（微生物学专业论文）生孢噬纤维菌jl01降解纤维素特性的研究.pdf

摘要 生孢噬纤维菌是能够降解纤维素的滑动细菌，对纤维素有着较强的降解作用，但是 其纤维素降解特性一直缺乏深入的研究，本论文对生孢噬纤维菌j l - 0 1 的固液培养特性、 发酵过程中p h 值和糖含量变化的测定、酶活测定方法的总结、产酶条件的优化和f p a s e 的分离纯化进一步阐明s p o r o c y t o p h a g as p 儿o l 对纤维素的降解机制。 实验结果具体如下： 1 在生孢噬纤维菌几0 1 滤纸纤维素固体平板培养的过程中，1 6 8 小时发现滤纸已经完 全被分解。在c f l l 纤维素粉固体平板培养的过程中，c f l l 纤维素粉在1 9 2 小时几乎被 完全降解。滤纸纤维素液体培养的过程中，1 4 4 小时滤纸完全被分解。无论是固体培养 还是液体培养，j l - - o l 对滤纸的降解效果要好于s 咖2 。 2 s p o r o c y t o p h a g as p j l 0 1 和s d 0 2 在进行滤纸纤维素液体培养时，p h 值都有上升的现 象，并且发酵液中无还原糖的产生，而且发酵液总糖含量在不断的增加，前两种现象与 纤维素霉菌发酵时是完全不同的，这说明在s p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 和s d 一0 2 在发酵过 程中，可能是由于大量的碱性物质的生成导致p h 的上升，并且有可能存在着特殊的糖 代谢途径；在以葡萄糖为碳源液体发酵时，p h 值都有下降的现象。综合s p o r o c y t o p h a g a s p 儿0 1 和s d 0 2 在液体发酵的现象，说明两株菌在分别以滤纸纤维素和葡萄糖为唯一 碳源时，糖代谢的途径也不相同，这样造成了p h 值上升和下降以及发酵液中还原糖检 测不到的现象。原因可能是因为碳源不同，菌体所产的酶系也不同。 3 在f p a s e 酶活测定过程中考察了酶液与缓冲液比例、酶解反应时间长短、p h 大小、滤 纸处理与否对产生还原糖的影响，并且确定了酶液与缓冲液比例为1 ：l 、反应时间为2 小时、p h 值为7 、以处理过的滤纸为底物时可以检测到f p a s e 的酶活。由于方法的原因 而未能检测到还原糖的存在就说纤维素细菌不存在f p a s e 是不科学的。并且在酶活的测 定过程中发现c m c a s e 最适p h 值是5 0 ，f p a s e 的最适p h 值是7 0 ，从酶学性质上来讲， 可以猜测s p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 纤维素酶系可能是由酸性纤维素酶和碱性纤维素酶共 同组成的。 4 在s p o r o e y t o p h a g as p j l - 0 1 最佳产f p a s e 条件的优化的过程中，从时间、接种量、温度、 p h 值、摇床转数五个因素对s p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 进行了最佳产f p a s e 条件的优化，旨 在为后续的f p a s e 分离纯化工作提供充足的f p a s e 粗样，因为f p a s e 酶活性的低值有可能是 因为此胞外酶含量极少的原因，优化结果为接种量为5 ，培养温度3 0 c ，p h 值7 2 ，摇 床转数为1 2 0 r m i n ，培养时间1 2 0 h ，并按照此优化结果进行重复实验，实验结果好于优化 前结果。 5 在f p a s e 分离纯化的过程中，粗酶液经过超滤浓缩后，采用了硫酸铵和c t a b 对样品 的联合处理方法，再经过s e p h a r o s ec l 6 b 制备柱的处理，除去了杂蛋白和大部分的杂 多糖。最后经分析用s e p h a c r y ls 1 0 0 和d e a e s e p h a d e xg 5 0 得到单一组分，收集组分 透析冻干进行电泳分析和酶学性质分析，电泳结果为f p a s e 为单一条带，分子量为 5 5 4 k d ，酶学的性质为f p a s e 最适反应p h 值为7 2 ，在p h 值6 8 7 4 范围内稳定，该酶最 适反应温度为5 0 ，在3 0 5 0 稳定，z n 2 + 和c 0 2 + 对f p a s e 活力有一定的促进作用， f e 对它有很强的抑制作用，而c a 2 + 、m 9 2 + 和n a + 对酶活力基本没有影响。 在实验过程中考察了f p a s e 对底物专一性的研究，f p a s e 对c m c 也有一定的催化能 力，且与滤纸酶活的比值近1 0 ：1 ，这就说明了在滤纸的降解过程中，此酶组分存在着 双功能的作用，一方面对结晶区纤维素的催化能力并且从纤维素的两端切下二糖单元， 另一方面又能发挥水解非结晶区的作用，可以猜测f p a s e 在结构上有着多个功能域( 或 者说是一个双功能酶) ( e n d o g l u c a n a s e 和c b h ) ，它们共同协同从而达到高效降解纤维 素的作用。使从滤纸降解的速率方面考虑，此酶具有高效性和多功能性的特点。由此可 以推断，在细菌f p a s e 酶活的测定当中，由于实验方法的原因测不到f p a s e 酶活而断定 无f p a s e 是不科学的。实验结果说明此酶具有双功能的作用。从而进一步揭示了 s p o r o c y t o p h a g as p j l 0 1 降解纤维素的机制。 关键词：生孢噬纤维菌、还原糖、f p a s e 酶、分离纯化、降解特性 i i a b s t r a c t 勋d m c y 幻p j f l q 酗i sak i n d o fg l i d i n g b a c t e r i at h a tc a l ld e c o m p o s et h e c e l l u l o s e e f f i c i e “v b u tt h ec e l l u l o l y t i cd e g r a d a t i o nm e c h a n i s mh a sn o tb e e n r e v e a l e dt i un o w d 血n g t h ew o r k ，w em a i l ：l l yc h o s es p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 a sr e s e a r c ho b j e c t w es t u d i e dt h e c e l l u l o l y t i cd e 甜a d a t i o ne f f i c i e n c yo fs p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 it h r o u g hs o l i da n dl i q u i d c u l f i v a t i o n ；t h ev a r i a t i o no fp ha n dr e d u c i n gs u g a rc o n t e n td u r i n gt h ep r o c e s s m no f1 1 q u l d c u l t i v a t i o n ：t h e m e t h o do f e n z y m e a c t i v i t y d e t e r m i n a t i o n ；t h eo p t i m i z a t i o n o f e i l z n e p r o d u c i n ga n dt h e f p a s ep u r i f i c a t i o n s o w ef u r t h e rc l a r i f i e dt h ec e l l u l o l y t i c d e g r a d a t i o n m e c h a n i s mo fs p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 t h er e s u l ta r ei l l u s t r a t i ea sf o l l o w s ： 1 d u r i n gm es o l i dc u l t i v a t i o n ，w e f o u n dt h a ts p o r o c y t o p h a g as p 儿- 0 1 c o u l dt o t a l l y d e c o 埘【p o s ef i l t e rp a p e rw i t h i n16 8h o u r sa n dc e l l u l o s ep o w d e rw i t h i n19 2h o u r s - d u r i n gt h e l i q u i dc u l f i v a t i o n ，s p o r o c y t o p h a g as p j l - o 1c o u l dt o t a l l yd e c o m p o s ef i l t e rp a p e rw i t h i n14 4 h q i 啦s 。s p o r o 印t d p h 8 9 as p ，m 0 1c a nd e c o m p o s ec e l l u l o s em o r ee f f i c i e n tt h a ns p o m c y l o p h n g a s p s d 0 2w h e t h e rd u r i n gs o l i d c u l t i v a t i o no rl i q u i dc u l t i v a t i o n s ow ec h o s es p o r o e y t o p h a g a s p j l _ ，0 1a sr e s e a r c ho b j e c t 2 w h e nw ep r o c e s s e dl i q u i dc u l t i v a t i o nw i t hf i l t e rp a p e r 嬲s o l ec a r b o ns o u r c e ，w ef o u n dt h a t t h ep ha n dt o t a lc a r b o h y d r a t ev a l u ei n c r e a s e d ，a n dn or e d u c i n gs u g a rw a sd e t e c t e d w h 锶 u s i n gg l u c o s ea ss o l ec a r b o ns o u r c e ，t h ec o n t r a r yr e s u l t so b t a i n e d ，t h ep h v a l u ed e c r e a s e d 。i h e r e s u l t si l l u s t r 锄砸t h a tt h em e t a b o l i cp a t h w a y sm i g h tb ed i f f e r e n tw i t hd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e s u s e d a sc a 出o ns o u r c e sv a r i e d ，t h ee n z y m es y s t e mc h a n g e d 3 w e咖d i e dt l l e i n f l u n c e st of p a s ee n z y m ea c u i t y d e t e r m i n a t i o n ，s u c h a sc r u d e e n z e - b u f i e rr a t i o , r e a c t i o nt i m e ，p hv a l u ea n dt h et r e a t m e n t o ff i l t e rp a p e r t h ef p a s e e 玎z 聊ea c t i v i t yo b t a i n e dw h e nr e a c t i o n c o n d i t i o n so p t i m i z e d r e a c t i o nc o n d i t i o n s a s f o l l o w s ：c n l d ee n z y m e b u 行e rr a t i o1 ：1 , r e a c t i o nt i m e2h o u r s ，p h v a l u e7 0 ，f i l t e rp a p e rt r e a t e d w i t hn a 0 h 4 b e c a u s eo ft h el o wf p a s ee n z y m ea c t i v i t y a s s a y e d ，w es t u d i e d t h eo p t i m i z a t i o no f e i 屹v m e - p r o d u c i n gb ym e a n so fo r t h o g o n a lt e s t w et a k et h e a s ef a c t o r si n t oc o n s l d e r a t l o n ，s u c h a sc u l t i v a t i o nt i m e ， i n o c u l a t i o na m o u n t ，t e m p e r a t u r e ，p hv a l u ea n dr o t a t i n gs p e e d t h er e s u l t s o fo n h o g o n a le x p e r i m e n ts h o wt h a t t h eo p t i m a lo p e r a t i o nc o n d i t i o n s a r ea sf 0 1 1 0 w s ： c u l t i v a t i o nt i m e12 0h o u r s ，i n o c u l a t i o na m o u n t5 ，t e m p e r a t u r e3 0 c ，p hv a l u e7 2 a n d r o t a t i n gs p e e d12 0 r m i n 。r e p e a t e de x p e r i m e n t sd o n ea so p t i m i z e dc o n d i t i o n g sa n ds h o w e d b e t t e rr e s u l t s 5 d u r i n gt h ep r o c e s s i o no ff p a s ep u r i f i c a t i o n ，i no r d e rt or e m o v et h ei m p u r i t yp r o t e i n a n d m u c o p o l y s a c c h a r i d e ，w ep r o c e s s e dt h eu l t r a f i l t r a t i o n ，a m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o n ，c t a b a n ds e p h a r o s ec l 一6 bp r e p a r a t i v ec o l u m n t h ef p a s ew a sp u r i f i e db yt h es e p h a c r y ls - 10 0 a n dd e a e s e p h a d e xg - 5 0s e q u e n t l y t h ep u r i f i e dc e l l u l o s ea s s a y e db ys d s - p a g es h o w e d o n ep r o t e i nb a n da n dt h em o l e c u l a rw e i g h t so ft h i se n z y m ei sa b o u t 5 5 4 k d t h eo p t i m a l d e g r a d i n gc o n d i t i o n sf o rf p a s ew e r eo b t a i n e d ：p h 7 2a n dt e m p e r a t u r e5 0 。c t h ee n z y m ei s s t a b l eb e t w e e np h6 8a n d7 4 ，a n dt e m p e r a t u r eb e t w e e n3 0 。c - 5 0 。0 t h ee n z y m ea c t i v i t yi s a c t i v i t i e db yz n 2 + a n dc 0 2 + , i n h i b i t e db yf e 3 + ，c a 2 + 、m 9 2 + a n dn a + h a v en os i g n i f i c a n te f f e c to n i t sa c t i v i t y w es t u d i e dt h es u b s t r a t es p e c i f i c i t yo ff p a s e ，f p a s ec a na l s oh y d r o l y s i sc m c ，a n dt h e a c t i v i t yo fc m c a s ei s10t i m e sh i g h e rt h a nt h a to ff p a s e s ow ec a nc o n c l u d et h a tf p a s ei sa b i f u n c t i o n a le n z y m e ，a l s ot h ed o m a i no ff p a s em a yh a v em u l t i f u n c t i o n a la r e a s ，t h e e n d o g l u c a n a s ea n dc b hf u n c t i o n a la r e aa c ts y n e r g i s t i c a l l yt oe f f e c tt h ee x t e n s i v eh y d r o l y s i s o fc r y s t a l l i n ec e l l u l o s e s ow ef u r t h e rc l a r i f i e dt h ec e l l u l o l y t i cd e g r a d a t i o nm e c h a n i s mo f s p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 k e y w o r d ：s p o r o c y t o p h a g ap u r i f i c a t i o nr e d u c i n gs u g a rd e g r a d a t i o nm e c h a n i s m 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究 工作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名：金塑奎 日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) ， 学位论文作者签名：逊 日 期：坦21 受：莎 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：自鱼趣 日 期：幽! 厶，f 口 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 己i言 ji 口 纤维素类物质占植物干重的5 0 ，是地球上分布最广、含量最丰富的碳源物质， 对人类而言，它又是自然界中数量最大的可再生资源。微生物对纤维素的降解转化是自 然界中碳素循环的主要环节，纤维素的转化利用对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、 环境污染等问题具有十分重要的意义。纤维素酶( c e l l u l a s e ) 是降解纤维素的一组酶系总 称，近年来随着对纤维素酶研究的深入，越来越多的性质各异的纤维素酶的发现，使得纤 维素酶的应用日益广泛，但是由于对纤维素酶的结构、功能，特别是降解纤维素的作用机 制还缺乏足够的认识，使得对纤维素酶的研究和高效应用还存在很大的局限性。为此，纤 维素酶的分子结构、基因表达、降解机制等方面一直受到国内外学者的极大关注，并取得 了许多突破性研究进展。 一、产纤维素酶的微生物 纤维素酶的种类繁多，来源也很广。大多数纤维素酶主要来自微生物体，2 0 世纪6 0 年 代以来，据不完全统计，国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约已有5 3 个属的几千个菌 株。其中，丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群。真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧 孔属、疣孢漆斑菌q m 4 6 0 、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、 绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌q m 9 3 8 1 和嗜热子囊菌q m 9 3 8 3 等【2 1 ；其 产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，故常用于饲用纤维素 酶的生产。但研究最多且最清楚的是里氏木霉zr e e s e ip j ，一般我国利用里氏木霉 q m 9 4 1 4 ( 美国陆军n a t i c k 实验室菌株) 作为其他酶活力的比较菌株【4 】。由于细菌所产 生的纤维素酶一般最适p h 为中性至偏碱性，而且这类酶对天然纤维素的水解作用较弱，长 期以来很少受到重视。9 0 年代以来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整 理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶也显示出良好的使用性能和巨大的经 济价值【孓7 1 。这类细菌常见于腐植土中，好氧性细菌如纤维弧菌属( c e l l v i b r i o ) 、纤维单 胞菌属( c e l l u l o m o n a s ) 、噬胞菌属( c y t o p h a g a ) 等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤 中纤维素的分解，主要还是纤维素分解真菌在起作用。而在厌氧条件下，纤维素的分解主 要是由一些厌氧性的芽孢梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 的细菌起作用。在草食动物的消化道、特 别是反刍动物的瘤胃中，也存在一些这类细菌，如产琥珀酸拟杆菌 ( b a c t e r o i d e s s u c c i n o g e n e s ) 、牛黄瘤胃球菌( r u m i n o c o c c u s 1 a v e f a 2 c i e n s ) 、白色瘤胃球菌 ( r a l b u s ) 、溶纤维丁酸弧菌( b u t y r i v i b r i of i b r i s o l v e n s ) 等。另外，还有一些可降解纤维 素细菌，例如p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ；r u m i n o c o c c u s a l b l 2 s ，r f l a v e f a c i e n s ；c l o s t r i d u m a c e t o b u t y l i n m ，c t h e r m o c e l l u l m ，cl o n g i s p o r u m ，c t h e r m o c e l l u l a s e u m ，c s t e r c o r a r i u m ；、 东北师范大学硕士学位论文 c e l l v i b r i o f u l v u s ，cg i l v u s ，c v u l g a r i s 等。 目前，我们对真菌关注较多，而对细菌和放线菌的纤维素降解特性研究却很少。实际 上，自然界中产生纤维素酶的菌株远不限于我们所知种属。 二、天然纤维素在降解过程中超分子结构的变化 1 天然纤维素的结构 一般来讲，纤维素物质都是以混合态存在的，即在纤维素生物质中同时存在有大约 占细胞干重2 5 左右的半纤维素物质和2 0 左右的木质素物质。纤维素是由吡喃型葡萄 糖以b 一1 ，4 一糖昔键连接成的线性大分子多聚物，纤维二糖是其基本单元，纤维素 分子表面平整、易于长向伸展，再加上吡喃型葡萄糖环上的侧基，十分有利于氢键的形 成，最终使这种带状、刚性的分子链聚集在一起，成为结晶性的原纤维结构。纤维素原 纤维结构为植物细胞壁基本骨架。纤维素分子的大小一般是由聚合度来定义，即一个分 子所含的葡萄糖残基数，根据其聚合度大小可以反应出其抗性程度。纤维素主要有结晶 区和非结晶区两部分( 如图1 ) ，前者结构稳定，微生物降解十分困难后者纤维素结构比 较疏松，很易被微生物降解。纤维素分子链结晶区有氢键，即包括分子链内、链间及分 子链与表面分子之间形成的氢键，这种氢键是造成纤维素物质难以被利用的最主要原因 【8 1 。 2 天然纤维素在降解过程中分子结构的变化 由于研究者们只是观察纤维素降解过程中纤维形态的变化，他们用短纤维，纤维碎 片，亚纤维，微纤维等造纸工业上的习语来形容纤维酶解初期发生的变化，而未能涉及 纤维素的超分子结构，对维持纤维素分子最重要的氢键也只是推测。 当应用扫描隧道显微镜观察到棉花纤维的超分子结构之后，又结合对其在酶解过程 中，红外光谱，x 光衍射，结晶程度，微量热活性和聚合度的测定以及末端基分析等得 到了一系列结果，表明： ( 1 ) s t m 观察可见酶解过程中纤维的长度显著变短，( 如图2 ) 特别是宽度减小，可见微 原纤维完全解离，呈小角度的螺旋存在。由于已知微原纤维之间只存在氢键的连接。显 然这是氢键断裂所致 9 】。 ( 2 ) 由多肽类组分造成的短纤维形成是真菌酶解过程中的普遍的现象。由2 6 株纤维素分 解真菌的粗酶液经过5 0 0 0 d 的超滤膜超滤后的膜下液内的多肽组分不含有各类纤维素 酶活，但都具有使棉花纤维产生短纤维的能力i l o j 。 2 东北师范大学硕士学位论文 目 幽( 2 三、纤维素酶的降解机制 1 真菌的纤维素降解机制 到目前为止纤维素降解机制的研究主要以霉菌为研究对象展 f 的，其原因足霉菌 具有较高的胞外纤维素酶活性，如人们发现木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 和青霉属( p e n i c i l l u m ) 等多个菌属的菌株均可产生胞外纤维索酶。在对霉菌的纤维素 降解的研究过程中，通过对纤维素酶菩组分的分离纯化和性质研究，人们提出了纤维素 降解的协同理冷( s y n e r g l s m ) 、原初反应假| 兑( i n i t i a l d e g r a d i n g ) 和碎片 假说( f r a g m e n t a t i o n ) 。其中，协同理论( s y n e r g i s m ) 和原初反应假说( i n i t i a ld e g r a d i n g ) 得到 了实验结果的史持，受到了人们的广泛认同。 西同坪论 在对真菌的纤维素降解的研究过程中，通过对纤维素酶各组分的分离纯化和性质研 究，早在5 0 年前g i l l i g a nr e e s e 【】_ 】就提m 了纤维素降解的协同理论。该理论认为天然纤 维素完全降解j = 少需要三类纤维素酶，即内切葡聚糖酶( e g ，e n d o g l u e a n a s e ) ，外切 葡聚糖酶( c b h ，c e l l o b i o 埘d r o l a s e ) ，0 葡萄糖苷酶( b g ，b - g l u c a n a s e ) 。降解纤 维素的过程是：内切酶首先作用于纤维素分了非结品区，形成外切酶需要的游历术端， 然后外切酶从糖链的非还原来端，1 3 - 葡萄糖苷酶水解纤维二糖单位，形成葡萄糖。r e e s e 提出的协同理论指出，协同性火小与酶解底物的结晶程度成正比。酶组分混合液比例与 发酵液中各组分相近时协同性最大，而不同菌源的内切酶之问也具有协同性。w h i t e 和 b r o w n 用电子最微镜也证明了内切酶、外切酶组分之间在水解结晶纤维素时的这种协同 作用。w o o d t l 2 1 3j 用木霉和青霉的纤维素酶水解纤维紊时发现，培养液中两种外切酶在 液化微品纤维时具有协同性，对于这种外切外切协同性的解释是两种外切酶具有两种 不同类型的非还原木端的种，当种外切酶从一种还原术端切下一个纤维一糖单位 后，暴露出另外一种类型的非还原术端，被在邻链e 的第二种立体特异性的外切酶切f 3 东北师范大学硕士学位论文 纤维二糖单位。f a t e r 、s t o m 1 4 】等也发现c h bi 和c b hi i 联合分解纤维素的速度和程 度是单酶组分二倍。但此假说的一个重要缺陷是未能说明天然纤维素结晶区的降解机 制。 原初反应理论 原初反应假说认为天然纤维素完全降解至少需要三类纤维素酶，即c l 纤维素脱结 晶酶、c ；内切葡聚糖酶( e g ) 及外切葡聚糖酶( c b h ) ，最后一类为b 葡萄糖苷酶( g ) 5 1 。而m a n d e l s 等人则更相信这种原初反应( i n i t i a ld e g r a d i n g ) 是由这些酶协同反应所引 起的，而不是一个独立步骤。其降解纤维素的过程是：c l 酶对纤维素进行脱结晶，然后由 内外切酶及1 3 葡萄糖苷酶共同作用于纤维素分子的非结晶区，形成葡萄糖。在此基础 上，人们建立了目前的纤维素酶分析系统，该系统广泛的应用于各种霉菌纤维素酶的分 析。 非酶催化的氧化性降解在纤维素生物降解过程中普遍存在。 通过丝状真菌的纤维素降解体系的研究，现一般认为纤维素降解酶系由外切葡聚糖 酶、内切葡聚糖酶和1 3 葡萄糖苷酶组成，只有三种酶互相协同才可完成对纤维素的完 全降解，而褐腐菌虽然大量降解木材，却不具有对水解纤维素的结晶区至关重要的外切 葡聚糖酶；在纤维素降解初期，只引起纤维素聚合度的下降却不引起失重【l6 】；另外褐腐 菌在基本不降解木素的情况下，首先分解木材中的纤维素和半纤维素，剩下无定形的、 褐色的、有许多孔洞的木素部分。1 9 6 5 年，h a u i w e l l 发现f e n t o n s 试剂h 2 0 2 f e 2 + 产 生的羟基自由基h o 具有极强的纤维素降解能力( h 2 0 2 + f e 2 + 一h o + o h 。+ f e 3 其引起纤维素聚合度下降的方式与初期褐腐茵降解木材的方式是相类似的1 1 7 】：且发现 褐腐菌的胞外纤维素酶系不能降解结晶纤维素，却能大大降解由f e n t o n s 试剂预处理 过的结晶纤维素，后经红外光谱、g c m s 分析证明纤维素经f e n t o n s 试剂h 2 0 2 f e 2 + 作用和纤维素经褐腐菌作用的产物是一致的；并在密粘褶菌g l o e o p h ) ，l l u mt r a b e u m 中通 过测定k t b a ( 2 一k e t o - 4 t h i o m e t h y l b u t y r i ca c i d ) 被h o 氧化产生的乙烯间接检测到了 h 0 的生成【博j 。 王蔚【19 】等人对1 1 株褐腐菌的胞外酶系进行了测定和初步分离，对h o 产生的普遍 性进行了研究，并探讨了h o 在褐腐菌降解纤维素初期的作用，确实发现了h o 的作 用，为褐腐菌中h o 氧化降解纤维素机制的普遍确立提供了一定的证据。 4 东北师范大学硕士学位论文 h q h o 勰oo ，胖h容琴专掣勰o n 2 还原性末靖 羟自由基对纤维素分子链进行氧化性降解的机理模式图 2 细菌降解纤维素的机制 h o w a r dg 等人在研究c e l l u l o m o n a s f i m i 是提出了一个与r e e s e 理论类似的纤维素 酶分子内协同理论。c e l l u l o m o n a s f i m i 纤维素酶是由一个c b d ( 相当于c 1 ) 和一个c d ( 相当于c x ) 组成的复合酶体系，在降解纤维素的过程中，c b d ( c e l l u l o s eb i n g d i n g d o m a i n ) 结合到纤维素上，打开结晶区，使得c d ( c a t a l y t i cd o m a i n ) 更容易附着在纤维素 上使纤维素发生降解【2 0 1 。高培基等人在对噬纤维菌降解纤维素的研究提出，噬纤维细菌 属存在氧化性降解酶类，并且，该氧化性降解酶类位于细胞膜上。由此可见，细菌降解 纤维素的机制可能远比我们目前所认识到的复杂【2 。 好氧菌 对于分解纤维素的好氧性细菌的研究是整个纤维素微生物降解研究中非常重要的 环节。因为好氧性细菌可直接消化纤维素，培养要求条件简单，而且便于发酵和遗传工 程操作。好氧性纤维素分解细菌主要有c y t o p h a g a 、s p o r o c y t o p h a g a ，b a c i l l u s 以及放线 菌中的s t r e p t o m y c e s 等种属。国内对好氧性纤维素分解细菌的研究开始于2 0 世纪 5 0 6 0 年代，1 9 9 0 年刘东波、高培基、王祖农等人分离到一株同时具有降解纤维素和 固氮能力的诺卡氏放线菌，但在研究过程时发现该菌株具有较强的纤维素分解能力，但 未发现胞外酶的存在，同时也发现菌体细胞和细胞碎片对纤维素具有较强的降解能力 瞄2 1 。从呼和浩特地区碱性土样中分离和筛选出一株产纤维素酶活力较高的好氧性细菌菌 株h t 3 。该菌产酶为胞外分泌，在最适条件下培养，酶活可达5 1 u 2 3 1 。曾有人分离出 一株芽孢杆菌属的好氧细菌一芽孢杆菌e 2 菌株，能在5 5 温度下生长良好并在培养 液中积累大量胞外纤维素酶，此酶为单一的羧甲基纤维素酶，不能水解棉花纤维、微晶 纤维和滤纸等天然纤维素；而且只有羧甲基纤维素钠能诱导该菌产酶，而微晶纤维等天 然纤维不能诱导该菌产酶【2 4 】。 东北师范大学硕士学位论文 厌氧菌 近几年来，人们着重对以c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 为代表的嗜热厌氧菌的研究 嵋5 。3 2 】。人们在研究c l o s t r i d i u m 、a c e t i b i b r i o 、r u m i n o c o c c u s 等属的菌株时发现，这一类 细菌的纤维素酶多数为纤维素酶体c e l l u l o s o m e ) 3 3 - 3 7 】，这些纤维素酶体是由多个c b d 、 c d 通过d o c k i np r o t e i n 和l i n g k e r 连接在一起的复合体系，其降解产物多为纤维寡糖。 人们对r u m i n o c o c c u s 对纤维素降解的过程进行了系统的研究，从形态上对厌氧菌对纤 维素降解的过程进行了研究，指出这类菌对纤维素的降解主要分为四个过程( 1 ) 非杆状细 胞到达底物部位的转移；( 2 ) 细菌与暴露位点的非特异性结合；( 3 ) 通过纤维素酶体、菌毛、 酶的c b p 及c b d 的特异性结合；( 4 ) 菌体的扩增。 在纤维素降解细菌的研究过程中，人们发现许多细菌具有较强的纤维素降解能力， 但却很难像真核生物一样测到较高的胞外酶活，其可能的原因是因为传统的纤维素酶活 测定方法不一定适用于细菌，也许我们更加应该关注降解产物性质和结构的研究上，比 如发酵液中糖的组分和含量的变化。 a li ； | a 。_ - _ _ _ - _ _ - - ， y 、_ _ _ _ _ _ _ - _ - _ ；一 口。- _ _ _ _ - _ 。_ _ _ - 7 - - - _ - - - _ _ - _ _ - _ _ o 1 l r 、 , 7x 9 - 、w - v a - - _ _ - - _ _ _ _ - _ _ _ 一- 一o - = 二- _ _ _ - _ - 二：二一 农c e l 咖蝴 o e 嗍i 一獬婶器螺尹 8 愀嘲孙黑螺嚣 b 6 器畿器奄埘e x m o g 掀l u c a n 。a m s e ( e g c e 孵c e t s ， 蟹 嗣c o h e 嘲m o l e b 商崩e x t h o g d o c l u e a 黼n a s e 晦润 8 e c e l l o d e x t r i np h o s h o 懈e qc a r b o h y d r a t e - b i n d i n gm o d u l e ( c b m ) s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h eh y d r o l y s i so fa m o r p h o u sa n dm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s eb y n o n c o m p l e x e d ( a ) a n dc o m p l e x e d ( b ) c e l l u l a s es y s t e m s t h es o l i ds q u a r e sr e p r e s e n tr e d u c i n ge n d s ，a n d t h eo p e ns q u a r e sr e p r e s e n tn o n r e d u c i n ge n d s a m o r p h o u sa n dc r y s t a l l i n er e g i o n sa r ei n d i c a t e d c e l l u l o s e ， e n z y m e s ，a n dh y d r o l y t i cp r o d u c t sa r en o ts h o w nt os c a l e 四、微生物纤维素酶系统的构成及结构 1 微生物纤维素酶系统的构成 纤维素酶由三类不同催化反应功能的酶组成，根据其催化功能的不同n - - 1 分为：( 1 ) 内 6 东北师范大学硕士学位论文 切葡萄耱苷酶( e n d o 一1 ，4 b d g l u c a n a s e ，来自真菌的简称e g ，柬自细菌的简称c e n l ，该类 晦能随机地在纤维索分子内部降解1 ，4 一b 糖苷键，f 2 1 外切葡萄特苷酶( e x o 1 ，4 b d g l u c a n a s eg l u c a n a s e ，来自真菌的简称c b h ，来自细菌的简称c e x ) ，它能从纤维索分于 的还原或非还原端切割糖营键，生成纤维一糖，( 3 ) 纤维二糖酶( b 1 ，4 - g l u c o s i d a s e ，简称 b g ) ，它把纤维二糖解离成单个的葡萄糖分了。h 有在这三类酶的协同i 作用下，昂终爿能 把纤维素分子降解成葡萄糖。微牛物特别是真菌能产生这类酶的复合物从而把纤维素分 r 降解为葡萄耱分子为自己所利用。通常能够能够降解无定行纤维素和结晶纤维素的酶 系称为完全酶系( c o m p l e t ec e l l u l a s es y s t e m ) 或全值酶系m - v a l u ec e l l u l a s es y s t e m ) 。仪 能降解无定性纤维素的纤维素酶系称为不完全酶系( u n c o m p l e t ec e l l u l a s es y s t e m ) 或低 值酶系”“( 1 0 w v a l u ec e l l u l a s es y s t e m ) 有些微生物能够产7 f 完整的纤维素酶系，但足各 个组分的含量足不同的，订的则足不完整的。 2 微生物纤维素酶分子的结构 大多数纤维索酶都有由一个或多个催化结构域( c a m b _ t i cd o m a i n ，c d l 和纤维素结 台区( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 组成，中间由一段可辨认的连接肽( 1 i n k e r p e p t i d e ) 所连接( 如图) ，只有少数微生物和高等植物产生的纤维紊酶小具有这类结构域如丁 r e e 2 s e ie g 的e g 3 就没钉c b d 结构域圳。 2i 纤维素结合结构域( c b d ) 结构 纤维素酶的c b d 中所含保守氨基酸多是芳香族氮基酸m 趣j ，如t y r 和t r p 。而 有些纤维素酶缺乏纤维素结合结构区。通常认为c b d 村高效降解纤维索起到关键的作用 但fr e e s e i 的c b h l 在没有c b d 的情下仍具有水解纤维素的活性同样的现象也往工 r e e s e i 的e g l 巾被观察到阳 ，此外，h u m i c o l ai n s o l e n s 的e g 5 和c e l l u l o m o n a s f i m i 的 c e n e g 都并未发现具有c