（应用化学专业论文）香蕉秆纤维素降解菌筛选及酒精制备研究.pdf

摘要 摘要 纤维素是一种廉价的可再生资源，由其发酵所产生的生物燃料乙醇 对能源工业以及环境可持续发展具有重大意义。本文针对南方农作物香 蕉大宗副产物香蕉秆的资源优势及香蕉秆的综合利用现状，根据微生物 学及发酵工程理论，采用微生物方法，利用香蕉秆生产酒精，为香蕉秆 的综合利用开辟一条新的途径，本文主要研究内容和研究结果如下： 从自然环境中采集样品进行分离纯化得到4 株疑似目的菌株。分别 采用羧甲基纤维素钠相对活性法、滤纸条崩解试验，从中选出2 株分解 纤维素能力较强的菌株( l i i 和l b ) 进行鉴定试验。经初步鉴定，菌株 l i i 与s t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i t i a 的1 6 sr d n a 序列有9 9 8 的同源性； 用18 sr d n a 对l b 进行序列分析，结果表明菌株l b 与e u p e n i c i l l i u m j a v a n i c u m 的1 8 sr d n a 序列有9 9 3 的同源性。初步得出l i i 是嗜麦芽 寡养单胞菌，l b 是爪哇正青霉。 本论文研究了香蕉秆预处理工艺及水解工艺。纤维素原料在水解前 经过预处理可破坏纤维素结晶结构，从而增大其接近表面，提高水解效 率。采用氢氧化钠对香蕉秆进行预处理，考察了氢氧化钠溶液浓度、温 度、固液比、时间等因素对预处理的影响，优化预处理工艺条件。实验 最后确定在2 5 条件下，按1 ：1 2 的固液比( 香蕉秆：氢氧化钠溶液) ， 加入质量浓度3 的氢氧化钠溶液，处理3 小时，可获得较佳的预处理 效果。水解工艺分别考查了氢氧化钠预处理、菌液用量、时间及p h 的 影响，通过四因素三水平的正交实验，最终确定各个因素对l 各个指 标的影响顺序为：预处理 菌用量 p h 水解时间，最佳条件组合为3 浓度氢氧化钠、3 m l 活化1 2 小时的菌液、p h8 0 、水解4 天：各个因素 对l b 各个指标的影响顺序为预处理 p h 菌用量 水解时间，最佳组合 为3 浓度氢氧化钠、p h7 0 、2 m l 活化1 2 小时的菌液、水解4 天。 利用筛选所获得的细菌l i i 、霉菌l b 与酵母混合发酵制备酒精， 初步确定香蕉秆生产酒精的发酵工艺。确立了由细菌l i i 、霉菌l b 及 广东工业大学工学硕 学位论文 酵母组成的微生物混合协同发酵体系； 蕉秆：微生物菌液：酵母= l ：0 1 o 5 ： 发酵重量组分技术配比约为：香 o 0 1 0 0 5 ，发酵时间为15 2 0 天。 关键词：微生物降解，香蕉秆，酒精，预处理 i i a b s t r a c t c e l l u l o s e sb i o m a s si sal o w - c o s tr e n e w a b l er e s o u r c e ，i tc a nb e p o t e n t i a l l yf e r m e n t e di n t oe t h a n o lb ym i c r o b i a lt e c h n o l o g y ，w h i c hi s s i g n i f i c a n tt o t h es u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n to ne n e r g y i n d u s t r ya n dt h e e n v i r o n m e n t a c c o r d i n g t ot h ea b u n d a n t a n dp o t e n t i a l b y p r o d u c t so f b a n a n as t a l ki ns o u t ha n dt h e i rf u l l - u t i l i z a t i o n ，a n dm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n ， t h et e c h n o l o g yo fp r o d u c i n go fa l c o h o lf r o mb a n a n as t a l kb ym i c r o o r g a n i s m m e t h o dw a ss t u d i e d i tb r e a k san e ww a yt om a k et h ef u l lu s eo fb a n a n a s t a l k a n dt h em a i nw o r ka n di t sr e s u l t sa r ea sf o f l o w s ： 4s p e c i e so fs t r a i n sa r es e p a r a t e df r o mt h en a t u r a le n v i r o n m e n t c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s es o d i u m a g a rp l a t er e c o g n i t i o na n d f i l t e r p a p e r s c o l l a p s i n gt e s t i n ga r ec a r r i e do u t t w os p e c i eo ff i l a m e n t o u sf u n g u sw h i c h c a nd e c o m p o s ec e l l u l o s eo nar e l a t i v e l y h i g hs c a l ew a ss c r e e n e da n d i d e n t i f i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ：t h es e q u e n c eo ft h es t r a i nli ih a s 9 9 8 h o m o l o g yw i t ht h e1 6 sr d n ao fs t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i a a n d t h es e q u e n c eo ft h es t r a i nl bh a s9 9 3 h o m o l o g yw i t ht h e18 sr d n ao f e u p e n i c i l l i u mj a v a n i c u m t h ep r e t r e a t m e n tc r a f ta n dh y d r o l y s i sc r a f to fb a n a n as t a l ka r es t u d i e d b e f o r e e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，b yl i g n o c e l l u l o s e sm a yd e s t r o yc r y s t a l c o n f i g u r a t i o n o fc e l l u l o s e ，f o r a g g r a n d i z i n ga p p r o a c h a b i l i t ys u r f a c e ， i m p r o v i n ge f f i c i e n c yo fh y d r o l y s i s t h es o d i u mh y d r o x i d ei su t i l i z e dt o c a r r y0 nt h ep r e t r e a t m e n tt ot h eb a n a n as t a l k ，a n dt h ei n f l u e n t i a l f a c t o r so f p r e t r e a t m e n t w e r es t u d i e d i n c l u d i n gs o d i u mh y d r o x i d ec o n c e n t r a t i o n ， t e m p e r a t u r e ，t h er a t i oo fs o l i dt ol i q u i da n dr e a c t i o nt i m e a n dt h e p r e t r e a t m e n tt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sa r eo p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a t ：t h eb e s tp r e t r e a t m e n te f f e c tc o u l db ea b a i n e da t2 5 、3 s o d i u m h y d r o x i d e 、3 h t h ei n f l u e n t i a lf a c t o r so fh y d r o l y s i sc r a f tw e r es t u d i e d 1 i i 广东t 业大学工学坝l 。学位论义 i n c l u d i n gs o d i u mh y d r o x i d ep r e t r e a t m e n t ，a m o u n to fb a c t e r i a ls o l u t i o n ， h y d r o l y s i st i m ea n dh y d r o l y s i sp h t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n to ff o u r f a c t o r sa n dt h r e el e v e l sf i n a l l yc o n f i r m e dt h a tt h ee f f e c ts e q u e n c eo fe a c h f a c t o ro ne a c hi n d e xo fli ii s p r e t r e a t m e n t b a c t e r i a a m o u n t p h h y d r o l y s i st i m e ，t h eb e s tc o n d i t i o nc o m b i n a t i o ni s3 n a o h ， 3 m lb a c t e r i al i q u i do fa c t i v a t i n g12 h p h8 0 h y d r o l y s i s4 d ；t h ee f f e c t s e q u e n c eo fe a c hf a c t o ro ne a c hi n d e xo fl bi sp r e t r e a t m e n t b a c t e r i a a m o u n t p h h y d r o l y s i s ，t h eb e s tc o n d i t i o nc o m b i n a t i o ni s3 n a 0 h ，2 m l b a c t e r i al i q u i do fa c t i v a t i n g12 h ，p h7 0 ，h y d r o l y s i s4 d u s et h eb a c t e r i ali ia n dm o u l dl bb ys c r e e n e dt ob l e n dw i t hy e a s ti n o r d e rt of e r m e n tb a n a n as t a l kt op r e p a r ea l c o h o l ，p r e l i m i n a r yd e t e r m i n e d t h ef e r m e n tt e c h n i q u eo fb a n a n as t a l kp r e p a r ef o ra l c o h 0 1 e s t a b l i s h e dt h e m i c r o o r g a n i s mc o o p e r a t i v ef e r m e n ts y s t e mi sc o m p o s e d o fb a c t e r i ali i ， m o u l dl ba n d y e a s t t h e t e c h n i c a l p r o p o r t i o n o ff e r m e n t w e i g h t c o m p o s i t i o ni sa b o u t ：b a n a n as t a l k ：m i c r o o r g a n i s ml i q u i d ：y e a s t = l ： o 1 0 5 ：0 0 l - 0 0 5 f e r m e n tt i m ei s1 5 2 0 d k e yw o r d s ：m i c r o b i a ld e g r a d a t i o n ；b a n a n as t a l k ；a l c o h o l ； p r e t r e a t m e n t 独创性声明 独创性声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在 导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以 标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包 含本人或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。 本学位论文成果是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下取得的，论 文成果归广东工业大学所有。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。 指导教师签字瓤 论文作者签字：砰强 2 0 0 8 年5 月 第一幸绪论 第一章绪论 1 1 生物质制取乙醇的意义 能源是人类赖以生存的物质基础，也是发展工农业生产、交通运输和提高人 民生活水平的重要物质保证。目前，人类可以开发利用的能源种类非常丰富，但 以石油、煤、天然气为主的常规能源仍是人类社会发展的主要动力。随着世界各 国经济的迅猛发展，常规能源消耗量不断攀升，这些能源最终会被开采殆尽，或 因开采成本过高而失去开采价值，能源问题终会成为一个世界性问题。为了解决 这些问题，在全世界范围内，人们已经达成共识：大力提高能源的利用效率，以 高新技术开发可再生的新能源，逐步取代石油、煤、天然气等矿物质不可再生能 源，是解决能源危机的重要途径之一。在众多新能源当中，可再生能源以其取之 不尽、用之不竭的优点，成为世界能源可持续发展战略的重要组成部分，而在众 多可再生能源中，生物质能源以其储量大、分布广、环保效果明显等优势，受到 世界各国的青睐。 生物质是世界第四大能源【1 】。7 0 年代初以来，生物质能源的开发利用已成为 世界性的热门研究课题，许多发达国家都制定了相应的研发计划，如美国专门成 立了生物质能局，制订了联邦生物质燃料计划，并与太阳能研究院共同拟订了纤 维素发酵的生产技术计划；日本也相应地制订了两个有关生物质利用的研究计划， 即绿色能源计划和生物质转化计划，并投入大量人力、物力付诸实施；发展中国 家对生物质能源的开发利用也非常重视，纷纷投入大量的人力、物力用于生物质 能源的开发研究工作【2 5 】。目前全球范围内生物质能源的利用占总能源消耗1 4 左 右。美国现在有大约4 的能源由生物质提供，估计到2 0 2 0 年，这一比例将达到 1 7 。根据f a o 组织1 9 9 3 年预测，2 0 5 0 年以后全世界6 0 的电力和4 0 的燃料 将由以生物质为主的可再生能源提供且价格将远低于化石燃料。在此背景下，生 物质作为唯一可转化为液体燃料的可再生资源，日益受到重视1 6 j 。 在我国，能源危机与环境问题已经成为制约我困经济增长和社会发展的主要 瓶颈。2 0 0 5 年，全国一次能源消费量已达到2 2 2 亿吨标准煤，中国已跃升为世界 广东t 业人学工学硕士学位论文 第二大能源消费国。与此同时，以煤为主的能源结构也带给中国日益严重的环境 问题。我国还是一个农业生产大国，每年都有数亿吨的农业废弃物生成，较常见 的有薪材、稻壳、秸秆、麦草等等。据统计m l ，我国农作物秸秆每年可收集量约 为4 5 亿吨，折合标准煤1 8 亿吨；稻壳每年可收集量约为5 0 0 0 万吨，折合标准 煤2 0 0 0 万吨；各种天然薪材提供量为1 4 亿吨，折合标准煤o 7 4 亿吨。据有关专 家预测，2 0 1 0 年我国农作物秸秆量将达7 2 6 亿吨，相当于5 亿吨标准煤；林业废 弃物包括薪材相当于6 0 0 0 万吨标煤 9 1 。这些大量的农业废弃物，在传统低效率的 能源利用方式下，不仅浪费了十分宝贵的生物质资源，还给当地生态环境带来日 益严重的负面效应，如能将这些纤维废物的1 0 1 5 3 f 1 以收集，用来做原料，就 可生产燃料乙醇0 2 亿吨。因此，利用生物质制取燃料乙醇对我国的经济和社会 的可持续发展有着重要的意义。 纤维质原料是自然界最丰富的可再生资源，可为人类提供用之不竭的资源。 但目前纤维素材料尚未得到充分利用，仅有一小部分被用于纺织、造纸、建筑、 饲料、制药、农肥、燃料等方面，大部分未得到利用而被抛弃或焚烧，不仅造成 资源的巨大浪费，而且污染环境，带来公害。如果能将这些农剐产品和工业废料 等纤维素材料转化成葡萄糖，再经发酵可生产出化工原料、饲料、燃料、食品和 药物等，就可改变目前依靠农业生产的传统方法，开辟饲料、发酵工业原料和人 类食品的新能源，同时还可以处理废物、减少公害、保护环境。因此对于人类解 决面临的粮食问题、能源问题和环境问题来说，纤维素材料是很有前景的一种资 源，研究纤维素资源的综合利用具有深远的意义【9 1 0 1 。 1 2 纤维素原料结构及组成 纤维素( c e l l u l o s e ) 是生物质的最主要成分，是不溶于水的均一聚糖。纤维素属 大分子多糖，是由葡萄糖脱水，通过1 ，4 一葡萄糖苷键连接而成的直链聚合体， 链两端组成不同，一个是还原端，另一个是非还原端。纤维素分子式可简单表示 为( c 6 h l 0 0 5 ) 。( 见图1 - 1 ) ，这里的n 为聚合度，表示纤维素中葡萄糖单元的数目， 其值一般在3 5 0 0 1 0 0 0 0 。由含碳4 4 4 4 ，氢为6 1 7 ，氧为4 9 3 三种元素组成。 纤维素经水解可生成葡萄糖。据x 射线的研究1 ，纤维素大分子的聚集，一部分 的分子排列比较整齐有规律，呈现清晰的x 射线图，这部分称之为结晶区；另 2 第一章绪论 部分的分子链排列不整齐、较松散，但其取向大致与纤维主轴平行，这部分称之 为无定形区。纤维素大分子有聚集态结构，即所谓的超分子结构，是一种有结晶 区和无定形区交错结合的体系，结构中存在许多结晶变体，这些结晶变体都以纤 维素为基础，有相同的化学成分，其刁i 同的聚集结构将影响到纤维素及其纤维的 性质。 c h 2 0 h n ：聚合度 h 图1 1 纤维素结构式 f i g 1 1c e l l u l o s es t r u c t u r a lf o r m u l a 在植物体内，半纤维素( h e m i c e l l u l o s e s ) 的含量仅次于纤维素，一年生作物 中，半纤维素约占2 5 0 r - 4 0 ，木材中约占2 5 3 5 。半纤维素是由各种五碳 糖( d 木糖和l 邛可拉伯糖) 、六碳糖( d 半乳糖、l 半乳糖、d 一甘露糖、l 鼠李 糖和l 岩藻糖) 及糖醛酸( d 葡糖醛酸) 组成的一种大分子多分枝杂聚物，较纤 维素容易被水斛1 2 】，水解产物主要是木糖。但因生物质里的半纤维素和纤维素是 互相交织在一起的，故只有当纤维素被水解时，半纤维素才能水解完全。 木质素是自然界最丰富的芳香烃聚合物，一般占植物干重的1 5 2 0 ，木 材的木质素含量可高达3 0 左右。木质素由c 、h 、o 三种元素组成，分子量 范围在2 00 0 0 5 00 0 0 约占5 0 ，1 0 0 0 2 00 0 0 之间约占4 5 ，其分子式可简单表 示为( c 6 h 1 1 0 2 ) 【1 3 】。木质素常与纤维素结合在一起，被称为木质纤维素，它的结构 复杂，具有芳香族特性( 如图1 2 所示) ，是由苯丙烷单元通过醚键和碳一碳键连 接而成的，非结晶性的，无定型的，三维高分子高聚物1 4 “6 ，分子结构中相对弱 的是连接单体的氧桥键和单体苯环上的侧链键，受热易发生断裂，形成活泼的含 苯环自由基，极易与其它分子或自由基发生缩合反应生成结构更为稳定的大分子， 进而结炭。木质素不能被水解为单糖，其水解产物极其复杂，多为发酵抑制物， 且在纤维素周围形成保护层，影响纤维素水解。 广东t 业人学工学碗i 学位论文 图1 - 2 术质素结构式 f i g 1 - 2l i g n i ns t r u c t u r a lf o r m u l a 天然纤维素原料的纤维素和半纤维素多数都是多糖，水解后可生成葡萄糖、 木糖等糖类。这些糖类经微生物发酵转化为乙醇、丙酮、丁醇、乙酸、丁二醇等 液体燃料和化工原料；也可作为抗生素、有机酸、单细胞蛋i 刍( s c p ) 、酶制剂的发 酵原料。木质素的单体是苯丙烷衍生物，这些物质可进一步转化为其他化工产品， 用作有机化学工业的基本原料。 1 3 纤维素原料预处理工艺 纤维素原料的预处理是木质纤维素转化乙醇过程中的关键步骤，其直接影响 纤维素的水解效率和纤维素制备乙醇的生产成本。由于构成生物质中纤维素、半 纤维素和木质素之间的互相缠绕，且纤维素本身存在复杂的晶体结构；另外由于 木质素在水解过程中还会被降解为多种发酵抑制物，故生物质直接水解时效率很 低，糖量一般在2 0 以下【，因此在木质纤维素被水解之前，往往需要对其进行 4 第一章绪论 预处理。通过预处理既可除去部分木质素、溶解半纤维素或破坏纤维素的晶体结 构，使木质纤维素结构更松散，还被认为可以有效地提高后续水解效掣1 8 】，提高 还原糖产率。近年来，木质纤维素预处理技术的研究非常多，主要的预处理技术 有物理法、化学法、物理化学联合法和生物法。随着新技术的发展，利用生物法 预处理以及更多的预处理试剂和预处理新方法也被逐渐的研究出来。 1 3 1 物理法预处理 1 3 1 1 研磨法 对木质纤维素进行切、辗、磨等工艺使生物质原料的粒度变小是最传统的物 理预处理法。通过这种方法，木质纤维的物理性能发生了明显的变化，物料的尺 寸明显变小，接触表面积增大，结晶度降低，平均聚合度变小，物料的水溶性组 分增加。纤维素分解性能与研磨时间和粉碎度直接相关，一般当飞速粒径微1 0 3 0 um ( 接近2 7 0 筛目) 时，纤维素酶解率可达8 0 以上。另外，经粉碎的纤维原料 的粉末，没有膨润性，体积小，可以提高基质浓度，能得到高浓度糖化液。与其 他预处理技术相比，这种方法能耗大，成本高。 1 3 1 2 蒸汽爆破 蒸汽爆破是研究得较为深入的一种方法，这种预处理方法和淀粉质原料蒸煮 的情况类似，影响其效果的主要因素有停留时间、处理温度、原料的粒度和含水 量等1 9 1 。蒸汽爆破的原理是原料用蒸汽加热至1 8 0 2 3 5 。c ，维持5 - 3 0 m i n ( 连续处 理时) ，或者加热到2 4 5 。c ，维持o 5 - 2 m i n ( 1 n 歇处理时1 ，蒸气处理过程中，在高 温和高压的作用下，半纤维素的乙酞基等生成有机酸类，而后又参与未损半纤维 素和木质素解聚的催化过程，使半纤维素部分水解成可溶性多糖，木质素的二丙 烯乙醚及部分二丙烯乙醚裂开，当加热完成时，纤维素原料被吹出罐外，由于突 然减压，产生二次蒸气，体积迅速增加，造成纤维素晶体和纤维束的爆裂，使木 质素与纤维素分离。经处理后的天然纤维素原料膨松呈烟丝状，纤维素的孔隙增 大，后续水解率明显提高。蒸汽爆破法最主要的缺点是要消耗大量蒸汽。 1 3 1 + 3 挤压膨化法 用挤压膨化技术对纤维素原料进行预处理，不仅可以达到类似于蒸气爆破的 效果，而且不需要消耗大量蒸气，并且有很好的连续生产性。将原料粉碎后调节 至一定水分，喂入挤压机内。在挤压机内，物料在螺秆的旋转推动下向前运动， 同时被剪切、挤压，并且在摩擦生热和外加热源的共同作用下升至1 4 0 左右， 广东t 业大学工学坝士学位论文 此时物料处于高温高压状态下。当物料从机头处喷出时，由于压力突然降低，物 料体积迅速膨胀，纤维素晶体结构被破坏，从而使木质素与纤维素分离。目前， 已有专家在从事这方面的研究。挤压膨化法有很好的发展前景。 1 3 1 4 冷冻处理法 b y k o v 和f r o l o v l 9 6 1 年指出，纤维素在水悬浮液中反复冷冻和融化( 降至一7 5 ) 可以破坏木质素和半纤维素的结合层，降低纤维素的聚合度，增加反应活性。 n o f i i n s h 0 1 9 8 0 年的专利概述了冻结法在减少颗粒大小和改变其结晶方面的作用。 但是该法能耗太高，大规模生产应用不经济。 1 3 1 5 微波、超声波、高能电子辐射口o ，2 1 1 微波是指波长在3 0 0 m h z 3 0 0 g h z 的电磁波。微波处理会使物料内部分子产 生碰撞、产生热量，导致物升温。微波处理的温度必须在1 6 0 1 8 0 。c 以上，这一 温度正好和半纤维素、木质素和纤维素的热软化温度相一致( 它们的软化点温度 分为1 6 7 1 8 1 、1 2 7 1 9 3 和2 3 1 - 2 5 3 ) ，这会使得纤维素的结晶度降低。此 外，微波处理时间短，操作简单，糖化效果明显。梁文廿【2 2 垮研究微波处理后纤 维素超分子结构及反应性能的变化，并考察微波辐射对纤维素碱化反应和碘酸高 选择性氧化纤维素反应的影响。结果表明，微波能加速纤维素的化学反应，尤其 可大大改善高碘酸高选择性氧化纤维素的反应条件。将先进微波技术应用于纤维 素学科的研究中，对提高纤维素化学反应活性、开通新的反应通道，具有非常重 要的意义。但这种试验目前还停留在实验室阶段。 超声波能够打开纤维素的结晶区，分解木质素大分子，有效提高纤维素的可 及度及化学反应性能，但超声波对纤维素的微细结构影响有限，且会同时降解半 纤维素，引起纤维比表面积下降，对后续水解不利。 高能电子辐射( y 射线、电子辐射等) 不仅能引起纤维素聚合度( d p ) 的下降，结 晶性减少，吸湿性增加，促进纤维素的水解；而且可以避免使用化学药品造成的 废水等环境污染问题。s a e m a n 等1 9 5 2 年报道，辐射剂量大于1 0 6 r a d 就能提高纤 维物料的水解速度和转化率，当辐射剂量达1 0 8 r a d 时，水解处于最佳状态，此时 糖的得率是对照的3 倍，而水解速度则提高了1 7 倍。但这种方法需高剂量的辐射 才能提高纤维素的水解速度及转化率，成本比研磨还高，目前还很难用于大规模 生产。 6 第一章绪论 1 3 1 6 热解法 热解中加入高压水即称液相热水处理，能够使木质纤维素中的半缩醛键断裂 生成酸，大幅提高纤维素的酶消化性，同时酸使半纤维素水解成单糖，水解产率 很高，产物可直接用来发酵生成乙醇。由于热解法不使用酸，所以不需使用化学 药品进行缓冲与中和处理，降低了成本，对环境无污染。在热解时，物料颗粒会 发生破裂，不需对物料进行降低颗粒大小的粉碎处理，能耗较少，半纤维素的水 解率与回收率高，并且，水解产物中中性残余物数量少。热水处理没有任何毒性， 对于纤维素和半纤维素的下一步酶水解不会产生任何影响。另外热水处理对设备 没有任何要求口3 1 。其缺点是易产生糠醛等微生物发酵的抑制物，需用碱( 如k o h ) 来保持p h 值在5 7 之间，控制预处理过程中的化学反应，尽可能使原料水解为 单糖f 2 4 1 。 1 3 2 化学法预处理 1 3 2 1 酸预处理 酸预处理是最早被研究也是研究得最深入的。常用的酸有硫酸、硝酸、盐酸 或醋酸，其中效果最好、应用最广泛的是稀硫酸旧。稀硫酸法是用木质纤维素原 料生产乙醇的传统方法，经此法预处理的木质纤维素原料，在使半纤维素水解的 同时，还会破坏纤维素的结晶结构，使原料结构疏松，从而提高了纤维素的水解 率跚。相对于其他预处理方法，酸预处理在转化半纤维素中的木聚糖成为木糖方 面尤其突出，半纤维素糖的得率较高，能够达到7 5 0 ，9 0 t 1 8 】。大多数木质纤维 素适合以稀硫酸法来处理，特别是玉米芯和玉米秸秆等半纤维素含量较高的原料 适合用稀硫酸法来预处理。经过酸预处理的木质纤维素在固相残留物中的主要是 纤维素和完整的木质素【2 7 - 3 0 】。稀硫酸法的缺点是，处理后产生发酵抑制物，腐蚀 金属设备，必须在糖发酵前将酸中和，且反应时间长，木质素脱除效果差，需增 加后续酸处理工艺，以便于后续酶法水解或发酵，并且要求物料进行粉碎，粉碎 处理的能耗占总能耗的3 3 ，因此，成本相对较高口1 3 叭。 1 3 2 2 碱预处理 碱处理法是利用木质素能溶解于碱性的特点，用稀氢氧化钠或氨溶液处理生 物质原料，破坏其中木质素的结构，从而便于酶水解的进行。同时，用碱预处理 还会使半纤维素部分溶解( 但不转化为糖) ，纤维素则因为水化作用而膨胀，由此 造成木质纤维素的结晶度降低，从而显著提高了剩余的半纤维素和纤维素的反应 广东t 业人学工学硕士学位论文 活性，使纤维素的表面积增加。碱法预处理还会除去半纤维素的乙酞基和糠醛酸 取代物等抑制性产物，因而提高了半纤维素和纤维素的酶可及性【35 1 。经过碱预处 理的木质纤维素在固相残留物中的主要是半纤维素和完整的纤维素 3 6 - 3 8 。与其他 预处理手段相比，碱法预处理过程的温度和压力稍低。碱法预处理可在室温条件 下进行，同时，碱法预处理对反应器的要求不像酸法那样苛刻，因而反应器的成 本比酸法的低。碱法预处理的缺点是容易造成环境污染，在进行废水和残余物的 回收处理时导致成本提高。常用于木质纤维素预处理的有碱石灰、氢氧化钠、氢 氧化钾、氢氧化钱、氢氧化钙。 近年来，人们发现用碱性双氧水处理纤维素原料也有脱木质素的效果【3 94 0 1 。 由于碱性双氧水只含有氢元素和氧元素，反应后对环境无污染，成为日前碱性处 理试剂的研究重点1 4 1 4 2 。但双氧水价格较贵，不适合工业化大量生产。 1 3 2 3 有机溶剂预处理 有机溶剂处理是指从天然纤维素原料中将木质素分离出来的工艺技术。可以 采用单一溶剂，也可以采用一种溶剂与其他溶剂或和几类物质相结合。常用的有 机溶剂主要有：甲醇、乙醇、丙酮、乙烯基乙二醇、三甘醇及四氢化糠基乙醇， 常与无机酸催化剂( 草酸、乙酰水杨酸、水杨酸、盐酸或硫酸等) 混合使用。在 16 0 2 0 0 。c 条件下，木质素基本溶解，半纤维素几乎完全被溶解。最新研究发现 非离子表面活性剂可应用于木质纤维素预处理。k r i s t e n s e n 等【4 3 】对非离子表面活 性剂作用机制的研究表明，非离子表面活性剂预处理能增大酶的可利用表面，增 加吸附纤维素酶的反应位点，有效稳定酶的性质，提高纤维素的糖化率。但有机 溶剂处理的条件较剧烈，比常规的化学制浆蒸煮条件要求还高，并且存在腐蚀和 毒性等缺点，易造成环境污染，需回收 4 4 1 。 1 3 2 4 氧化预处理 氧化处理就是利用过氧化氢、臭氧或氧气在碱性条件下，使木质素分解而溶 出，而纤维素液被部分氧化，这样纤维素酶解率可明显提高。常见的氧化剂主要 有h 2 0 2 、0 3 和0 2 。木质纤维素通过h 2 0 2 的预处理可以脱去5 0 的木质素和大 部分半纤维素，使纤维素水解率达到9 5 【4 5 】。c u r r e l i 等在碱性条件下用h 2 0 2 处 理麦秸秆，纤维素回收率达9 0 4 6 。e n i k o 等采用湿氧化法处理玉米秸秆，纤维 素酶转化率( e c c ) 达8 5 1 4 7 1 。v i d a l 等采用臭氧处理麦草，水解率提高了5 倍【4 8 1 。 现已有报道使用氧碱制浆的，氧碱处理主要用于取得传统的氯漂白方法，是一项 第一章绪论 无氯的、极有反正前景的技术。该处理的特点不仅可分解木质素，而且对纤维素 产生氧化作用，但尚停留在实验室阶段。 1 3 3 生物法预处理 除了上述比较传统的预处理方法外，生物方法现在也被越来越多的采用。生 物法主要研究的有真菌( 白腐菌、褐腐菌、软腐菌) 、基因工程菌、酶类( 多酚氧 化酶、漆酶、过氧化氢生成酶、苯醌还原酶) 等。例如白腐菌，其可以腐蚀掉木 质素，由此破坏木质纤维素的结构，为后续的酶水解反应创造更好的条件 4 9 】。潘 亚杰等研究表明，利用白腐菌对玉米秸秆进行生物降解预处理，木质纤维素的降 解率由原来未添加营养物质的3 5 4 0 提高到5 5 6 5 t 5 0 1 。生物法具有能耗低、无 污染、条件温和等优点，但周期长、菌体会利用部分纤维素和半纤维素使水解得 率降低。随着基因工程技术的发展，许多改进的基因工程菌将在木质纤维素预处 理中发挥重要的作用，生物法的优势也将逐渐显示出来 5 1 1 。 1 3 4 联合法预处理 单一处理方法对木质纤维素原料进行预处理时，难以达到预定效果，往往需 要采用不同方法的组合。常见的联合法是先采用机械粉碎，然后用化学、物理或 生物的方法进行处理，还有机械粉碎一电子辐射碱处理法、机械粉碎微波一化学处 理法、机械粉碎化学处理蒸汽爆破等同。朱圣东等先对稻草进行机械破碎，然 后将微波与化学法联合处理，提高稻草的初始水解速率【5 3 1 。联合法能针对不同的 木质纤维素原料，综合几种单一预处理方法的优点，可显著提高水解效率。 总之，无论用哪种预处理方法对木质纤维素进行预处理，对后续的水解反应 都有定的促进作用，但是每种方法也都有其局限性；因此，今后的研究方向应 该着重于：针对不同类型的生物质开发出高效、无污染、低成本，安全可靠的预 处理技术，进一步探索有效的预处理模型，建立预处理相关机理，突破木质纤维 素原料预处理的瓶颈，为今后木质纤维素制取燃料乙醇大规模工业化生产打下坚 实的基础。 1 4 常用菌种 自然界中，能降解木质纤维的菌有很多。2 0 世纪6 0 年代以来，据不完全统计， 国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约己有5 3 个属的几千个菌株。目前，研究比 9 广东t 业人学t 学坝十学位论立 较多的有以下几种。 1 4 1 细菌 细菌一般是单细胞的，大小从o 5 3 0 t ar l l 由于体积小，细菌具有较大的比表 面积，能使物质快速进入细胞。因此，细菌往往比真菌多得多，一些芽孢秆菌由于 能产生较厚的孢子，可以抵御高温、辐射及化学灭菌作用。大量研究表明，一些 细菌如：假单胞菌属、秆菌属中的芽孢秆菌、枯草秆菌、地衣球菌。另外，深黄 纤维弧菌、普通纤维弧菌、纤维秆菌、荧光假单胞秆菌、瘤胃球菌等均具有纤维 素分解能力。 1 4 2 放线菌 放线菌很少利用纤维素，但它们能容易地利用半纤维素，并能在一定程度上 改变木质素的分子结构，继而分解溶解的木质素。尽管由于放线菌繁殖慢且降解 纤维素和木质素的能力不及真菌，但因为在不利的条件下，放线菌能形成有芽孢， 与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，所以在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维 素起着重要的作用。高温放线菌可以从自然界中许多地方分离出来，如沙子、成 熟堆肥、马粪和果园土中。主要包括：诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 酬、节秆菌 ( a r t h r o b u c t e r ) 、链霉菌属( & 唧幻叼坩p 5 ) f 5 5 j 、高温放线菌属( 砌p 删伽咖。碍) w ，) 、 小单胞菌属。 1 4 3 真菌 真菌对木质纤维的分解起着重要作用。真菌一般可分为嗜温真菌和高温真菌， 大多数的真菌属于嗜温真菌，在5 3 t c 下生长良好，最佳温度范围是2 5 。3 0 4 c 。 高温真菌对纤维素、半纤维素和术质素有很强的分解作用，它们不仅能分泌胞外 酶，而且其菌丝具有机械穿插作用，共同降解难降解有机物( 如纤维素和木质素) ， 促进生物化学作用。真菌中的担子菌对木质纤维的生物降解起着十分重要的作用。 这类真菌可以分为3 类：褐腐菌、软腐菌和白腐菌。褐腐菌主要分解纤维素和半 纤维素成分，几乎对木质素不起作用，这些菌有c o n i p h o r ap u y e a n a ，绿色木霉 ( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 1 5 6 ；软腐菌，如球毛壳( c h e a t o m i u mg f o b o s u m ) ，既可分 解纤维素，又可分解木质素，它能降解硬木或软木，包括土壤中的植物残渣，但 其降解速度非常慢；自然界中木质素的降解主要靠白腐菌，大多数自腐菌既可降 解硬木又可降解软木，其对木质素的降解速度和效率与其它菌种相比，具有明显 的优越性。因此，对白腐菌的研究最为广泛，较常见用于降解的白腐菌有黄白卧 1 0 第一章绪论 孔菌( p o r 缸s u b a c i d a ) ，变色多孔菌( p o l y p o r u sv e r s i c o l o r ) ，粗皮侧耳等。真菌 中的霉菌对纤维素也有很好降解作用，霉菌的代表有青霉( p e n i c i l l i u m ) 和曲霉 ( a s p e r g i l l u s ) 【5 刀。目前，应用于纤维素降解的菌株多为青霉属( a s p e r g i l l u s ) 和 曲霉属( p e n i c i l l i u m ) 。常见的可降解粗纤维的霉菌有：黑曲霉、米曲霉、海枣曲 霉、棘孢曲霉等。 1 5 纤维素降解机理 纤维素是一种潜在的可再生资源，可为人类提供用之不竭的资源，因此纤维 素的研究一直受到人们的重视。在研究的过程中，有关纤维素降解机理的研究有 很多，但目前较为普遍接受的理论主要有3 种：协同理论、初始反应假说和碎片 理论。 1 5 1 协同理论 协同理论是目前最为普遍接受的理论。它认为：纤维素降解是由e g ( 内切葡 聚糖酶：e c 3 ，2 ，1 ，4 ) 、c b h ( 夕b 切葡聚糖纤维二糖水解酶：e c 3 ，2 ，l ，9 4 ) 和 c b ( 纤维二糖酶或8 葡萄糖苷酶：e c 3 ，2 ，1 ，2 1 ) 共同作用的结果。它的反应顺 序机理为：当纤维素酶分子吸附到纤维素表面时，内切葡聚糖酶首先攻击纤维素 结晶区，并在葡聚糖链的随机位点水解底物，产生寡聚糖；然后c b h ( 外切酶) 从 葡聚糖链的非还原端切下纤维二糖单位、b 葡萄糖昔酶水解纤维二糖单位【5 8 】； c b 可水解纤维素二糖为葡萄糖。这三类酶的“协同”才能完成对纤维素的降解。 其中对结晶区的作用必须有e g 和c b h ，对无定形区则仅e g 组分就可以。由于 不同的纤维材料中结晶区、无定形区所占比例不同，加上其他物理性质的影响， 完全降解时所需上述3 类纤维素酶的比例也各异。由于协同理论始终没有说明协 同作用的起始反应是如何进行的，特别是对结晶区的降解秽l * o 没有很好的解释【5 ” 6 0 i ，因此协同理论还有待进一步的探讨。 1 5 2 初始反应假说 在研究褐腐菌降解纤维素的过程中发现，生成还原糖的量没有随纤维素聚合 度降低而增加。为此，c o u g h l a n 在1 9 8 5 年提出了结晶纤维素降解的多步骤学说， 他认为初始反应使纤维素的结晶状态发生改变，使随后的纤维素 e g ，c b h ，g e 】 水解更容易进行6 “。当菌丝贴近纤维细胞壁时，产生高浓度的消化剂，使木质结 广东工业人学工学硕士学位论文 构紧密度下降，利于纤维素酶的扩散和进攻。在研究培养滤液水解底物时，通过 分析还原糖释放和失重现象，发现没有降解作用发生，然而电子显微镜观察则说 明培养滤液确实降解了木质纤维素，这证明了活细胞并非是其降解酶进攻细胞壁 结构所必需的。由于天然纤维素是种不溶于水的底物，因此与大多数能转化可 溶性底物为产物的酶不同，纤维素酶必须在接触和催化发生之前扩散到纤维素表 面才一能起催化作用，在研究纤维素降解的原始反应机理时发现，由于纤维素酶分 子太大以至于不能进入纤维素内，认为其降解只能与小分子非酶试剂有关。为此， k o e n i g s 认为小分子的非酶试剂能催化广泛的纤维素解聚并使其碱溶性迅速增加 而失重很低【6 “。v a h e r i 发现，在纤维素被降解时会有糖醛酸产生，并且在降解过 程中有氧化反应参与。通过比较有氧与厌氧时的短纤维形成，发现氧气是降解结 晶纤维素所必需的。氧化可能导致无可溶性产物生成，但却更易于内切葡聚糖酶 的进攻。目前，初始反应假说的研究主要集中在游离基的生成或相似氧化剂的降 解系统或非酶因子上【6 。 1 5 - 3 短纤维形成理论 短纤维形成现象在6 0 年代就已经被发现畔l ，但是否是纤维素降解中第一步 所必需的则一直处于争论中。随后，g r i f f i n 分离出一种由滤纸形成微纤维或短纤 维的微纤维生成因子，并且发现在形成微纤维的过程中几乎没有可溶性糖形成， 该因子含有铁，它对煮沸、甲醇提取相对稳定，而且与内切和外切纤维素酶的协 同反应影响纤维素水解程度，被认为是一种低分子量的非酶因子【6 。水解过程中 碎片形成的速度和程度与纤维素粒子的起始大小有关，w a l k e r 等观察到霉菌的内 外切酶对碎片的形成有强烈的协同性，纤维素酶问的协同反应为增加降解打开纤 维素结构，但这种情况下的协同性并不是通过增加表面积导致纤维素酶吸附和催 化增加的直接结果。一般认为，微纤维生成因子是以非水解方式随机切断糖苷键， 使纤维碎裂为短纤维，过程中没任何可溶性糖释放。虽然在微纤维生成因子的