（材料学专业论文）磷脂酰胆碱的分离提取与松萝酸脂质体的研究.pdf

郑州人学硕f ：学位论文 摘要 本论文分为两部分开展实验。第一部分以蛋黄粗磷脂作为原料分离提纯得到 e s o ( 磷脂酰胆碱p c 的含量在8 0 以上) 以及深加工产品e 9 8 ( 磷脂酰胆碱p c 的含量在9 8 以上) ，并对两种产品的质量做出评价。e 8 0 的质量评价包括酸值、 碘值、皂化值、有关物质、水分等；e 9 8 的质量评价除包括上述e 8 0 各检测项之 外，用h - n m r 和”c - n m r 图谱对p c 的结构进行了确证。并用h p l c 分析了 两种产品中各磷脂组分的种类和含量。第二部分是使用第一部分分离提纯得到的 e 9 8 ，与胆固醇筛选合适的配方包埋药物松萝酸制备松萝酸脂质体。对松萝酸脂 质体进行质量评价，包括粒径测量、药脂比大小、载药量高低、包封率高低等。 并对贮减了一个月的脂质体进行了稳定性研究。 采用有机溶剂沉淀法对蛋黄粗磷脂进行处理。依次用丙酮和无水乙醇溶解浸 泡该磷脂粗品，过滤除去不溶性杂质；用重蒸丙酮沉淀得到成品粗品；用活性炭 进行脱色处理；9 5 乙醇进行精制；重蒸丙酮二次沉淀后在冻干设备上冻干制得 成品。按2 0 0 5 年版中华人民共和国药典有关规定对成品进行质量评价。经 分析采用有机溶剂沉淀法制备的成品各质量参数均符合宝鸡力邦生物工程有限 公司的企业内部自控标准。产品性能达到了德国l i p o i d 公司生产的e 8 0 产品的 水平，完全可以替代该产品使用。 将制得的e 8 0 作为原料，采用柱层析色谱法深加工得到高纯磷脂产品e 9 8 。 上柱的沈脱液采用氯仿和甲醇的混合溶媒。t l c 进行实时检测，检测结果作为 更换沈脱液中氯仿和甲醇比例的判断依据。将洗脱液按所含物质种类的不同分批 收集浓缩后脱色，在重蒸丙酮中沉淀、冻干设备上冻干制得成品e 9 8 。按e 8 0 的 相关步骤对深加工产品进行质量评价。结果得到的成品纯度在9 8 以上。用核磁 共振仪对e 9 8 进行1 h - n m r 和3 c n m r 的分析确定了其结构。 将e 9 8 和胆固醇作为基础原料，筛选合适的配方工艺制备松萝酸脂质体， 并评价了其质量。建立了松萝酸脂质体的h p l c 色谱条件和包封率的测定方法。 h p l c 色谱条件是用c 1 8 反相色谱柱，( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 1 a ) ，流动相组成为甲醇： p b s ( p h 为5 0 左右) = 7 0 ：3 0 ( 体积比) ，流速为l m l m i n ，紫外检测波长为2 8 4 n m 。 包封率的测定方法是用自制的s e p h a d e xg 2 5 葡聚糖微型凝胶色谱柱分离脂质体 和游离药物，蒸馏水作为洗脱剂，用h p l c 检测脂质体中药物和游离药物的含量， 郑州人学顾 二学位论文 计算出松萝酸脂质体的包封率结果表明，e 9 8 和胆固醇以7 0 ：3 0 ( m o l ：m 0 1 ) 为 配方制备的脂质体，可以包封松萝酸药量达l m g 5 0 m g 左右，脂质体的粒径为 1 3 0 - a ：2 0 n m ，包封率在9 0 以上。 将贮存一个月后的脂质体再进行质量评价，发现脂质体粒径较以前有所变 大。这和p c 为中性磷脂有关，符合文献报道的情况。包封率也有所下降。 关键词：卵磷脂；质量评价；脂质体；高效液帽：包封率 郑州人学硕i ：学位论文 a b s i r a c i t h e r e8 r et w op a r t si n t h i sp a p e r t h ep a r to n e ，u n t r e a t e de g gp h o s p h o l i p i d sa s s t a r t i n gm a t e r i a lw a ss e p a r a t e dt og a i ne 8 0a n dt h ed e e pp r o d u c te 9 8 ，a n dt h e q u a l i t i e so ft w op r o d u c t sw c r ee v a l u a t e d t h eq u a l i t yp a r a m e t e r so fe 8 0i n c l u d ea c i d v a l u e , i o d i n ev a l u e , s a p o n i f i c a t i o nv a l u e , t h er e l a t e ds u b s t a n c e , t h ew a t e rc o n t e n t ，e t c e x c e p tf o rt h eo p t i o n so fq u a l i t yp a r a m e t e r so fe 8 0 ，t h e1 h n m ra n d 3 h n m rw a s u s e dt od e t e m i n et h es t r u c t u r eo fp c 。h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g u a p h i c ( h p l c ) w a su s e dt oa n a l y s et h ev a r i e t i e sc fp h o s p h o l i p i d sa n dc o n t e n t si nt w o p r o d u c t s t h ep a r tt w o ，t h ef i tr a t i oo fe 9 8a n dc h o l e s t e r o lw a sc h o o s e dt op r e p a r e l i p o s o m a lu s n i ca c i d 。t h el i p n s o m e s q u a l i t i e sw f f ee v a l u a t e ds u c ha sp a r t i c l es i z e , d u r g - t o l i p i dr a t i o ，d u r g - c a r r y i n g , e n c a p s u l a t e de f f i c i e n c y , e t c t h es t a b i l i t yo ft h e l i p o s o m e sw a sa l s om e a s u r e da f t e ro n em o n t h t h em e t h o do fp r e c i p i t a t i o nw i 也o r g a n i cs o l v e n tw a su s e dt og a i ne 8 0 f i r s t t h er a wm a t e r i a lw a sd i s s o l v e da n dm a r i n a t e db ya c e t o n ea n de t h a n o lw i t h o u tw a t e ri n t u r n ，a n dp r e c i p i t a t e dw i t hv a p o r i z e da c e t o n et og a i nr a wp r o d u c t ，t h e nt h el a w p r o d u c tw a sd e c o l o r i z e dw i t ha c t i v a t e dc a r b o n a n dr e f i n e dw i t h9 5 e t h a n 0 1 f i n a l l y , p r o d u c tw a so b t a i n e db ys e c o n d a r yd e p o s i t e dw i t hv a p o r i z e da c e t o n e , a n df r e e z e d r i c d a c c o r d i n gt ot h ec h i n e s ep h a r m a c o p e i aw h i c hp u b l i s h e di nt h ey e a ro f2 0 0 5 t h eq u a l i t yp a r a m e t e r so fe 8 0w e r ee v a l u a t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h em e t h o dw h i c h m e n t i o n e da b o v ec o u l dp r o c u r ev a l i dp r o d u c t t h eq u a l i t yp a r a m e t e r sa r ec o n s i s t e n t w i t ht h es t a n d a r do fb a o j il i b a n gb i o e n g i n e e r i n gc o ，l t d c o m p a r i s o nw i t ht h e l i p i de 8 0m a d ei ng e r m a n y , o u rp r o d u c th a ss a m ec o n t e n t t h i ss h o w e dt h a to u t p r o d u c tc o u l dr e p a l c et h el i p o i de 8 0i no u rl i f e 。 t h ef u r t h e rp r o d u c te 9 8w a sp r e p a r e db ym e a n so fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y u s i n ge s 0a sr a wm a t e r i a l ，a n dt h ee l u a n tw a st h em i x t u r eo fc h l o r o f o r ma n d m e t h a n 0 1 t h ee l u a n ts o l u t i o nw a sd e t e c t e db yt l ci n r e a lt i m e a c c o r d i n ga st h e r e s u l to f t l c ，t h er a t i oo f c h l o r o f o r ma n dm e t h a n o lw a sc h a n g e d t h ee l u a n ts o l u t i o n w a sc o l l e c t e di nb a t c h e sa n dc o n c e n t r a t e d ，d e c o l o r i z e d ，t h e nd e p o s i t e da n df r e e z e d r i e d t h eq u a l i t yp a r a m e t e r so fe 9 8w e r ee v a l u a t e du s i n gt h em e t h o do fe 8 0 t h e 郑州人学硕l 学位论文 r e s u l ts h o w e dt h a tt h ep u n t yo ft h ep r o d u c tw a sa b o v e9 8 t h es t r u c t u r eo fp cw a s d e t e r r n i n e db ym e a l l so f h n m ra n d ”c n m r u s i n ge 9 8a n dc h o l e s t e r o la sr a wm a t e r i a l ，t h el i p o s o m a lu s n i ca c i dw a s p r 掣e d a n dt h eq u a l i t yp a r a m e t e rw a sa l s o e v a l u a t e d t h ec o n d i t i o no fh p l ca n d t h e d e t e c t i n g m e t h o dt ot h e e n c a p s u l a t ee f f i c i e n c y w e r ee s t a b l i s h e d a 2 5 0 m m x 4 6 m m c , s ( 5 p ) c o i o m n w i t ham o b i l e p h a s ec o n s i s t i n g o f m e t h a n o l - p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p ha b o u t5 o ) 27 0 ：3 0 ( v ：v ) w a su s e d c h r o m a t o g r a p h yw a sp e r f o r m e da ta m b i e n tt e m p e r a t u r ew i t hf l o w - r a t eo fl m l m i n a n du l t r a v i o i l e td e t e c t i o na t2 8 4 n m t h em i n i - g c lc o l u m nm a d ew i t hs e p h a d e xg - 2 5 p o l y g l u c o s a ng e lw a su s e dt os e p a r a t el i p o s o m e sa n df r e ed r u g , a n du s i n gt h e v a p o r i z e dw a t e ra se l u a n t t h ec o n t e n to fd r u gi nl i p o s o m e sw a sd e t e c t e db yh p l c a c c o r d i n gt ot h ed a t a , t h ee n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yw a s c a l c u l a t e d t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h el i p o s o m ec o u l de n c a p s u l a t ed r u gl m g m l ，t h ep a r t i c l es i z ew a s13 0 - a ：2 0 n m ， t h ee n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yw a sa b o v e9 0 a n dt h ed r u g - c a r t i n gw a sa b o u t l m g 5 0 m g i tw a sf o u n dt h a tt h ep a r t i c l es i z eo fl i p o s o m a lu s n i ca c i dd e p o s i t e do n em o n t h w a sal i t t l eb i g g e rt h a nb e f o r e ，w h i c hc o n s i s t e dw i t hs o m ed o c u m e n t ss a i dt h a ti tw a s c o n c e r n e dw i t ht h en e u t r a lp h o s p h o l i p i d so f p c t h ee n c a p s u l a t ee f f i c i e n c yw a sl o w e r a l s o k e yw o r d s ：p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ；q u a l i t ye v a l u a t i o n ；l i p o s o m e s ；h p l c ； e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y 郑州人学硕i j 学位论文 第一章绪论 1 1 磷脂简介 磷脂是含有磷酸根的类脂化合物总称。最早由u a u q u e l i n 于1 8 1 2 年从人脑 中发现，又由g o b l e y 于1 8 4 4 年从蛋黄中分离出来，并于1 8 5 0 年按希腊文l e k i t h o s ( 蛋黄) 命名为l e c i t h i n ( 卵磷脂) 继而陆续从其他动植物种中分离、确认了许 多磷脂物质。1 8 6 1 年t o p l e r 又在植物种子中发现了磷脂的存在。迄今认为磷脂 种类最为丰富的大豆磷脂是在1 9 3 0 年发现的。1 9 2 5 年l e v e n 将卵磷脂( 磷脂酰 胆碱) 从其他磷脂中分离出来。t h u d i c h u m 证明了磷脂的化学结构，分离并分析 出磷脂中磷和氮的比例，从而鉴定出了磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p c ， 当时称l e c i t h i n ) 、磷脂酰乙醇胺( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ，当时称c e p h a l i n ) 和神经鞘磷脂( s p h i n g o m y e l i n ) 1 1 - 3 1 。 至今，人们已发现磷脂几乎存在所有的有机体细胞中，是生物膜的基本组成 成分。磷脂在生命过程中起代谢和形成结构的作用，是重要的生命物质。动物磷 脂主要来源于蛋黄、牛奶、动物体脑组织、肝脏、肾脏及肌肉组织部分。而植物 磷脂主要存在于油料种子，且大部分存在于胶体相内，并与蛋白质、糖类、脂肪 酸、f 醇、维生素等物质以结合状态存在，是一类重要的油脂伴随物。 1 1 1 磷脂的分类 磷脂一般按化学结构分为甘油醇磷脂和神经氨基醇磷脂两大类。 甘油醇磷脂是脂肪酸、甘油和磷酸等化合物的衍生物，按其分子中的磷酸基 团处于丙三醇的1 位和2 位可分为小和b 磷脂。自然界中存在的磷脂为l - a 型 ( r 2 c o 基处于甘油碳链的左边为l 型) ，其通式为： 0 n r 2 一c 一0 一c h 2 i c i i - c i h i l l oc h 2 。0 - p - 0 x l o h 式中r l 、r 2 为碳数1 4 - - 2 2 的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，且以偶碳数居多。 郑州人学颂l ：学位论史 r i 和r 2 可以相同也可以不同。在蛋黄磷脂甘油骨架上1 位的一般为饱和脂肪酸， 而2 位大多为不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸、亚麻酸、和花生四烯酸等。来自 植物细胞的多为不饱和脂肪酸，来自动物细胞的多为饱和脂肪酸。x 为不同的氨 基醇残基。根据x 的不同，甘油醇磷脂又可分为卵磷脂、脑磷脂、心磷脂、肌 醇磷脂、溶血磷脂、丝氨酸磷脂和缩醛磷脂等。其中最主要的为卵磷脂、脑磷脂、 肌醇磷脂和丝氨酸磷脂，其结构式分别如下： 0 i i 如。c o t 心 吣0 p c h c h 2 o 旦c h 2 c h ，汀 鼢 il i + 一p o c n ( c h 3 ) 3 1 0 。 磷脂酰胆碱，俗名卵磷脂，简称p c ( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ) 0 如- c 0 c 如 l 凡一；0 1 三- 0 - 曰p - o c h 2 c h 2 汀魄 l n c 塌 盯h 3 i o 。 磷脂酰乙醇胺，俗名脑磷脂，简称p e ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o a m i n e ) 0 。 ： r ，羔o c h 2 r 2 芝一。一c h 2 r 2 - c o ? h 2 r 2 q u i n 2 i i n i 。0 色* 抄h轴- c - o - c 邺h _ 涡h 6 do o 0 。苫y 妇 磷脂酰丝氮酸，俗名丝氮酸磷脂，简称p s磷h 匕酰肌孵，俗名肌醇磷脂，简称p l ( p h o s p h a t i d y l s e r i n e ) ( p h o s p h a t i d y l i n o t 0 1 ) 还有一种磷脂叫溶血磷脂，如溶血卵磷脂，它是卵磷脂的 l ；分水解产物，也 是一种比较重要的磷脂种类。近年来研究的也较多。其结构式如下： o | | r c - - o c h 2 l h o c ho c ih 2 - - o 一：_ o c h 2 c h 2 n + ( c h 3 ) 3一p o o h 溶血卵磷脂，l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e 郑州人学颂i ：学位论文 另一类神经氨基醇磷脂不含甘油基团，是神经酰胺与磷脂直接相连，再与胆 碱或乙醇胺相连而成的酯，其结构式为： c i l 3 - - ( c h 2 ) m c h ：c h o h c h n h co ( c h i ) n c h 3 占h 2 _ x 其中m 、n 分别代表脂肪酸中亚甲基的数目，x 代表磷酸胆碱或磷酸胆胺。 神经氨基醇磷脂又可以分为神经鞘磷脂、半乳塘苷神经酰胺、葡萄糖苷神经酰胺 和脑苷酯等神经氨基醇磷脂种类中最具代表性且现阶段研究较多的是鞘磷脂， 是动物组织中含量最丰富的鞘脂类。鞘磷脂的结构式为： o c h 3 - - ( c h 2 ) 1 2 - - c h ：c h c h s h c h 2 - 0 一i o c h 2 c h 2 n + ( c h 3 b o ihn ih o i 0 。c r 神经鞘磷脂，简称s m ( s p h l g o m y e l i n ) 另外还有一种分类方法，是根据磷脂分子中氮与磷的比例将其分为一氨基磷 脂、二氨基磷脂及不含氮的磷酸酯三类。一氨基磷脂中，磷和氮的比例为l ：1 ， 如卵磷脂与脑磷脂；二氨基磷脂中磷和氮的比例为l ：2 ，如神经鞘磷脂，它存 在于动物组织内，油料种子中的含量很少或不存在；不含氮的磷脂是由磷酸、脂 肪酸与甘油所形成的酯，如在许多油料种子中存在的环己六酵磷脂酸。 大家普遍认同的是以分子结构来进行分类的方法。 1 1 2 磷脂的功能和用途 磷脂具有两亲的分子结构，即同时具有亲水性和亲油性，两个脂肪酸链为疏 水基，磷酸和胆碱等基团为亲水基。磷质作为表面活性物质，具有一系列界面和 胶体性质，如界面吸附、形成胶团、形成微乳液、形成脂质体和乳化作用等。另 外，作为重要的生命物质还有以下功能活性及用途。 1 1 2 1 磷脂的功能活性 磷脂是和生命活动有关的一类物质，生物的生存和生k 都需要一定量的磷 脂。不同的磷脂具有不同的生物学功能和用途。 ( 1 ) 有明显的促进巨噬细胞吞噬功能的作用。可使巨噬细胞应激性增强，巨 噬细胞数增加，吞噬功能增强。 3 郑州人学颂i 二学位论文 ( 2 ) 磷脂具有乳化、分解油脂的作用，防止血液中血脂和胆固醇含量过高。 它可促进血液循环，改善血清脂质，清除过氧化物，使血液中胆固醇及中性脂肪 含量降低，从而降低血液黏度。 ( 3 ) 提高血清中磷脂含量，增加血红蛋白，使血清白蛋白有上升趋势，改善 机体营养状况，并对力竭性运动后血红蛋白的恢复有良好作用。 ( 4 ) 增加红细胞对低渗溶液的抵抗力，使红蛋白在低渗溶液中避免溶血现 象。 ( 5 ) 增强纤毛运动、肌肉运动，加速表皮愈合，增强胰岛素功能、骨细胞功 能及神经细胞功能。 ( 6 ) 磷脂中含维生素k ，可加速衄液凝固，调节和增进血小板的发育，增加 血小板的数量。 ( 7 ) 降低自由基对生物膜的过氧化损伤，保护细胞器的萨常结构和功能。 ( 8 ) 神经醇磷脂能有效地降低皮肤水分丢失，提高皮肤角质层的水分含量， 维持皮肤正常的渗透屏障。 由以上可以看到，磷脂能够维持和调节人体细胞的正常生理活动。人体含有 足量的磷脂，其细胞活性增强，精力充沛，生命旺盛，免疫功能提高，人体健康 快乐。磷脂具有滋补大脑，增强记忆；保护肝脏，防止脂肪肝、酒精肝的发生； 改善皮肤营养，减少和消除褐斑；清除过氧化脂质，延缓衰老等作用。 1 1 2 2 磷脂的用途 卵磷脂这个名词有两种含义”。一种是广义的，将卵磷脂视作各种磷脂的同 义词，或定义为“丙酮不溶物在6 0 以上的一种极性和非极性脂类的混合物，其 中包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等磷脂和甘油三 酯的混合脂类”。另外一种是狭义的。即仅将磷脂酰胆碱称作卵磷脂，而将磷脂 酰乙醇胺称作脑磷脂。本文中沿袭狭义的说法，即认为卵磷脂仅仅是磷脂酰胆碱 一种磷脂。 目i ；i 磷脂酰胆碱是世界公认的最具生物学活性的磷脂，同时也是研究最多最 全面的磷脂种类，已被应用于药物的制造。磷脂酰胆碱的两条脂肪链的长短和饱 和度的不同决定了各种磷脂酰胆碱的不同生物学功能。 卵磷脂能安定人的神经，并可以增强人的记忆力。磷脂酰胆碱被人体摄入消 4 郑州人学颂i 坞 位论文 化后释放出胆碱，胆碱随血液循环系统进入大脑，在胆碱乙酰基转移酶的作用下， 与乙酰辅酶a 反应，生成乙酰胆碱。乙酰胆碱是天然的精神安定剂，具有调节 植物神经的功能，能够缓解焦虑、失眠、耳鸣、紧张等症状，同时乙酰胆碱含量 增加能促进大脑神经突触迅速发达，从而使大脑神经细胞之自j 的信息传递速度加 快，提高注意力和思维功能1 5 - 9 1 。 卵磷脂中的胆碱对脂肪具有亲和能力，能促进脂肪以磷脂形式由肝脏通过血 液输送出去，或改善脂肪酸在肝脏的利用，防止脂肪在肝脏的异常积累。并且具 有的良好的乳化功能，有助于降低胆固醇并阻止胆固酵在血管壁上的沉积，可以 防止血管壁细胞膜发生硬化，还可以预防心血管疾病和防止动脉硬化 1 0 - 1 3 1 。 近年来，关于卵磷脂衍生物的研究也取得了很大的进展。如棕榈酰磷脂酰胆 碱是肺细胞的主要磷脂成分，可以用来改变肺的表面张力，改善其呼吸功能。十 六烷基磷脂酰胆碱是一种肿瘤生长抑制剂，可用作治疗癌症的药物1 1 4 l 。溶血卵 磷脂是卵磷脂的部分水解产物，其在不同温度和p h 环境下的稳定性均远大于普 通的磷脂，能适应于更多的场合使用陋。并且其独特的锥形分子结构以及在三 维空间中自山度的增加，能大大增强其渗入细胞膜的能力。也有许多例子显示细 胞膜上的溶血卵磷脂能改变酶的活性，其中某些溶血卵磷脂也具有抗肿瘤的作用 1 8 - 1 9 。如1 氧十八烷基一2 氧甲基s n 甘油3 磷脂酰胆碱( e t - 1 8 o m e ) 在体内 有抗肿瘤活性1 2 0 】。2 氧十六烷基甘油磷脂酰胆碱具有抑制病毒活性的能力，和 抗病毒药物连用时，能大大提高抗病毒的效力( 2 “。 卵磷脂还可以作为微乳液、脂质体等的主要组成部分使用。微乳液的分子粒 径仅为2 0 - 1 0 0 h m 左右，为热力学稳定体系，有很好的物理和化学稳定性【2 2 】。微 乳液可以简单的分为油包水型和水包油型。卵磷脂有两亲性，在水溶液中可以自 发的形成双分子层的囊泡，粒径为1 0 0 5 0 0 姗。这种囊泡被称为脂质体，和细 胞的生物膜有很好的相似性，因此也被称作“人工生物膜”。现阶段，把水溶性 或脂溶性的药物包裹在微乳液或脂质体中进行给药的研究讵如火如荼的丌展，并 有一系列的药物通过了f d a 的批准实现了商业化的生产。关于脂质体的研究主 要集中在抗肿瘤药物的丌发和研制上，因为脂质体有很好的被动靶向性( 对人体 器官组织有较高的选择性) ，并能延长在体内的保留时间，从而实现了药物的缓 释作用，使体内药物浓度在较长的一段时问内保持较高的浓度水平上。在脂质体 5 邦州人学顾j 二学位论文 的配方中添加其他的磷脂种类来改善只含有卵磷脂和胆固醇的脂质体的研究也 得到了很好的效果。如免疫学中一般采用卵磷脂、胆固醇和负电性的二酰磷脂或 磷脂酸，以及萨电性的十八烷胺制备脂质体。有文献报道称神经鞘磷脂与胆固醇 组成的脂质体与抗原结合后所激发的免疫响应比卵磷脂脂质体更有效。这可能是 因为鞘磷脂的临界温度高于卵磷脂，在体内的存留时f b j 更长。同理，临界温度高 的二棕榈酰胆碱和二硬脂酰胆碱脂质体的免疫强化作用大于卵磷脂脂质体的 1 2 3 1 。近年来在脂质体的表面进行修饰以获得主动靶向性的研究也取得了长足的 进展。 自然界中存在含量最丰富的是卵磷脂。植物各组织中以富含油的种子中的磷 脂含量最高。各种油料种子中又以大豆磷脂的质量好、数量多、加工易得、成本 低、用途广泛而著称。既可作为主料直接加工成制品，又可以作为辅料混合加工 成制品，从而为人类提供宝贵的营养资源。大豆磷脂的组分般为：磷脂酰胆碱 为3 6 2 、磷脂酰乙醇胺为2 1 4 、磷脂酰肌醇为1 5 2 、磷脂酰甘油为1 6 1 、 磷脂酸为3 6 ，其他磷脂为7 5 。 在动物的各种组织细胞中，含磷脂最丰富的是动物的卵，各种蛋品的总磷脂 含量和含磷成分的分布大致相同。蛋品是卵磷脂、鞘磷脂和溶血卵磷脂的理想来 源。类脂物绝大多数存在于蛋黄中，因而蛋品中含磷脂最丰富的是蛋黄。一般而 言，蛋黄磷脂和大豆磷脂相比，其突出特点是卵磷脂含量高。蛋黄磷脂除具有磷 脂一般生理活性外，还有许多生理活性是大豆磷脂无法比拟的 2 4 - 2 7 1 。因此，蛋黄 磷脂的丌发，是一个更令人振奋的研究方向。 肌醇磷脂是细胞的信息分子，经磷脂酶c ( p l c ) 水解得到的肌醇三磷脂( i p 3 ) 和l ，2 - 二酰基甘 | t i ( d a g ) 能激发蛋白质激酶c ( p k c ) ，引发细胞反应如收缩、 分泌和代谢等。肌醇磷脂的代澍是中枢多种神经传递受体的跨膜传导途径之一。 丘脑和下丘脑中参与体温调节的n 受体与p i 代谢相偶连，能调节体温调节中枢 的耐受功能。高纯度的p i 制备成脂质体，具有选择性的杀伤多种癌细胞的生物 活性，是具备抗肿瘤特异性脂质体的主要化合物1 2 8 - 3 2 1 。 鞘磷脂在自然界中存在的含量远远不及甘油醇磷脂，但其作为生物细胞膜的 主要成分，一直是生物化学非常感兴趣的问题之一。鞘磷脂和卵磷脂一样，都可 以聚集形成双分子层囊泡( 脂质体) 。近年来细胞生物学的研究显示，鞘磷脂与 6 郑州人学颀l ：学位论文 胆围醇共同作用可以在细胞膜上形成支架样的微区。这些微区可能具有某些生物 功能，如与其他一些蛋白一起形成功能平台，在信号传导和物质运输过程中发挥 作用。鞘磷脂形成的脂质体显出了比卵磷脂更好的性能，如可以延长在动物体内 的保留时间，提高腊质体的缓释和防泄漏能力等。所以，关于鞘磷脂的研究受到 了大家的广泛关注。同时由于鞘磷脂的含量比较少，分离提纯比较困难，其国际 市场的价格一直居高不下，这也从另一方面揭示了其吸引较多的人才和资金的原 因所在。鞘磷脂的人工合成是一个利润巨大的市场l ”- 3 4 1 。 综上所示。我们叙述了各磷脂种类在医药和保健品领域的生理功能和用途。 另外磷脂在饲料工业、食品工业、化妆品、纺织工业和皮革工业中也有着很广泛 的用途。我们可以看出磷脂对于我们生存、生活以及生命活动的重要性是其他物 质无法替代的，因此分离和提纯出高纯度的卵磷脂，对于进行科学研究来说是必 要的，也是提高人们生命水平和生活质量的有力保证。 1 1 3 磷脂的研究现状 有关磷脂的研究，始于2 0 世纪3 0 年代的德国。6 0 年代以来在部分发达国 家已实现工业化。7 0 年代后，研究工作r 趋活跃。以美国化学文摘( c a ) 所列 的有关磷脂研究的专题文献为例，1 9 7 2 1 9 7 6 年期间为9 0 0 多篇，1 9 7 7 1 9 8 1 年 突增至8 0 0 0 多篇。由此可以明确的显示出各国科学工作者对磷脂的重视程度。 1 9 8 0 年在意大利首都罗马召丌了第一届国际大豆磷脂专题研讨会( i n t e r n a t i o n a l c o l l o q u i u ms o y al e c i t h i n ) ，其后基本上每隔一年召丌一次。1 9 8 6 年在美国芝加 哥召丌的第四届国际磷脂会议上还成立了国际磷脂研究集团( t h ei n t e r n a t i o n a l l e c i t h i ns t u d yg r o u p ) ，每年举行一次国际性聚会，互通科研、生产、应用和销 售方面的消息，并且使精细磷脂得以丌发和应用【3 5 1 。这魑都使磷脂迅速在世界 各国掀起“磷脂热”的狂飙，而这种“磷脂热”反过来又促进了磷脂研究的进程。 磷脂先后获得国际上一些粮油组织和卫生组织的认可，并由他们推荐为重要的营 养品和保健品p 射。 现如今，磷脂的研究工作已经深入到各个领域。涉及到的学科群有化工工程 分离技术、精细有机合成、分析测试、化工过程及设备、化工机械、生物化学、 脂质化学、动力工程计算机科学与技术、化工系统工程等等。 7 郑州人学硕i ：学位论文 关于磷脂的研究有以下几个方面： ( 1 ) 研究磷脂的生物活性 磷脂是构成细胞基本结构的必需物质，也是生命的基础物质。对于维持细胞 的通透性和氧的传递起重要作用。2 0 世纪7 0 年代以来，科学界逐步发现，磷脂 不光是构成细胞膜的主要成分，同时还是众多信息分子的前提贮备形式。在人体 机能的调控中有着重要的作用。这些信息分子有些还是许多疾病形成的重要化学 介质，虽然其结构迥然不同，但近十几年在生物和化学方面的众多研究结果表明， 它们之间存在着十分微妙的关联。他们在传递的信息上存在着相互协同和相互制 约的对立统一关系。这些化学信息分子均来自于细胞膜内的磷脂，而且还都是现 用现合成的。但是这类信息分子在体内的含量非常少，而且化学稳定性很差，故 鉴定这类分子的结构、研究探索其生理活性过程和合成机理对于预防和治疗疾 病，提高人类身体素质和生活质量等方面都是极有价值和意义的工作，也是生命 科学界的历史任务。实际上，自9 0 年代以来，磷脂研究在生命科学和脑科学领 域已经取得了显著的成效【3 扪。 ( 2 ) 研究磷脂的营养功能 5 0 年代时人们就认识到磷脂具有降低胆固醇的作用。1 9 5 9 年司马昭指出口 服磷脂可降血脂，治疗脂肪肝、肝硬化，使老龄动物血管壁作用增强并减少坏死。 并认为磷脂有以上功能的原因在于它是体内细胞膜的主要构成成分。大豆磷脂含 有的3 系列不饱和脂肪酸是对消除血管胆刨醇有极其重要作用的高密度脂蛋 白糖的基本成分，在血浆内起着乳化利作用，影l 粕胆固醇及中性脂肪的运输和沉 着，冲刷已附着在血管内壁的沉着物，减轻和预防动脉硬化的产生。 这之后是磷脂研究的一个高峰期，磷脂的营养作用得到了大家的广泛认同。 磷脂被誉为“伟大的营养师”、“脑的食物”、“血管的清道夫”、“可食用的化妆品”、 “细胞的保护神”以及“长寿因子”等。值得一提的是蛋黄磷脂。蛋黄磷脂中含 有大量的花生四烯酸，该物质是形成生物膜的主要功能物质。同时磷脂还有促进 细胞膜结构连续性和影响大分子膜的功能，是信号传导的膜基质。躇食磷脂能显 著影响细胞膜及脂蛋白结构，它可能在下面四个方面j 起作用州：保持细胞及 微环境的稳定；控制慢性病传染；控制粥样动脉硬化症的发展；能部分恢 复因年龄增大而退化的免疫力。 郑州人学硕l 擘位论文 ( 3 ) 研究磷脂的分离提纯方法 随着生活质量和生命质量的提高，2 0 世纪8 0 年代以来人们对保健营养品、 功能食品、疗效食品等不断提出新要求，促进了磷脂的研究与丌发。从磷脂中分 离提纯卵磷脂，一直是磷脂研究的重要课题。目前关于卵磷脂分离提纯的方法主 要集中在有机溶剂萃取法、超临界液体萃取法、色谱分离法、膜分离法和有机溶 剂沉淀法等1 5 0 4 9 1 。这些方法都可以不同程度的满足磷脂的分离和提纯。而得到在 医药上静脉注射使用的9 _ 磷脂，一般需要经过二次分离或多次分离，以得到纯度 很高，且不含溶血磷脂的成品。 ( 4 ) 研究磷脂的用途 磷脂作为细胞膜的重要组成部分，能调节人体尘理机能、促进人体新陈代谢、 增强免疫力、预防疾病、增进健康的作用已被大家广泛的关注。现在，许多国家 以将磷脂用于临床中，防止脑、心、肝、肿瘤等疾病。除了上述的医用价值之外， 磷脂还由于具有乳化、防溅、速溶、湿润，分敬、脱膜、分离，改善黏度和营养 源等，被理想的应用于食品领域中。另外在非食品领域，如涂料、塑料、橡胶、 油墨、会属加工、饲料、纺织以及录音磁带等各方面也有广泛的使用硎。 ( 5 ) 研究磷脂的改性方法 磷脂是良好的天然表面活性荆，但因其亲水亲油平衡值( h l b 值) 低，且 由于含有较多的不饱和的脂肪酸链和亲水基，在空气中易吸湿和氧化，化学性质 极不稳定，因而应用范围受到了很大的限制。要想深度丌发应用天然磷脂，除了 要降低磷脂产品的生产成本之外，还要进一步研制和丌发广谱h l b 值的磷脂改 性产品。因此磷脂产品的改性研究成了目前国内外专家学者十分关注的热门问题 之_ _ 1 6 1 - 7 0 1 。 磷脂的改性分为水解改性、饱和改性、酰基化改性、羟基化改性、酰羟化改 性、磺化改性、醇解硫酸化改性以及其它类型的改性。磷脂的改性研究，很早就 已经进行了。磷脂乙酰化以后可成为对离子感受性低，在水中分散性良好的稳定 乳化剂；磷脂中脂肪酸不饱和键的羟基化，可提高其在水中的分散性及亲水性； 用酸、碱部分水解或磷脂酶a 2 作用得到的溶血磷脂，亲水性更好，可形成稳定 的o w 型乳状液，并有在离子作用下难以引起乳化力下降的特点。 磷脂的水解改性现在多集中在酶解改性的研究方面。因为酶解具有反应物不 9 郑州人学硕l ：学位论文 须纯化、反应条件温和、速度快、进行完全、副产物少、酶制剂作用部位准确、 选择性高、来源方便等特点，因此有很深的丌发潜力。相反酸碱水解因条件难以 控制，水解产物的颜色较深，基本上已被淘汰。 饱和改性是通过催化加氢使磷脂结构中含有不饱和键的两个脂肪酸基链变 成饱和的脂肪酸链，获得颜色浅、气味淡、稳定的化合物。氢化卵磷脂作为血脂 乳化剂可用于静脉注射用，能防止动脉硬化，同时还具有易消化、易吸收、几乎 不在内脏中残存等优点。自然界中卵磷脂的含量比较丰富，卵磷脂的分离提纯相 对其它磷脂产品来讲比较容易，因此，氢化卵磷脂的改性方法得到了很大的推广 和应用。 酰基化改性是磷脂改性的另一种重要方法。磷脂经酰化后，其流动性和水分 散性能得到极大的改善，成为多种食品配方有效的o w 乳化剂。中度和高度酰 化的磷脂具有很好的耐热性，经多次升温冷却，色泽仍能保持不变。 其他类型的改性方法，都能在一定程度上改善磷脂的某些性能，拓宽磷脂的 使用范围。在这里就不一一赘述了。 1 2 脂质体简介 脂质体，或称类脂小球、液晶微囊，英文名l i p o s o m e ，是一种类似微型胶囊 的新剂型。脂质体在水中具有两性性质，即亲水性和亲油性，故其确切的术语应 该称为兼性小体( a m p h i s o m e ) 。最初是由英国学者b a n g h a m 和s t a n d i s h 将磷脂 分散在水中进行电镜观察时发现的1 7 i 】。磷脂分散在水中能自然形成多层囊泡， 每层均为脂质的双分子层；各层之问被水相分开，双分子层的厚度为4 纳米左右。 由于它的结构类似天然的生物膜，且与天然尘物膜的成分是一样的，故又被称为 人工生物膜( a r t i f i c i a lb i o l o g i c a lm e m b r a n e ) 。1 9 7 1 年r y m a n 等人丌始将脂质体 用作药物载体【7 2 】。所谓载体，可以是一组分子，包蔽于药物外，通过渗透或被 巨噬细胞吞噬后被酶类分解而释放药物，从而发挥作用的一类物质。 脂质体大小从直径几十个纳米到几十个微米。其结构如图1 1 所示。在脂质 体的水相和膜内可以包裹多种物质。一般脂质体膜材由磷脂和胆固醇两部分组 成。这两种物质都是两亲物质，即同时具有亲油和亲水的性质。他们在水溶液中 形成双分子层的结构。胆固醇的结构式如下： 1 0 郑州人学颈l 二学位论文 h h c h 2 c h 2 c h 2 c h ( c h 3 ) 2 h 3 药物可以根据各自理化性质的不同，自动选择脂质体的不同部位进行结合， 从而达到作为药物载体来应用的目的。比如，脂溶性的药物，包埋在脂质体的双 层膜中问，而水溶性药物主要包埋在脂质体内核的水相中 b 圈i 1 脂质体的结构示意幽a 单室脂质体b 多室脂质体 f i g 1 1t h es t r u c t u r es k e t c ho f l i p o s o m e as i n g l e - c e l ll i p o s o m ebm u l t i c e l ll i p o s o m e 1 2 1 脂质体的形成原理及成份组成 把磷脂的醇溶液倒入水面时，醇溶剂很快溶解于水，磷脂分子则排列在空气 水的界面上，他们的极性部分在水中，亲油的非极性部分则伸向空气中。当极 性磷脂分子被水完全包围时，其极性基团面向两侧的水相，而非极性的烃链彼此 面对面的缔合成双分子层，或者呈球状，即形成脂质体。 制备脂质体用的磷脂分为三个种类，包括中性磷脂、负电荷磷脂和正电荷磷 脂等 7 3 - 7 4 l 。 卵磷脂、鞘磷脂、烷基醚磷脂酰胆碱和脑磷脂等都属于中性磷脂。制备脂质 体一般最经常用到的是卵磷脂，因为它是许多细胞膜中磷脂的主要成分，是非常 弱的抗原。卵磷脂极易从蛋黄和大豆中提取得到。与其他磷脂相比较，它具有价 格低、中性电荷、化学惰性等优点。 制备脂质体常用的负电荷脂质有磷脂酸( p a ) 、磷脂酰甘油( p g ) 、磷脂酰 郑州人学硕l 学位论文 肌醇( p i ) 、磷脂酰丝氨酸( p s ) 、双鲸蜡磷脂酸( d c p )