毕业论文--抗冷基因RLK对玉米骨干自交系HiⅡ的遗传转化.docx

本科生毕业论文（设计）中文题目 抗冷基因RLK对玉米骨干自交系HiII的 遗传转化 英文题目 Genetic Transformation of Maize Inbred Line Hi by Cold Resistance Gene RLK 学生姓名 班级 821305 学 院 植物科学学院 专 业 生物技术（植物） 指导教师 职称 教授 论文要求一、毕业论文（设计）必须经过答辩才能评定成绩。二、毕业论文（设计）必须打印。文中所用的公式、图表及程序代码，在条件许可时，应打印输出。三、撰写500字左右的中文论文摘要，提倡以中外两种文字书写，外文摘要附在中文摘要之后，关键词一般3-5个。四、毕业论文（设计）一律装订为横开本，左侧装订。五、文中所用的符号、缩略词、制图规范和计量单位，必须遵守国家规定的标准或本学科通用标准。作者自己拟定的符号、记号缩略词，均应在第一次出现时加以说明。六、注序要与文中所提的页码一致，序号不能用1,2,3等数码表示，以免与参考文献的序号相混淆。七、文后要注明参考文献和附录，参考文献要写明作者，书名（或文章题目及报刊名）、版次（初版不注版次）、出版地、出版者、出版年、页码，序号使用1,2,3，中译本前要加国别。八、指导教师评语、评阅人评语、答辩意见，在装订时，装订在论文的最后。吉林大学教务处制吉林大学学士学位论文（设计）承诺书 本人郑重承诺：所呈交的学士学位毕业论文（设计），是本人在指导教师的指导下，独立进行实验、设计、调研等工作基础上取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本人实验或设计中做出重要贡献的个人或集体，均已在文中以明确的方式注明。本人完全意识到本承诺书的法律结果由本人承担。 承诺人 年 月 日中文摘要玉米是原产于中南美洲的一年生常见植物。它不仅在我国，而且在全球范围内都是一种非常重要的工业、饲料及粮食作物。低温胁迫是在玉米生长的过程中对其影响巨大的一种非生物胁迫，会大程度地降低玉米产量。为解决这个问题，本研究将筛选获得的抗冷基因ZmRLK使用农杆菌介导法转入到玉米自交系Hi-II中，从而培育得到抗冷玉米新种质，以适应低温的生长环境，为进一步研究抗冷玉米新材料提供实验依据。抗冷基因ZmRLK是一类定位在质膜上的类受体蛋白激酶，由胞外LRR结构域、跨膜域和胞内激酶组成。它参与植物细胞的分子识别过程，胞外LRR结构域感知并完成跨膜信号的传递过程，当植物遭遇例如冷害的逆境胁迫时，促使胞内激酶域在其作用下做出相应的应答反应。经相关实验及功能验证，研究者们证明ZmRLK可以提高植物对于冷害的耐受能力。本研究通过将玉米抗冷基因ZmRLK使用农杆菌介导法在玉米自交系Hi-II中的遗传转化，培养获得能耐受低温冷害的玉米抗冷新种质。从玉米自交系Hi-II中挑取幼胚并经过培养得到胚性愈伤组织,并以培养获得的胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法对其进行遗传转化，在使用浓度为3mg/L的双丙氨膦对侵染后胚性愈伤组织进行筛选后，将筛选得到的抗性愈伤组织置于分化培养基中进行出芽与生根分化，共得到102株转化植株，经PCR检测后得到3株阳性植株，阳性率为2.9%。关键词 玉米；抗冷基因ZmRLK；农杆菌介导法；胚性愈伤组织IAbstractCorn is a common plant originating in Central and South America. It is a very important industry, feed and food crop not only in our country, but also around the world. Low temperature stress is an abiotic stress that has a great impact on the growth of maize, which will reduce maize yield to a large extent. In order to solve this problem, the anti-cold gene ZmRLK obtained by screening was transferred into the maize inbred line Hi-II by Agrobacterium tumefaciens, and the new germplasm of cold-resistant maize was cultivated to adapt to the low temperature growth environment, and provided experimental basis for further study of new materials for cold-resistant maize.The cold-resistant gene ZmRLK is a class of receptor-like protein kinases located on the plasma membrane, consisting of extracellular LRR domains, transmembrane domains, and intracellular kinases. It participates in the molecular recognition process of plant cells, and the extracellular LRR domain senses and completes the transmembrane signal transfer process. When the plant encounters, for example, the stress of stress injury, the intracellular kinase domain is prompted to respond accordingly. Experiments and functional tests show that ZmRLK can improve the tolerance of plants to chilling injury.In this study, maize cold-resistant gene ZmRLK was transformed into maize inbred line Hi-II by Agrobacterium-mediated method, and cultured to obtain a new cold resistant cold germplasm resistant to chilling injury. Embryogenic calli were obtained from the maize inbred Hi-II, and the embryogenic callus was obtained by culture. The embryogenic callus was obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The callus of the callus was screened by using the concentration of 3 mg/L of dipropylamine. The callus was screened in the differentiation medium for budding and rooting differentiation. 102 strains were transformed and three positive plants were obtained after the PCR molecular detection. The positive rate is 2.9%.Keywords：Maize;cold-resistant gene ZmRLK；Agrobacterium-mediated method;Embryogenic callusIII目录前言1第1节 农杆菌介导法11.1 农杆菌介导法的发展历程1 1.2 农杆菌介导法的特点2 第2节 抗冷基因2 2.1 冷害的概念及作用机理2 2.2 类受体激酶RLK3 2.3 抗冷基因ZmRLK3第3节 Hi-II材料优点4第4节 研究意义4第1章 材料与方法5第1节 实验材料5 1.1 玉米材料5 1.2 仪器、试剂5 1.3 培养基5 第2节 实验方法5 2.1 胚性愈伤组织的获得5 2.1.1 挑取玉米幼胚5 2.1.2 培养胚性愈伤组织6 2.2 农杆菌的制备6 2.3 农杆菌侵染7 2.4 恢复培养及抗性愈伤筛选7 2.5 分化出苗与生根8 2.6 使用CTAB法提取玉米叶片DNA9 2.7 分子检测10 2.8 炼苗与移栽11 第3节 结果分析11 第4节 讨论12结论14致谢15参考文献16前言第1节 农杆菌介导法转基因技术中，当前最常被人们所采用的是农杆菌介导法1。因为农杆菌所介导的遗传转化过程是在自然界中发生的一种完美的基因转化过程，它能将自身的一段DNA（T-DNA）插入到受体植物细胞的基因组之中，并将其稳定地遗传给下一代2。这个遗传转化过程是一种天然的植物基因转化系统，备受人们的重视，拥有如拷贝数低、聚合后的外源基因结构变异较小、转化机理清楚、转化的外源DNA结构完整、整合位点稳定等众多优点。农杆菌介导法具有的众多优势使它有可能成为玉米转基因实验中的主要转化方法3，也正是因为它所具有的众多优点，本研究中才选择农杆菌介导法作为受体材料的侵染方式，以求获得更多的阳性转化植株。1.1 农杆菌介导法的发展历程在1975年Green等人开创了先河，首次使用幼胚诱导出了愈伤组织，并再生得到了完整植株，1988年Rhodes等人通过实验首次培养得到了完整的转基因玉米植株，为玉米的遗传转化技术奠定了基础，使得对玉米的遗传转化研究发展迅速。1996年，Ishida等人对A188及其杂交种的未成熟胚使用农杆菌介导法完成了转化，顺利获得了玉米转基因植株，使玉米种质资源创新获得了新途径。国外已经建立了较为完善的农杆菌介导的遗传转化体系，但国内相关领域的发展仍稍显落后，不过国内在农杆菌介导的玉米遗传转化体系上已有较大的突破，并通过该体系获得了多种新的转基因玉米种质材料。在当前条件下，在使用农杆菌介导法的玉米遗传转化体系中，仅有较为完善的以A188为受体的体系遗传转化率较高，其他体系都相对比较低，因此国内外研究者仍然将提高转化率作为研究的重要目标。就当前的研究成果判断，我们可以推断影响遗传转化率的关键因素是受体材料的基因型4。目前只有以A188为受体材料的转基因实验成功率比较高，或者是具有A188和B73背景的Hi-的幼胚5,6。因此，我国仍需在加强针对玉米育种自交系或优良自交系遗传转化体系的研究等方面加大投入力度与重视程度7。一旦能作出突破，对全世界范围内的转基因技术研究都有巨大的意义8。为了改变这一现状，在过去的多年中我国科学家在农杆菌介导法的优化上作出了众多贡献。1.2 农杆菌介导法的特点当前世界范围内研究得最为透彻、技术方法最先进、理论机制比较完整的基因转化途径是由根癌农杆菌介导的遗传转化体系。农杆菌介导法与其他的转化方法不同，它拥有所携带的外源DNA结构比较完整，片段较为准确,适合应用于大片段基因的转化，并且转入外源基因的整合位点较稳定、外源基因的拷贝数比较少,转化效率相对比较高,以及成本较低材料简单等众多优点，因此通常是研究首选方法9。但是,国内科学家在的玉米材料转化实验中发现，农杆菌介导法的可重复性依然很差，而且系统也不稳定。所以在此方面还要继续研究各个影响转化的因素,并且针对这些因素对实验条件进行优化，这样才能将农杆菌转化法变为当前玉米遗传转化研究中最实用、性价比最高的方法10。第2节 抗冷基因2.1 冷害的概念及作用机理最低温度、最适温度和最高温度是植物生长过程中对温度的反应的三基点。植物遭受冷害时，周围环境温度低于最低温度，“膜脂相变”学说在1973年由Lyons提出，表明植物在寒冷期间最先受到伤害的结构是细胞膜11。低温使植物细胞膜相分离和相变，使液晶态变为凝胶态，这是冷害作用的最初机制。当温度骤降、植物周边环境变冷时，由于膜脂具有不对称的特性，无法均匀地收缩，因此发生断裂，细胞内含物质亦会因为膜透性增大产生渗漏，使植物本身因离子平衡失调而受到直接伤害。当温度降低时，膜结构会因膜脂均一的固化产生紧缩，一方面让光合作用和呼吸作用中活跃的代谢酶活性降低，抑制了光合作用和呼吸代谢速率，造成植物体代谢紊乱，降低电子传递途径中细胞色素C途径的效率，使得由线粒体产生并供给植物生命活动的ATP大幅减少，引起细胞的能量短缺，对植株造成间接伤害，并且因为间接伤害有累加性，对植物生命活动的影响将更为明显12；另一方面冷害降低了植物根细胞吸收水分和溶质的能力，因根系吸水困难而造成生理干旱13。综上所述的直接伤害、间接伤害及生理干旱在程度严重时都会造成植株的萎蔫、生长停滞甚至最终导致植株死亡14。最后导致的结果就是作物生长严重受损并造成粮食减产，使农民的利益遭受巨大的损害15,16。2.2 类受体激酶RLK植物在生长过程中需要面对温度，营养条件，光照变化，以及暴露于病原体和其他不良环境等各种外界的挑战（Morris和Walker，2003）。受体位于细胞表面，通过感知并处理从外界和其他细胞接受到的的信号在所有生物体中都发挥着重要的作用17。类受体激酶（RLK）是信号蛋白，其与信号肽，配体结合细胞外结构域跨膜区和细胞质-激酶结构域享有共同的结构。1990年人类从玉米中鉴定出了第一个RLK（Walker和Zhang，1990）。随后，从20多种植物物种中克隆了多种RLK。对一些特定的RLK基因的功能研究，例如ERECTA（Torii等人，1996），CLAVATA1（Clark，2000），BRI1（Schumacher和Chory，2000），S-基因座受体激酶（McCubbin和Kao，2000）和Xa21（Song等人，1995）显示出RLKs参与了植物生理活动中的不同过程，包括激素感知，细胞分化，植物生长和发育等18。2.3 抗冷基因ZmRLK抗冷基因ZmRLK19作为类受体蛋白激酶定位在细胞的质膜上，这一类类受体蛋白激酶均由胞外LRR结构域、跨膜域和胞内激酶域三个部分组成20。目前，人类已对LRR-RLKs进行了比较深入的研究，在植物中LRR-RLKs存在范围非常广，在单子叶和双子叶植物中均得到了普遍表达，并已经可以通过克隆从多种常见的植物中提取获得。它已经在多种植物中进行了功能验证。科学家经研究发现，植物细胞内蛋白间的互作需要RLK的参与，其在植物细胞分子识别的过程中，在胁迫应答、DNA修复和RNA加工、抗逆防御、细胞发育、信号感知和传递、细胞粘连等一系列过程中发挥着重要的作用21-24。 当植物遭遇到逆境胁迫时，跨膜信号传递过程是通过胞外LRR结构域感知识别并跨膜域完成的，使得胞内激酶域能够做出相应的应答反应25。Xing等人通过对LRR-RLK基因PdERECTA进行功能验证实验，发现所得到的过表达拟南芥植株与野生型拟南芥相比，能够好地利用水分避免生理干旱对自身产生影响26。烟草中LRR-RLK的两个基因NtLRR1、NtLRR2提高了植株对盐胁迫的耐受能力27。Sang-Choon Lee等人发现，低温和盐胁迫可以诱导水稻中OsRLK1基因的表达28,29。以上这些都是LRR-RLKs在植物应答外界环境带来的逆境胁迫的过程中发挥着重要调控作用的证明，表现了其在植物生理活动调控中不可或缺的地位。人类也通过克隆在玉米中获得了许多LRR-RLKs家族基因，获得了大量能耐受各种逆境胁迫坏境的玉米新种质30。第3节 Hi-II材料优点在众多曾被用于遗传转化实验的玉米材料中，玉米杂交品种Hi-不仅在农杆菌介导中拥有较高的遗传转化效率，它的幼胚还拥有极高的型愈伤组织组织发生率，因此Hi-玉米幼胚受体材料在转基因育种当中成为一种广受欢迎并被广泛应用的材料31。但是从当前已知的大量农杆菌介导的转基因育种试验数据中我们可以发现，在当前所掌握的遗传转化体系中，遗传育种的效率并不高，尤其是育种过程中的幼苗的生根效率、体细胞胚的诱导率和遗传转化效率需要得到进一步提高。因此对Hi-玉米阳性愈伤组织再生体系进行优化、以提高农杆菌介导的Hi-玉米自交系的遗传转化效率，是非常重要的，这直接关系到转基因育种的成品数量，对于提高转基因育种效率有着极大的意义32。第4节 研究意义随着人类对玉米需求量的不断提高，选育出对环境具有更高适应能力并且高产的优良玉米材料成为当前的热门研究方向。影响植物生长发育及产量的非生物胁迫元素众多，如低温冷害、干旱缺水、高盐等逆境都可导致植物生长受阻，作物减产。而在我国作为玉米主要产区的东北地区，遭受冷害时受到的影响也是相当巨大的。本实验通过将抗冷基因ZmRLK导入了玉米Hi-II自交系，培育抗冷新材料，得到了玉米新种质，为作物冷害减产问题提供了新的解决方法30,33,34。第1章 材料与方法第1节 实验材料1.1 玉米材料玉米（Zea mays L.）自交系Hi-II，由吉林大学基础生物系实验室提供。1.2 仪器、试剂仪器：移液枪、分析天平、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、PCR仪、电泳仪、高速离心机、恒温培养箱、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳仪、冰箱、高速打磨机、电磁炉、电热恒温水浴锅。试剂：天门冬氨酸、蔗糖、L-脯氨酸、乙酰丁香酮（AS）、琼脂、液氮、无菌水、75%乙醇、氯仿、Ex Taq酶、CTAB、异戊醇、DL2000 Marker、酸水解酪蛋白、甘露醇、利福平等。1.3 培养基Hi-II继代培养基（PH=5.8-6.0）（1L）：叶酸1mg、VC 67.5mg、MS有机5mL、铁盐5mL、N6微量5mL、N6大量50mL、2,4-D 2mg、L-脯氨酸0.7g、酸水解酪蛋白0.4g 、天门冬氨酸0.2g、琼脂8g、蔗糖30g。Hi-II分化培养基（PH=5.8-6.0）（1L）：叶酸1mg/L、VC 67.5mg、N6大量25mL、MS有机2.5mL、铁盐2.5mL、N6微量2.5mL、L-脯氨酸0.35g、酸水解酪蛋白0.2g、天门冬氨酸0.1g、琼脂6g、蔗糖15g。侵染用重悬液（使用前加AS）（pH=5.5）（1L）：L-脯氨酸0.7g、酸水解酪蛋白0.4g、MS有机5mL、铁盐5mL、N6微量5mL、N6大量50mL、天门冬氨酸0.2g、蔗糖30g。第2节 实验方法2.1 胚性愈伤组织的获得2.1.1 挑取玉米幼胚取授粉后12-14天且健康生长的Hi-II玉米自交系果穗（表面没有病虫害，且每穗玉米籽粒数量应该大于一百粒），用浓度为75%的乙醇对玉米果穗进行消毒并剥离苞叶，切去果穗头部的花丝及无籽粒生长的幼嫩部分，并使用酒精对剪切处进行消毒。整个过程应该一直保持果穗向下倾斜，以避免酒精倒流入籽粒区域造成污染，在操作时应注意双手尽量不要碰到果穗以免造成污染。用在酒精灯外焰上灼烧消毒后降至室温的手术刀小心地削去玉米籽粒顶部2/3的胚乳直至可隐约见到其中的白色幼胚。此过程中要注意削去部分过多会伤害到其中的幼胚，而削去部分过少将对挑取幼胚造成困难。2.1.2 培养胚性愈伤组织小心地从胚乳中挑出长度约为0.8-2.0mm的白色幼胚，使其盾面向上接种于预培养基中进行培养。每平皿（9cm的玻璃培养皿）接种幼胚60个左右35。在约20天的培养后，获得生长状态良好的初级愈伤组织，将其转移至继代培养基上进行继代培养。经观察发现，Hi-II玉米幼胚具有极高的愈伤诱导率，是一种非常优秀的实验材料。并且在继代时可以通过切割增加愈伤组织的数量，同时还可以通过切除弃去状态不佳的部分来调整愈伤组织的生长状态。将具白色致密硬质结构的I型愈伤组织剔除后，剩下的II型愈伤组织不仅松散易碎呈颗粒状，颜色白而透明，并且生长较快再生能力强，仍然拥有活跃的胚性36。经3次继代培养后得到的胚型愈伤组织结构松散呈颗粒状，颜色白而半透明，且生长状况良好，适宜使用农杆菌介导法进行侵染。2.2 农杆菌的制备从80冰箱中取出状态良好且含有目的基因RLK的农杆菌，通过平板划线法将其接种到事先制备好的YEB固体培养基上，在28条件下活化培养至长起单菌落为止。将挑取得到的单菌落接种到YEB液体培养基中，28，200r/min遮光培养20h，活化农杆菌，出现单菌落。将活化后的单菌落接种到含卡那霉素及利福平的YEB新鲜液体培养基（50ml）中，在28，200r/min的温和条件下避光培养，扩摇至农杆菌生长至活性最强的对数期，时刻取样并使用紫外分光光度计测量菌液分光度，当OD600=0.8-1.0时便立即收集菌体，将收集好的菌体用加了AS的重悬液重悬至OD600=0.5-0.6等待侵染时使用。2.3 农杆菌侵染向重悬好的菌液中放入事先预培养的状态良好的胚性愈伤组织，经梯度实验对比优化可知为使转化率最高，应将侵染条件控制在农杆菌菌液经紫外分光光度计测量得OD600=0.55，AS浓度为100mol/L，在28恒温摇床中150 rpm振荡侵染25min。在侵染过程结束后小心将菌液弃去，取出锥形瓶中侵染后的胚性愈伤组织并平铺在经高温消毒后干燥的滤纸上，仔细地吸干胚性愈伤组织表面的菌液，为避免感染，让其在超净工作台中风干至胚性愈伤组织的表面无明显的菌液残留为止（约30min）。将胚性愈伤组织接种到铺有事先剪好的圆形灭菌滤纸的共培养基上，在25条件下暗培养3天,如图2.1。图2.1 共培养基上的Hi-II材料Fig.2.1 The Hi-II material on the co-culture medium2.4 恢复培养及抗性愈伤筛选暗培养3天后将胚性愈伤组织转至恢复培养基继续培养，经多10天左右的培养后会形成初级愈伤组织，开始对愈伤组织进行进一步的继代培养，置于散光条件下控制环境温度为25，每15天继代一次，并在此期间多次使用添加了浓度为3mg/L双丙氨膦的培养基对材料进行筛选。在筛选途中可以发现，有大量胚性愈伤组织的生长受到抑制，并开始逐渐褐化死亡。而剩余的部分幼胚仍然生长状况良好，且转化出的球泡状初级愈伤组织呈浅白色。经约2周的筛选培养后，可发现大批材料已完全褐化死亡，将死亡的非转化胚性愈伤组织弃去后对形成的初级愈伤组织小心地进行继代培养。在大约三代的继代培养后可得到稳定的侵染后胚性愈伤组织，如图2.2。图2.2 侵染后的稳定Hi-II胚性愈伤组织Fig.2.2 Stable Hi-II Embryogenic Callus after Infection2.5 分化出苗与生根将侵染后得到的胚性愈伤组织接种到添加了适当激素的分化培养基中，置于光照条件下进行分化培养，每25天对材料进行一次继代，并在继代时注意切除生长状况不佳的愈伤组织，并可将大块的材料分割为适宜大小的若干小块以增加材料的总量。由于Hi-II玉米胚性愈伤组织具有极强的生根性，因此为避免其生芽分化受到影响，需要经常继代以切除疯狂生长的根，并保留分化出的幼嫩芽，见图2.3。待分化出的苗长至3-4cm后转入生根培养基内使其生根，在这过程中可以通过分苗将生长密集的一簇苗分为若干植株以增加材料数量。当再生植株生长至瓶口，高度约为7-10cm，根系旺盛且有侧根时，对其进行PCR检测找出符合条件的阳性植株,见图2.4。图2.3 分化中的Hi-II胚性愈伤组织Fig.2.3 Differentiation of Hi-II Embryogenic Calli图2.4 待检测抗性植株Fig.2.4 To be tested for regenerated plants2.6 CTAB 法提取玉米叶片DNA （1）首先将消毒后的研钵和研磨棒通过液氮进行预冷，将待测玉米叶片置于加入了液氮的研钵中，在防护措施完全的情况下将样品叶片小心地研磨成粉末。（2）将粉末装入事先消毒准备好的离心管中，并向每个离心管内加入已事先预热好的2CTAB提取液600l，在管盖上做好标记后，剧烈振荡使管内材料充分混匀。 （3）将编好号的离心管放入65水浴锅中恒温水浴1h，为保证管内材料得到充分裂解，应做好计时工作，保证在此期间每隔10-15 min都将离心管取出然后轻轻地颠倒混匀，注意这个过程中动作不可以过于剧烈。（4）从水浴锅取出后加入氯仿：异戊醇（24:1）混合液600L，重新将每管材料都颠倒并混匀后，置于室温条件下静置5min。 （5）将离心管置于高速离心机内离心10min，控制转速为12000rpm，使溶液分为肉眼可见的三层。用剪去尖端并消毒过的枪头慢慢吸取上清液，在此过程中应注意不要吸取到下层液体造成污染。将上清液小心地转移至新的离心管中，管内剩余的液体倒入废液缸。 （6）加入氯仿：异戊醇（24:1）混合液500l，将每管材料都颠倒混匀后，将其置于室温条件下静置5min。 （7）在高速离心机内以12000rpm的转速离心10 min。用剪过的枪头小心地吸取管中上清液，注意不要吸到下层液体影响实验。将上清液转移至消毒过的新离心管中，剩余液体倒入废液缸。（8）取出冰箱中已事先预冷的的无水乙醇，向每个离心管中加入500l无水乙醇，慢慢将离心管中液体颠倒混匀，放入-20冰箱中冷冻保存1-2h。 （9）取出冰箱中冷冻保存的样品材料，将离心管放入离心机中离心10 min，控制转速为12000rpm，弃去管中的上清液，细心观察可以看到离心管管底有少量DNA。（10）使用1mL75%的无水乙醇对离心管底沉淀进行洗涤，经两次洗涤后将离心管倒置于洁净的干燥滤纸上，将其彻底晾干。 （11）加入30-50L含有RNAase A的dd H2O，37培养箱温育60min，待DNA充分溶解在其中后将离心管置于-20冰箱中保存，等待分子检测。2.7 分子检测以提取的玉米转化再生苗叶片基因组DNA为模板，对所得的全部转化植株进行DNA分子检测。为了确保分子检测的精确，设计ZmRLK基因全长引物，对阳性苗进行筛选。PCR检测引物序列，PCR反应体系以及PCR反应程序参照表 2.5，2.6，2.7。 引物名称 寡核苷酸序列 ZmRLK-F 5-CGGGATCCCAAGGCATTGGGAACCTGAGA-3 ZmRLK-R 5-AACTGCAGCGAATTGAAGCCCCTATACGA-3表2.5 PCR检测引物序列Table.2.5 PCR was used to detect primer sequences 成分 用量 Ex Taq酶 12.5L 上游引物 0.5L 下游引物 0.5L ddH2O 9.5L 模板DNA 2L 总计 25L表2.6 PCR反应体系Table.2.6 PCR reaction system 程序及时间 循环数 预变性95，5min 1 变性95，30s 退火62，30s 40 延伸72，50s 延伸72，10min 1 4保存，Forever表2.7 PCR反应程序Table.2.7 PCR reaction procedure2.8 炼苗与移栽当分化苗根系发达，且植株高度不再适合在培养基中生长时，对其进行炼苗。开盖后先向培养瓶中倒入一层适宜高度的无菌水。若经过7天的炼苗后再生苗未死亡，则将再生苗小心地移出培养基，去除长势不佳的发黄枯死叶片，保留长势良好的鲜嫩叶片，洗净根系上残留的部分培养基，移栽到事先配好土、湿度适宜的花盆中。若根系上有培养基残留，将易导致细菌生长造成污染。待幼苗长出新芽，且生长健壮，长至一定高度可适应外界不断变化的自然环境后再将其移栽至大田。第3节 结果分析使用PCR仪对获得的大量抗性玉米植株进行分子检测，即进行ZmRLK全长的检测，获得含有目的基因ZmRLK全长的阳性植株。以玉米自交系Hi-II胚性愈伤组织为受体，农杆菌侵染500个胚性愈伤组织，使用浓度为3mg/L的双丙氨膦进行筛选后，得到102株分化苗，PCR检测获得3株阳性转化植株，转化率为2.9%。检测电泳图见图3.1，实验结果见表3.2.图3.1 部分转基因植株ZmRLK全长检测电泳图 注： M：DL2000 Marker 1-6:待检测样品 7：空白对照（水）； 8：阳性对照（质粒）Fig.3.1 Partial transgenic plants ZmRLK full - length detection electrophoresisM：DL2000 Marker 1-4:Sample to be tested 5:Blank control (water) 6:Positive control (plasmid)幼胚数量 胚性愈伤组织 再生植株 阳性转化植株 转化率500 800 102 3 2.9%表3.2 玉米转化各过程数据统计Table.3.2 Table of data for each process of maize conversion第4节 讨论胚性愈伤组织和幼胚在玉米的遗传转化实验中都是极好的受体材料。其中幼胚活性强生长旺盛，分化率和诱导率高。而胚性愈伤组织有I型和II型两种形态，呈白色致密结构的I型生长状态不佳不宜作为受体材料，而结构松散易碎呈颗粒状的II型胚性愈伤组织生长较快再生能力强，且能保持活跃的胚性，是进行遗传转化的极佳材料。避免染菌在整个植物组织培养流程中具有极重要的意义。在整个实验流程中，应该保证全程均在无菌条件下进行，避免杂菌侵染引起材料污染，是对最后能得到理想的实验结果的重要条件。从挑取幼胚开始，包括实验途中的一系列继代等操作都需要在经紫外线灭菌处理后的无菌操作台中进行，使用的工具和仪器均需要事先经过高压蒸汽灭菌处理或紫外线灭菌处理。而在使用农杆菌菌液对材料进行侵染时，最后弃去菌液晾干侵染后的玉米胚性愈伤组织这个步骤也尤其重要。因为根据过往的经验，如果在这个步骤上处理得不够谨慎，比如未能将胚性愈伤组织表面残留的菌液擦干，使农杆菌被带入共培养基，在暗培养3天后将会发现整个培养皿被农杆菌严重污染，所有侵染得到的材料都无法使用，不得不将其弃去。而在接下来的分化过程中，培养基封口膜破裂、继代时操作不当等都会导致培养基染菌。本研究中就遇到了大量的这种情况，因为未能在学习和实验之间掌握好平衡，结果在理应花大量时间对材料进行继代和生长状况调整时投入不够，致使材料生长状况不佳且大量染菌死亡。虽然在染菌情况发生后采取了补救措施开始向培养基添加适量浓度的头孢抑菌，以及将已染菌植株在专用的无菌操作台中使用高浓度头孢溶液涮苗挽救，但仍有大批材料因此而死亡。这也就是实验最初的大批幼胚与最后所得植株数量差异悬殊的原因。因此未来进行实验时应更为注意在操作环境以及操作步骤上避免杂菌污染，尽可能地避免因为人为因素造成材料的大量损失。并且还应合理规划好实验的流程及投入的精力，以免因为现实的各种因素而对实验的进程造成不可挽回的影响。Hi-II玉米自交系具有极强的生根能力，在进行生芽分化时会生出大量根争夺营养，因此在这期间需要耗费大量精力将分化生成的根切除以促进芽的生成。且在继代时进行分芽，可以有效增加材料的数量，以增加转化苗的再生率，以求得到更多的转基因阳性植株。实验中为了克服侵染幼胚数量受限的弊端，增加获得的抗性植株数量，通过将幼胚诱导为愈伤组织的方法，在愈伤途中不断进行继代扩繁，获得了大量的胚性愈伤组织，以增大侵染基数，虽然并未提高转化概率，但是随着基数扩大提高了转基因事件总数，以获得数量更多的目的植株。结论本研究以玉米自交系Hi-II胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法侵染500个胚性愈伤组织，经浓度为3mg/L的双丙氨膦进行筛选后，得到102株分化苗，经PCR检测获得3株阳性转化植株，转化率为2.9%。致谢转眼已进入毕业季，可以说当我的大学生活已经进入尾声了。在吉林大学四年的大学生活中，带给我收获最大的便是在基础生物系实验室度过的那段时光了。正是那段天天沉浸于实验中的生活让我的大学生活更加有意义，使我的实验技能、基础知识水平乃至和他人共同工作的能力都得到了提高。在此我要首先感谢我的指导教师吴颖教授，正是她慷慨地给了我这个进入实验室实习的机会，并给了我无微不至的关心与指导，当我在实验中遇到问题时，她都能够悉心地给我一一解答，消除我的疑惑，使我能够顺利地完成真个实验流程。吴颖教授踏实敬业的精神也使我深受感触，并决心以她为目标，努力在学术道路上走出自己的一条路。同时我也要感谢以李倩师姐为首的实验室里的师兄师姐们，当老师忙于教学工作时，正是她们亲切地为我指点迷津，手把手地传授了我在实验室里工作学习所需要的知识，让我能够顺利地完成实验，使我受益良多。同时我的组员们也是我共同前进的伙伴，正视我们之间的互相帮助，才能在繁忙的学习生活中兼顾实验室里繁杂的操作，不至于因为无法兼顾两方而寸步难行。正是我们之间的团结协作，才是我们能够共同进步并最终取得成果。最后我要感谢的是这四年来亲切地包容了我，并给我提供了诸多机会的母校吉林大学。可以说没有进入吉林大学的话我是不可能顺利完成上述的诸多试验流程的，也不可能会遇到这么多对我有诸多帮助的人。16参考文献1Shou HX,Bronwyn RF,Steven AW,etal.Assessmentoftransgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium-mediated transformation.Molecular Breeding,2004,(13):201-208.2李海霞农杆菌介导的玉米遗传转化的优化和抗蚜虫的转化研究D河南郑州:河南农业大学，2010.3葛振林，朱春权，黄建峰.玉米转基因育种研究进展.北京农业 2011年1月下旬刊.（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325027）.4熊换英，钟伟光，张寿文.农杆菌介导的植物遗传转化影响因素研究进展. 安徽农业科学.2012.40(17):9214-9217,9287.5张荣，王国英，张晓红，等.根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立.农业生物技术学报,2001,19(1):4548.6Huang XQ, Wei ZM. High-frequency plant regeneration through callus initiation from mature embryos of maize(Zea Mays L.).Plant Cell Rep,2004,22(11):793-800.7史庆玲.玉米转基因方法研究进展.生物技术进展 2011年第1卷第3期 178183.（中国农业大学资源与环境学院，北京 100193）8孙传波，郭嘉，陶蕊，李海华，邢少辰，袁英.农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究.中国农学通报 2012,28(36):71-75.（吉林省农业科学院生物技术研究中心，长春 130033）9张素芝，荣廷昭.农杆菌介导的玉米遗传转化系统研究进展J.HEREDITAS 2008,30(10):1249-1256.10郭海军.玉米转基因技术的研究.辽宁师范大学硕士学位论文，201011温万里.黑龙江省常用玉米自交系抗冷性鉴定及生理生化机制研究.东北农业大学硕士学位论文12孟英，李明，王连敏，等.低温冷害对玉米生长影响及相关研究J. 黑龙江农业科学，2009 (4): 150-153.13Aroca R,Vernieri P,Irigoyen J J,et al.Involvement of abscisic acid in leaf and root of maize (Zea mays L.) in avoiding chillinginduced wate stress.Plant Science,2003,165(3):671-67914温万里,郑颖坤,艾莉,刘洪亮,孔伟庆,艾佳,杨德光,张志武.玉米抗冷性研究进展.作物杂志 Crops 2014.4.( 东北农业大学农学院，150030，黑龙江哈尔滨)15杨光，刘宏魁，李世鹏，等.玉米抗冷种质资源的筛选与鉴定玉米科学J. 2012,20(1): 57-60,66.16刘忠丽，陈维榕，丁忠尧，高冬冬.植物抗冷性国内外的研究现状。（1.贵州农业科技信息研究所，贵州贵阳 550006;2.毕节市烟草公司纳雍分公司，贵州纳雍 553300）17宋爽，赵弘巍，曹俊然，方琳，王宁宁.大豆叶片衰老相关的类受体蛋白激酶的研究.(南开大学生命科学学院生化与分子生物学系,天津300071)18Peng Liu, Wei Wei, Shouqiang Ouyang, Jin-Song Zhang, Shou-Yi Chen,Wan-Ke Zhang.Analysis of expressed receptor-like kinases (RLKs) in soybean.Journal of Genetics and Genomics 36 (2009) 61161919杨光，玉米苗期冷响应分子机理的研究D.吉林大学博士论文, 2010.20STONE J M, WALKER J C. Plant Protein Kinase Families and Signal Transduction J. Plant Phys