（环境工程专业论文）氯氰菊酯优势降解菌的筛选及降解特性研究.pdf

ad i s s e r t a t i o ni ne n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g s c r e e n i n ga n dd e g r a d i n g c h a r a c t e r i z a t i o no f d o m i n a n tb a c t e r i af o rt h ed e g r a d a t i o no f c y p e r m e t h r i n - 一 s u p e r v i s o r ： n 0 lr i-l _ ， 。i 一 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 ：e 恧。 学位论文作者签名：巷砖唱 日期：螂坪f ；4 f 午甩 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 0ll ，_ ， t 1 l ， 东北大学硕士学位论文 摘要 氯氰菊酯优势降解菌的筛选及降解特性的研究 摘要 农药是用以防治植物病虫害、消灭杂草和调节植物生长的化学药剂，对农业 生产起着重要作用。但由于长期和广泛地大量施用，造成土壤环境中农药残留与 污染导致危及动植物和人体健康。虽然人们普遍认为拟除虫菊酯类农药具有高效 低毒的特性，但是它同时具有对光、热稳定的特点，所以，在环境中半衰期较长， 很难在自然条件下快速降解。而氯氰菊酯由于疏水性比较大，是拟除虫菊酯类农 药中较难降解的一种。由于传统的物理化学降解方法仍然会带来二次污染，近年 来，作为一种成本低廉、对环境友好的土壤污染的生物修复技术已成为研究的热 点，而采用微生物降解农药也成为无害化技术的发展趋势。 本研究从喷洒过氯氰菊酯的土壤中筛选分离、驯化得到6 株具有降解活性的 菌株，其中1 种l o 茵的降解能力稳定且降解率最高。通过研究菌株l o 的形态及 生理生化特性，初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p ) 。 进一步研究l o 菌株的最佳生长条件为：在普通培养基中，7 2 h 达到最大生 长量，在无机盐培养基中，4 8 h 生长量最大；最佳生长温度2 6 ，最佳初始p h 值7 ，最佳氮源为蛋白胨，最佳碳源是葡萄糖；当葡萄糖浓度为1 时，最适的 c ：n 为2 0 - l ；最佳无机盐离子浓度为：n a + 0 2 9 l 、k + o 6 9 l 及m 9 2 + 0 5 9 l 。 采用气相色谱法分析l o 对氯氰菊酯的降解作用。在最佳生长条件下l o 对氯 氰菊酯的降解率高达到8 7 5 ；l o 对氯氰菊酯的最佳降解条件：温度2 6 ，p h7 ， 底物浓度为1 0 0 m g l ；添加少量的外加碳源( 葡萄糖) 能促进l o 对氯氰菊酯的 降解，最佳j l ；0 n 碳源浓度为2 0 0 m g l 。 初步研究了l o 对氯氰菊酯污染土壤的微生物修复作用。将菌株扩大培养后， 添加到模拟氯氰菊酯污染的土壤中，在自然条件下降解，利用紫外分光光度计法 检测土壤中氯氰菊酯的残留量，经1 5 天降解率可达到5 7 6 7 。研究结果表明： 利用微生物治理农药污染土壤的生物修复技术具有广阔的应用前景。 关键词：氯氰菊酯芽孢杆菌分离筛选降解特性生物修复 i i ) l 0 妒 东北大学硕士学位论文 a b s t r a c t s c r e e n i n ga n dd e g r a d i n gc h a r a c t e r i z a t i o no fd o m i n a n t b a c t e r i af o rt h ed e g r a d a t i o no fc y p e r m e t h r i n a bs t r a c t p e s t i c i d e sa r eu s e dt oc o n t r o lp l a n td i s e a s e s ，i n s e c tp e s t s ，w e e d sa n dr e g u l a t e p l a n tg r o w t h ，a n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei na g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o n h o w e v e r ，d u et o l a r g en u m b e ro fl o n g t e r ma n de x t e n s i v ea p p l i c a t i o n ，p e s t i c i d e s c a u s ep e s t i c i d e r e s i d u e si nt h es o i le n v i r o n m e n ta n de n d a n g e rp l a n t s ，a n i m a l sa n dh u m a n sh e a l t h w h i l ei ti sg e n e r a l l yc o n s i d e r e dt h a tp y r e t h r o i dp e s t i c i d e sh a v et h ec h a r a c t e r i s t i c so f h i g he f f i c i e n c ya n dl o wt o x i c i t y ，b u tt h e ya l s oh a v eo p t i c a l a n dt h e r m a ls t a b i l i t y c h a r a c t e r i s t i c s ，t h e r e f o r e ，t h e yh a v el o n gh a l f - l i f ep e r i o di ne n v i r o n m e n t ，a n dv e r y d i f f i c u l tt o d e g r a d er a p i d l y u n d e rn a t u r a lc o n d i t i o n s c y p e r m e t h r i ni sm o r e h y d r o p h o b i ea n dm o r ed i f f i c u l tt ob ed e g r a d e di np y r e t h r o i dp e s t i c i d e s b e c a u s eo f t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a ld e g r a d a t i o no fp e s t i c i d e so ft h et r a d i t i o n a lm e t h o dw i l l s t i l l b r i n g s e c o n d a r yp o l l u t i o n ，i n r e c e n t y e a r s ，a s al o w - c o s ta n d e n v i r o n m e n t a l f r i e n d l yt e c h n o l o g y o fc o n t a m i n a t e ds o i l ， b i o r e m e d i a t i o nh a s b e c o m eah o tr e s e a r c ha n du s em i c r o b i a ld e g r a d ep e s t i c i d e sh a sa l s ob e c o m et h e d e v e l o p m e n tt r e n do fh a r m l e s st e c h n o l o g y i nt h i ss t u d ys i xc y p e r m e t h r i nd e g r a d i n g - b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mt h es o i l p r a y e dw i t hc y p e r m e t h r i n ，a n do n eo ft h e mn a m e dl 0 ，w h i c hc o u l dd e g r a d e c y p e r m e t h r i ns t a b l ya n dh a d t h e h i g h e s t r a t eo fd e g r a d a t i o n b ys t u d y i n gi t s m o r p h o l o g ya n dp h y s i o l o g i c a l - b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t h es t r a i nl 0w a si n i t i a l i d e n t i f i e db e l o n gt ob a c i l l u sb a c t e r i a ( b a c i l l u ss p ) f u r t h e rs t u d yo fl 0s t r a i no ft h eb e s tg r o w t hc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：i nt h e g e n e r a lm e d i u m ，l oc o u l dr e a c ht h em a x i m u ma m o u n to fg r o w t ha f t e r7 2h o u r s ，b u t i nt h ei n o r g a n i cs a l tm e d i u m ，i to n l yu s e d4 8h o u r s ；t h eo p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r e w a s2 6 c ，t h eb e s ti n i t i a lp hw a s7 ，t h eb e s ts o u r c eo fn i t r o g e nw a sp e p t o n ea n dt h e b e s tc a r b o ns o u r c ew a sg l u c o s e ；w h e nt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a sl t h e o p t i m u mc ：nw a s2 0 ：1 ；b e s ti n o r g a n i ci o nc o n c e n t r a t i o n s ：n a + 0 2 9 l ，k + 0 6 9 l a n dm 9 2 + 0 5 9 l i i i 东北大学硕士学位论文a b s t r a c t t h i s s t u d y u s e d g a sc h r o m a t o g r a p h y t o a n a l y s i s t h e d e g r a d a t i o n o f c y p e r m e t h r i n o fl 0 g r e wi nt h eb e s t c o n d i t i o n s ，t h ed e g r a d a t i o n r a t eo f c y p e r m e t h r i n o fl 0c o u l d r e a c h8 7 5 t h eb e s tc o n d i t i o n so fc y p e r m e t h r i n d e g r a d a t i o no fl 0w e r ea sf o l l o w ：t e m p e r a t u r e2 6 c ，p h7 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n 10 0m g l ；a d d e das m a l la m o u n to fa d d i t i o n a lc a r b o ns o u r c e ( g l u c o s e ) c o u l d p r o m o t el 0t od e g r a d ec y p e r m e t h r i n ，t h eb e s tp l u sc a r b o nc o n c e n t r a t i o nw a s2 0 0m g l p r e l i m i n a r ys t u d i e dt h e e f f e c to fm i c r o b i a lr e m e d i a t i o nt ot h ec y p e r m e t h r i n c o n t a m i n a t e ds o i lb yl 0 a f t e ri tw a sa u g m e n t a t i v ec u l t u r e d ，a d d e dt h es t r a i nt ot h e s i m u l a t e ds o i lw h i c hw a sc o n t a m i n a t e d b yc y p e r m e t h r i n ，a n d l e ti t d e g r a d e c y p e r m e t h r i ni nt h en a t u r a lc o n d i t i o n s t h er e s i d u a lq u a n t i t yo fc y p e r m e t h r i ni nt h e s o i lw a sd e t e c t e db yu vs p e c t r o p h o t o m e t r y a f t e r15d a y sd e g r a d a t i o nr a t ec o u l d r e a c h5 7 6 7 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb i o r e m e d i a t i o nt e c h n o l o g yo fu s i n g m i c r o b et r e a tp e s t i c i d e c o n t a m i n a t e ds o i lh a sb r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c t s k e y w o r d s ： c y p e r m e t h r i n ， b a c i l l u s ， i s o l a t e d ，d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ， b i o r e m e d i a t i o n i v ， 毫 东北大学硕士学位论文目录 目录 独创性声明i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第一章综述l 1 1 拟除虫菊酯简介2 1 1 1 拟除虫菊酯发展史2 1 1 2 拟除虫菊酯主要品种的性质3 1 1 3 拟除虫菊酯农药污染现状5 1 2 农药的降解6 1 2 1 农药的化学降解6 1 2 2 农药的光降解7 1 2 3 农药的超声降解7 1 2 4 微生物降解7 1 2 5 生物修复技术简介8 1 3 拟除虫菊酯生物降解国内外研究现状、发展动态8 1 3 1 菌株筛选9 1 3 2 酶促降解的研究1 0 1 3 3 研究中存在的问题及发展方向1 0 1 4 课题的研究意义和主要研究内容1 1 1 4 1 课题研究意义1 l 1 4 2 论文研究的主要内容1 1 第二章实验材料与方法1 2 2 1 实验仪器、设备和试剂1 2 2 1 1 实验仪器、设备。l2 2 1 2 实验试剂1 2 v ， ， ， 东北大学硕士学位论文 目录 2 2 土样来源1 4 2 3 试剂的配制1 4 2 3 1 菌株鉴定所用试剂1 4 2 3 2 培养基配制1 4 2 4 实验方法1 5 2 4 1 菌株分离纯化一15 2 4 2 菌株的初步鉴定16 2 。4 3 菌株生长条件的测定1 8 2 4 4 氯氰菊酯气相色谱检测一1 8 2 4 5 降解菌对氯氰菊酯降解性能的研究1 9 2 4 6 菌株修复氯氰菊酯污染土壤的模拟实验1 9 第三章氯氰菊酯优势降解菌的筛选及特性研究2 1 3 1 菌株的筛选与驯化2 1 3 1 1 菌株的初筛2 l 3 1 2 菌株的驯化与复筛2 1 3 2 降解性能的验证2 2 3 2 1 氯氰菊酯的标准曲线制作2 2 3 2 2 培养基中氯氰菊酯的萃取2 3 3 2 3 添加回收率的测定：2 3 3 2 4 菌株的培养及取样2 4 3 2 5 农药降解率计算2 4 3 2 6l o 对氯氰菊酯的降解2 4 3 3 菌株的初步鉴定2 5 3 3 1 菌落特征菌体形态2 6 3 3 2l o 生理生化特征2 7 3 4 最佳生长条件的研究3 0 3 4 1 菌株的生长曲线测定3 0 3 4 2p h 值试验一一31 3 4 3 温度试验3 2 一v i 东北大学硕士学位论文目录 3 4 4 最佳碳源试验3 2 3 4 5 最佳氮源试验3 3 3 4 6 最佳碳氮比试验3 4 3 4 7 无机盐利用试验3 4 3 5 小结3 5 第四章氯氰菊酯优势降解菌降解性能研究3 7 4 1 菌悬液的制备3 7 4 2 降解率影响因素的研究一3 7 4 2 1 温度对降解率的影响3 7 4 2 2p h 值对降解率的影响3 8 4 2 3 底物浓度对降解率的影响3 8 4 2 4 共代谢3 9 4 3l o 修复氯氰菊酯污染土壤的模拟实验4 0 4 3 1 氯氰菊酯溶于三氯甲烷的特征吸收峰检测一4 0 4 3 2 氯氰菊酯紫外分光光度计法标准曲线检测一4 0 4 3 3l o 对土样中氯氰菊酯降解研究一4 1 4 4 小结4 2 第五章结论4 4 参考文献4 5 致谢4 9 v i i t ， 东北大学硕士学位论文 第一章综述 第一章综述 帚一早综怂 农药在现代农业中已经成为了不可或缺的生产资料，对农业的丰收起着很重 要的作用。在农业生产中使用最多的是有机农药，都是人工合成的化学品。农药 的生产、运输、贮存和使用都将对环境产生不利的影响，每一个环节都是保护环 境所不可忽视的。农药除了直接对土壤环境、水环境和大气环境造成污染外，还 会通过食物链在生物体内产生富集，导致对生物，特别是人类健康的严重危害【l l ， 如图1 1 【2 】所示。 图1 1 农药进入人体途径示意图 f i g 1 1t h es k e t c hm a po fp e s t i c i d ee n t e r st h eh u m a nb o d yp a t h 另一方面，农药的防治对象一害虫和杂草，对农药还会产生抗性。抗性的形 成会使农药的使用量增加，从而使农药对环境的污染更为严重，形成一个恶性循 环。虽然。如此，农药仍然是不可替代的农业生产资料【l 】。因此，对农药污染的治 理也越来越受到人们的关注。 ， 。 东北大学硕士学位论文 第一章综述 1 1 拟除虫菊酯简介 1 1 1 拟除虫菊酯发展史 拟降虫菊酯类【3 l ( s y n t h e t i cp y r e t h r o i d s ) 农药是一类仿生合成的杀虫剂，是 改变天然除虫菊酯的化学结构衍生的合成酯类。天然除虫菊酯是古老的植物性杀 虫剂，是除虫菊花的有效成分，其化学结构到2 0 世纪4 0 年代才被研究确定，此 后，开始了类似物质的合成研究。1 9 4 9 年，美国的m s 谢克特等合成了第一个 商品化的类似物丙烯菊酯。在5 0 , - - 一6 0 年代，又有一些类似化合物陆续研制成功， 通称为合成拟除虫菊酯。这些早期品种与天然除虫菊酯一样，在光照下易分解失 效，仅适用于室内条件下防治害虫。许多科学家为此进行了长期研究，以弄清分 子结构中易被光分解的不稳定部位，其中包括英国化学家m 埃利奥特领导的小 组。2 0 世纪7 0 年代研发成功的一类人工合成除虫菊酯杀虫剂，具有性质稳定， 不易光解，无特殊臭味及安全系数高，使用浓度低，触杀作用强，灭虫速度快， 残效时间长等优点，适用于农林害虫的防治。被称为是杀虫剂农药的一个新的突 破，是杀虫剂历史上的第三个里程碑f 4 】。此后不断出现许多光稳定性品种，被称 为第二代拟除虫菊酯，其中还包括了不含三元环的氰戊菊酯。8 0 年代以来，结 构改变的研究仍在深入，并有了新的进展。例如结构中引入氟原子的品种兼具杀 螨效能，又如，把酯键改为醚键后，可大大降低对鱼的毒性等。 拟除虫菊酯杀虫剂由于成本低，用量少，杀虫谱广及使用安全等优点，自 1 9 7 8 年投放市场以来，获得了广泛的应用。19 8 7 年，全球的杀虫剂市场约为6 l 亿美元，其中2 5 ( 1 5 亿美元) 为拟除虫菊酯。拟除虫菊酯在1 0 亿美元的水果 市场和6 2 5 亿美元的蔬菜市场中，分别占了2 2 和2 9 嘣5 1 。同时，拟除虫菊酯 在全世界公共卫生和传病媒介昆虫防治中具有广泛的应用并且发挥了显著的作 用1 6 l 。根据文献【7 1 统计1 9 7 2 1 9 9 5 年四种杀虫剂的递变规律见表1 1 。 表1 11 9 7 2 1 9 9 5 年四种杀虫剂的递变 t a b l e1 - 1u s a g eo ff o u rk i n d sp e s t i c i d e sf r o m1 9 7 2t o1 9 9 5 2 ， ， 东北大学硕士学位论文第一章综述 近些年来，有机磷等剧毒类农药的中毒事件以及因农药残留超标而遭遇的 “绿色壁垒”事件频频发生，引起世界各国的高度重视，纷纷做出相关规定，严格 限制剧毒农药的使用，大部分有机磷农药已被禁用。于是拟除虫菊酯农药因其新 型、高效、低毒等特点成为有机磷农药的替代产品，其品种和使用量仅次于有机 磷农药，占杀虫剂市场第二位，约占杀虫剂总量的2 0 【8 】。近几年，拟除虫菊 酯全世界销售量最大的品种有氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯等， 它们的销售额每年已分别超过l 亿美元【9 1 。目前，我国拟除虫菊酯类农药的施用 面积也已占杀虫剂总施用面积的1 3 以上。 1 1 2 拟除虫菊酯主要品种的性质 拟除虫菊酯类农药的主要品种有氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊 酯等，它们的基本性质如下所述。 1 氯氰菊酯( c y p e r m e t h r i n ) 化学名称：( r s ) a 氰基3 苯氧基苄基( s r ) 3 ( 2 ，2 二氯乙烯基) 2 ，2 二甲基环丙烷羧酸酯；其它名称：灭百可，兴棉 宝，安绿宝。分子式：c 2 2 h 1 9 c 1 2 n 0 3 。相对分子质量：4 1 6 3 。化学结构式如图 1 2 。 c h 3c h ， 、 c f l l a c = = = c h c l t c h c o c h d c n o 图1 2 氯氰菊酯的化学结构式 f i g 1 2t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fc y p e r m e t h r i n 氯氰菊酯的理化性质：纯品为无色液体。熔点6 l 8 3 ，蒸汽压2 0 1 0 1 4 m p a ( 2 0 ) ，闪点8 0 c 。难溶于水，水中溶解度为0 o l 0 2 m g l ( 2 0 ) ，易溶于 多种有机溶剂，如丙酮、氯仿、环已酮、石油醚、环己烷。本品在中性、酸性条 件下稳定，强碱条件下水解，热稳定性良好。常温贮存稳定性两年以上，6 0 时 为液体。 2 氰戊菊酯( f e n v a l e r a t e )化学名称：( r s ) a 氰基3 苯氧基苄基( s r ) 2 一( 4 氯苯基) 3 甲基丁酸酯；其它名称：速灭杀丁、速灭菊酯、杀灭菊酯。 分子式：c 2 5 h 2 2 c 1 n 0 3 ，相对分子质量：4 1 9 9 ，结构式见图1 3 。 ! - 3 气 东北大学硕士学位论文 第一章综述 e l o 图1 3 氰戊菊酯的化学结构式 f i g 1 3t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo ff e n v a l e r a t e 氰戊菊酯的物化性质：纯品为黄色透明油状液体。相对密度1 1 7 5 ( 2 5 ) ， 沸点3 0 0 ( 4 9 3 k p a ) ，在辛醇与水中的分配系数( 2 3 ) 为1 0 3 x 1 0 5 ，蒸汽压 3 7 3 p p a ( 2 5 ) 。2 3 在水中的溶解度为o 0 2 m g l ，在二甲苯、甲醇、丙酮、氯 仿中的溶解度大于5 0 ，己烷中1 3 4 ，耐光性较强，酸性中较稳定，碱性中易 分解。 3 溴氰菊酯( d e l t a m e t h r i n ) 化学名称：( s ) a 一氰基3 苯氧基苄基( 1 r ，3 r ) 3 ( 2 , 2 二溴乙烯基) 2 ，2 二甲基环丙烷羧酸酯；其它名称：敌杀死，凯素灵。 分子式：c 2 2 h 1 9 b r 2 n 0 3 ，相对分子质量：5 0 5 3 ，结构式见图1 4 。 c l f i b c i b c 、f 1 、l i b r c = c l i c l t c l i c oa i b r c n o 图1 4 溴氰菊酯的化学结构式 f i g 1 4t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fd e l t a m e t h r i n 溴氰菊酯的物化性质：纯品为白色斜方形针状结晶，熔点1 0 1 1 0 2 ，2 5 时蒸气压2 0 “p a 。2 0 。c 时溶解于丙酮及二甲苯等大多数芳香族溶剂，微溶于水。 在酸性介质中稳定；在碱性介质中易发生苄基碳的外消化，酯键断裂，发生皂化 反应；对光稳定。原药为无嗅白色粉末，纯度一般为9 8 ，熔点9 8 1 0 1 。 4 氟氯氰菊酯( c y f l u t h r i n )化学名称：( r s ) a 氰基4 氟3 苯氧基苄基 ( 1s r ，3 s r ；1s r ，3 s r ) 3 ( 2 ，2 二氯乙烯基) 2 ，2 二甲基环丙烷羧酸酯； 其它名称：百树得，百治菊酯，百树菊酯。分子式：c 2 2 h 1 8 c 1 2 f n 0 3 ，相对分子 质量：4 3 4 3 ，结构式见图1 5 。 ! 4 t 咖l 一 0 一 o i c 一 叫l nc h m c c mc ， ， 东北大学硕士学位论文 第一章综述 c h ， c h 3 c o 、| | c i c = c l l c i t c h c o c h o 图1 5 氟氯氰菊酯的化学结构式 f i g 1 5t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fc y f l u t h r i n 氟氯氰菊酯的物化性质：纯品为黏稠的、部分结晶的琥珀色油状物。熔点 6 0 ( 工业品) ，相对密度1 2 7 , - , 1 2 8 。其异构体在水中最大的溶解度( 2 0 ) 为 4 3 9 9 l ( p h3 ) 。易容于二氯甲烷、甲苯、正已烷、异丙醇。稳定性：室温稳定 d o l 。 1 1 3 拟除虫菊酯农药污染现状 虽然拟除虫菊酯类农药普遍具有高效低毒的特性，但近些年来，随着拟除虫 菊酯农药使用的日益广泛和使用时间的延长，有关菊酯类农药的污染问题及危害 也日益暴露出来，引起科研工作者和有关部门的高度重视。 拟除虫菊酯类农药主要应用于棉花、蔬菜、果树以及家庭中多种虫害的防治， 与人们的生活息息相关，虽然其毒性较其它类农药低【1 1 h 1 2 l ，但和其它种类农药 一样，它在杀灭、抑制病害虫，保证农作物的稳产高产的同时，也会通过各种途 径危害到环境的安全，进而损害人体健康。近些年来，拟除虫菊酯农药的危害已 经开始得到部分科研工作者的重视，经过大量研究，发现拟除虫菊酯对某些非目 标生物【1 3 1 如蜜蜂1 4 l 、家蚕【1 5 1 及天敌昆虫【1 6 】毒性大，对鱼、虾、贝等水生生物毒 性也很高【17 1 ，对人体的危害也正在被关注1 1 8 】。 随着世界经济一体化的推进，农药残留将作为技术壁垒在农产品国际贸易中 起着重要作用，越来越引起各国政府的重视。西方发达国家通过采取严格的检验 标准来限制并达到他们的贸易保护主义目的。如表1 2 ，欧洲联盟对农产品中菊 酯类农药残留m r l 值大幅度变严【l9 。 5 东北大学硕士学位论文第一章综述 表l 一2 欧联盟农产品中农药残留m r l 值的变化( m g k g ) t a b l e1 - 2c h a n g e si nm r lo fp e s t i c i d er e s i d u e si na g r i c u l t u r a lp r o d u c t si ne u r o p e a nu n i o n 由于欧盟国家是纯茶叶进口国，当前世界茶叶市场供略大于销，因此对茶叶 的农药残留限制特别严格。我国颁布的最高残留限量( m r l ) 参照值为2 m g k g ， 而国外实施的是0 1 m g k g 的标准。我国在1 9 9 3 - 1 9 9 8 年对来自全国1 4 个省市的 13 0 0 多份茶样的分析结果，按我国颁布的2m g k g 标准，氰戊菊酯有o 5 0 - 4 5 0 超标，如按国外实施的o 1 m g k g 的标准，茶叶中的氰戊菊酯阳性率为4 5 - 10 0 。 据1 9 9 9 年1 6 月的分析结果，氰戊菊酯如按o 1 m g k g 标准计算，检出率高达 9 0 以上，超标率在7 0 以上。1 9 9 9 年出口到德国的茶叶中氰戊菊酯农药残留 超标4 倍甚至到1 0 0 倍，相当数量的茶叶不能出口 2 0 】。 以上数据表明，拟除虫菊酯农药残留问题日益严重，对我国农产品出口造成 了很大的威胁。 1 2 农药的降解 1 2 1 农药的化学降解 农药的化学降解是人们采用的较为广泛的降解方法，人们可以针对不同的化 学官能团采用相对应的化学试剂与其进行反应，从而达到降解农药的目的。农药 的化学降解中研究较多的就是氧化降解【2 1 1 ，如臭氧对蔬菜中残留农药的降解【2 2 1 ， 利用臭氧，或添加氧化剂过碳酸钠处理一些农药污水等。超临界水氧化法【2 3 1 是 利用超临界水良好的溶剂性能和传递性能，使有机污染物在超临界水中迅速、有 效地氧化降解，这种方法能有效地降解有机磷农药氧乐果废水。使用微碱解法【2 4 1 预处理有机磷农药废水，则是利用农药在碱性条件下会不同程度降解的特性，这 种方法可有效地降低废水中有机磷的含量，其去除率可达5 5 。当其与混凝沉 淀法联合使用，可进一步提高有机磷农药的去除率。吴勇勇等【2 5 1 利用气相色谱 仪测定了过碳酸钠对有机磷农药的降解，发现过碳酸钠对甲胺磷农药的降解率比 碳酸钠高一倍多，原因是过碳酸钠溶液呈碱性，同时具有氧化性，属于典型的化 学降解。 6 东北大学硕士学位论文第一章综述 1 2 2 农药的光降解 由于农药中一般含有c c ，c h ，c o ，c n 等键，而这些键的离解正好在太阳 光的波长范围内，因此农药在吸收光子之后，就变成为激发态的分子，导致上述 化学键的断裂，发生光解反应【2 6 1 。自然光谱中的紫外波段对农药降解作用最大， 因此可以单独利用紫外线进行照射。在所有种类的农药中，最容易被光解的农药 是有机磷类农药。光解是有机磷农药在表层土壤中进行转化的一个主要的途径。 1 2 3 农药的超声降解 除了上述的降解方式外，人们还尝试利用超声对农药，特别是对农药废水 进行降解。孙红杰等【2 7 1 采用功率超声的新方法，研究发现甲胺磷农药的降解率 与超声反应时间基本呈线性关系，具有一级反应动力学特征，低频范围内改变超 声波频率对甲胺磷降解的影响很小，增大超声波功率、声强和变幅杆直径，甲胺 磷降解率明显提高，变幅杆直径为2 5 m m 时可达6 1 7 ，溶液初始p h 值的影响 显著，酸性条件较利于甲胺磷降解。 1 2 4 微生物降解 生物降解( b i o d e g r a d a t i o n ) 2 8 】，1 9 7 8 年化学品安全委员会在布鲁塞尔 b i o d e g r a d a t i o nt a s kf o r c e 上将生物降解定义为：活的生物体复杂的生命活动导致 的有机物分子结构的降解。一种物质对环境不利的性质丧失就认为它被生物降解 成了环境可接纳物。生物降解导致的一些特征功能或性质的丢失则被称为生物转 化。 进入环境中的农药主要是靠环境微生物对其进行降解。一般而言都是藻类、 细菌、真菌等土壤和水体中的微生物。土壤环境和水体环境是农药污染物质的最 终归属。即使被生物所截留的部分农药也会因为淋洗等原因而大部分进入到水体 或土壤环境中。土壤和水体环境中存在大量的微生物，能对各种污染物质进行有 效降解。既有一般的毒性降解，也可以对多种有机农药物质进行完全降解、被矿 化为c 0 2 和h 2 0 【2 9 1 。 微生物对农药的作用方式可分为两大类，一类是微生物的降解作用主要是通 过其分泌酶直接作用于农药，通过酶促反应降解农药，常见的降解酶类主要有水 解酶类( 包括磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等) 以及氧化 还原酶类( 过氧化物酶、多酚氧化酶) 。微生物通过酶促反应降解农药的方式主 7 东北大学硕士学位论文第一章综述 要有氧化、脱氢、还原、水解、合成等几种反应类型【3 0 1 。另一类是通过微生物 的活动改变化学和物理环境而间接作用于农药，常见的作用方式有矿化作用、共 代谢作用、生物浓缩或累积作用和微生物对农药的间接作用 3 1 1 。 常说的农药微生物降解多属于酶促降解的方式。农药分子对生物体的代谢活 动具有毒性作用，这是微生物在代谢降解农药污染物时应该有的一个特殊反应。 因此，酶促方式的代谢就是解毒代谢。微生物通过酶系中的特殊酶对农药分子的 特殊毒性基团进行代谢，使其失去毒性，这是微生物抵御不良环境，避免受农药 杀伤的一种抗性机制，是微生物种群的生态适应的表现。 微生物可以将农药分子当作自身所需的碳源物质对农药进行分解代谢，从而 在代谢过程中获得生长所需的能量。这种将农药分子作为碳源物质的分解代谢常 常是在农药污染物浓度较高的情况下进行的。即使农药分子不是可以被直接利用 的物质，也可以在经过初级转化后成为碳源物质。近年来的研究发现，由于微生 物具有极其多样的代谢类型和很强的变异性，许多微生物能降解人工合成的农 药，甚至原以为不可生物降解的合成农药，通过定向诱变也找到了能降解它们的 微生物【2 9 11 3 2 1 。 1 2 5 生物修复技术简介 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 是指利用微生物或其它生物将存在于土壤、地 下水和海洋中的有毒、有害污染物降解为二氧化碳和水或转化为无害物质的系 统，与物理化学方法相比，是一种有效、安全、廉价和无二次污染的方法【3 3 】。 微生物修复技术是在人为强化的条件下，用自然环境中的土著微生物或人为投加 外源微生物的代谢活动，对环境中的污染物进行转化、降解与去除的方法【3 4 h 3 5 1 。 传统方法降解农药的副作用大，往往造成环境的二次污染，并且作用很慢。 物化方法对于规模较小的污染源或农产品的农残降解在一定程度上还是可行的， 但对大规模的面源污染则无能为力，而且物化方法处理不彻底，无法从根本解决 农药残留问题【36 1 。所以利用微生物技术处理残留在环境中的农药，对受污染的 土壤和水体进行生物修复，己成为当前环境科学研究的热点【3 。 1 3 拟除虫菊酯生物降解国内外研究现状、发展动态 国外工作者已筛选得到一些能降解拟除虫菊酯的菌株并进一步研究了农药 的降解机理。而在国内，主要侧重于研究拟除虫菊酯的环境行为和残留消解动态 8 - 东北大学硕士学位论文第一章综述 的工作。有关拟除虫菊酯农药微生物降解工作主要集中在筛选菌株方面，已经筛 选的菌株不仅数量有限，对拟除虫菊酯的降解率也不是很高【38 1 。而且有关与拟 除虫菊酯微生物降解相关的d n a 片段的克隆，构建工程菌株等借助分子生物学 技术更深一步的研究还很少见。 1 3 1 菌株筛选 美国l e e 等【3 9 】从受污染的沉积物中分离出5 6 株拟除虫菊酯降解菌，其中6 株能够在水相中转化联苯菊酯和氯菊酯及在沉积物中转化联苯菊