（材料学专业论文）丝胶蛋白羟基磷灰石复合材料的制备及生物相容性研究.pdf

浙江理t 大学硕+ 学位论文 摘要 生物矿化指的是生物体严格控制下形成无机矿物质的过程。仿生合成有机无机复合 材料不仅能帮助理解生物矿化机理，同时也能为制备生物矿化材料提供新思路，因此受到 广泛关注。本研究在不同浓度的丝胶溶液中，利用化学沉淀法仿生合成丝胶羟基磷灰石复 合材料。用x 射线粉末衍射仪( m ) 、傅立叶变换红外光谱仪( f t i r ) 、透射电子显微 镜( t e m ) 、扫描电子显微镜( s e m ) 、原子力显微镜( a f m ) 等分析了复合材料的晶相组 成、化学结构和微观形貌。最后，通过体外细胞培养评价了复合材料的生物相容性。 结果表明，以丝胶蛋白为有机基质调控生成了类牙釉状羟基磷灰石，并对其生长机理 进行研究。t e m 、s e m 和a f m 结果显示晶体是由直径大约1 0 2 0 n m 的纳米微晶聚集而成， 当浓度较小为0 0 0 1 ( w v ) 时，纳米微晶聚集成长约7 0 1 0 0 n m ，宽约1 0 2 0 n m 的类牙釉 状；当丝胶浓度到达1 ( w v ) 时，晶体尺寸长度超过2 0 0 n m ，宽度也达到了6 0 8 0 n m ； 说明随着浓度的逐渐增大，晶体尺寸也随之增加。研究还发现，实验初始阶段，丝胶蛋白 在搅拌作用下，自组装成亲水端向外的纳米小球，碱性环境使得小球带负电，能与羟基磷 灰石微晶的晶面发生静电作用，从而阻断了在这些晶面发生的晶体一晶体间的融合，最后 形成了类牙釉状的s s h a 复合颗粒。 本研究将不同浓度丝胶溶液调控所得s s h a 复合粉末和作为对照的纯羟基磷灰石粉 末与m g 6 3 细胞体外共同培养，研究复合材料的生物学性能。通过形态学观察，荧光染色 观察以及m t t 检测，与纯羟基磷灰石相比，丝胶与羟基磷灰石的复合材料更能促进m g 6 3 细胞的增殖、生长，具有更好的生物活性，检测m g 一6 3 细胞的碱性磷酸酶( a l p ) 活性以 及细胞上清液中骨钙素( o c ) 含量，结果表明丝胶与羟基磷灰石复合材料更能促进细胞 a l p 活性的表达和诱导细胞分泌o c ，使得m g 6 3 细胞的成骨能力能到增强，是一种理想 的复合生物材料。 上述结果表明，本研究以丝胶为有机基质调控羟基磷灰石的结晶生长，制得类牙釉状 羟基磷灰石具有良好的生物相容性和生物活性。研究其生长机理，希望能为阐明蛋白质的 生物矿化过程及其调控机理提供了理论依据，也可以为制备理想的复合生物材料提供新的 思路。 关键词：羟基磷灰石丝胶蛋白生物矿化生物相容性 浙江理j ：入学硕+ 学位论文 a b s t r a c t b i o m i n e r a l i z a t i o ni st h es o p h i s t i c a t e dp r o c e s so fp r o d u c t i o no fi n o r g a n i cm i n e r a l sb yl i v i n g o r g a n i s m s c o n s t r u c t i o no fo r g a n i c i n o r g a n i ch y b r i dm a t e r i a l s 、析也c o n t r o l l e dm i n e r a l i z a t i o n a n a l o g o u st ot h o s ep r o d u c e db yn a t u r eh a sr e c e n t l yr e c e i v e dm u c ha t t e n t i o nb e c a u s ei tc a na i di n u n d e r s t a n d i n gt h em e c h a n i s m so ft h eb i o m i n e r a l i z a t i o np r o c e s sa n dd e v e l o p m e n to fb i o m i m e t i c m a t e r i a l sp r o c e s s i n g s i l ks e r i c i n ( s s ) h y d r o x y a p a t i t e ( h a ) c o m p o s i t e sw e r ep r e p a r e db yc o - p r e c i p i t a t i o nm e t h o d i nt h es ss o l u t i o n 诵t ht h ed i f f e r e n ts sc o n c e n t r a t i o n sf r o m0 0 01 “，v ) t o1 ( w v ) t h e m o r p h o l o g i e s ，c o m p o n e n t s ，p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ec o m p o s i t es c a f f o l d sw e r e i n v e s t i g a t e db yt e m ，s e m ，a f m ，x r d ，f t i r , e t c t h er e s u l t ss h o w e dt 1 1 a ta tal o w c o n c e n t r a t i o no fs s ，i e ，0 0 0 1 ( w v ) ，t h ec o m p o s i t e 州t l lt h es i z eo f7 0 10 0n l ni nl e n g t ha n d l0 2 0n n li nw i d t hw a sp r e s e n ta sa s s o c i a t i o no fn a n o p a r t i c l e s h o w e v e r ，t h es i z e ，e s p e c i a l l yt h e l e n g t ho fc o m p o s i t e si n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h ei n c r e a s eo fs sc o n c e n t r a t i o n w h e nt h es s c o n c e n t r a t i o nw a s1 ( w v ) ，t h eo b t a i n e dc o m p o s i t e sw e r ee x h i b i t e da st h ew h i s k e rm o r p h o l o g y w i t has i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dl e n g t ho fm o r et h a n2 0 0n n la n d6 0 8 0 n mi nw i d t h o nt h eo t h e r h a n d ，i ti sf o u n dt h a tt h ef o r m a t i o no fe n a m e l l i k es s h ac o m p o s i t e sm a yi n c l u d ef o l l o w i n g s t e p s ， f l r s e r i c i nm o n o m e r sa s s e m b l et o g e n e r a t en a n o s p h e r ea t t h e b e g i n n i n g o f b i o m i n e r a l i z a t i o np r o c e s s ，t h e nf o r man e g a t i v e l yc h a r g e ds u r f a c ea ta l k a l i n ec o n d i t i o n ，a n i o n i c s i d e - c h a i n so nt h en a n o s p h e r e si n i t i a l l yi n t e r a c te l e c t r o s t a t i c a l l y 、析t ht h eh a c r y s t a l l i t ef a c e s p a r a l l e lt ot h eca x i s ，p r e v e n t i n gt h ec r y s t a l c r y s t a lf u s i o n s i nv i t r oe x p e r i m e n tw e r ed e s i g n e da n dc a r r i e do u tt oe v a l u a t et h eb i o l o g i c a lr e a c t i o no ft h e s s h ac o m p o s i t e s ，c o n t r o l l e db yh a m o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n , a c r i d i n eo r a n g e ( a o ) s t a i n i n g a n dm t tr e s u l t ss h o wt h a tt h el i k e - e n a m e ls s h ai sb e t t e rb e n e f i tt om g 6 3t h a th a ，i ti s b e n e f i tt om g 6 3a d h e s i o nd i f f e r e n t i a t i o na n dp r o l i f e r a t i o n a tt h es a m et i m et h er e s u l t so fa l p a n do ci n d i c a t et h a tt h es s h ac a np r o m o t et h ea l p e x p r e s s ，a n di n d u c et h eo cp e r s p i r e c o n t r o l l e dw i t hh a s ot h el i k e e n a m e ls f h ab i o m a t e r i a li sab e t t e rb i o m a t e r i a l b a s e do nt h ee v i d e n c e sf r o mt h ee x p e r i m e n t s ，c a l c i u ma n dp h o s p h o r u sb e g i nd e p o s i t i o n ， n u c l e a t i o na n dg r o w t hu n d e rc o n t r o lo fs i l ks e r i c i na n df o r ml i k e e n a m e ls s h a b i o c o m p o s i t e l i 浙江理 ：大学硕 ：学位论文 谢mg o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n db i o a c t i v i t y m o r e o v e r , i tm a yp r o v i d es o m ei n f o r m a t i o no nt h e p r o t e i nb i o m i n e r a l i z a t i o na n di t sb i o m o l e c u l a rc o n t r o l ，a n dg i v ean e wp a t h w a yo ft h e b i o m i m e t i cm a t e d a l s k e y w o r d s ：h y d r o x y a p a t i t e ；s i l ks e r i c i n ；b i o m i n e r a l i z a t i o n ；b i o c o m p a t i b i l i t y 1 1 1 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：危疟 日期：如a7 年，月i s h 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保斌 学位论文作者签名：屈蹇 日期：加。刁年1 月f f 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：包：卷萄u 皇 日期：7 哆年月f r 日 浙江理t 大学硕十学位论文 1 1 生物矿化的概述 第一章绪论 生物矿化指的是在生物体内形成无机矿物质的过程，通过特定的有机模板的调控使无 机物在无机有机界面处成核并缓慢生长，最终得到具有一定形状和结构的无机一有机复合 材料。其重要的特征是细胞分泌的有机基质控制无机矿物的成核和生长，形成具有特殊组 装方式和多级结构特点的生物矿化材料( 如贝壳、骨等) 【1 3 1 。 生物矿物的形成常常是各种因素协同作用的结果。m a n n 4 1 曾提出界面有组织矿化的观 点，认为生物矿化过程存在着不同层次的控制作用。生物体内的矿化过程一般分为4 个阶 段【5 1 。 ( 1 ) 基质大分子的预组装 基质大分子构型有序的反应环境决定了无机物成核的位置。预组织原则是指有机基质 与无机相在分子识别之前将识别无机物的环境组织得越好，则它们的识别效果越佳，形成 的无机相越稳定，该阶段是生物矿化进行的前提6 。 ( 2 ) 有机一无机界面的分子识别，控制晶体的成核、生长和聚集。目前主要研究集中 在基质蛋白和矿物之间的分子识别机理，如静电作用、螯合作用、表面能和范德华力等。 在有机一无机界面的分子识别过程中，常常存在下面几个作用。 有机基质与矿物的晶格匹配 当有机基质表面结构与晶体某一晶面的晶格参数相匹配时，可以降低晶体成核活化 能，诱导晶体沿该晶面择优生长，从而使该晶面相对稳定并体现在最终形态中。品格匹配 除了决定晶体的取向外，还可以决定晶体的晶形。 立体化学互补和空间定位 立体化学互补是指界面处的有机分子和晶体中的无机离子在空间机构上达到互补，从 而相互识别并引发特定的成核。空间定位是指有机界面提供了一个有效中心，使晶体在这 个中心定位生长，同时，它又对晶体生长在空间上的扩展给予约束和限制，从而使得晶体 在结构、形态及尺寸上都得到控制。例如，p - p d a 构成的l a n g m u i r - s c h a e f e r 有机薄膜诱导 方解石( 0 1 2 ) 面定向成核。从静电作用及晶格周期来讲，方解石( 0 0 1 ) 面也具有相似的 性质，但有机薄膜的羧酸头基是倾斜排列的，正好与( 0 1 2 ) 面上的c 0 3 2 - 的倾斜排列相适 应；而( 0 0 1 ) 面上的c 0 3 2 - 呈平面三角形排列，与有机薄膜的头基立体化学不能互补，结 浙江理丁大学硕士学位论文 果导致p p d a 薄膜只能诱导方解石沿( 0 1 2 ) 面定向生长o l 。 静电作用和电荷匹配 静电作用对于界面电荷富集和双电荷层的形成起着关键的作用。l o c h l l e a d 【1 1 】等认为， 带负电荷的有机基质螫合带正电荷的阳离子，然后吸引阴离子并局部晶体阴离子浓度增 大，从而进一步吸引更多的阳离子，直到浓度增大到有利于晶体异相成核【1 2 1 ，生物矿化过 程中的这一“离子移变说 已被红外光谱所证实。对富天冬氨酸的蛋白质而言，钙结合位 点是羧酸：对糖蛋白和磷蛋白而言，钙结合位点是硫酸或磷酸集团；可溶蛋白质中的黏多 糖也是钙结合位点。上述大分子均具有浓缩钙离子、调节矿物成核和生长的作用。但在溶 液中静电作用对结晶的调控作用于在两相界面上并不完全相同【1 3 】。 ( 3 ) 生长调节( 化学矢量调节) ，使晶体初步组装形成亚单元：无机相通过晶体生长 进行组装得到亚单元，同时形状、大小、取向和结构受有机基质分子组装体的控制；由于 实际生物体内矿化中有机基质是处于动态的，所以在时间和空间上也受到有机基质分子组 装体的调节。 ( 4 ) 细胞水平调控与加工：亚单元矿物组装形成多级结构的生物矿物。迄今为止， 生物矿化的研究主要集中在仿生合成方面，生物矿化机理研究很少【m 】。从蛋白质发展到细 胞和基因的水平上去理解矿化机制1 5 】，是当前生物矿化作用基本理论研究发展趋势和取得 突破的关键。 随着矿化蛋白质结构功能预测研究的进展，我们可以从分子水平上去理解蛋白对生物 矿化调节和控制的途径。但具体地了解蛋白质的功能，还需要实际的实验验证。确定生物 体中各种蛋白、特别是某些重要的微量基质蛋白对矿化的控制作用，被认为是目前生物矿 化机理研究的一个重要领域【4 】。 1 2 羟基磷灰石及其仿生矿化研究进展 1 2 1 羟基磷灰石的晶体结构及其性质 羟基磷灰石是骨基质中无机盐的主要化学成分，化学式为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，简称h a ， 密度为3 1 6 9 e m ，折射率是1 6 4 1 6 5 ，c a p 原子比为1 6 7 ，微溶于纯水，呈弱碱性( p h = 7 , - - - , 9 ) ，易溶于酸而难溶于碱。羟基磷灰石属六方晶系，属p 6 3 m 空间群，其结构为六角柱体， 与c 轴垂直的面是一个六边形，毛b 轴夹角即a a b = 1 2 0 。，a a c = b a c = 9 0 。晶胞参数为a - 0 9 4 2 1 、 b = 0 9 4 2 1 、e = 0 6 8 8 2 n m 。单位晶胞含有1 0 个c a 2 + ，6 个p 0 4 3 和2 个o h ( 见图1 1 ) 1 6 , 1 7 】。 2 浙江理工人学硕十学位论文 从图中可看到o h 。位于晶胞的四个角上，1 0 个c a 2 + 分别占据两种位置，4 个c a 2 + 占据c a ( i ) 位置，即z - - - - 0 和z = 1 2 位置各两个，该位嚣处于6 个0 组成的c a - o 八面体的中心。 6 个c a 2 + 处于c a ( i i ) 位置，即z = l 4 和z = 3 4 位置各有三个，位置处于三个o 组成的 三配位体中心。6 个p 0 4 四配位体分别位于z = l 4 和z - - 3 4 的平面上，这些p 0 4 3 。四面 体的网络使得h a 结构具有较好的稳定性【1 8 2 3 1 。h a 微晶表面具有几种可能的表面状态 2 4 , 2 5 】：( 1 ) 当o h 。位于晶体表面时，o h 与两个c a ( ) 离子相连，当h a 在水溶液中时， 表面o h 。位置至少在某一瞬间空缺，由于两个c a ( i i ) 离子带正电荷，形成了一个吸附位 置，这个位置能吸附p 0 4 3 - 或大分子上的磷酸根基团或羟基基团。( 2 ) 当c a 2 + 位于晶体的 表面时，由于c a ( i ) 与6 个带负电荷的o 原子相连，c a ( i i ) 与3 个带负电荷的。原子 相连，当h a 在水溶液中，表面的c a ( i ) 位置形成较强的吸附位置，能吸附s p ，k + 等 阳离子及蛋白质分子的基团，而在c a ( i i ) 位置则形成一个较强的吸附位置。( 3 ) p 0 4 3 位于晶体的表面时，h 2 0 通过氢键与p 0 4 3 - 离子结合。 羟基磷灰石生物陶瓷具有良好的生物相容性和生物降解性。大量的生物相容性试验证 明h a 无毒、无刺激、不致过敏反应、不致突变、不致溶血，不破坏生物组织【2 6 。2 8 】；研究 表明【2 9 】多孔h a 具有生物降解性，在人体环境下，多孔h a 会发生物理化学溶解，或在晶 界等活性较高的区域发生化学变化而分解成较小的颗粒。h a 还是一种强离子交换剂，分 子中c a 2 + 易被c d 2 + 、h 9 2 + 等有害金属离子和s ，、b 0 2 + 、p d 2 + 等重金属置换，o h 也可以 被f 。、c 1 所置换，且置换速度非常快【3 0 j 。 1 2 2 羟基磷灰石的制备方法 图1 1h a 晶体结构示意图 1 6 , 1 7 h a 由于其成分与生物体骨骼的无机成分相近，因而引起了人们广泛的关注。h a 具有 3 浙江理： 人学硕十学位论文 许多优良特性，除与本身特性有关外，还与其制备方法和制备工艺有密切的关系。h a 的 制备方法很多，大致可以分为三类：干法( 固相反应法) 、水热法和湿法( 溶液反应法) 【3 i 】 o 1 干法 目前通常采用的方法是c a 3 ( p 0 4 ) 2 或c a c 0 3 和c a 4 p 2 0 9 在12 0 0 的高温下通入水蒸气， 通过固相反应合成h a 。该法的优点是可以得到无品格缺陷和结晶程度高的h a 晶体。缺点 是原料粉末需要长时间混磨，易污染，反应速度慢，产物粒径大，产物的活性较差。故一 般不用干法合成纳米h a 。 2 水热法 3 2 - 3 4 】 水热法的合成原理是在有个密闭的压力容器中，用水溶液作为反应介质，通过对反应 容器加热，使得在通常条件下难溶或不溶的物质溶解并重结晶。将c a ( n 0 3 ) 2 与h 3 p 0 4 按 c a p = i 6 7 混合均匀，放入密闭高压锅内，加入蒸馏水，按一定速度加热到指定温度，从 而使o h 。加入晶格中生成h a 。反应方程式如下： c a ( n 0 3 ) 2 - + - h 3 p 0 4 - f - h 2 0 - - 9c a l0 ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 反应容器冷却至室温取出h a ，用去离子水反复洗净在1 1 0 c 干燥即可。该法的优点是 产物直接为晶态，无须烧结晶化，粒度均匀、形态比较规则。但是此法对设备要求很高， 成本也高。 3 湿法 湿法反应包括化学沉淀反应法、水解法、溶胶一凝胶法、微乳液法及电化学沉积法等。 ( 1 ) 化学沉淀法 化学沉淀法是根据酸碱中和反应生成h a l 3 5 1 。如将事先用水调成糊状的c a ( o h ) 2 加入 到加热至7 0 ( 2 的蒸馏水中，缓慢滴加h 3 p 0 4 ，调节p h 值，即可生成h a 。反应方程式如 下： c “o h ) 2 + h 3 p 0 4 c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 - - h 2 0 此法操作简单方便而且最经济，不需要复杂的设备，比较适合工业化生产。 ( 2 ) 水解法 水解法和水热合成法原理相似。在水解法中，通常c a h p 0 4 在7 0 左右和p h = 8 5 的 条件下使o h 。加入晶格中生成h a 3 6 1 。反应方程式如下： 。 c a h p 0 4 + 2 h 2 0 - - c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ( 3 ) 溶胶一凝胶法 4 浙江理丁大学硕士学位论文 溶胶一凝胶法的基本原理是将金属醇盐或无机盐水解，然后使溶质聚合凝胶、干燥和 焙烧p 7 。3 9 1 。其技术方法是将c a 溶胶缓慢滴入p 0 4 3 溶胶中，体系中分别加入不同量的 n h 4 h c 0 3 ，用氨水调节p h 值，生成的c h a p 凝胶经2 4 h 陈化一洗涤一干燥一焙烧。该方 法工艺过程简单，产物组成容易控制且无需大型设备，但合成h a 过程中，所得胶体的重 复性低、胶体不均匀、颗粒尺寸分布较宽。 ( 4 ) 微乳液法 微乳液法是将钙盐和磷盐分别制成微乳液，将两种微乳液放置一定时间，将沉淀物用 无水乙醇洗净，即可获得纳米尺寸的h a 粉体3 6 ，4 0 1 。 ( 5 ) 电化学沉积法 电化学沉积法是根据电化学的基本原理，从c a ( p 0 4 ) 2 水溶液中把h a 粒子电沉积在阴 极上【4 1 1 。 以上简单的介绍了目前较为常见的h a 制备方法，比较而言，化学沉淀法制备纳米羟 基磷灰石具有以下优点：反应温度较低，一般为室温或稍高温度；制备粉体颗粒较 小、均匀，各组分化学计量比容易控制；可以保证最终产品的纯度：工艺简单，操 作简便，对实验设备要求不高。故本研究采用化学沉淀法制各纳米丝胶羟基磷灰石复合粉 末。 1 2 3 羟基磷灰石的应用 h a 的不同形貌在发挥其不同性能方面尤其重要。柱状、晶须状、片状h a 可应用于生 物医学功能材料和聚合物基复合材料领域；多孔状h a 可应用于催化、催化载体、蛋白质 或酶的分离、绿色环保材料领域；粒状、柱状、片状h a 可应用于智能敏感材料领域捌。 纳米羟基磷灰石粒子由于颗粒尺寸的细微化，比表面积急剧增加等特点，而具备了和普通 羟基磷灰石粒子不同的理化性能。目前，对纳米羟基磷灰石的应用研究，主要集中在硬组 织修复材料、药物载体及抗肿瘤活性等几个方面。 ( 1 ) 硬组织修复材料 人体骨主要由有机的骨基质结构与无机的骨盐框架结构组成4 3 1 。无机结构的基本单元 为针状和柱状的磷狄石晶体，长约4 0 , - - 6 0n m ，宽约2 0n n l ，厚约3 5n m 。它们或定向和卷 曲排列，或相互缠结，构成多种结构。不同的结构形成了骨在纳米尺寸上的功能单元，如 束状结构和团聚结构适于承受高强度，而卷曲和束状交织结构具有很好的韧性，并利于营 养物质的传递。纳米羟基磷灰石高分子复合材料通过对天然硬组织的模仿，以期得到性能 5 浙江理j l _ = 大学硕十学位论文 良好的骨修复材料。 冯庆玲等1 4 4 1 将采用仿生沉淀法制得的纳米h a 胶原骨修复材料植入兔骨髓腔中后发 现，植入体的界面层可发生溶解沉积的动态快速更新过程，巨噬细胞可在种植体表面或深 入种植体内通过吞噬和细胞外降解吸收种植体材料，种植体表面及内部被吸收后伴随有新 骨的沉积，种植体与骨组织可形成化学键合。李玉宝等1 4 5 ，4 6 1 通过共沉淀法、常压共溶法等 获得了高纳米h a 含量和分散均匀的纳米h a 聚酰胺复合材料，体外实验及体内动物实验 结果表明，纳米h a 聚酰胺6 6 复合材料具有良好的生物相容性和生物活性，且在兔下颌骨 组织中发现有诱导成骨的特性，是一种较为理想的骨修复材料。姚晖等1 4 7 对控制析出法制 备的纳米尺寸h a 胶原复合骨材料进行修复家兔颅颌骨实验性穿通型骨缺损研究，结果发 现纳米级h a 结晶均匀沉积于胶原蛋白上，便于被机体组织和细胞识别与利用。 ( 2 ) 药物载体 a o k i 等1 4 8 】将羟基磷灰石纳米微晶用作药物载体，对其吸附和释放药物的性能进行了细 致的研究。体外动物细胞培养实验证明，粒子大小为4 0n l n 1 5 n l n 1 0n l n 的纳米h a 溶液 对阿霉素的最大吸附量为0 2 lm g ；阿霉素和阿霉素一h a 对癌细胞均有抑制作用，但阿霉素 - h a 的抑制作用明显长于阿霉素。i j n t e m a 掣4 9 】采用共沉淀法将蛋白类药物b s a 包裹于纳米 h a 晶粒中获得了具有缓释功能的药物释放体系。体外缓释实验结果表明，药物的释放速率 由h a 的溶解过程控制。 ( 3 ) 抗肿瘤活性 h a 作为骨组织的无机成分，具有良好的生物相容性，且能被组织细胞消化分解，是理想 的抗癌药物的材料。h a 纳米粒子由于粒径小，具有更大的表面能，因而易被恶性肿瘤细胞 所吞噬，其可以通过细胞膜和核膜导致d n a 损伤，对细胞周期有阻断，并抑制癌基因c 2 m y c 的表达。a o k i 等【5 0 】将纳米h a 微晶作为抗癌药物的载体，在进行体外细胞培养的实验中发 现，用作空白对照的h a 对c a - 9 癌细胞的增殖也有明显的抑制。同时还发现，h a 对癌细胞 增殖的抑制效应需要一定的时间才可以表现出来，培养液的p h 值发生变化，大量纳米h a 进入细胞内部，引起细胞空胞变形，导致细胞大量死亡。张士成等【5 1 】研究表明，h a 微晶 在一定的浓度( 最低1 0 5m o l l ) 和时间条件下，对h e l p 2 细胞、m g c 等细胞的生长、增殖均 有明显的抑制作用。进一步研究发现，h a 微晶对胃癌m g c 一8 0 3 细胞的微管和微丝有明显 的解聚和破坏作用，h a 微晶作用后，癌细胞的微结构发生明显变化。夏清华等【5 2 】研究也 表明：经h a 处理的w 一2 5 6 癌肉瘤细胞，其形态和结构也发生了明显的变化。h a 微晶对w 2 5 6 癌肉瘤细胞的d n a 含量及细胞周期有一定的影响，对g l 期和s 期的细胞最具杀伤力，同时 6 浙江理工大学硕士学位论文 h a 微品还可以阻止癌细胞的增殖分化，使g 2 期细胞积累，阻止g 2 一m 期的进程。李世普等 【5 3 1 发现5 0i l i a 的h a 对人肺癌及胃癌细胞具有抑制作用。魏凤香等酬研究发现粒径在1 0 0a m 以下的h a 颗粒能够抑制宫颈癌h e l 枷胞的分化和毒株的形成，并能诱导其死亡。 1 2 4 有机基质调控羟基磷灰石仿生矿化研究进展 9 0 年代中期，科学家们在多年研究生物材料过程中发现：自然界生物体利用自身温和的 生物环境，通过精密的分子自组装合成了功能卓越的生物材料。因此，提出了分子仿生合 成的概念，将生物材料的研究带入到一个崭新的阶段一仿生合成。仿生合成技术模仿了自 然界生物体合成自身矿物的过程，即无机成分在有机模板的精确调控下合成有机无机复合 体。 天然骨是由无机矿物与生物大分子规则排列而成的复合体。骨基质中无机盐的主要化 学成分是羟基磷狄石，生物大分子主要是胶原蛋白。因此选用胶原蛋白作为有机基质体外 模拟天然的矿化过程是国内外众多研究小组的第一选择。早在9 0 年代，清华大学的崔福斋 教授已经开始用胶原蛋白调控羟基磷灰石生长，制得了纳米级羟基磷灰石胶原复合材料具 有与天然骨相似的成分与结构【5 5 】。 丝素蛋白胶原蛋白同属结构蛋白，具有良好的生物相容性、生物活性及一定的生物降 解性，且来源广泛，提取方法简便，成本低廉，对细胞的粘附、扩展、分化的作用好，适 用于组织工程材料1 5 6 , 5 7 1 。苏州大学卢神州、李明忠等【5 8 】用氢氧化钙与磷酸湿法合成羟基磷 灰石，加入丝素蛋白以诱导羟基磷灰石晶体的定向生长，以仿生的方法得到复合颗粒。研 究结果表明，丝素蛋白能调节纳米羟基磷灰石晶体的矿化，使其沿c 轴方向优先生长，制 备的复合颗粒为纳米级针状晶体，长度在1 0 0 , - - 4 0 0a m ，宽度在3 0 8 0n l i l 之间。 壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 是一种天然的生物可降解多糖，其降解产物为氨基葡萄糖，有一 定的碱性，对人体及组织无毒、无害它除了具有优异的生物相容性外，还具有天然的药物活 性、抗肿瘤活性、消炎作用，对受损生物体能诱生特殊细胞，加快创伤愈合壳聚糖已经在医 学上有广泛的生物医药用途。李保强【5 9 】等用原位沉析法制备壳聚糖羟基磷灰石棒材，解决 了羟基磷灰石单独用作骨修复材料所表现出的脆性大、弯曲强度低等缺点。c s h a 的弯曲 强度为6 7 8 ( m p a ) ，弯曲模量为3 3 ( g p a ) ，剪切强度为2 1 2 ( m p a ) ，压缩强度为4 7 8 ( m p a ) ，均 比人的自然骨高2 3 倍，基本满足了作为骨折内固定材料的力学性能的要求。 硫酸软骨素( c h s ) 属于粘多糖，存在于细胞的表面和软骨的细胞外基质中。研究表 明，c h s 在骨和牙齿形成的早期中出现，并被认为在骨生长的整个过程中控制矿物的沉积 7 浙江理工大学硕士学位论文 和晶体的形态【俐。肖秀峰【6 l l 等以硫酸软骨素( c h s ) 为模板合成了片状纳米羟基磷灰石 ( h a ) ，结果表明c h s 的浓度很大程度地影响了h a 的形貌，浓度较低时( 0 1 o 3 质量分数) ， 形成短纤维状晶体；浓度较高时( t 0 5 质量分数) ，则形成片状晶体。电导率测试结 果表明，c h s 和钙离子之间存在较强相互作用，他们还讨论了h a 的生长机理：在c h s 分子 中周期排列的带负电的羧基和硫酸基会与钙离子螯合而形成c a - c h s 联合体，然后在c a - c h s 联合体的三维结构上吸收钙离子、磷酸根、碳酸根和氢氧根形成一定尺寸的束，这就有可 能为h a 生长提供形核点，形核后由于h a 晶体和c h s 的预组装的功能团之间的相互作用， h a 晶体就沿着平行于c h s 的c 轴方向生长，因此，当c h s 浓度低时得到短纤维状的h a ，当 c h s 浓度提高时，溶液中的c a 2 + 和两条近乎相互平行的c h s 分子链上的c o o 一、- - o s 0 3 一结 合，沿其c 轴方向生长，多条c h s 分子链并排，则得到片状h a ，浓度越高，c h s 分子链并排 的几率越高，片状也越大。 牙的主要矿物质也是羟基磷灰石，其结构比骨更为复杂牙齿由外层的牙釉质和里层 的牙本质组成。牙釉质覆盖在牙冠上，具有光泽，呈半透明。它是由釉柱和釉间质组成， 釉柱和釉问质交替地有序排列。采用仿生方法体外模拟牙釉质的矿化过程是研究牙釉质矿 化机理，制备类牙釉质晶体的一个重要途径。凝胶体系是比本体溶液更接近生物矿化的模 拟体系，王磊等【6 2 】采用自组装寡肽分子在明胶凝胶载体中模拟牙釉质的矿化过程，在自组 装寡肽的影响下，凝胶载体中先形成片状及针状的磷酸八钙晶体。2 - 4 周后片状和针状的磷 酸八钙品体逐渐转变为棒状的羟基磷灰石晶体，然后棒状羟基磷灰石晶体可以排列或生长 为束状，在形态上与人体牙釉质相似。但是棒状羟基磷灰石晶体具有多晶结构，而人牙釉 质中的晶体更多为单晶结构，两者晶体排列和晶粒大小有一定的差异。 1 3 丝胶蛋白的结构、性质和应用 蚕丝蛋白是由丝素蛋白( s i l kf i b r o i n ，简称s f ) 和丝胶蛋白( s i l ks e r i c i n ，简称s s ) 两部分组成，亲水性的丝胶包覆在丝素蛋白的外部，约占总重量的2 5 1 6 3 】。 1 3 1 丝胶蛋白的组成和结构 丝胶是一种球状蛋白，相对分子质量为1 4 , - - - 3 1 4 万，由1 8 种氨基酸组成，其中丝氨 酸( s e r ) 、天门冬氨酸( a s p ) 和甘氨酸( g l y ) 含量较高( 见表1 1 ) 。丝胶蛋白产生于蚕体的中部 绢丝腺，在中部绢丝腺的后、中、前三区，分别合成丝胶、i i 、i 。k o m a t s u 删根据 绢丝腺和茧丝丝胶溶解曲线上的三个转折点，认为丝胶存在四种不同组分( 四层丝胶模型) ， 8 浙江理工大学硕士学位论文 按溶出先后次序分别称为丝胶i ，丝胶i i ，丝胶，丝胶，它们从外到里按层状结构分 布于丝素外围，其含量比为4 1 o ：3 8 6 - 1 7 6 ：3 1 ，k o m a t s u 还从四种丝胶的氨基酸组成、 高次结构和性质等方面进一步阐述四种丝胶的差异，结果见表1 2 。 表1 1 蚕茧丝胶蛋白的主要氨基酸组成 6 , 5 1 氨基酸m 0 1 氨基酸m 0 1 g l y ( 甘氨酸) 1 3 6 a r g ( 精氨酸) 2 8 a l a ( 丙氨酸) 5 2 s e r ( 丝氨酸) t y r ( 酪氨酸) v a l ( 缬氨酸) g l u ( 谷氨酸) a s p ( 天门冬氨酸) t h r ( 苏氨酸) 3 3 1 3 1 3 1 7 9 1 4 6 8 3 l y s ( 赖氨酸) l i e ( 异亮氨酸) p r o ( 脯氨酸) l e u ( 亮氨酸) t r p ( 色氨酸) c y s ( 半胱氨酸) m e t ( 蛋氨酸) 4 4 0 5 o 5 0 8 o 3 o 3 o 1 p h e ( 苯丙氨酸) 0 4h i s ( 组氨酸) 1 0 表1 2 茧丝用热水分级溶解去制得丝胶各部分的氨基酸组成( m 0 1 ) 氨基酸 丝胶各部分 总丝胶b g l y 1 3 2 1 1 2 8 11 5 6 911 8 9 1 3 4 9 a l a v a l l e u l i e p r o 研( a ) c y s m e t s e r ，n l r 4 6 8 2 9 7 o 8 6 0 5 9 o 5 8 0 1 9 0 1 7 0 0 4 3 4 0 3 1 0 3 4 6 6 9 2 2 1 0 9 6 0 5 7 0 6 3 0 2 0 o 1 5 0 0 4 3 6 6 4 8 4 8 6 6 8 3 2 1 1 2 7 0 8 5 0 6 6 o 2 5 o 1 2 0 0 4 2 8 1 5 4 3 6 9 3 0 4 1 6 6 2 6 3 5 0 2 7 5 o 2 3 o o 1 2 1 2 4 0 7 2 5 5 9 7 2 7 5 1 1 4 o 7 2 o 6 8 0 2 1 o 1 5 0 0 4 3 3 4 3 9 7 4 t y r 2 5 32 4 3 3 1 52 4 5 2 6 1 9 浙江理一r = 大学硕士学位论文 a ：用对二甲氨基苯甲醛和乙醛酸对碱水解液比色测定； b ：按丝胶i ：i i ：i i i ：1 1 - - 4 1 o ：3 8 6 - 1 7 6 ：3 1 计算后加权平均： c - 试料1 0 0 克中氨基酸的克数。 后来又有学者突破四层丝胶模型提出新的观点【6 6 舶1 ，陈文兴i 鲫论证了全丝胶肽链组分 可归纳为分子量从1 4 万至2 5 6 万不等的1 4 种。丝胶肽链组分在茧丝上的分布是不均匀 的。分子量为1 5 8 万和1 7 9 万的丝胶组分主要存在于茧丝丝胶外层，分子量为2 2 o 万和 2 5 7 万的丝胶组分主要存在于茧丝丝胶外中层，分子量低于1 2 6 万的丝胶组分主要存在于 茧丝丝胶中内层，而分子量约1 2 6 万的肽链组分则在茧丝的外中内层中均存在。姜玉兰【6 7 】 用s d s p a g e 对家蚕成熟幼虫丝腺分区进行蛋白质多肽组成研究，结果表明，家蚕丝胶表 现出由不同的多肽组成，分子量分别为2 7 5 ，5 7 5 ，6 9 ，1 2 6 ，1 5 1 ，1 9 6 和2 0 9 万等七 种组分。最近，t a k a s u 等用s d s p a g e 将家蚕丝胶分离出分子量为4 0 0 ，2 5 0 和1 5 0 k d a 三种丝胶。 丝胶的二级结构以无规卷曲为主，并含有部分d 构象，几乎不含a 螺旋结构6 4 1 。接近 丝素的内层丝胶中含p 结构的比例相对外层丝胶来说要高，但外层丝胶在环境条件，特别 是湿度的影响下，部分无规卷曲能向p 结构发生不可逆转化。至于丝胶中p 结构的比例，有 l n 浙江理t 大学硕士学位论文 两种说法，t s u l ( a d a 【6 9 】认为水溶液中的丝胶是无规卷曲和b 结构的混合，根据不同材料得出 1 3 结构的比例约在2 2 2 3 5 6m 0 1 之间，k o m a t s u l 6 4 j 则认为根据圆二色性在2 1 8 n m 处的峰值， 可见越接近丝素，即越难溶的丝胶，d 结构越多，这个看法被瓜中酰胺i 、v 吸收带的 所证实。 另一种观点认为水溶液中丝胶本不存在d 结构，只是由于形成丝胶膜时，因干燥条件 而形成1 3 结构的，特别是在反复吸湿放湿或在吸湿状态下加热才会向1 3 结构转变并增加结 晶度的。这种使原有分子形态改变的情况属于蛋白质变性的一种。 由于丝胶结构的复杂性，过去的测试手段都无法测定丝胶的一级结构，随着科技的发 展，生物检测手段的更新，希望在不久的将来借助生物科学的进步揭开丝胶一级结构。 1 3 2 丝胶蛋白的性质 丝胶蛋白具有两性性质，等电点是3 8 - 4 5 。在p h 值较小的溶液里，丝胶蛋白以正离 子形式存在；在p h 值较大的溶液里则以负离子形式存在。丝胶的颗粒直径在1 1 0 0 n m ， 属于胶体粒子范围，因而显示出胶体的性质。将溶于水中的丝胶，在自然条件下放置，可 得到可逆性的丝胶凝胶。朱良均f 7 0 】等研究了丝胶溶液的凝胶化速度与温度和溶液浓度的关 系，结果显示凝胶化速度大体上与温度成正比。在2 0 6 0 范围内，凝胶化速度随温度的 上升而加快。其中，在2 0 4 0 时，凝胶化速度上升很快；在4 0 6 0 。c 时，凝胶化速度上升减 缓；在较低温度( 如1 0 c ) ，凝胶化速度又有变快的趋向。同时，丝胶凝胶化速度与溶液 的浓度成正比，在1 0 一5 0 范围内，浓度越高，凝胶化速度越快。 由于丝胶氨基酸组成中，极性侧链氨基酸占7 4 6 1 6 4 1 ，因此丝胶具有良好的水溶性， 茧丝中的丝胶在冷水中能够吸水膨胀，热水中逐步溶解。这是丝胶最重要的性质，也是人 们能用水来制丝、精炼脱胶的根据。丝胶另一个重要性质就是一湿热变性。陈文兴i 吲对丝 胶在高温高湿气相环境中的变化问题作了详细研究，指出丝胶蛋白质一方面发生变性，分 子构象从无规卷曲向p 一折叠结构转变，另一方面发生变质( 水解降解) ，分子量变小。 变性使丝胶水