毕业论文--抗冷基因RLK转化玉米自交系H99的研究.docx

吉林大学学士学位论文（设计）承诺书 本人郑重承诺：所呈交的学士学位毕业论文（设计），是本人在指导教师的指导下，独立进行实验、设计、调研等工作基础上取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本人实验或设计中做出重要贡献的个人或集体，均已在文中以明确的方式注明。本人完全意识到本承诺书的法律结果由本人承担。 承诺人 年 月 日中文摘要玉米是当今世界一种重要的粮食、饲料和工业原料作物。利用生物技术创造的玉米新材料与人们的生活息息相关。我国东北地区农业气象灾害中低温胁迫问题还较为严重并有待解决，若在玉米生长季节受到低温冷害则会对玉米质量和产量造成影响。近年来，国内外许多科研工作者都在从事抗冷玉米遗传转化的研究，其中农杆菌介导法在玉米遗传转化体系方面取得了巨大的成果。玉米抗冷基因ZmRLK是高等植物中一类定位在质膜上的类受体蛋白激酶（receptor-likeprotein kinase，RLK）。基因全长由2028bp核苷酸序列组成，编码675个氨基酸。能参与植物细胞内的蛋白互作，在抗逆防御、胁迫应答、信号感知和传递等过程中发挥重要作用。本研究以玉米优良自交系H99胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法将抗冷基因RLK转入玉米，共侵染800块玉米愈伤组织，经双丙氨膦筛选后进行器官的分化,最终成苗450株，分子检测获得含有Bar基因阳性植株24株，阳性率5.3%，目的基因RLK基因表达阳性植株10株，阳性率2.2%。 本研究利用基因工程将抗逆基因转入玉米优良自交系，减少损害，使后代具有抵抗逆境的能力，从而更深入地研究各种调控因素玉米在生长发育中的影响，培育出适应环境的抗冷玉米新种质，为提高玉米抗冷性能奠定实验基础。关键词：玉米；抗冷基因RLK；胚性愈伤组织；农杆菌介导法IAbstract Zea mays is a kind of important grain, feed and industrial raw material crop in the world today. Peoples lives are closely related to the use of biotechnology to create new corn materials. The problem of low temperature stress in agrometeorological disasters in northeastern China is still serious and remains to be solved. During the growing season, if the chilling injury in maize is affected by low temperature , the quality and yield of maize will be affected. In recent years, many scientific research workers at home and abroad are engaged in the transformation of cold maize genetic research, in which Agrobacterium-mediated transformation of maize genetic transformation system has made great achievements. Maize cold-resistant gene ZmRLK is a class of receptor-like protein kinase (RLK) located in the plasma membrane. The full length of the gene consists of 2028bp nucleotide sequence encoding 675 amino acids. The gene can participate in plant cell protein interaction, and plays an important role in the anti-stress defense, stress response, signal perception and transmission process. In this research, we used the H99 embryogenic callus of maize inbred line as the recipient, and the cold resistance gene ZmRLK was transferred into maize by Agrobacterium tumefaciens, and 800 maize calli were infected. Screened by dipropylamine, 450 strains were harvested after organ differentiation. The results showed that the transformation of Bar gene got 24 strains of positive plants, and the positive rate of 5.3%. The target gene RLK gene transformation got 10 positive plants, the positive rate of 2.2%. Using transgenic technology to transfer the resistance gene IIto maize elite inbred lines, could reduce damage and make the offspring have the ability to resist adversity, so as to study the influence of various regulating factors on the growth and development of maize, cultivate the new germplasm of maize and to lay a solid experimental foundation for improving the cold resistance of maize.Keywords：Maize；cold resistance gene RLK；Embryogenic callus；Agrobacterium-mediated methodIV目 录前言1 第1节 抗冷基因的研究进展1 1.1冷害的类型1 1.2冷害对玉米生产的影响1 1.3关于抗冷基因1 第2节 农杆菌介导法及转化检测方法简介2 第3节 玉米转化的受体材料概述3 第4节 研究内容和意义4第1章 玉米受体材料的获得 5第1节 相关材料5 1.1 植物材料5 1.2 实验药品5 1.3 实验仪器5 1.4 主要培养基5 第2节 实验方法6 2.1 胚性愈伤组织的诱导6第2章 农杆菌侵染玉米胚性愈伤组织7 第1节 相关材料7 1.1 实验仪器7 1.2 相关试剂7 第2节 实验方法7 2.1 农杆菌侵染液的制备72.2 农杆菌侵染玉米自交系H99胚性愈伤组织7 2.3 抗性愈伤组织的筛选及分化8第3章 分子检测10第1节 相关材料10 1.1 实验仪器10 1.2 相关试剂10 第2节 实验方法102.1 转化苗DNA的提取102.2 PCR分子检测11第3节 结果分析12 第4节 讨论14结论15致谢16参考文献17前 言第 1节 抗冷基因的研究进展1.1冷害的类型根据低温程度以及植物所受到的伤害，可将低温逆境分为冷害(chilling injury)和冻害(freezing injury)两种1。冷害是指冰点以上低温对植物造成的伤害，而冻害是指冰点以下的低温引起细胞内的水分发生冻结所造成的伤害2。冷害分为三种类型：第一是延迟型冷害。是指作物生长期内，温度长期偏低，热量供应不足，植物光合作用受阻。尤其是东北地区，作物生长发育较为缓慢，生育期拖后，导致在正常时节作物不能成熟影响产量3。 第二是障碍型冷害。是指作物在孕穗、抽穗、开花等生殖生长的关键时期，外界气温短时间内明显低于生物学正常指标下线，使作物的生殖器官生理功能受到严重破坏，致使种子不饱满成熟受阻的一种冷害4。第三是混合型冷害。指延迟型冷害和障碍型冷害在同一生长季节或一年中同时出现，这种冷害会给作物的整个生长发育过程带来更为严重的损害，同时使农业造成大幅减产。1.2冷害对玉米生产的影响 玉米生长发育的不同发展阶段遇低温会产生不同的效果，如果低温时间过长，就会造成对其细胞和组织造成不可逆的损害。玉米播种后的一段时间内遇低温会有出苗延迟，苗弱，低发芽率和叶片功能造成巨大的障碍。在四叶期植株表现出生长缓慢，有效叶面积显著降低削弱了光合能力；到成熟期，低温影响植物的高度，厚度，叶面积和单株干物质的重量，将导致有效积温不够，授粉困难，结实期干物质积累减少致使玉米产量下降5。1.3关于抗冷基因植物冷诱导基因在特定环境条件（主要为低温和短日照）下才得以启动表达，是一种诱发基因，进而使细胞表现出抗冷性状6。在低温诱导蛋白中,其中一些蛋白可能直接与提高植物的抗冷能力相关，且抗冷植物比冷敏感植物具有更强的抗氧化性。近年来，随着基因工程的发展，科研工作者们对植物的抗冷性机理进行了深入的研究7，克隆了许多抗冷性相关的基因，并将这些抗冷相关基因应用于各种实验，意识到低温胁迫是影响作物正常生长的主要障碍之一。植物体在干旱、低温及高盐等逆境胁迫下会接受且转导逆境胁迫信号，启动植物对逆境胁迫的响应机制，引起相关植物尤其是经济作物的抗冷性强弱直接影响作物生长，同时特定功能基因可对逆境胁迫做出各类适应性反应8。植物蛋白激酶在信号转导中起着重要作用，当其受到信号刺激蛋白激酶即开始磷酸化，促使信号转导通路的开启；当信号消失蛋白激酶又会去磷酸化，促使信号转导通路关闭9。植物类受体蛋白激酶RLK(Receptor protein kinase)位于细胞膜上，包括胞外结合域、跨膜域和胞内激酶域三部分10。胞外结合域主要是识别和接受外界信号；跨膜结构域将胞内和胞外结构域连接并将蛋白进行绑定，使信号可以从胞外传递到胞内；胞内激酶域是核心功能部分，激活胞内的级联反应11。RLK作为信号分子的受体，能够感受外界刺激引起的信号，并通过磷酸化和去磷酸化作用开启或关闭下游的靶蛋白, 从而在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。第2节 农杆菌介导法及转化检测方法简介 农杆菌介导法是目前植物转基因的常用方法12。在根癌农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，Ti质粒的T-DNA可以被转移至植物细胞并插入染色体基因中13。Grimsly等用农杆菌将玉米条纹病毒的cDNA转入玉米染色体DNA中14，植株表现出系统感染的症状，直接证明了农杆菌能侵染玉米基因组15。 农杆菌侵染液浓度、整个实验的侵染时间和共培养时间是影响植物遗传转化效率的关键因素16。合适的农杆菌侵染浓度、侵染时间及共培养时间不仅可以降低农杆菌对过度敏感受体材料的毒害作用，而且可以减少组织培养后期过程中农杆菌的过度污染17。上述几种要素对转化率会产生影响的主要原因：植物受体材料的每个细胞只有结合一定数量的细菌的能力，过量菌体会导致受体材料的生存能力降低；侵染时间过长会使农杆菌受到缺氧毒害而变软腐，但使用少量农杆菌菌体和过短的侵染时间又不能达到较好的侵染效果，降低转化率；共培养时间过长则会加速抗生素的消耗，从而降低它的抑制作用，会造成农杆菌过度繁殖，使材料染菌；而时间过短农杆菌又不能与受体植物材料细胞很好的结合。关于转化率的研究中由于所选用的农杆菌菌株、受体材料等的不同，最佳农杆菌侵染液浓度、侵染时间及共培养时间长短还没有一致的结论18。转化植株可以从三个方面进行检测，分别是基因整合水平、转录水平和翻译水平。其中最广泛且最基本的技术之一是运用PCR技术来检测。一旦设计好具有特异性的引物，就能很快的扩增出想要的目的基因。有目的条带的阳性植株就能够初步确定19。虽然PCR技术广泛用于转基因检测，操作非常方便，但是假阳性率高，很多因素都会影响检测结果，所以这项技术只能作为检测的最初根据20。如果对象是阳性植株，PCR检测技术就可以进一步的验证判断目的基因是否已经整合到受体细胞内，并且可以确定出整合后目的基因的拷贝数21。Southern杂交技术是通过两条单链杂合成双链DNA，以已知链为探针，从而检测外源DNA是否存在。用限制性内切酶切割DNA，把DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离，最后转移到硝酸纤维素膜上使之与探针杂交，就可以将目的基因整合到基因组中22。虽然Southern杂交的准确率高，但是需要很高的成本，步骤比较复杂，且方法比较难掌握23。Northern杂交是一种可以从转录水平上检测外源基因的技术，其原理是将RNA与探针在膜上进行杂交。通过Northern杂交能够确定外源基因是否在受体细胞内被转录。与基因芯片实验相比Northern杂交的灵敏度比较高，与PCR相比Northern杂交可以有效降低实验的假阳性24。Western杂交是从翻译水平检测遗传转化结果，通过Western杂交能够确定外源基因是否能在受体细胞内整合并且被翻译成蛋白质，使基因能够发挥功能25。第3节 玉米转化的受体材料概述具有强烈的细胞分裂和DNA复制能力是转基因T-DNA整合过程所必需的，尽管来源、发育状态和基因型不同的玉米受体材料对农杆菌的敏感性也不同26。在育种研究中，农杆菌转化法适用的进行玉米转化受体材料有多种，如幼胚、成熟胚、I型愈伤组织、型愈伤组织、悬浮细胞系、原生质体、茎尖等部位27。原生质体是最早用于玉米遗传转化的受体材料，该方法主要通过改变细胞膜通透性，使目的基因转入细胞内，使其整合到基因组，从而实现表达。使用这种受体虽然操作简便，转化频率高，嵌合体少等优点，但遗传稳定性差，培养周期长且受基因型限制28，目前并未得到广泛应用。玉米遗传转化受体材料中，幼胚和愈伤组织最为常用，因其进行转化操作简单，植株再生容易。经试验玉米授粉后10-15天，培养幼胚长度至1.0-2.0mm时，再生能力最强也易操作，是良好的遗传转化受体材料。大多数玉米自交系能形成型愈伤组织，这种愈伤松散呈白色，活力差，不易继代且继代后较难再生出植株29；而型愈伤组织生长迅速、颜色鲜黄表面干燥，可以保持良好胚性并长期继代。尽管玉米型愈伤组织的诱导受基因型限制较大，有些不易形成，但由于其愈伤组织再生能力强，获得转化植株的周期相对较短，仍是目前应用最广泛的受体材料之一30。对禾本科植物如玉米来说，农杆菌介导的转化都要经过愈伤组织培养阶段，这会使遗传改变的机率增加。通过器官发生的方式获得遗传转化后再生植株的方法已经在玉米等禾本科植物上取得良好的应用31。第4节 研究内容和意义我国东北地区，昼夜温差大，土地肥沃，非常适合种植玉米，也因此而成为我国玉米的主产区。因此培育出适应环境的抗冷玉米新种质是至关重要的。本研究以玉米自交系H99胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法将抗冷基因ZmRLK转入玉米，为提高玉米抗冷性能奠定实验基础。 随着基因工程技术的发展，研究者们对各种植物的抗冷性机理进行了深入研究，克隆了很多抗冷性有关的基因，对植物遗传转化育种有重要意义。而且植物尤其是经济作物的抗冷性强弱直接影响作物产量，广泛将玉米基因工程技术应用于东北地区及易受冷胁迫地区，可以弥补玉米遗传资源的不足，与常规育种进行结合培育出适应环境的抗冷玉米新种质。第1章 玉米受体材料的获得第1节 相关材料1.1植物材料由基础生物系提供的玉米自交系H99，种植于植物科学学院实验基地。1.2实验药品甘露醇、蔗糖、琼脂、L-脯氨酸、天门冬氨酸、酸水解酪蛋白、利福平、卡那霉素、乙酰丁香酮（AS）、铁盐、叶酸、2,4-D等32。1.3实验仪器超净工作台、高压灭菌锅、烘箱、可控温摇床、高速离心机、水浴锅。1.4主要培养基继代培养基（pH=5.8-6.0）：N6微量、MS有机、铁盐、N6大量、叶酸1mg/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-D 2mg/L、天门冬氨酸0.2g/L、琼脂8g/L、蔗糖30g/L、酸水解酪蛋白0.4g/L、VC 67.5mg/L。 分化培养基（pH=5.8-6.0）：MS有机、N6大量、N6微量、铁盐、酸水解酪蛋白0.2g/L 、蔗糖15g/L、L-脯氨酸0.35g/L、天门冬氨酸0.1g/L、琼脂6g/L，叶酸1mg/L、VC 67.5mg/L。 诱导培养基（pH=5.8-6.0）：N6大量、改良MS有机、铁盐、N6微量、L-脯氨酸0.6 g/L、天门冬氨酸0.2g/L、2,4-D 2 mg/L、蔗糖30g/L、酸水解酪蛋白0.5g/L、肌醇0.1g/L、琼脂6g/L。 共培养培养基（pH=5.8-6.0）：N6大量、N6微量、改良MS有机、铁盐、酸水解酪蛋白0.5g/L、肌醇0.1g/L、叶酸1mg/L、琼脂6g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.4-0.6g/L。 重悬液（使用前加AS）（pH=5.5）：N6微量、N6大量、MS有机、L-脯氨酸0.7g/L、铁盐、 酸水解酪蛋白0.4g/L、天门冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L。 YEP固体培养基（pH=7.0）：氯化钠5g/L、酵母提取物5g/L、琼脂15g/L（YEP液体培养基不添加）、胰蛋白胨10g/L。第2节 实验方法2.1胚性愈伤组织的诱导 取玉米自交系H99的完整果穗，自然环境状态条件下生长经过人工套袋授粉后12-14天，在超净工作台内将苞叶剥开，用75乙醇多次消毒处理，用消毒后的解剖刀从玉米粒中挑出幼胚(直径1-1.5mm)，在预培养基上盾片向上放置，每皿60粒左右。在25条件下遮光暗培养。接种到预培养基上3-5天后，玉米幼胚陆续开始出芽，此时用解剖刀将芽剥离后防止抢夺幼胚营养。将幼胚重新放回诱导培养基中继续增殖培养，注意记录幼胚生长状态和颜色。每15-20天继代一次，继代过程中需避免沾染杂菌。挑选松脆生长迅速型愈伤组织，可以保持胚性并长期继代，3-4代后可进行基因遗传转化实验。（图1）图1 玉米自交系H99幼胚及愈伤组织Fig1 Maize Inbred H99 Immature Embryos and Callus 第2章 农杆菌侵染玉米胚性愈伤组织第1节 相关材料1.1实验仪器超净工作台、可控温摇床、高速低温离心机、分析天平、高温蒸汽灭菌锅、紫外分光光度计。1.2相关试剂 利福平、卡那霉素、YEP培养基（液体、固体）、头孢霉素、乙酰丁香酮（AS）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）。第2节 实验方法2.1农杆菌侵染液的制备（1）在-80冰箱中取出已保存带有目的基因的农杆菌，待其解冻后，用平板划线法在YEP固体培养基上纯化农杆菌以获得单菌落。（2）将培养皿倒置于28恒温培养箱中，培养约28h后用接种针挑取农杆菌单菌落，置于1mLYEP液体培养基（含有抗生素利福平和卡那霉素）中。（3）将装有农杆菌单菌落的离心管放入28恒温摇床中震荡培养14-18h。（4）随后进行PCR分子鉴定，准备好50mLYEP液体培养基（含有利福平和卡那霉素）中，把鉴定正确的菌液放入，再次于摇床内震荡培养14-18h。（5）使用紫外分光光度计测定菌液吸光度，当扩摇至OD600=0.8-0.9便可收集菌体。收集菌体时需将大离心管放在低温高速离心机内收集，使用重悬液（AS 1:1000 重悬液）轻轻吹打后将收集好的呈乳白色的菌体重悬到OD600=0.5-0.6供侵染使用，在此期间需多次测量菌液吸光度为达到最好的侵染效果。2.2农杆菌侵染玉米自交系H99胚性愈伤组织 取继代3至4代的玉米优良自交系H99的胚性愈伤组织，放入备用农杆菌侵染液中，放入恒温摇床28下振荡培养20-25min（本实验室发现农杆菌菌液浓度为OD600=0.55，AS浓度为100mol/L时，有助于提高转化率）。在超净工作台内慢慢倒出农杆菌侵染液，用解剖刀将愈伤均匀散乱平铺于高温灭菌的滤纸上，表面重悬液让其在超净工作台中风干至表面无明显的菌液残留为止（约30分钟），完全晾干后用镊子夹出，每皿放置约30个胚性愈伤，小心平铺于放有圆形滤纸的共培养培养基上，操作期间注意保持无菌环境（图2）。 图2 农杆菌侵染过程及共培养 Fig2 Agrobacterium infection process and co-culture2.3 抗性愈伤组织的筛选及分化共培养期间为暗培养，三天后转入恢复培养基，在恢复培养期间使用浓度为3mg/L的双丙氨膦进行筛选。筛选期间经观察可发现，许多玉米愈伤发生褐化，表现培养基中出现褐色物质，致使培养基和愈伤组织材料逐渐变褐，失去生长活力，最后逐步死亡而被淘汰。这种现象可能是由于植物本身基因型、生理状态、培养过程中外植体发生损伤以及光照、温度、培养时间过长未更换培养基和培养基成分不合理等外因导致。而部分材料不褐化，能逐渐形成疏松易碎浅黄色的初级愈伤组织。在超净工作台内逐渐剔除褐化材料，挑出正常生长的材料放入新培养基继续培养。约2至3周后非转化愈伤褐化死亡，此时便可以进行剩余愈伤组织的继代培养。25恒温散光培养，每15-18天继代一次，期间可继续使用双丙氨膦进行2-3次筛选，注意更换培养基，根据愈伤组织实际情况调整，约三代后可获得稳定继代的玉米胚性愈伤。当获得数量足够且生长健康的愈伤组织后，便可对其进行分化培养。将愈伤组织接种到分化培养基中，25恒定光照条件下进行分化培养，先在生芽培养基（加入500mg/L 6-BA）中培养，再移入生根培养基（加入500mg/L IBA），待成苗到一定高度（约8-10cm）且分化苗根系健康发达时，可进行分子检测（图3）。图3 愈伤组织分化过程及生长状态Fig3 Callus differentiation process and growth status 将鉴定为阳性的再生植株炼苗，炼苗3至5天后，将再生苗轻轻地移出培养基，去除根系上残留的培养基，移栽到花盆中。若根系上有培养基残留，将易导致细菌生长造成污染。生长正常后移栽到田间观察是否有抗逆性，移栽到土壤中时要注意使用土的品质，挑选优质土壤才能保证抗性苗易存活，并要给予合适的光照和水分和基本营养（图4）。 图4 农杆菌侵染玉米胚性愈伤后炼苗和移栽Fig.4 Hardening-seedling and transplanting after Agrobacterium infecting embryogenic callus第3章 分子检测第1节 相关材料1.1实验仪器高速离心机、高速打磨机、冰箱、电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、PCR扩增仪、微波炉等。1.2相关试剂CTAB、氯仿、75%乙醇、ddH2O、RNase、无水乙醇。第2节 实验方法2.1 转化苗的DNA提取（1）将各培养瓶中的玉米苗编号，剪取约1cm的叶片（不要破坏叶脉）和打磨用小钢珠放入1.5mL离心管中，标注号码。（2）向每个离心管加入600-700L的CTAB（预热至65），放入高速打磨机研磨3min。（3）打磨后将离心管放入65恒温水浴锅水浴加热1h，每10min翻动一次使其充分混匀裂解，1h后室温冷却2min。（4）向每个离心管中加入600L氯仿，轻轻颠倒翻动混匀，室温静置5min后按顺序放入离心机离心（12000rpm，10min）。（5）取新离心管，重新标号，使用剪6-8mm的黄枪头小心吸取离心后的上清液至新离心管中，注意枪头内不要吸取到下层液体影响实验。将上清液转移至消毒过的新离心管中，剩余液体倒入废液缸。（6）重复步骤4-5。（7）向离心管内加入预冷的无水乙醇在-20冰箱放置1h。（8）醇沉后离心（12000rpm，10min），倒上清液。（9）加入1mL75%乙醇。将每个离心管上下翻转颠倒两次，室温静置5min，高速离心机12000rpm离心10min，弃去上清液后再次加入1mL75%乙醇进行离心。（10）洗过两次后倒掉乙醇，注意不要将絮状DNA倒出，放在滤纸上倒置离心管晾干（约30min），可看到絮状沉淀。（11）向每个离心管加入ddH2O 50L（RNase 1L），37烘箱内放置1h。（12）将提取好的DNA放入-20冰箱，储藏备用。2.2 PCR分子检测 以再生苗叶片DNA为模板对其进行PCR分子检测。结合引物Bar-F、Bar-R 和ZmRLK全长基因引物进行PCR扩增。以质粒作为阳性对照，ddH2O作为空白对照。表1 PCR检测引物序列Table1 The primer sequence of PCR detection 引物名称 寡核苷酸序列 Bar-F 5-GTCTGCACCATCGTCAACC-3Bar-R 5-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3ZmRLK-F 5-CGGGATCCCAAGGCATTGGGAACCTGAGA-3ZmRLK-R 5-AACTGCAGCGAATTGAAGCCCCTATACGA-3表2 PCR反应体系及程序Table2 The PCR reaction system and conditions成分 用量2Ex Taq 酶ddH2O上游引物下游引物模板总计12.5L9.5L0.5L0.5L2L25L PCR反应程序如下： 95 5min95 30s 58 30s 40 cycles72 40s72 10min4 forever第3节 结果分析 农杆菌侵染前需进行菌液鉴定，如图所示，1、2、3号都是携带目的基因的菌液。 M 1 2 3 4 5 2028bp 注：M：DL2000 Marker；1：菌液1 ；2：菌液2；3：菌液3；4：阴性对照 5：阳性对照图5 农杆菌菌液鉴定Fig5 Agrobacterium tumefaciens Identification 对获得的抗性植株DNA进行Bar基因和ZmRLK全长的PCR分子检测，引物序列见表3.1,反应体系及程序见表3.2。PCR反应扩增Bar基因后经琼脂糖凝胶电泳，在444bp处出现与阳性对照（质粒）长度一致的电泳条带，证明Bar基因成功被转入部分玉米胚性愈伤，见图6。444bp 注：M：DL2000 Marker；10：空白对照(水)；11：阴性对照； 12：阳性对照(质粒)；其余为再生苗DNA样品 图6 部分Bar基因检测电泳结果Fig6 Part of Bar gene detection electrophoresis resultsM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 PCR反应扩增ZmRLK基因后同样经琼脂糖凝胶电泳，在2028bp处出现与阳性对照（质粒）长度一致的电泳条带，证明目的基因ZmRLK成功被转入部分玉米胚性愈伤，见图7。 M1 2 3 45 6 7 2028bp注：M：DL2000 Marker；1：阳性对照(质粒)；2：阴性对照；3：空白对照(水)；其余为再生苗DNA样品 图7 部分ZmRLK基因检测电泳结果Fig7 Part of ZmRLK gene detection electrophoresis results以玉米自交系H99胚性愈伤为受体，农杆菌侵染800块愈伤组织。经3mg/L双丙氨膦筛选愈伤，分化成苗450株，最终分子检测获得含有Bar基因表达阳性植株24株，转化率5.3%，ZmRLK基因表达阳性植株10株，转化率为2.2%。第4节 讨论 植物组织培养和农杆菌转化过程中防止细菌感染滋生对实验的成功有着至关重要的影响。例如，在农杆菌侵染过程中，农杆菌若残留在胚性愈伤表面上可能带来检测后期的巨大隐患。可在共培养培养基内添加入适当浓度可防止细菌感染的头孢霉素，同时处理已感染细菌的植物组织也需用加入头孢霉素的无菌水清洗涮苗以除去细菌使其继续生长，需注意若使用浓度过高则会在某种程度上抑制胚性愈伤的生长。对于感染真菌的植物组织大多难以救活应尽快舍弃避免污染到其他材料。本次实验中，在继代和分化阶段都有不同程度的染菌，导致成苗率和转化率严重下降。所以在超净工作台内需严格遵守操作规范，合理规划实验流程和时间，降低植物组织沾染杂菌和内生菌的风险，避免引起不必要的损失。实验发现玉米材料生长过程中，玻璃化现象经常出现，表现为组培苗生长不健康，且培养基上会出现透明或半透明的水渍状物质，逐渐导致植株矮小肿胀，失绿且叶片黄化。这时可以调节培养基配方，增加甘露醇或蔗糖浓度，降低培养基中渗透势，减少植物材料从外界环境吸收水分。外在环境中也可以通过增加光照、控制温度、改善通风条件来防止玻璃化。当发现组培苗生长状况不佳及时发现原因进行调整，如培养基配方和实验条件等，防止出现大面积玻璃化、褐化或染细菌和真菌的情况。农杆菌侵染后的分化成苗时期，一小块愈伤组织经培养会形成多个绿芽点，长出很多棵再生苗。此时根据绿芽点或再生苗的生长，用镊子和解剖刀将它们从愈伤中剥离，转移至新的培养基中，也会生长出正常的玉米植株，从而获得更多的再生苗，增加基因的转化率以及苗再生率。 在提取玉米叶片DNA的过程中，要注意每一步都要认真细致，全程戴一次性手套操作，避免药品沾染皮肤。离心管上编号需清晰否则易对应不上实际苗编号。提取后的DNA需稳定保存于-20冰箱。运用PCR技术来检测方便快捷，有目的条带的阳性植株就能够被初步确定。检测呈阳性的再生植株电泳结果需重复一到两次，以确保农杆菌侵染胚性愈伤后获得抗逆性植株，同时鉴定正确阳性植株也需继续仔细培养，便于后续实验的进行。结 论本研究以玉米自交系H99胚性愈伤为受体，通过农杆菌介导法将抗冷基因RLK转入玉米，共侵染800块愈伤组织，经双丙氨膦筛选后，分化成苗450株，分子检测获得含有Bar基因阳性植株24株，阳性率5.3%，目的基因RLK基因阳性植株10株，阳性率2.2%，为提高玉米抗冷性能奠定实验基础。致 谢经过近一年的忙碌和工作，本次毕业实验已经接近尾声，我的大学生活也即将画上句号。作为一个本科生的毕业实验，由于经验的匮乏，难免有许多考虑不周全的地方，如果没有导师和师兄师姐们的督促指导，以及一起工作的同学们的支持，想要完成整个实验是难以想象的。在这里首先要感谢我的导师吴颖老师。吴老师平日里工作繁多，但在我做毕业实验的每个阶段，从查阅资料，写开题报告，实验过程路线的确定和修改到后期整个实验等过程中都给予了我悉心的指导。同时吴老师的治学严谨和科学研究的精神也是我永远学习的榜样，并将积极影响我今后的学习和工作。其次由衷地感谢在实验具体操作过程中对我指导最多的李倩师姐，她耐心为我讲解实验原理，不厌其烦给我纠正错误，帮我克服了许多困难，才得以完成此次毕业实验。然后还要感谢大学四年来所有的老师，为我们打下坚实专业知识的基础；同时还要感谢实验室师兄师姐和所有的同学们，正是因为有了你们的支持和鼓励，此次毕业实验才会顺利完成。最后感植物科学学院和我的母校吉林大学四年来对我的大力栽培。参考文献1曹玉婷，丁艳菲，朱诚.类受体蛋白激酶与植物非生物胁迫应答J.中国生物化学与分子生物学报.2014,30(3):241-247.2周介雄，蒋向辉等.抗冷水稻的生理生化特性J.种子.2003（4）3张俊飞.玉米抗冷相关基因JMJ15克隆及对玉米的遗传转化D.吉林大学硕士论文.2015，06.4扈光辉，张志武,杨德光等.玉米耐低温冷害研究进展A.中国农学通报2014,30(33):1-7.5李祎君，王春乙.东北地区玉米低温冷害综合指标研究A.自然灾害学报，2017.126秦东玲,李钊等.作物抗冷性及其化学控制机理研究进展J.作物杂志Crops 2016(4):26-35.7陈儒刚，巩振辉等.植物抗寒基因工程研究进展J.西北植物学报，2008（6）.8田超，王冉等.植物抗逆胁迫相关蛋白激酶的研究进展A.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2015.43 (20)4-6,37.9XU Z S,LIU L ,et al. W55a encodes a novel protein kinase that is involved in multiple stress responsesJ.Journal o