（食品科学专业论文）金黄色葡萄球菌B型肠毒素的分离纯化及其单克隆抗体的制备.pdf

金黄色葡萄球菌b 型肠毒素的分离 纯化及其单克隆抗体的制备 食品科学专业 研究生朱俊友指导教师李玉锋 摘要： 食品中的肠道致病菌是引起人类食源性疾病的主要原因之一，临 床症状主要表现为腹泻、呕吐，也是食物中毒的主要因素，是人类健 康的一大杀手。其中，金黄色葡萄球菌( s a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 是人类 和某些动物的病原菌之一，常引起食物中毒。其致病力强弱主要取决 于产生毒素和侵袭性酶的能力，其中金黄色葡萄球菌耐热性肠毒素 s e b ，是引起人类食物中毒和葡萄球菌胃肠炎的主要原因。 快速和自动化检验方法在应用微生物学领域还处于快速发展时 期，目前用于微生物检验的检测方法有很多，出现了一些快速检测致 病微生物的方法，到目前为止只有生物芯片技术能较好地满足人们对 检测致病微生物的快速、准确、简易等要求。由于基因与其所表达的 毒素蛋白之间有表达水平不对应等原因，单凭基因芯片检测结果是不 能完全反应出生物体内的蛋白质水平，因此，要想得到完整的生物信 息，其解决办法之一就是直接研究基因的表达产物一蛋白质。 本课题旨在制作出能应用于蛋白质芯片点印的s e b 的单克隆抗 体，为蛋白质芯片在致病微生物的应用上做一些前期的工作。所做实 验课题主要内容包括金黄色葡萄球菌b 型肠毒素的分离纯化及其单克 隆抗体的制备。选用金黄色葡萄球菌产毒标准菌株c m c c ( b ) 2 6 0 0 2 ， 采取玻璃纸覆盖琼脂平板的膜培养法培养产毒，毒素经预处理后，首 先利用羧甲基阳离子交换纤维素c m - - 3 2 柱层析，对b 型肠毒素进行 初步分离富集，然后依据分子筛原理按分子量大小经葡聚糖凝胶g 一 7 5 进一步纯化，只经两步细分级分离就获得了纯化的能应用于蛋白质 芯片的s e b 。用分离纯化的s e b 免疫b a l b c 小鼠，然后取其脾细胞 与骨髓瘤细胞s p 2 0 融合，再经过选育、检测、鉴定等步骤，成功获 得了s e b 的单克隆抗体细胞，抗体特异性经酶联免疫吸附测定法检 验，单克隆抗体细胞特异性强。本课题的研究成果为蛋白质芯片技术 快速检测产肠毒素金黄色葡萄球菌奠定了基础。 关键词：s e b 、致病菌、分离纯化、单克隆抗体、蛋白质芯片技术 t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fs e ba n d t h em a k i n go fs e bm o n o c i o n a l a n t i b o d y f o o ds c i e n c e m a s t e rz h uj u n - y o ut u t o rl iy u - f e n g a b s t r a c t ： e n t e r o p a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s mi nf o o di st h em a i nf a c t o ro ff o o d p o i s o n i n gd i s e a s e ，a n d i t s s y m p t o mi sm a i n l yd i a r r h e a ，v o m i t i t i s h a r m f u lt oh u m a n sh e a l t h s t a p h y l o c o c c u sa u r e u si so n eo ft h ep a t h o g e n s f o rh u m a nb e i n ga n ds o m ea n i m a l sa n di tc a nb r i n gf o o dp o i s o n i n g i t s p a t h o g e n i c i t yr e s tw i t ht h ea b i l i t yt os e c r e t ep a t h o t o x i na n dz y m i n s ，a n d h e a t r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u se n t e r o t o x i nbi st h em a i nc a u s a t i o n t h a tr e s u l t si nf o o dp o i s o n i n ga n ds t a p h y l o c o c c u sg a s t r i t i sa n de n t e r i t i s f a s ta n da u t o m a t i ct e s tw a y si so nt h eq u i c kd e v e l o p i n gp e r i o d a t p r e s e n t ，t h e r ea r em a n yt e s tw a y si np a t h o g e n i cm i c r o b i o l o g yt e s ta n d s o m en e wq u i c kt e s tw a y sa p p e a r , b u t ，a tp r e s e n t ，o n l yb i o l o g yc h i pc a n m e e tw e l lh u m a nb e i n g sq u i c k , v e r a c i o u sa n ds i m p l ed e m a n df o rt e s t i n g p a t h o g e n i cm i c r o b i o l o g y m o r e o v e r , g e n ed o e s n tc o r r e s p o n d t oi t s e x p r e s s i v et o x i np r o t e i n ；g e n ec h i p sa n a l y t i c r e s u l tc a nn o tr e f l e c t p r o t e i n sl e v e l s o ，o n eo ft h em e t h o d si s t os t u d yg e n e s e x p r e s s i v e s u b s t a n c e - - p r o t e i n t h i st h e s i si st om a k es e bm o n o c l o n a la n t i b o d yt h a ti su s e db y p r o t e i nc h i pa n dd os o m ea n t e r i o rw o r kf o rp r o t e i nc h i p sa p p l i c a t i o ni n p a t h o g e n i cm i c r o b i o l o g y t h em a i np r o c e s si n c l u d e st h es e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fs e ba n dt h em a k i n go fs e bm o n o c l o n a la n t i b o d y a st o p r o d u c i n g t o x i n a u r e u ss t a n d a r db a c t e r i u mc m c c ( b ) 2 6 0 0 2 ， e n t e r o t o x i nc u l t i v a t i o nm e t h o du s ev e l u mc u l t i v a t i o nt h a ta g a rc u l t u r e d i s ha r ec o v e r e dw i t hd i a l y t i cc e l l o p h a n ep a p e r e n t e r o t o x i ni sp r e t r e a t e d t h ef o l l o w i n gw o r ki st ou s ep o s i t i v ei o n - e x c h a n g ec a r b o x ym e t h y l c e l l u l o s e ( c m c ) t os e p a r a t es e b ，a n dt h e nu s es e p h a d e xg 一7 5t op u r i f y s e ba c c o r d i n gt of i l t e rt h e o r y t h u s ，w ec a ng a i np u r i f i e ds e bo n l yb y t w os t e p s i nt h ee x p e r i m e n t p u r i f i e ds e bw a su s e dt o i m m u n i z e b a l b cm o u s e ，t h e n ，l e ts p l e e nc e l la n dm y e l o m ac e l l s ( s p 2 0 ) f u s e a f t e rs e l e c t i v ec u l t i v a t i o n ，t e s ta n di d e n t i f i c a t i o n ，t h ee x p e r i m e n tg a i n s u c c e s s f u l l ym y e l o m ac e l l st h a tc a ns e c r e t es e bm o n o c l o n a la n t i b o d y a n di t si d i o s y n c r a s yi sg o o dt h r o u g he n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) t h er e s u l t so ft h i se x p e r i m e n th a v ee s t a b l i s h e dg o o df o u n d a t i o n f o rp r o t e i nc h i p si nt e s t i n gp a t h o g e n i cm i c r o b i o l o g y k e yw o r d s ：s e b ，p a t h o g e n i cm i c r o b i o l o g y , s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ， m o n o c l o n a la n t i b o d y , p r o t e i nc h i pt e c h n o l o g y 西华大学硕士学位论文 独创性申明 本人申明所呈交的论文是我个人在导师李玉锋老师指导下进行的 研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写的研究成果，也不 包含为获得西华大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 研究生签名：黝越时间：伽习年厂月偏 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西华大学有关保留、使用学位论文的规定，即；学 校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意西华大 学可以用不同方式在不同媒体上发布、传播学位论文的全部或部分内 容。 研究生签名：批 导师签名：主 咱霉i 时间凡曲7 年于月喇日 争时间： 口声口月妙日 西华大学硕士学位论文 前言 1 概述 食品安全是一个世界性问题，不仅直接关系着人们的身体健康而 且也是影响农业与食品工业能否持续、健康发展的关键因素。 国际上，先是英国暴发“疯牛病和口蹄疫”，迅速席卷欧洲，并 传人拉美、海湾地区和亚洲。后是英国、泰国、越南等国又暴发了口 蹄疫、禽流感。1 9 9 6 年日本大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 污染事件引起近万人 食物中毒。致使在疫情发生时，日本人不敢吃生鱼片，比利时人不敢 吃鸡、鸭、鹅，英国人不敢吃牛肉f l 】。 近年来我国发生的食品安全事故，如广州的黄曲霉毒素污染大米 事件，安徽阜阳的劣质奶粉事件，震惊全国的苏丹红事件等等。2 0 0 5 年全国部分传染病在局部流行或暴发。如春季安徽的流脑、浙江的麻 疹暴发疫情，夏季福建、浙江的霍乱流行，夏秋季四川等地发生人感 染猪链球菌病疫倩、安徽疟疾连续高发。以及现在正在发生的人感染 禽流感死亡事件等等都需要对严重危害人民群众身体健康的致病微 生物进行快速准确的检 jr 2 】【3 】。 食品企业的不断发展壮大，产品品种越来越多，为了能够使产品 提前发放，降低库存，参与市场竞争，加快资金周转的速度。并能在 短时间内发现潜在的风险，尽早采取防范措施，这就要求我们应用微 生物快速检测技术，迅速准确地检测食品中的微生物指标。 食品中致病菌的传统检测方法需经过增菌、转种分离、生化试验、 血清学试验才能完成，需时较长。而不管对由致病微生物导致的病人 还是对现代的食品质量检测，都需要快速准确地进行检测，以能对病 人进行及时的治疗和对食品的质量做出快速的质量报告。到目前为 止，科技工作者在这方面做了很多工作，研究出了一些快速检测微生 物技术：b a c t o m e t e r ( 全自动微生物监测仪) 法、细菌直接计数法、自动 微生物监测系统( a m s ) 、快速检测纸片法、免疫学方法、免疫捕获 p c r 、荧光定量p c r 和生物芯片技术等。生物芯片包括基因芯片、蛋 两华大学硕士学位论文 白质芯片和组织芯片，本课题旨在研究蛋白质芯片技术在食品致病菌 检测中的应用 4 】。 细菌按形态可分为球菌、杆菌和螺旋菌。金黄色葡萄球菌 ( s t a p h ，l o c o c c u sa u r e u s ) 就是球菌的一种，它是革兰氏阳性菌的代表。 葡萄球菌广泛存在于自然界中，如空气、土壤、水及物体表面上。在 人和动物的皮肤表面、鼻咽、肠道也常可发现葡萄球菌。大部分葡萄 球菌不致病，对人致病的主要是金黄色葡萄球菌，主要引起化脓性疾 病，几种产生耐热肠毒素的菌株能够引起人类的食物中毒【5 】。 金黄色葡萄球菌是引起人类感染和细菌性食物中毒的一种重要 致病菌，在自然界中分布广泛。由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒发 生频率极高。在我国，2 0 2 5 的食物中毒病例是由金黄色葡萄球引 起的，它是仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌的第三大致病菌。在美国， 每年由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒占3 3 i “。在加拿大，这一比 例更高达4 5 。由于金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，其肠毒素具 有高度的耐热性，因此，它引起的食品污染和食物中毒的危险性就更 大。2 0 0 0 年，在日本发生的雪印牛奶中毒事件，就是由金黄色葡萄球 菌引起的，它造成的危害令世人震惊。 随着社会的不断发展和人们生活水平的不断提高，人们对食品质 量安全的要求越来越高，与此相应，人们对食品的安全检测水平的要 求也越来越高。当今社会普遍存在的食品安全事故，特别是致病微生 物引起的急性群体事件一直在要求现在的科技工作者不断找到能在 最短的时间内准确地检测出致病源，给予及时的有效治疗。 2 国内外快速检测常见致病菌进展 如何使微生物学技术快速、简易和自动化，一直是微生物工作者 研究的热点，随着物理、化学、微电子、计算机、分子生物学等先进 技术向微生物的渗透和多学科的交叉，这方面已取得了突破性进展， 主要表现在【7 】：( 1 ) 利用物理、化学领域已通常使用的仪器和设备， 如气相色谱仪、高压液相色谱仪、质谱仪、激光显微镜等，能快速准 西华大学硕士学位论文 确地进行多种微生物学的实验；( 2 ) 利用飞速发展的微电子、计算机 等现代技术，已研制出许多微生物学实验专用的自动化程度很高的仪 器，如微生物传感器测量仪、阻抗测定仪、放射测定仪、微量量热计、 生物发光测量仪、自动微生物检测仪( a m s ) 和药敏自动测定仪等； ( 3 ) 涌现出众多的各种类型的多项微量简易监测系统，例如：a p l 2 0 e 、 b i o l o g 全自动和手动细菌鉴定系统等；( 4 ) 随着分子生物学和免疫学 的日新月异，各种各样的酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 、d n a 探针、 聚合酶链反应( p c r ) 技术和全自动免疫诊断系统( v i d a s ) 等，在 微生物学领域广泛地被采用，较好地做到了快速、简易和自动化：( 5 ) 计算机在微生物学中越来越多的应用，如：数据的分析、处理：图像 的分析、制作：菌种和资源的分类鉴定及保藏；文献检索、情报搜集、 实验设计、结果处理等，特别是计算机国际网络的连通，“人机对话” 的实现，更促进了微生物学技术的快速、简易和自动化。以下是目前 应用于微生物检测的常用方法及其原理和优缺点，其中蛋白质芯片技 术目前还未曾专门应用于食品致病微生物的检测。 2 1 全自动微生物监测仪( b a c t o m e t e r ) 的应用 b a c t o m e t e r 是一种微生物快速检测和计数系统，我们可以根据需 要选择相同的培养基来检测样品中的菌落总数、大肠菌群、乳酸菌、 霉菌和酵母菌等项目，菌落总数和大肠菌群的检测2 4 h 之内完成，样 品匀液不必进行稀释，而且污染越严重，检测越迅速，甚至几个小时 就能出结果，一个细菌分析处理器( b p u ) 一次可以处理1 2 8 个样本 ( 如果样品量太大，可以根据需要添加b p u ) ，所以能够快速有效地 指导生产。 利用电阻抗原理。操作时将接种样品的培养基置于一个装有一对 不锈钢电极的模板内，测定因微生物生长而产生的阻抗变化。细菌在 培养过程中将培养基中的大分子如蛋白质、碳水化合物等电惰性底物 转化为小分子如氨基酸、乳酸等电活性的产物，当微生物的生长和代 谢活性旺盛时，培养基中大的电惰性分子即被大量的电活性分子和离 西华大学硕士学位论文 子所置换，从而使培养物的阻抗降低，培养基中的电导性有所增大。 该仪器每隔6 m i n 对样品池中的样液进行一次测量，并根据时间和电 位变化建立生长曲线。做菌落总数的检测在使用该方法之前必须建立 一条标准曲线。 2 2 细菌的裂解气相色谱鉴定 气相色谱技术【8 】( g c ) 是色谱技术的一种，其试验仪器气相色谱 仪主要由载气系统、迸样系统、色谱柱、检测器和记录仪或数据处理 装置等组分。该技术的基本原理是试验样品中的各组分，随流动相( 气 体) 经过装在色谱柱中的固定相而流动，吸附力或融解性弱的组分很 难被吸附或溶解在固定相中，流动快，首先流出色谱柱，而吸附力或 溶解性强的组分则后流出色谱柱，因此样品中各组分便能分离开，被 分离开的组分依次使检测器能检测到，记录仪在记录纸上则依次记录 被分离开的组分，每一组分呈一色谱峰，或同时由数据处理装置直接 计算或打印出结果。 2 3 a p i 鉴定系统 a p i 鉴定系统由法国生物梅里埃公司生产，有鉴定细菌的“国际 金标准”之称。a p i 试条配合a p il a bp l u s 软件使用，使细菌鉴定 更加简单快速、准确可靠。a p i 鉴定系统在我们做微生物生化鉴定工 作中帮助很大，特别是在做未知菌的鉴定工作中起了重要作用。对未 知菌的鉴定，用传统的方法做是一项非常繁琐的工作，需要查找相关 的资料，做几十个生化试验，准备起来相当麻烦，而结果不一定都符 合，要反复做许多次，而使用a p i 鉴定系统，就省去了很多操作，菌 株纯化后，通过镜检和氧化酶试验，选择合适的试条，将制备好的菌 悬液按照要求加入试条，选择适宜的条件( 温度和氧气) 培养2 4 h 后， 根据需要加入试剂，读取结果，将相应的反应编码，输入a p il a bp l u s 软件，得出鉴定结果。 4 西华大学硕士学位论文 2 43 m 测试片的应用 测试片上含有微生物生长及生化试验所需要的营养及试剂，样品 处理后不需要增菌，直接接种纸片，适宜温度培养后计数。目前有大 肠菌群大肠杆菌测试片；金黄色葡萄球菌测试片和霉菌酵母菌测试片 等。 2 5 多项微量简易鉴测技术 进二十多年来，国际上研制成功了仅做一次试验就能检出多项反 应，使微生物能很快地、简易地被鉴定，这种技术称为多项微量简易 鉴测技术，或数码分类鉴定法。其基本原理是针对微生物的生理生化 特性，配置各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量地( 约0 1 m 1 ) 加入各个分隔室中，脱水或不脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构 成检测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养2 4 8 h ，观察鉴定 卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索表( 根 据数码分类鉴定的原理制成) 判断检测微生物的鉴定结果，或用电脑 判断( 软件也是根据数码分类鉴定的原理编制) ，打印出检测微生物 的鉴定结果。 2 6 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 酶联免疫吸附试验是免疫酶技术的一种，是将抗原抗体反应的特 异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术。e l i s a 的技术原 理是【9 】：将酶分子与抗体( 或抗原) 结合，形成稳定的酶标抗体( 或 抗原) 结合物，当酶标抗体( 或抗原) 与固相载体上的相应抗原( 或 抗体) 结合时，即可在底物溶液参与下，产生肉眼可见的颜色反应， 颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，使用e l i s a 检测仪，郎酶 标测定仪，测定其吸收值可做出定量分析。此技术具特异、敏感、结 果判断客观，简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物学中 应用广，而且也被其他学科领域广为采用。 5 西华大学硕士学位论文 2 7 基因芯片技术 基因芯片又称d n a 微阵列，是采用原位合成或显微点样技术， 将数以万计的d n a 探针固化于支持物表面，有序地集成一系列可寻 址识别的基因片段，与标记的样品进行杂交后，通过检测杂交信号来 实现对生物样品的快速检验或医学诊断，它具有高通量、可并行检测 的特点【1 0 】。根据载体上核酸分子的不同，分为e d n a 芯片和寡核苷酸 芯片等。它在i 临床微生物检测中的应用为其在卫生微生物检验中的应 用奠定了良好的基础。 其原理是基于细菌1 6 sr r n a 的高度保守性】。r r n a 进化速度缓 慢且很保守，原核生物即保留了其基因结构和功能的同源性，又有一 定程度的变异而具有种、属甚至株的结构特征。r r n a 基因包括2 3 s 、 1 6 s 和5 s 三个基因，几乎所有已知细菌1 6 sr r n a 基因的碱基序列已 被测定并存入基因库，且细菌和真核生物的1 6 sr r n a 基因至少有9 个以上明显不同的保守序列，病毒不含1 6 sr r n a ，所以细菌的1 6 s r r n a 基因成为细菌分类的金指标”。1 6 sr r n a 分可变区和保守区 0 2 ，保守区为细菌共有，其中交错排列有属间差异的9 1 0 个变异区。 同一种细菌的基因组同源性应大于7 0 。若1 6 sr r n a 有3 个碱基以 上的差异即可断定细菌不属于同一种属。另外，1 6 sr r n a 与2 3 sr r n a 间隔区的长度和序列也有种属间差异，亦可用于细菌的鉴别。 基因芯片通过检测m r n a 的丰度或者d n a 的拷贝数来确定基因 的表达模式和表达水平，然而根据m r n a 的水平( 包括m r n a 的种 类和含量) 并不足以估计蛋白质的表达水平。实际上，对于某些基因， 当m r n a 的水平相等时，蛋白质的表达水平可以相差2 0 倍以上；反 之，当某一蛋白质的表达稳定于一水平时，各转录m r n a 的水平也可 相差达3 0 倍 13 1 ，所以说单凭基因芯片检测结果是不能完全反应出生 物体内的蛋白质水平，要想得到完整的生物信息，其解决办法之一就 是直接研究基因的表达产物蛋白质。本课题旨在制作应用于蛋白质 芯片的毒素蛋白之一s e b 的单克隆抗体【i4 1 。 6 西华大学硕士学位论文 2 8 蛋白质芯片技术 上世纪8 0 年代，e k i n s 等【”】的理论研究结果认为可以将抗体大量 地在固相表面进行微量点样，以实现高灵敏度的试验研究。但是直到 9 0 年代末当d n a 芯片技术被大家所认识和接受而且芯片的制作技术 已经不再是瓶颈的时候，抗体微阵列才开始被用来进行定量和定性的 蛋白质组学等许多方面的研究【1 6 】。 蛋白质芯片是对固相载体进行特殊的化学处理，再将己知的大量 蛋白有规律地固定其上( 如酶、抗体、抗原、受体、配体、细胞因子 等) ，制成由高密度的蛋白质或多肽分子的微阵列组成蛋白微阵列， 其中每个分子的位置及序列为已知，根据这些生物分子的特性，捕获 能与之特异性结合的待测蛋白( 存在于血清、血浆、淋巴、间质液、 尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等) ，然后用激光扫描系统或c c d ( 电感耦合器件) 获取数组图像，最后用专门的计算机软件进行图像 分析、结果定量和解释1 7 】【1 8 】 19 1 。 蛋白质芯片根据其结合被测蛋白的介质不同，可以大致分为两大 类【2 0 】【2 l 】：化学型蛋白质芯片和生物化学型蛋白质芯片。对于前者，最 有代表性的是c i p h e r g e nb i o s y s t c m s 公司以表面加强激光解吸电离一 飞行时间质谱( s e l d i ) 技术为基础开发的系列芯片：后者又大致可 以分为两种基本形式：n o n - l i v i n g 芯片和l i v i n g 芯片。目前主要的 n o n - l i v i n g 芯片有微阵列芯片、微孔板芯片、三维凝胶块芯片和芯片实 验室等种类，l i v i n g 芯片是由u c t z 2 2 】等利用酵母细胞于2 0 0 0 年首次构 建成功的基于抗原抗体特异性反应的生物化学型蛋白芯片。 抗体蛋白质芯片是把能和不同抗原特异性结合的多种抗体高密 度地固定到玻片或其他载体上，使待测样品通过芯片表面，经过洗脱 把非特异性结合的蛋白洗掉。从而对特异性地结合在上丽的抗原进行 检测【2 3 1 。抗体蛋白质芯片具有以下特点【2 4 1 【2 5 】：( 1 ) 特异性，这是由抗 原抗体之间的特异性结合决定的；( 2 ) 高通量，在一次实验中对成百 上千种目标蛋白进行检测；( 3 ) 敏感性赢，可达到n g l 水平：( 4 ) 平 行性，可以同时检测多种蛋白，所需抗体量少，花费少，检测时间短： 7 两华大学硕士学位论文 ( 5 ) 检测范围广，对浓度5 2 5 00 0 0 n g l 的样品都能检测到；( 6 ) 变异小，不同次实验间相同两点之间变异小于1 0 。 除蛋白质芯片技术以外的其它微生物检测技术不是检测周期长 就是每次只能确定或排除一种细菌，都不能通过一次检测就能快速、 准确地同时把所有可能的致病菌都检测鉴定出，而蛋白质芯片技术却 能达到这种目的。 蛋白质芯片对致病微生物的检测就是对生物毒素的检测。生物毒 素蛋白芯片是利用抗原抗体的特异性反应原理进行检测的。 检测食品致病菌的蛋白质芯片所固定的配基是单克隆抗体，因 此，制备芯片的原料就是常见的所有可能的致病菌( 甚至包括其不同 种、菌株) 所分泌的特定毒素的单抗。用事先实验设计、验证好的单 克隆抗体按一定规律点印在芯片上制作蛋白质芯片。需要说明的一点 是，利用蛋白芯片进行检测时，样品可以是未经提纯的含待测蛋白的 样品液等，但有时由于样品中存在的其它物质的影响，也会降低检测 的灵敏度，而且可能出现假阳性结果，因此在检测前对样品进行适当 必要的提取、纯化等预处理也是必要的【2 。 综上所述，摆在我们面前的任务是：一要广泛深入细致地研究金 黄色葡萄球菌肠毒素的致病机理，包括毒素型疾病和超抗原型疾病。 二要进行快速经济适用的检测。金黄色葡萄球菌分布广泛，致病力又 强，同时也是食物中毒常见的细菌，耐药菌株和变异菌株不断出现， 给卫生防疫工作和临床检验带来巨大挑战。但随着科学的进步，各种 检测方法日新月异，相信通过不懈的努力和意识的提高，随着其它相 关学科如纳米技术、材料科学和表面科学的发展，这些问题终将得到 解决。相信随着蛋白芯片技术的不断完善，蛋白质芯片技术定会在包 括食品卫生检测在内的多领域发挥越来越重要的独特作用。 3 金黄色葡萄球菌及其毒素 3 1 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌在1 8 8 4 年被正式发现，并用s t a p h 3 7 l o c o c c u s 西华大学硕士学位论文 a u r e u s 来命名。在希腊语中，s t a p h y l e 表示成串之葡萄，c o c c u s 表示 谷粒或浆果。1 8 9 4 年，d e l a y s 首次记录了它引发的食物中毒事件。1 9 3 0 年，研究人员指出它引发食物中毒与其产生肠毒素有关。 3 1 1 生物学特性 葡萄球菌属( s t a p h yl o c o c c u s ) 中的金黄色葡萄球菌( sa u r e u $ ) 致病力最强，常引起食物中毒。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌， 直径为0 8 1 0 l am ，呈葡萄状。无芽孢、无鞭毛。需氧和兼性厌氧菌， 生长温度在6 5 4 6 之间，最适温度为3 0 3 7 。可在p h 4 o 9 8 范围内生长，最适生长p h 7 4 。能在1 5 n a c l 和4 0 胆汁中生长。 在普通肉汤固体培养基上能形成光滑、低凸、闪光、边缘整齐的菌落， 菌落色素不稳定，但多数为金黄色”。 该菌在2 0 3 7 条件下，能产生引起食物中毒的肠毒素。如果条 件合适，5 h 后既有毒素产生。在水分、蛋白质和淀粉含量较多的食物 中，极易繁殖和产生较多的毒素。根据其血清学特征的不同，从血清 型上已被鉴定的金黄色葡萄球菌肠毒素有1 0 种：a 、b 、c 、d 、e 、g 、 h 、i 、j 、k 型，其中c 型抗原又根据等电点的不同分为3 个亚型：c ，、 c 。、c 。，s e g 、s e i 、s e k 为新发现的肠毒素幢8 1 但钔。”。a 型毒力最强， 摄入lug 既能引起中毒。所有的肠毒素都是由单个无分枝的多肽链 所组成，含有比较大量的赖氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸，分 子量大约是2 7 0 0 0 3 5 0 0 0 ，是可溶性蛋白质，耐热，并且不受胰蛋白 酶的影响。b 型肠毒素，在9 9 条件下，经8 7 m i n 才能破坏毒性。 3 1 2 金黄色葡萄球菌的致病性 金黄色葡萄球菌致病力的强弱主要取决于产生毒素和侵袭性酶 的能力。金黄色葡萄球菌可分泌2 0 多种毒性蛋白质，所产生的重要 毒素有溶血毒素( a 、b 、y 、6 ) 、杀白细胞素、溶表皮素和肠毒素； 侵袭性酶类主要有血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶、脂肪酶、磷酸酶、 透明质酸酶、胶原酶和溶纤维蛋白酶等【3 l 】。这些毒性物质是引起人类 9 西华大学硕士学位论文 疾病的主要致病因子，它们常常引起人和动物的化脓性感染( 如毛囊 炎、疖、伤口化脓、心包炎、骨髓炎、脑膜炎和乳腺炎等) 、全身感染 ( 如败血症、脓毒血症等) 和葡萄球菌食物中毒等等【3 2 1 。金黄色葡萄球 菌致病性是一个多因子作用的复杂现象，在毒素的理化性质、分子结 构、致病机制、作用模式、产毒的遗传学控制、毒素之间在致病中的 相互作用等问题的研究上，尽管目前取得了一定的进展，但研究仍有 待深入。 3 1 3 金黄色葡萄球菌分型 金黄色葡萄球菌分型的目的主要是为了研究它的流行情况、型别 与化脓性疾病的关系以及它污染食物与食物中毒的关系，以便采取有 效的预防措施。金葡菌的分型方法很多 ”】，包括传统的基于表型的噬 菌体分型、血清学分型、耐药谱分型、凝固酶分型，以及新兴的分子 生物学分型，如质粒分型、染色体d n a 脉冲电泳分型、核糖分型和 全细胞蛋白图谱分型等。 6 0 7 0 的金黄色葡萄球菌可被相应的噬菌体裂解，故可用噬 菌体分型。噬菌体分型在传染源追踪上具有重要意义，但对于有些菌 株，用噬菌体无法分型( 大约有5 2 0 的分离菌株) 。 金黄色葡萄球菌经水解后，获得两种抗原成分，即蛋白抗原和多 糖抗原，可用于金黄色葡萄球菌的血清学分型，有的学者据此将金黄 色葡萄球菌分成9 个血清型，但不能区别是否有致病性。 金黄色葡萄球菌产生的耐热性肠毒素( s t a p h ) ，l o c o c c a l e n t e r o t o x i n s ，简称s e s ) ，是引起人类食物中毒和葡萄球菌胃肠炎的主 要原因。迄今为止，从血清型上己被鉴定的金黄色葡萄球菌肠毒素有 1 0 种。对于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，目前大多数实验室依据 血清学方法进行诊断。检测已知的肠毒素型容易，但要确定新的肠毒 素则比较困难，因为要涉及肠毒素的纯化和特殊抗血清的制备等大量 的工作。另外，由于一种金黄色葡萄球菌菌株能产生一型或两型及以 上的肠毒素，因而肠毒素的型别不能代表细菌的型别。 1 0 西华大学硕士学位论文 多年来，在作金黄色葡萄球菌流行病学调查时以对噬菌体的敏感 性作为主要分型方法。后来，在直接噬菌体分型基础上又配合反向噬 菌体分型以及为解决特殊问题设计的噬菌体分型。然而，现有分型噬 菌体对分不出型的菌株或常见菌型的亚分却无能为力。这时就应采用 两种或更多分型方法以提高分型率、辨别力及结果的可靠性。这种方 法称为金黄色葡萄球菌的流行病学分型 3 1 4 金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动 物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来， 美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅 次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国 由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的 3 3 ，加拿大则更多，占4 5 ，我国每年发生的此类中毒事件也非常 多。 金黄色葡萄球菌引起食物中毒是该菌致病性的一个重要方面 3 4 1 。 目前已知肠毒素有1 0 个血清型，每型肠毒素都能引起食物中毒，其 中以a 型肠毒素( 7 7 8 ) 引起的食物中毒最多，d 型( 3 7 5 ) 和b 型 ( 1 0 ) 次之，涉及到s e e 的发病率最低【3 5 1 。有资料报道，在每1 0 0 9 食物中含有不足1 0 0 2 0 0 n g 的肠毒素，便能引起金黄色葡萄球菌食 物中毒症状p 6 j ： 引起葡萄球菌食物中毒的食品主要是肉、奶、蛋、鱼类及其制品 等各种动物性食品。另外，凉粉、剩饭和米酒等也曾引起食物中毒。 金黄色葡萄球菌可通过化脓性炎症的病人或带菌者在接触食品时而 使食品污染。食品在制造、运输、销售、食用过程中，如不注意卫生 操作和管理，也易使食品污染上金黄色葡萄球菌。 由肠毒素引起的食物中毒，其主要症状为急性胃肠炎，潜伏期短， 一般为2 4 h ，恶心、呕吐、腹痛和腹泻，水样便。此外，有头晕、 发冷之感。病情严重时，可引起大量失水和虚脱【2 7 1 。 西华大学硕士学位论文 肠毒素导致食物中毒症状的机制还未完全证实。研究认为其作用 机理主要是由于肠毒素直接作用于胃肠粘膜而引起病变所致【37 】【3 ”。肠 毒素能刺激t 细胞增殖，致使宿主在感染初期i g m 的合成受抑制，加 以单核巨噬细胞的消除功能障碍，细菌大量生长繁殖，产生内、外毒 素，并使宿主对毒素休克及心、肝坏死的敏感性增加。但在细胞和分 子水平上的解释仍然是含糊的，部分原因是难以找到合适的动物模 型，很多工作只能用恒河猴开展。 3 2 金黄色葡萄球菌肠毒素 金黄色葡萄球菌肠毒素( s t a p h k ，l o c o c c a le n t e r o t o x i n ，简称s e ) 主要 是由血浆凝固酶或耐热核酸酶阳性的菌株所产生的一类结构相关、毒 力相似、抗原性不同的胞外蛋白质【35 1 。研究表明，所有的毒素都有以 下共同特性：( 1 ) 具有引起急性胃肠炎的能力( 催吐性) ；( 2 ) 刺激非特异性 t 细胞增殖的超抗原特性；( 3 ) 对热和蛋白酶消化作用的抵抗能力( 即肠 毒素对热和水解酶的变性都有很高的耐性) ；( 4 ) 分子内都存在二硫键 【3 9 】【4 0 】【4 1 1 。肠毒素导致葡萄球菌胃肠炎性食物中毒和刺激非特异性t 细胞增殖的超抗原特性分属毒素蛋白质的不同结构区域所控制，但它 们之间存在很大的相关性，多数情况下，超抗原活性的损失往往会伴 随肠毒素活性的减少【4 2 】f 3 8 1 。 3 2 1 金黄色葡萄球菌肠毒素分子的结构组成 金黄色葡萄球菌肠毒素都是简单的蛋白质，它们水解后能释放出 1 8 种氨基酸，其中赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸的含 量最高。所有s e 的氨基酸组成已经测定，组成肠毒素肽链的氨基酸 残基的数目各个型别不一样，a 为3 0 5 个，b 为2 3 9 个，c 1 为2 9 6 个， c 2 为2 9 4 个，c 3 为2 3 6 个。肠毒素b 的氨基酸顺序最先被确定【4 ， 由2 3 9 个氨基酸残基组成，它的n 一端是谷氨酸，c 一端是赖氨酸。 肠毒素c i 、c 2 的n 一末端均为谷氨酸，c 3 为丝氨酸，a 为丙氨酸。 c 1 和c 2 的c 一末端为甘氨酸，a 为丝氨酸。 1 2 西华大学硕士学位论文 通过对编码s e 氨基酸序列的基因顺序分析发现，各型肠毒素之 间存在着不同程度的相关性 4 4 1 4 5 】【4 6 1 1 4 7 儿4 8 。按肠毒素氨基酸序列同源 性的比例，可将肠毒素分为二组。第一组包括s e b 和s e c s ( c l 、c 2 、 c 3 ) ，其中，s e b 和s e c 同源性为6 3 。第二组包括s e a ，s e e ，s e d 和s e h 。其中s e a 和s e e 的同源性大于8 0 ，s e d 和s e h 的同源 性比s e a 和s e e 之间的同源性更高。s e d 和s e a 、s e e 的同源性大 于5 0 。新发现的s e g 和s e i 属于第一组，因为s e g 、s e i 和s e b 、 s e c 的同源性分别为3 7 4 2 ，而与s e a 、s e d 、s e e 的同源性分 别为2 6 2 8 ，和s e h 的同源性为2 1 。s e b 和s e c 之间的同源性 虽然不如s e a 、s e d 和s e e 高，但彼此之间也存在一定的同源性。 各型肠毒素氨基酸序列同源性比较的具体情况见表1 表1 各型肠毒素氨基酸序列同源性的比较 t a b l e1c o m p a r i s o no f a m i n oa c i ds e q u e n c eh o m o l o g ya m o n gs e s 3 2 2 金黄色葡萄球菌肠毒素的理化性质 金黄色葡萄球菌肠毒素为单肽链蛋白质，相对分子质量( m ) 为 2 7 3 0 k d ，但不同型肠毒素分子量大小稍有差异。等电点( p i ) 7 o 8 6 ， 1 3 两华大学硕士学位论文 多数偏碱性，个别型如s e h 偏酸性，为5 ，7 。最大吸收波长2 7 7 n m 左 右。纯化的肠毒素呈白色绒毛性粉状物，易溶于水和盐溶液，不溶于 乙醚、氯仿等有机溶剂中。 肠毒素能抵抗许多蛋白酶( 如胰蛋白酶、凝乳酶、木瓜酶和蛋白酶) 的消化作用，不被分解，在胃中不能立即被灭活，有充足的时间通过 胃粘膜而发挥其毒素效应。 金黄色葡萄球菌的菌体细胞在8 0 ，经3 0 m i n 即被杀灭，而肠毒 素非常耐热，肠毒素在1 0 0 * c 煮沸3 0 r a i n 不被破坏( 其粗制品抗热力更 强) ，必须在2 1 8 2 4 8 经3 0 m i n 才能使其毒性完全消失。肠毒素各 型之间的抗热力不同，依次为：s e c s e b s e a 4 9 】。 3 2 | 3 肠毒素的分离和纯化 各型肠毒素的分离纯化方法相似，主要步骤为：选择合适的菌株， 进行产毒培养( s e b 用膜培养法) ，然后洗脱、离心，收集上清液在 透析袋内透析浓缩得粗肠毒素5 0 】 5 】1 1 5 2 1 。粗毒素用羧甲基阳离子交换纤 维素c m - - 3 2 和葡聚糖凝胶g 一7 5 进行柱层析，得到纯化的s e b 等 5 3 】【5 4 1 。另外，也可用等电聚焦和亲和层析等方法进行分离纯化【5 5 5 6 】。 4 本课题的主要研究内容 根据实验过程，本课题实验内容可分为两大部分： 第一章金黄色葡萄球菌b 型肠毒素的分离纯化，主要包括以下 内容： 1 ) 金黄色葡萄球菌的产毒培养。 2 ) 洗脱、离心、透析浓缩。 3 ) 浓缩毒素的羧甲基阳离子纤维素柱层析得粗毒素。 4 ) 粗肠毒素的进一步葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 7 5 凝胶层析纯化得 s e b 第二章s e b 单克隆抗体的制备，主要包括以下内容： 1 ) 用s e b 免疫6 7 周龄的b a l b c 雌性小鼠。 1 4 西华大学硕士学位论文 2 ) 免疫小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合。 3 ) 杂交瘤细胞选育。 4 ) 杂交瘤细胞培养生产单克隆抗体。 5 本研究的创新点 本课题研究对毒素蛋白的分离纯化方案进行了优化，简便且效果 好；同时，本课题制备了纯度高、特异性强的应用于蛋白质芯片的s e b 的单克隆抗体，对蛋白质芯片技术应用于治病微生物检测方面进行了 初步的探索。 1 ) 分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分 级分离和细分级分离3 步。此过程会涉及到盐析、等电点沉淀、有机 溶剂分级分离、超过滤、冷冻真空干燥、浓缩、离心等粗分级分离以 及凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析( 凝集素亲和层析、 免疫亲和层析、金属螯合层析、染料配体层析和共价层析) 、区带电 泳、等电聚焦、结晶等细分离分级过程。 本实验在纯化s e b 时在离心、浓缩后，浓缩液依次经羧甲基