e 抑制活性检测和体内活性检测。 将大豆酶解液浓缩液放入冷冻干燥机中( 冷阱温度为4 7 5 。c 4 8 5 ) ，大约2 4 h 后取出，真空袋装封存。冻干样粉术溶解至原肽液浓度后作a c e 抑制活性检测和体内 活性检测。 将灌装的棕色瓶干热灭菌，在无菌操超净台上进行无菌操作，用一次针筒吸入大豆 肽液后，安装无菌过滤器( 孔径0 2 9 m ) ，将肽液缓缓推入棕色瓶中后封口。灌装样品 1 6 为杀菌条件对三种 经加热处理p h 4 5 的样品。常温下贮藏，检测贮藏后其体外a c e 抑制活性的变化。 将无菌过滤样品保存至灭菌后的棕色瓶中，冷冻干燥样品真空袋装封存，也定期进 行活性检测。 1 7 3 1 1 酶解体系放大实验的体外活性检测 表3 11 5 l 体系酶解产物的水解度和活性抑制率 t a b 3 一id ha n da c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yr a t ec u r v eo fp e p t i d e sf r o m1 - 5 lr e a c t i o ns y s t e m s 2 34 体积( l ) 6 2 摹 蜊 琏 5 8 苌 图3 - 11 5 l 反应体系酶解液的水解度和a c e 抑制活性 f i g 3 1d ha n da c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yr a t ec u r v eo fh y r o l y s a t ef r o m1 5 lr e a c t i o ns y s t e m s 结果表明：增大反应体积对酶解液的水解度和体外活性波动幅度不大，增大反应体 系体积至5 l 未对a c e 抑制活性造成影响。水解过程中，除了人为操作因素会引起这种 踮 踟 佰 加 琴一瓣器嚣蛆-戥 第二三章结果i j i , t 论 波动外，某些方法本身存在一定的误差。如在测定体外a c e 抑制活性的紫外法本身就 具有一定误差：在此方法模拟反应的体系中，微量的底物h h l 也会被乙酸乙酯萃取出， 同时，h h l 和h i p 在2 2 8 n m 均具有最大特征吸收峰，这样就会对h i p 的检测结果造成 干扰，进而影响活性的测量。前期实验中，以试管作为反应容器( 无搅拌) ，木瓜蛋白 酶水解物a c e 活性抑制率为7 2 3 ，体积增大至4 0 0 m l ，其a c e 活性抑制率为7 4 8 ， 而本实验中的a c e 活性抑制率达到了8 0 以上。a c e 是一种特异性较为宽泛的酶，酶 解产物的a c e 抑制活性是多种肽共同作用的体现，虽然各种反应体系的水解条件相同， 但体积增大过程中引起的实验操作差异( 蛋白热处理时间，搅拌时间等因素) ，会使蛋 白酶切割蛋白的效果略显差异，即释放的具有a c e 抑制活性片断不同，从而影响了肽 液的活性。 实验结果并未表现出水解度和体外活性存在一定的联系。例如：水解度相对较小， 但其释放出的活性片断的数量却相对较多，这样也会表现出较高的活性，反之亦然。但 从较长时间酶解的角度来看，水解度和a c e 抑制活性有时会呈现出一定的规律：蛋白刚 酶解成肽时，a c e 抑制活性位点逐渐暴露，此时活性逐渐增强；当水解时间过长，水解 度过大时，水解产物中氨基酸比例过高，使水解产物的降压活性逐渐降低；在某个水解 时刻，对应的产物活性会达到一个峰值。在实际中，有时却不能表现出相应的规律。如 w e n d e ec h i a n g 等1 4 8 j 选用碱性蛋白酶酶解大豆蛋白，随着水解时问的增加，产物的i c 5 0 值持续走低，水解至2 5 h ，其i c 5 0 值依然有下降趋势；j e a n e t t eo t t e 等【4 9 j 在酶解牛乳蛋白 时也遇到了相似的情况，5 种蛋白酶酶解5 种牛乳蛋白，在3 2 4 h 内，绝大部分产物的抑 制率依然保持在较高的水平。对此，作者认为：3 h 酶解后，活性肽成分基本释放出，酶 解可逆反应开始达到一个平衡状态，即产物中有效肽的合成量已经达到降解量，产物不 再进一步降解，因此，抑制活性能够一直保持。总之，在水解反应中，酶反应动力学起 到了至关重要的作用，酶解产物的抑制率活性与肽混合物中具有a c e 反应活性位点的有 效肽成分多少有关，与水解度的大小没有必然的联系。 3 1 2 酶解液体外活性稳定性初步研究 3 1 2 1 热处理对酶解液a c e 抑制活性的影响 本实验选取相对较低的温度( 3 0 。c 、5 0 。c 、7 0 。c 、9 0 。c ) 对大豆肽液进行热处理 2 h ，以常温下肽液作为对照，实验结果如图3 2 所示。 1 9 图3 2 酶解液热处理后a c e 抑制活性变化 f i g 3 2a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yc u r v eo fh y r o l y s a t ea f t e rh e a tt r e a t m e n t 3 1 2 2p h 对酶解液a c e l ：p $ f l 活性的影响 本实验对大豆蛋白酶解液进行酸碱处理，分别调整p h 至4 、6 、8 、l o ，5 0 处理 2 h ，以原水解液( p h 6 3 6 5 ) 作为对照，实验结果如图3 3 所示。 余 、_ 一 褂 = ， 啦 嚣 趟 蜞 原液p h 4p h 6p h 8 p h l o 图3 - 3 不同p h 酶解液a c e 抑制活性 f i g 3 - 3a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yc u r v eo fh y r o l y s a t ew i t hd i f f e r e n tp h 2 0 踮 踟 佰 加 弱 弱 的 第三审结果j i t 论 实验结果表明：酶解液在一定的酸度和温度范围内取得了较好的稳定性。目前在稳 定性的研究方面多以体外活性位参考标准。如马海乐、吴琼英1 5 0 】将a c e 抑制活性发酵 乳7 0 以上热处理l h 后，其a c e 抑制活性出现明显呈下降趋势；发酵乳经酸、碱处 理，p h 值升至1 1 后，其a c e 抑制活性也开始明显下降。j i a n p i n gw u 和x i a o l i nd i n g l 2 4 l 将大豆源a c e 抑制肽分别进行热处理( 2 0 1 0 0 ) 和酸处理( p h2 、1 0 ，4 0 ) ，结 果表明：活性短肽基本能够保持原有的a c e 抑制活性。 3 1 3 酶解液热杀菌稳定性研究 三种p h 酶解液样品( 原液、p h 5 4 、p h 4 5 ) 选取较高温度( 8 5 。c 、1 0 0 。( 2 、1 2 1 ) 对进行热杀菌处理，以确定a c e 抑制剂的稳定性。 3 1 3 1 酶解液热杀菌后a c e 抑制活性的变化 毋 料 淝 最 掣 ! g ol o 2 03 04 05 06 0 热处理时问( m i n ) 图3 - 4 酶解液热处理后a c e 抑制活性变化 f i g 3 4a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yc u r v eo fh y r o l y s a t ea f t e rh e a tt r e a t m e n t 实验结果表明：经8 5 和1 0 0 。c 热处理后过处理后，a c e 活性抑制率在l h 内未发 生明显改变，而1 2 1 处理1 h 后，其活性下降至5 9 6 9 。高温下处理较长时间，可能 会使酶解液中的某些有效肽成分失活，从而导致活性大幅度下降。 2 l o2 03 04 0 5 06 0 热处理时问( m i n ) 图3 - 5p h 5 4 酶解液热处理后a c e 抑制活性变化 f i g 3 5a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yc u r v eo fp h5 4s a m p l e sa f t e rh e a tt r e a t m e n t 会 、 斛 ：， 讨e 最 掣 蜒 o 2 03 04 05 06 0 热处理时问( m i n ) 图3 6p h 4 5 酶解液热处理后a c e 抑制活性变化 f i g 3 6a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yc u r v eo fp h4 5s a m p l e sa f t e rh e a tt r e a t m e n t 踮佰加晒印弱的蛎 第三章结果j 讨论 小结：热杀菌结果表明，加热后，8 5 、1 0 0 处理样品活性波动不大，基本上保 持较高的抑制率；1 2 1 下其活性下降较为明显，抑制率于6 0 m i n 后降至5 9 6 9 。调酸 后的样品与原样相比，结果大致相同；p h 4 5 样品加热后，在1 2 1 下，其活性降到了 5 0 以下。 3 1 4 酶解液经减压浓缩、无菌过滤、冷冻干燥处理后其g p 韦j j 活性的变化 将肽液将进行减压浓缩、无菌过滤、冷冻干燥处理后判定其活性的变化，减压浓缩 和冻干样品加入去离子水后复原到原液浓度，以可溶性固形物作为参数指标( 原肽液可 溶性固形物含量为1 5 ) 。活性检测以原液作为参照，实验结果如图3 7 所示。 拿 、- ， 褂 ：， 妊 最 趟 蜒 原液减压浓缩无菌过滤冷冻干燥 图3 7 酶解液不同方法处理后a c e 抑制活性变化 f i g 3 7a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh y r o l y s a t ea f t e rs e v e r a lt r e a t m e n t 实验结果表明：原样活性抑制率为8 6 ，无菌过滤产品、浓缩液、冷冻品，调整至 原来浓度，其体外活性抑制率分别为8 5 8 5 ，8 4 4 7 ，8 4 9 ，活性并无明显变化。 小结：活性肽在不同程度上存在螺旋与折叠【5 1 1 ，这使肽类具有易氧化，脱酰胺反应、 氧化、水解、形成错误的二硫键、b 消除、变性、吸附、聚集或沉淀等变构作用【5 2 1 。那 么，在一系列诸如热、酸、酶等物理、化学因素的作用下，降血压肽结构及组成更加容 易发生改变，则导致其功能活性变化。除了活性与一级结构肽序的关系外，还与二级结 2 3 踮 两 加 晒 弱 第二三章结果j 讨论 构、几何构象、空问立体构象等存在关系。有报道表明：k k s 系统中缓激肽易与a c e 反应而导致失活，当缓激肽在c 端产生一个b 折叠后，与a c e 的相互作用就会大大减 弱【3 2 】；顺反异构与体外a c e 抑制活性之间存在一定联系【5 3 】：具有反式p r o 残基的a c e 抑制肽d k i h p ，其i c 5 0 值为11 3 1 8um ，具有较高的抑制活性；而同时含有顺式和反 式p r o 的d k i h p 混合样品，其i c 5 0 值仅为5 7 7 9 2 1 1m ，相对于前者，活性大幅度下降。 由此可见，热杀菌处理过程中，在1 2 1 下处理1 h ，酶解液中的有效肽可能发生结构上 的改变，从而导致活性的大幅度下降。在温度较低，处理时间较短的条件下，不会破坏 有效肽与a c e 的结合位点，以致能够保持较高的体外活性。 3 1 5 降血压肽产品贮藏过程中a c e 抑制活性情况 热杀菌样品贮藏中的活性变化如图3 8 所示。检测时间为：杀菌后当同( 记为贮藏 后0 d ) 、贮藏后l d 、3 d 、7 d 、1 5 d 、3 0 d 、6 0 d 、1 2 0 d 、1 8 0 d 。 1 0 0 9 5 蒙9 0 褂 些8 5 辖 趟 舆8 0 7 5 7 0 01 5 3 04 56 07 59 01 0 51 2 01 3 51 5 01 6 51 8 0 贮藏时问( d ) 图3 88 5 c 杀菌样品贮藏中a c e 抑制活性变化情况 f i g 3 8a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yc u r v eo f8 5 s t e r i l i z i n gs a m p l e si nt h ep e r i o do fs t o r e 无菌过滤和冻干品样品贮藏中的活性变化如图3 - 9 所示。冻干品检测前溶解稀释至 原液浓度，检测时间同上。 2 4 图3 - 9 贮藏中肽制品a c e 抑制活性变化情况 f i g 3 9a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yc u r v eo fp e p t i d e si nt h ep e r i o do fs t o r e 实验结果表明：8 5 杀菌样品，无菌过滤样品，冷冻干燥样品，在贮藏1 8 0 d 中， 其a c e 体外抑制活性均达到了较高的水平。此外，在热杀菌样品中，贮藏一段时间后， 会出现一定的沉淀现象，但实验结果表明，沉淀后未对活性成影响。 3 2 体内活性稳定性研究 将s h r 染色编号，然后根据大鼠血压来对大鼠进行随机分组，分为对照组和灌胃 组。对照组以等量纯净水灌胃。灌胃剂量均为1 0 m l k g 。同时，等剂量灌胃w i s t a r 大鼠 作为参照。 大豆蛋白酶解产物灌胃s h r 后，实验结果如图3 1 0 所示。降压最大时问出现在2 h ， 最大降压值为1 8 2 m m h g ，经过单因素分析可知p 0 0 5 ，则无显著性差异；s h r 血压7 h 后恢复到正常值。灌胃w i s t a r 大鼠后，其血压并未出现明显下降状况。可以说， 原液不会对造成低血压的副作用。实验结果如图3 1l 所示。 2 5 灌胃后时问( h ) 图3 1 0 酶解液灌胃s h r 后降压效果 f i g 3 - 10s b p l o w e r i n ge f f e c to fh y r o l y s a t ea f t e ra d m i n i s t r a t i n gs h r 1 2 8 1 2 6 1 2 4 1 2 2 1 2 0 1 1 8 1 1 6 1 1 4 1 1 2 1 l o 0 12 3456 灌胃后时问( h ) 图3 1 1 酶解液灌胃w is t a r 大鼠后降压效果 f i g 3 - 11s b p l o w e r i n ge f f e c to fh y r o l y s a t ea f t e ra d m i n i s t r a t i n gw i s t a rr a t 实验中选用鼠龄为1 4 w - 1 5 w 的原发性高血压大鼠( s h r ) 来进行体内活性检测。 一般来说，鼠龄3 4 个月为s h r 的高血压的确立期，s h r 的血压会随着鼠龄的增加而 2 6 一暑苣一日嫖擎篮 第三章结果j 讨论 改变。同时，s h r 鼠龄与受试