（植物学专业论文）龙须草愈伤组织的诱导及植株再生植物细胞骨架标记及检测方法初探.pdf

华中农业大学硕l 研究生学位论文 缩略语表 2 。4 一二氯苯氧乙酸 萘乙酸 激动素 6 一苄基腺嘌呤 脯氨酸 谷氨酰胺 脱落酸 吲哚丁酸 磷酸缓冲液 乙二醇一双一( 2 一氨基乙基) 四乙酸 异硫氰酸荧光素 鬼笔环肽 牛血清白蛋白 卜 a 队 o n a a s n 亿 a a 冲 盯 眺 撇 吼 隅 叭 眦 吼 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否如需保密，解密时问年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生鲐同爿兽 帆彦。刁年1 月巧日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存使用学位论文的规定”，印学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的e p r v j 版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存，汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学雠文储始日习嘻导师始功笆孓冷 签名日期：土瓠7 年，月妒签名日期：2 7 年月私自 华中农业人擘颈j ：研究生学位论文 摘要 以禾本科无融合生殖植物龙须草的成熟种子为材料，对其愈伤组织的诱导、继 代及其分化进行了研究，建立了愈伤组织诱导及植株再生体系。主要结果如下： 1 与其他禾本科植物一样，龙须草成熟胚主要对2 ，4 一d 比较敏感，能够诱导出 较好的愈伤组织。其他常用植物激素效果不明显。 2 以i i s 为基本培养基，附加2 5 m g l 的z 4 一d ，琼脂粉8 9 i 。蔗糖3 0 9 l ，2 8 。c 下暗处培养，龙须草成熟种子的愈伤组织诱导率为9 7 2 7 。培养基中添加脯氮酸和 谷氨酰胺对愈伤组织的诱导有一定的促进作用而添加脱落酸时抑制愈伤组织的形 成。愈伤组织继代培养时，仍以上述条件为佳。 3 适宜的愈伤组织分化培养基为m s + 6 一b a2 o r n g 1 + n a a o 1m g l ，分化率达到 2 9 7 。 4 幼嫩的叶片不能诱导出愈伤组织。在其他禾本科植物中应用较多的n 6 和h b 等培养基，舜f 龙须草愈伤组织的诱导效果较m s 为差。 细胞骨架在细胞中除了具有维持形状的作用外，还参与众多重要的生理活动。 但足植物材料细胞骨架的标记由于植物组织、细胞本身固有的特点存在较大的困难。 目i j 仃对植物细胞骨架标记进行研究的报道相对较少，可供参考借鉴的标记及检测方 法不多。本实验以枇杷花粉为材料，进行了细胞骨架的几种标记及检测方法的比较 研究，结果如下： 1 以考马斯完蓝r 2 5 0 为染色剂，将材料固定后去除非骨架蛋白，考马斯亮蓝 非特异地结合骨架蛋白后，在光学显微镜下即可较清楚地观察骨架蛋白的分布趋势。 其结果与其他方法所得结论符合。 2 利用鬼笔环肽专一结合微丝蛋白的特性将结合有异硫氰酸荧光素的鬼笔环 肽作为标记物，通过普通荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察、摄像可以得 到较清晰的荧光图像，显示的微丝网络结构清楚，明亮。 3 通过免疫荧光技术对微管蛋白进行标记，结合荧光显微技术观察、摄像，能 够清楚地得到微管分布的图像。 4 三种方法互相比较所得结果基本一致。考马斯亮蓝法简便、快速、易操作， 成本低以鬼笔环肽荧光探针和免疫荧光标记的方法分别只检测微丝和微管，虽然 华中农业大学磺 研宛生学位论文 成本较高，步骤比较繁琐但是因其特异结合的特点。结果比较可靠，而且由于其 图像清晰，对于细致地研究一些植物生理、生化问题，有着更重要的作用。 关键词：龙须草愈伤组织再生植物细胞骨架 6 华中农业大掌颂l 研究生学位论文 a b s t r a c t t 1 1 em a t u r es e e d so ft h ea p o m i c t i cp l a n t , e u l a l i o p s i sb i n a t aw a su s e da st h ee x p l a n t t os t u d yt h ec a l l a si n d u c t i o n s u b - c u l t u r e , c a l l u sd i f f e r e n t i a t i o na n dt h ew h o l ep l a n t r e g e n e r a t i o n 1 1 1 em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 a st h es a m ea so t h e rg r a m i n e o u sp l a n t s t h em a t u r ee m b r y oo fe u l a l i o p s i sb i n a t ai s s e n s i t i v et o2 4 db u tn o tt h eo t h e rp l a n th o r m o n e s 2 1 1 陀c a l l u sw a si n d u c e ds u c c e s s f u l l yi naf r e q u e n c yo f9 7 2 7 i nt h em sm e d i u m p l u sw i t h2 5 m e , l2 d ，s g n a g a r o 辩a n d3 0 9 ls u c r o s e a d d i t i o no fp r o l i n ea n d g l u t a m i n et ot h em e d i u me n h a n c e dt h ec a l l u s t si n d u c t i o nf r e q u e n c yt os o m ee x t e n t w h i l e a b ai n h i b i t e dt h ec a l l u sf o r m a t i o n t h es u b - c u l t u r eo f c a l l u sa l s oi i k et h i s 3 1 1 1 eo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nw a sm s + 2 o m g ，l6 b a + 0 1m g l n a a t h er e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yr e a c h e d2 9 7 4 w bc o u l dn o ti n d u c et h ec a l l u sf r o my o u n gl e a f t h en 6a n dh bm e d i u m w h i c h f r e q u e n t l yu s e di ng r a m i n e o u sp l a n t s ，a l en o tg o o df o ri n d u c t i o ne f f i c i e n c yt oe u l a l i o p s i s b i n a t a i na d d i t i o nt ot h em a i n t e n a n c ee e l ls h a p e c y t o s k e l e t o na l s ot a k e sp a r ti nm a n y i m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s f o rt h er e a s o no fp l a n tc e l li n h e r e n tf e a t u r e s ，t h e l a b e l l i n go fp l a n tc y t o s k e l e t o ni s s t i l l r e m a i n i n gs o m ed i f f i c u l t i e s ，i nt h i sr e s e a r c h ，w e s c r e e ns e v e r a lw a y so fp l a n tc y t o s k e l e t o nl a b e l i n gb a s e d0 0l o q u a tp o l l e n t h er e s u l t s w e r es h o w e d ： 1 a t i e rf i x a t i o no ft h em a t e r i a l t h en o n c e l lb o n ep r o t e i n sw e r et a k e na w a y u s i n g c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u er 2 5 0a sd y i n gr e g e n t ，i tc o u l dn o n s p e c i f i c a l l yb i n dw i t hc e l l b o n ep r o t e i n s t h ed i s t f i b u t i o no fe e l lb o n ep r o t e i n sc o u l db eo b s e r v e dc l e a r l yi no p t i c a l m i c r o s c o p e t h i sr e s u l ti l a s ts i m i l a rw i t ho t h e rr e s e a r c h e s 2 1 1 1 ep h a l l o i d i nc o u l ds p e c i f i c a l l yb i n dw i t hm i c r o f i l a m e n t u s i n gt h i sf e a t u r e t h e f l u o r e s c e i ni s o 山i o c y a n a t e b i n dc o u l dh ee m p l o y e da sm a r k e r u s i n go f f l u o r e s c e n ta n d c o n f o c o lm i c r o s c o p e s w eo b t a i n e dt h ec l e a rf l u o r e s c e n ti m a g e t h es t r u c t u r eo f m i c r o f i l a m e n tw a sc l e a ra n db r i l l i a n t 3 t h em i c r o t u b ep r o t e i n sw e r el a b e l e d 、v i t hi m m u n o f l u o r e s c e n c et e c h n o l o g y c o m b i n eb yt h ef l u o r e s c e n c em i c r o - t e e h n o l o g y , w ec o u l do b s e r v et h em i c r o t u h ec l e a r l y 4 c o m p a r i n gw i t ht h e s et h r e em e t h o d s t h er e s u l t s 、 r ea l m o s tt h es a m e c o o m a s s i e b r i l l i a n tb l u ed y i n gw a sc o n v e n i e n t ，q u i c k ，e a s y h a n d l ea n dh a dal o wc o s t t h eo t h e rt w o m e t h o t i sc o u l dd e t e c tt h em i c r o t u b ea n dm i c r o f i l a m e n t ，b u tt i l e yw e r eh i g hc o s ta n df u s s y p r o c e d u r e s f o rt h es p e c i f i cb i n d i n g ，t h er e s u l t sw e r em o r ee r c d i b i l i t y f u r t h e r m o r e ，t h e c e a ri m a g eq u a i l t yh a sd i r e c tm e a n i n gf o rs o m er e s e a r c h e so f p h y s i o l o g ya n d b i o c h e m i s t r y k e y w o r d s ：e u l a l i o p s i sb i n a t a ca l l u s r e g e n e r a t i o np l a n tc y t o s k e l e t o n 7 华中农业人擘碗上研究生学位论文 第一章龙须草愈伤组织的诱导及植株再生 1 综述 1 1 龙须草分类及分布 龙须草( e u l a l i o p s i sb i n a t a ) 俗称蓑草、蓑衣草，拟金茅、羊胡子草，羊草 等，属禾本科( 6 r a m i n e a e ) 黍亚科( $ u b f a a p a n i c o i d e a e ) 。甘蔗族( 厂，拍5 a c c h a r e n e ) 楔颖草亚族( s u b t r i ba p o c o p i d i n a e ) ，拟会茅属( e u l a l i o p s i sh o n d a ) 多年生草 本植物。 中国是龙须草的主要分布区之一湖北西北部湖南南部、西南部，广西西南 部、西部、西北部，云南大部分地区广东连洲地区贵州的黔南，黔东南、黔西 南及安顺，铜仁地区。四川东部，东北部、南部陕西汉中、安康地区及河南南阳 地区广有分布上述各省的其它地区及江西、福建、台湾、甘肃、青海、宁夏等省 局部地区也有零星分布( 刘亮1 9 9 4 ) 。其中在纬度偏低的云南，贵州、广西和湖南 等省区，龙须草主要生长于海拔2 6 0 0 m 以下的山地，而在纬度偏高的湖北、河南、 陕西和四川则相对集中地分在在海拔8 0 0 m 左右的山坡，见于干燥、排水良好和日 光充足的地方( 王请锋，1 9 9 3 ) 。龙须草生长适应性很强，在沙壤土、沙性土、冲积 土，粘土及石山土等多种类型的土壤上和在缓坡地，陡坡地( 乃至悬崖峭壁) 及非 积水平地等多种类型的地形上都生长良好( m o l l a ，1 9 9 5 ) 龙须草还分布于印度、口 朗、菲律宾、越南、缅甸等一些南亚国家，世界其它 地区犯u 没有龙须草的自然分布( 刘亮，1 9 9 4 ：s u r ，2 0 0 1 ) 。从龙须草的自然分布区可 以看出，它是禾本科植物山低纬度低海拔向商纬度高海拔发展过程中，由热带潮湿 气候向高温干旱环境迁徙过程中衍生的物种，因此从形态到生理上都具有明显的耐 干热环境特性。 1 2 龙须草的特。洼 龙须草草秆密丛，高3 0 c m - 7 0 c m 。基部叶鞘密生白色长绒毛，叶片无毛。狭长 条形，长3 0 c m 2 5 0 c m ，宽l m m - 3 m m ，内卷成针状；总状花序2 4 ，呈指状排列，密 生淡黄褐色绒毛，长2 c m - - 4 5 c m ：穗轴逐节断落，节间与小穗柄具长纤毛；无柄小 穗长4 5 m - 8 m m ，中部以下乳黄色或棕黄色长柔毛；第一颖边缘稍内卷，顶端钝或 9 华中农业人学颐t ：研究生学位论文 有2 、3 不规则的裂齿：第二颖有短芒；第二外稃的裂齿间伸出一稍弯曲的芒。花 果期5 6 月( 南京大学生物系，中国科学院植物研究所，1 9 5 9 ：耿以礼，1 9 6 5 ) 。 经过对叶片形态解剖特征、叶j 生理功能的系统研究，发现龙须草是一种新的 c 。植物( 张友德和周大明，1 9 9 4 ) 其形态结构上表现为叶片狭长，上下表面均呈波 浪状，以增大光合叶面积，减少水分蒸发：种子为具毛护颖包裹极轻，且能由穗 轴上逐节脱落便于随风传播。光合效率高，c 晚补偿点低，光呼吸量低。净生产率高 因此能在干旱季节有效地利用稀少水分：种子无后熟期和休眠期，从成熟至几年后 仍有发芽能力，具有旺盛的生殖力，能在严酷的环境下生存和发展。生长习性上表 现为充分利用水热同步增长时期，迅速生长积累干物质：入秋后生长速度明显下降： 入冬后草质变硬，养分储存于根系，并进入休眠：翌年春末夏初，在恢复生长的同 时迅速拔节抽穗结籽，以保证种子在干旱、寒冷到来之前有足够的时白j 顺利发芽成 苗( s h a r m ae ta 1 。1 9 8 8 ：g u p t aa ta 1 1 9 9 5 ) 。对其形态解剖、生理活性及生殖 方式研究，发现，其为无融合生殖的体细胞无孢子生殖，且胚和胚乳的发育过程与 一般的禾本科植物基本致，胚的发育滞后( 张友德和张君芝，1 9 9 6 ；张友德等，1 9 9 6 ： 杨小菊和张友德，1 9 9 8 ) 。 龙须草叶鞘基部密生白色绒毛，叶舌、叶耳毛状，因而具有抵御病菌孢子和昆 虫入侵的作用，而且其叶片纤维含量高，对昆虫有拒食作用( 柳义竹，1 9 8 0 ) 由于 其生长速度快，一旦成活，其它杂草难以大量蔓延，易形成优势种。同其它宿根性 草本植物一样，龙须草也具有耐割、耐山火、耐牲畜践踏等特性。 1 3 龙须草的研究进展 龙须草在中国作为一种野生植物资源，主要分布在山区，大多数处在自生自灭 的状态，近些年来由于其具有较大的经济、社会和生态价值逐渐引起人们的关注 有研究表明，龙须草纤维含量高达5 6 7 8 ，灰分含量低，杂细胞少，多戊糖含量较 多，制浆收获率高，打浆比较容易，木质素含量低，制浆过程因此而简单，易漂白。 因此龙须草做造纸原料，可以替代进口针叶浆、竹浆，适用于生产高档文化用纸和 工业技术用纸( 中国科学院植物研究所1 9 7 3 ；柳义竹，1 9 8 0 ；卢惠敏。1 9 8 0 ) 龙须草限系发达，整个根系交织成网，密布在活土层里，适应范围广，抗逆性强， 易定植成活，且具类似木本植物一次定植，长期利用的特点。草层截雨根系固土， 0 华中农业夫掌颐i ：研究生学位论文 是良好的水土保持植物与拓荒建群种( 邹冬生和周青，2 0 0 0 ：秦天才等，1 9 9 6 ) 发展 龙须草产业投资少，管理费用低币i 且见效较快，当年发展当年受益，一次种植 多年受益。利用龙须草可编织、加工造纸，也能吸收大量的劳动力。有利于山区 农民脱贫致富 1 3 1 栽培技术研究 龙须草属于宿根性禾草，生活史中营养生长时期氏生殖生长时问较短一般 可以通过种子繁殖，也可以采用分蔸的营养繁殖方式。在人工栽培中为了提高龙 须草繁殖成活率，高产量，增加经济效益人们对龙须草种子的活性和生命力、龙 须草的分蘖规律和影响因子、如何提高龙须草生物产量等栽培技术开展了一些工作。 龙须草种子没有生理后熟和休眠过程，当年的耔实具有较高的生活力，种子发 芽率可达到6 0 一7 0 ，但随着储存时间的增加其活力下降很快，种子收获一年后 的发芽率只有3 0 - 4 0 左右三年后种子发芽率在l o 以下。龙须草的分蘖级高达 6 7 级，籽实6 月上旬集中成熟后，才进入分蘖的旺盛期，随后伴有少量的抽穗结 实现苏。龙须草分蘖持续时问长，从3 月份初始分蘖一直到l1 月中旬分蘖结束：在 水、肥充足、气候适宜时，一年可达到一草百蘖，是禾本科中分蘖能力最强的种类 之一。影响龙须草分蘖的因子有很多，但主要因子是温度和水分，在有效温度范围 内田臼j 持水量7 0 左右，温度越高，分蘖越多，分蘖速度越快( 周茂堂和杨景锋， 1 9 9 0 ：张友德等，1 9 9 3 ) 。 1 3 2 形态解剖与生理功能研究 龙须草叶是人们利用的主要器官，研究证明其叶片的光合效率商，叶片结构具 有c 4 植物的解剖特点。其上表皮气孔数目多于下表皮，且泡状细胞十分发达。细胞 较易失水皱缩，使叶片内卷成筒状，有利于减少水分蒸腾。从而增强龙须草的保水 抗旱能力；维管柬密度大，是其它禾本科作物的3 - 4 倍，其中大型维管束主要分布 在接近表皮处，有明显发达的韧皮纤维束，靠下表皮的韧皮纤维达8 1 0 层细胞厚； 叶肉细胞在叶片边缘的数量多于中脉，使叶片呈现中间薄，边缘厚的特征：龙须草 叶片维管束鞘细胞为一圈大型薄壁细胞，内含多而大的叶绿体且排成离心的弧形， 与其紧邻的外周叶肉细胞构成。花环型”结构( j 长友德和周大明，1 9 9 4 ：邹冬生等 华中农业大学硕j 。研究生学位论文 2 0 0 0 ) 。对龙须草叶片光合作用、蒸腾作用、呼吸强度等生理指标的测定表明在相 同生态条件和生长期中其光合速率和叶绿素a b 值与c 4 植物玉米相近光合效率 和水分利用率略高于玉米，分别比水稻高1 1 2 倍和0 7 8 倍，但龙须草叶片的c 4 结 构特征和功能在苗期尚不明显，在旺盛生长期于体燃( s h a r m a 1 9 8 8 ：邹冬生等， 2 0 0 0 ) 。 1 3 3 生态效益研究 随着环境的不断破坏和重大自然灾害的频繁出现，对环境加以保护的呼声越来 越强烈。对水土资源的保护和合理利用成为了生物学家重视的课题。龙须草因其特 有的水、土保持功能而引起了人们的重视。最近的研究发现，1 0 年生龙须草地的土 壤物理性状、化学性状、生物学性状和草地小气候环境与其它自然草地和柑橘经济 林地相比，都有不同程度的改善龙须草通过降低土壤容量，提高土壤总孔隙度， 适当增加土壤中的粘粒、粉粒含量，减少砂粒含量，而改善土壤通气透水性能，提 高土壤肥力，从而达到改善土壤耕性的效果( 黄字等，2 0 0 3 ，2 0 0 4 ) 。 1 3 4 无融合生殖研究 近年来，张友德、杨小菊等对龙须草进行了初步的胚胎学研究，认为其成熟胚 囊是4 细胞大黍型无孢子生殖胚囊( 张友德等，1 9 9 6 ：杨小菊和张友德，】9 9 8 ) 。此 后，对窄叶型龙须草和红杆型龙须草大孢子的发生、胚囊的起源、发生和发育、胚 的起源、胚乳的产生等过程进行了系统研究，得到了龙须草无融合生殖的证据，探 明了龙须草胚和胚乳的发育可以不经过受精而分别由卵细胞和极核自发分裂形成； 并对其龙须草的花粉发育过程进行了观察，其雄性配予的发育过程类似于其它有性 生殖的禾本科植物，最后形成3 细胞型成熟花粉粒( 杨平仿，2 0 0 2 ：y a oe ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。姚家玲等利用a f l p 分子标记技术。结合形态学特征观察和叶片纤维素含量、 成分等的测定，将龙须草划分为4 种类型：窄叶类型、浓绿叶类型、红杆类型和宽 叶类型( 姚家玲等，2 0 0 4 ) 。陈智慧等对窄叶型和红杆型龙须草花粉活性及结实率与 其无融合生殖的关系研究中发现，龙须草花粉对其种子形成没有实质性贡献，龙须 草具有很高的无融合生殖程度，是优良的无融合生殖基因供体( 陈智慧和姚家玲 2 0 0 5 ) 。刘传虎对龙须草核型进行了分析，确定其染色体数目为4 0 条，种群内存在 1 2 华中农业大学硕1 1 珊究生学位论文 有染色体数目的变异，龙须草的核型为l b 型核型公式为2 n = 4 0 = 1 8 m + 2 s m 利用 r a p d 分子标记和形态特征观察将全国龙须草1 2 个居群划分为4 类。通过遗传差 异较大的龙须草类型自j 杂交。获得杂交种子萌发后得到4 6 株f i 代，其中3 株来自 有性生殖方式确定龙须草为兼性无融合生殖植物( 刘传虎，2 0 0 6 ) 。 1 4 植物组织培养 1 4 1 组织培养的基本原理 植物组织细胞培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1 9 0 2 年，德国著名植物学家g h a b e r l a n c l t 根据细胞学理论大胆地提出了高等植物的器 官和组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断 分裂和繁殖发育成完整植株的潜力的观点。1 9 4 3 年美国w h i t e 在烟草愈伤组织培 养中，偶然发现形成一个芽，证实了g h a b e r l a n c l t 的论点( 孙丽华和朱翔，2 0 0 0 ) 组织培养所使用的基本培养基有m s 、b 5 、w h it e 、n 6 等。其中含有植物生长过 程中所需要的各种大量及微量元素，以一定的比例搭配，再配以碳源( 糖) 、适当的 植物激素等有机物，有时以琼脂、卡拉胶等为支持物，满足各种实验体系的需要， 灭菌后在无菌条件下接种外植体并在一定的温度、光照条件下培养、继代，直至 得到目标生长物。 1 4 2 植物组织培养的简史 植物组织培养技术的整个历史可以追溯到1 9 世纪末和2 0 世纪初。 g h a b e r l a n c l t 提出自己的观点后，于1 9 0 2 年发表了植物细胞培养的第一篇论文， 被誉为“植物组织培养之父”。1 9 0 4 年h a r m i n g 在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜 和辣限菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。1 9 2 2 年，w k o t t e 用稀释的k n o p 溶液加入相当复杂的有机物质培养豌豆和玉米的根尖，获得成功。这是有关根培养 的最早实验。1 9 2 5 年到 9 2 9 年，l a i b a c h 把由弧麻种间杂交形成的不能成活的种子 中的胚剖出来在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中 利用的可能性。 进入2 0 世纪3 0 年代以法国的r j g a u t h e r e t 和美国的p r w h i t e 为首的科 学家形成了两个植物组织培养研究中心工作不断取得进展。1 9 3 4 年，w h i t e 由番 华中农业大学磺l 研究生学位论文 茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真i f 的成功。 后继的一些实验逐渐发现了b 族维生素( 吡哆醇、硫胺素、烟酸) 对植物生长的意 义，他用以此为基础的w b i t e 培养基将1 9 3 4 年建立的番茄根培养物一直保存到1 9 6 8 年他逝世i i i 不久。g a u t h e r e t 在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中，又揭示出了 生长素在组织培养的重要意义( 李浚明，2 0 0 2 ) 。 2 0 世纪6 0 年代进入发迅速发展的时期。招统计，2 0 世纪6 0 年代初期，全世界 还只有十几个国家的少数实验室从事组织培养研究，但是到了2 0 世纪7 0 年代。组 织培养领域仍然空白的国家已经屈指可数了( 罗士韦，1 9 7 8 ) 。1 9 6 5 年，v a s i l 和 h j l d e b r a n d t e 用一种化学成分确定的培养基，由分隔培养的烟草单细胞获得了完整 的再生植株进一步证实了植物细胞的全能性。1 9 7 1 年，t a k e b e 等在烟草上首次由 原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁 的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体 材料。值得一提的是，中国学者在禾谷类植物如水稻、小麦、玉米、高粱、谷子和 大麦等的原生质体和花药培养方面，做出了重要的贡献。 1 4 3 禾本科植物组织培养研究进展 禾本科中集中了许多重要的粮食作物。相对于其他植物来说，禾本科植物的组织 培养是比较困难的。但是组织培养体系的建立与完善又是应用植物基因工程改良品 质的重要基础和保证。随着研究的深入近年禾本科植物的组织培养也取得了不少 的进展。 已有的很多研究结果都表明，对禾本科植物进行组织培养时，外植体的类型和 植物的基因型，对培养的成功与否影响很大。 目前研究报道的小麦外植体来源有幼胚、幼穗、成熟胚、幼叶、根、种子、花 药、胚轴和胚芽鞘等。很多禾谷类植物的叶片在离体条件下培养能够诱导出愈伤组 织，如燕麦( c h e ne ta 1 1 9 9 5 ；g l e s se ta 1 ，1 9 9 8 ) 、黑麦( l i n a c e r o 。1 9 8 6 ：z h a n g a n dj i a ，1 9 9 3 ) 、大麦( b e c h e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 等。但再诱导出苗比较困难，即使有 少量苗出现，也缺乏规律性。幼胚是目前公认最好的小麦外植体源，其愈伤组织的 诱导和植株再生能力最高用小麦成熟胚作为外植体，可以保证不同的个体间生理 状况相似，而且取材方便，不受季节限制，代价小，可大量获得，因此，已得到广 1 4 华中农业大学碰上研究生学位论文 泛的研究应用( 彭朝华和毛炎麟1 9 8 9 ) 。从种子体细胞直接产生愈伤组织，不受时 问和季节的限制，是最快速和简便的方法，已在水稻研究中得到了广泛的应用，而 用小麦整粒种子作为外植体，诱导率极低，其愈伤组织是由胚轴细胞形成的，星透 明状，生长缓慢( 李书平和刘世强，1 9 9 8 ) 目前，用于玉米组织培养的外植体了主 要是幼胚和幼穗。幼胚长度不同，对愈伤组织的诱导率有影响( 陈英和周先礼，1 9 9 9 ： 付风玲和李晓忱，1 9 9 9 ) 。高粱是目前公认的最难建立植物无性组织或器官再生体系 和导入外源基因的作物之一。高粱外植体培养最多、最成功研究工作开展得较早 也是未成熟胚培养，一般认为这一时期的内源激素合成酶活性较强，因此容易成功 ( b h a ta n dk u r u v i n a s h e t t i 1 9 9 5 ) 。 许多研究者对玉米不同基因型的幼胚进行离体培养研究，认为玉米愈伤组织的 诱导能力较为普遍，但诱导率因基因型的不同有明显差异，基因型是影响愈伤组织 的一个重要因素( 贾利敏等，2 0 0 2 ) 。小麦幼胚的培养再生过程往往表现出明显的基 因型差异，不同的小麦基因型可以在致密愈伤组织的诱导、分化及分化能力的保持 等方面表现出较大差异( s e a r sa n dd e c k a r de ta 1 ，1 9 8 2 ；刘少翔等，2 0 0 3 ) 。 在n a h d i 等的报道中，1 1 个高粱品种的茎尖再生频率为0 - 9 1 ，不同基因型问相差 更大，说明基因型对高粱茎尖的再生有非常重要的影响。 课题的提出和研究的意义 已有的研究结果表明，龙须草是禾本科一种优异的无融合生殖资源，在无融合 生殖分子机理研究和作物育种中具有独特的价值，但其离体再生体系、遗传转化体 系等基础性的研究十分缺乏，限制了对其分子机理与基因克隆的进一步研究。 虽然单子叶禾本科植物离体再生比较困难，但随着培养技术的改进和成熟，目 前已经在相当多的禾本科植物中通过愈伤组织诱导建立了再生体系。本文以龙须草 的成熟种子为外植体，研究基本培养基、外源激素等对愈伤组织诱导的影响，分析 愈伤组织继代和分化培养过程中的再生能力以建立龙须草离体培养再生体系，为 进一步开展遗传学、分子生物学研究提供技术平台。 华中农业j = 学碗j ：研究生学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 本实验所用龙须草种子足在5 - 6 月份于资源圃中收集，剥取烘干后挑选饱满 粒大的备用。 2 2 方法 2 2 1 愈伤组织诱导激素种类的筛选 愈伤组织诱导，先以m s 为基本培养基，附加不同种类和浓度的植物激素。本文 中所用培养基，如无特别说明，植物激素浓度单位均为m g l ，加琼脂粉7 9 l ，蔗糖 3 0 9 l ，p h 值调至5 8 具体配方如下： a 、h i s + 2 ，4 - d0 0 5 + n a a0 2 + k t3 0 b 、m s + 2 4 - d3 o + n a a 0 5 + k t0 5 + 6 一b a0 5 c 、m s + n a a1 0 + 6 一b a0 5 d 、m s + n a a0 】+ 6 - b a2 0 e 、m s + 2 4 - d0 5 + 6 一b a0 2 f 、m s + 2 4 - d1 5 + 6 一b a0 2 g 、m s + 2 4 - d1 0 + 6 一b a0 4 h 、m s + 2 4 - d1 0 + 6 一b a0 2 i 、m s + n 从o 1 + 6 一b 1 o j 、m s + n a a0 1 + 6 一b a1 5 k ，b l s + n 从o o l + 6 - b a2 0 1 ，b t s + n 从0 1 + 6 - b 2 o m 、m s + n 从o 2 + 6 - b a2 0 0 1 的h g c l ：溶液中，加几滴t w e e n 一8 0 晃动直至其完全溶解于溶液中。种子 直接放入消毒溶液中，消毒8 m i n ，中途摇动若干次，以使附着于种子表面的小气泡 浮出来，使杀菌更彻底。消毒结束后，无菌水洗5 次接种入诱导培养基中诱导愈 伤组织，或者接种入不加激素的惦培养基中于光下培养无菌苗。后者成苗后，将幼 嫩的叶片切成小段，接种入诱导培养基中，一部分光下( 2 0 0 0 l a x ，下同) 培养，另 毕中农业入学碗l ：研究生学位论文 一部分和种予直接诱导愈伤组织一样，在2 8 。c 暗处进行4 0 d 后观察并记录结果。 2 2 2 愈伤组织诱导及植株再生 根据前面的实验结果结合查阅相关文献资料设计愈伤组织诱导所用培养基 配方如下，培养基中的添加物p r o 和g l n 均为5 0 0 m g l ，a b 为1 o m g l ： 种子消毒后接种入诱导培养基中诱导愈伤组织。 愈伤组织诱导在2 8 。c 暗处进行。诱导4 6 9 后轻轻剥下愈伤组织，转移到继代 1 7 华中农业大学顿士研究生学位论文 培养基中。3 0 d 后一部分直接放到光下培养，另一部分转入分化培养基中光下 培养，诱导植株再生，两者温度均为2 4 。c 。分析第一阶段实验结果，将分化培养基 配方选用为：m s + - 6 - b a 2 o + n 从o 1 2 2 3 植株生根及移栽 丛生的苗较多可进行生根。具体方法是： 将丛生芽切开，在不含激素的m s 培养基( 蔗糖2 0 9 l ) 中壮葡2 0 d ，然后转移 到生根培养基中，生根培养基配方为：i 2 m s ( 大量元素减半) + i b a1 o m g l + 蔗糖 1 5 9 l + 活性炭0 5 9 l 。壮茁与生根在光下进行，温度2 4 。c 。生根培养l o d 左右，当 根长约l c m 时，可直接将苗取出，洗净苗上所附带的培养基栽于花盆中。栽培的 基质为普通黄土与泥炭土以l ：1 体积比搭配。每株苗上扣一个剪掉底的矿泉水瓶， 前3 5 d 盖上盖子，以保证瓶内空气湿度。后面可将盖子拿掉，但是瓶子仍扣于苗上。 将花盆置于光下，但是忌强光长时间直射。视苗的生长情况，约2 0 d 后可以除掉矿 泉水瓶，进行正常的水分管理。 2 2 4 数据统计 愈伤组织诱导率= ( 长出愈伤的外植体个数接种后未污染的有效外植体个数) “) o 愈伤组织再生率= ( 再生出小苗的愈伤个数用于植株再生的愈伤组织总个数) l o o 3 结果与分析 3 1 愈伤组织诱导激素种类的筛选 种子经消毒处理后，在培养基中2 3 d 多数种子即开始萌发。此种方法消毒效果 比较理想，整个培养过程中，只有少数瓶中会有个别种子长出真菌苗丝，此时将整 瓶培养物灭菌舍弃。 至4 0 d 时，因起始培养物、培养基配方和培养条件等的不同，表现出了不同的 状态。 1 8 华中农业大学颀卜刎究生掌位论文 其中。先培养出叶再用幼嫩叶片切段进行培养的，无论将其冕二f 光下还是暗处 4 0 d 后叶均已死亡，变成厌褐色，不能够长出愈伤组织 用完整种子进行诱导实验的，有一些只长了长短不一的茁但是都不见愈伤组 织长出，它们是编号为a ，c ，d 、i j 、k ，l ，m 的8 种培养基而编号为b 、e 、f 、 g 、h 的5 种培养基，均有愈伤组织长出，而且长出的叶片均有不同程度的螺旋状 弯曲 分析返两类情况下的培养基，我们发现它们的最明显的不同就在于生长索类 激素2 ，4 - d 的加入与否。在我们试验的这若干种培养基中，凡是没有加2 ，4 一d 的处 理，均没有愈伤组织长出，而且虽然苗的长短不同。但是它们的形状基本上正常， 即大体呈平滑的曲线。而凡是加有2 ，4 一d 的组合，都有愈伤组织长出，叶的形态也 都表现出了不同程度的畸形即螺旋状弯曲。 这样的现象与在水稻、玉米等一些其它采本科植物上报道的结果相似，即愈伤 组织诱导时，外植体对2 ，4 - 0 比较敏感，效果较好。 ， 激素筛选实验中，我们还得出了其他一些结果。 那些没有长出愈伤组织的处理，有些长出了极其丰富的丛生芽，例如m s + n a a o 1 + 6 - b a 2 0 ( 编号为1 ) 。此处理中的种子，长出叶后，即从基部丌始分生出了许多丛 生的芽，小苗的颜色浓绿轴后，因芽过多，已经完全将根基部托起于培养基之上。 虽然此时只有少数的叶能接触到培养基，但是继续分尘，叶色仍然很健康，没有出 现因养份吸收困难苗长势变差的情况。鉴于此，我们将此种培养基选择为再生实验 时所使用的培养基。 3 2 愈伤组织的诱导及再生 由于在暗处培养，生氏出的芽缺乏色素呈白色。约1 w 左右检查，因培养基的不 同，各种处理的生长情况表现出较大的差异。 以m s 为基本培养基的处理，在只添加了2 ，4 一d 时愈伤组织诱导率均在9 0 9 6 以上， 而且随着浓度从0 增加到2 5 m g l 优愈率也逐步增加达到7 0 0 0 ，之后又逐渐降 低。同时，随着2 ，4 一d 浓度的增加，苗逐渐变短，叶片越来越弯曲。只添加了2 ，4 一d 的处理，1 5 d 时大多数从叶片的基部长出了愈伤组织，诱导率很高，均在9 0 以上( 见 表1 ) ，只是各处理长出的愈伤组织状态、颜色、大小有些差别。4 5 d 时，2 ，4 一d 浓 1 9 毕中农业丈学硕j ：研究生学位论空 度对愈伤组织诱导效果的差别已经非常明显。当2 4 一d 浓度为2 0 和2 5 m g l 时， 愈伤组织颜色淡黄结构致密，直径4 - 7 m m 。而2 ，4 一d 浓度低于2 o m g l 时的愈伤 纽织就显得过稀，而且是2 ，4 一d 浓度越低愈伤组织就越稀状态越差。当2 ，4 - d 浓 度大于2 5 m g l 时愈伤组织比较硬，颜色淡黄，不疏松，也比较小，平均直径只 有2 - 3 m ，而且有些愈伤组织上会有极小的灰黑色的点，推测为死亡了的小细胞团。 表1 愈伤组织诱导培养基配方及诱导情况统计 t a b e1 c o m p o s i t i o no fc a l l u si n d u c t i o nm e d i u ma n ds t a t i s t i c a n a l y s is 华中农业人掌硕j 。研究生学位沧丈 将只添加了2 o m g l l2 ，4 - d 与含有等量2 ，4 一d 并附加有其它添加物时诱导的愈 伤组织进行比较。当另外添加有1 o m g l a b a 时，明显抑制丁芽和根的生长，但愈伤 组织的诱导率也从9 3 6 9 下降到3 3 6 - 1 ，说明a b a 对于龙须草愈伤组织的诱导具有 强烈的抑制作用，这与a b a 在其它一些植物材料上对愈伤组织的诱导具有正面效应 的结论是不同的。当培养基中增加了p r o 和g i n 两种成分时龙须草种子愈伤组织 的诱导率从9 3 6 升到9 5 3 5 ，优愈率也提高了0 5 5 ，虽然两首都有所提高，但 是不明显。同时添加a b a 、p r o 和g l n 时愈伤组织诱导率为i j 6 7 5 ，介于两者之 间。结合前面的分析可知，p r o 和g i n 的加入对愈伤组织的诱导有促进作用并且 可以减弱a b a 对愈伤组织诱导的负面效应。 在n 6 基本培养基中添加2 ，4 一d ，龙须草愈伤组织诱导率在5 0 一7 0 之问，明显 低于以惦作为基本培养基的处理，优愈率同样如此。所不同的是，随着2 。4 一d 浓度 从1 5 m g l 升到2 5 m g l ，其愈伤组织诱导率下降，与同浓度2 ，4 一d 的m s 培养基处 理得到的结果相反。但这两种处理也有相同之处，即当2 ，4 一o 使用浓度为2 5 m g l 时，优愈率为各自系列的最高。 r 一。一一一jf 一一 一 一一 币埘2 4 一d 浓度下窟伤组织诱导宰j - 1 ：同24 一o 浓j 堑优愈串 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 8 7 。0 6 0 静 8 器 a 愈伤组织诱导率的比较b 优愈率的比较 a r a t eo fc a ll u si n d u c t i o nhr a t eo fg o o dc a l l u s 图1 不同2 ，4 一d 浓度条件下三种基本培养基愈伤组织诱导率及优愈率的比较 c o m p a r a t i v ea n a l y s i so fi n d u c t i o ne f f i c i e n c y